schiedliches Verhalten bei der Austestung erwar-ten können. Die Frage, ob die Flavanone als solche die Wachstümshemmung ergeben, oder ob eine Über führung in die Chalkone stattfindet, muß vor-läufig noch offen bleiben. Im Gang befindliche Ver-suche über die Konstitutions-Spezifität der Chal-kone werden sicherlich auch in dieser Richtung nähere Aufschlüsse geben können.

W i r k u n g s m e c h a n i s m u s d e r C h a l k o n e

Man kann wohl annehmen, daß es sich bei der Hemmwirkung der untersuchten Chalkone nicht nur um eine phenolische Wirkung handelt; viel-mehr wird auch die Struktur des ungesättigten Ketons, wie aus dem relativ guten Hemmwert des Chalkons gefolgert werden kann, f ü r den bakterio-statischen Effekt dieser Verbindungen verantwort-lich sein.

Durch Serumzusatz wird der Einfluß der Chal-kone auf das Wachstum der Bakterien bedeutend geschmälert. Setzt man der Bouillon 1% Serum zu,

so muß z. B. bei Verbindung I I I die Konzentra-tion von 1:320000 auf 1:80000 erhöht werden, um völlige Wachstumshemmung zu erzielen. Bei 10-proz. Serumzusatz ist bei der Verdünnung 1: 20000 keine Bakteriostase mehr zu beobachten. Da der antagonistische Einfluß des Cysteins bei einigen ungesättigten Ketonen und Lactonen be-reits bekannt ist, sollte festgestellt werden, ob die Abschwächung der Wirkung durch Serum auf die Anwesenheit der SH-Gruppen zurückgeführt wer-den kann. Entsprechende Versuche ergaben je-doch, daß selbst 100 Mole Cystein-hydroehlorid auf 1 Mol 2.2'-Dioxy-5-brom-chalkon ( I I I ) keine Her-absetzung des Hemmungsvermögens bewirken. Die Wirkungsbeeinträchtigung durch Serum muß da-her anderer Natur sein.

Weitere Versuche sollen dieses Problem ein-gehender behandeln.

F ü r w e i t g e h e n d s t e U n t e r s t ü t z u n g u n d w e r t v o l l e R a t s c h l ä g e s i n d w i r H r n . D o z . D r . R . P f l e g e r , E r l a n g e n , in d e s s e n L a b o r a t o r i u m d i e s e A r b e i t a u s g e -f ü h r t w u r d e , z u g r o ß e m D a n k v e r p f l i c h t e t .

Fleckfieber-Klarimpfstoff Kolloidbiologischer Beitrag zur Antigen-Gewinnung aus Viren

V o n F E R D I N A N D J O S E F L A U E R

A u s d e m I n s t i t u t f ü r K o l l o i d k u n d e u n d d e m M e d i z i n i s c h - B i o l o g i s c h e n L a b o r a t o r i u m P o p p e n h a u s e n a. d. W a s s e r k u p p e

(Z. Naturforschg. 3b, 171—177 [1948]; eingegangen am 11. Februar 1948)

D u r c h d i e V e r f a h r e n d e r U l t r a d i s p e r g i e r u n g , d e r U l t r a f i l t r a t i o n u n d d e s A d s o r p t i o n s -D e k a n t i e r e n s w e r d e n d i e w i r k s a m e n A n t i g e n - K o m p o n e n t e n d e s F l e c k f i e b e r - I m p f s t o f f e s v o n B a l l a s t - E i w e i ß e n u n d F r e m d s t o f f e n g e t r e n n t u n d in m ö g l i c h s t g r o ß e m R e i n h e i t s -g r a d g e w o n n e n .

E s z e i g t s i c h , d a ß s i c h d i e b e i m I m m u n i s i e r e n w i r k e n d e n A n t i g e n - K o m p o n e n t e n A J u n d A T g e m e i n s a m i m K l a r i m p f s t o f f g e w i n n e n l a s s e n . W e i t e r h i n k a n n d u r c h U l t r a -f i l t r a t i o n d i e K o m p o n e n t e A J , d i e h a u p t s ä c h l i c h f ü r d i e S c h u t z w i r k u n g g e g e n F l e c k -f i e b e r - I n f e k t i o n B e d e u t u n g h a t , v o n d e r K o m p o n e n t e A T g e t r e n n t w e r d e n .

W ä h r e n d d i e K o m p o n e n t e A J m e c h a n i s c h e n , c h e m i s c h e n u n d a d s o r b i e r e n d e n K r ä f t e n g e g e n ü b e r b e s t ä n d i g i s t , b e s i t z t d i e K o m p o n e n t e A T e i n e s e h r l a b i l e c h e m i s c h e N a t u r ; s i e i s t l e i c h t a d s o r b i e r b a r d u r c h g e e i g n e t e o r g a n i s c h e K o l l o i d e u n d s c h w e r a d s o r b i e r b a r d u r c h a n o r g a n i s c h e K o l l o i d e .

D i e K l a r i m p f s t o f f e e n t h a l t e n k e i n e i n t a k t e n R i c k e t t s i e n o d e r s e n s i b i l i s i e r e n d e n B a l l a s t s t o f f e . D i e H a l t b a r k e i t d e s K l a r i m p f s t o f f e s w i r d w a h r s c h e i n l i c h d u r c h d a s F e h l e n l e i c h t z e r s e t z l i c h e r F r e m d s t o f f e w e s e n t l i c h e r h ö h t .

E s e r g e b e n s i c h d u r c h d i e V e r w e n d u n g v o n K l a r i m p f s t o f f f o l g e n d e T a t b e s t ä n d e : D i e I m m u n i s i e r u n g g e g e n F l e c k f i e b e r i s t n i c h t a n d i e I m p f u n g m i t i n t a k t e n R i c k e t t s i e n ge -b u n d e n . D i e A n t i g e n e s i n d n a c h T r e n n u n g d e r g r o b e n E i w e i ß - B a l l a s t s t o f f e u n g e h e m m t w i r k s a m u n d m o n a t e l a n g h a l t b a r .

Die vorliegende Arbeit ging aus einer Arbeits-planung hervor, die sich die Reindarstellung

des Fleckfieber-Erregers oder damit zusammen-hängender Wirkstoffe zum Ziel setzte.

Da fü r eine wirksame Bekämpfung des Fleck-fiebers grundlegende Pionierarbeit durch R i k -k e 11 s und P r o w a z e k , C o x , O t t o und an-dere geleistet und der Erreger als solcher bekannt

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war, interessierte hauptsächlich die möglichste Reindarstellung der Wirkstoffe zur Bekämpfung des Fleckfiebers. Die von Ballaststoffen befreiten Impfstoffe werden Klarimpfstoffe genannt. Sie sind wasserklar und können verschiedene wirk-same Antigene enthalten, die gerade gewünscht werden.

1. D i e F l e c k f i e b e r - I m p f s t o f f e d e r G e g e n w a r t

D i e E r f a h r u n g e n d e r l e t z t e n J a h r z e h n t e , i n s b e s o n -d e r e d i e d e s e r s t e n u n d z w e i t e n W e l t k r i e g e s , h a b e n g e l e h r t , d a ß e i n e w i r k s a m e B e k ä m p f u n g d e s F l e c k -fiebers e i n e r s e i t s d u r c h V e r n i c h t u n g d e r R i c k e t t s i e n -Ü b e r t r ä g e r u n d a n d e r e r s e i t s d u r c h I m p f u n g d e r v o n e i n e r I n f e k t i o n b e d r o h t e n P e r s o n e r r e i c h t w i r d 1 . D e r I m p f s t o f f z e i g t j e n a c h H e r s t e l l u n g u n d H e r k u n f t m e h r o d e r w e n i g e r s t a r k e R e a k t i o n e n b e i m I m p f l i n g . H e r s t e l l u n g u n d H e r k u n f t b e d i n g e n n e b e n d e n W i r k -s t o f f e n e i n e n g r ö ß e r e n o d e r k l e i n e r e n G e h a l t a n F r e m d e i w e i ß e n u n d a n f ü r d e n I m p f v o r g a n g n i c h t e r -f o r d e r l i c h e n S t o f f e n . A m m e i s t e n e r p r o b t i s t d e r I m p f -s t o f f a u s L ä u s e d ä r m e n n a c h W e i g l 2 . D i e W e i g l s c h e I m p f u n g b r i n g t a u ß e r d e n R i c k e t t s i e n a u c h G e w e b s -t r ü m m e r d e r L ä u s e d ä r m e s o w i e Z e l l e l e m e n t e a r t -f r e m d e n E i w e i ß e s in d e n K ö r p e r d e s I m p f l i n g s . D e r G e h a l t a n W i r k s t o f f e n f ü r d i e I m p f u n g i s t r e l a t i v k l e i n im V e r h ä l t n i s z u d e n F r e m d s t o f f e n , d i e m i t d e r I m p f u n g n i c h t s z u t u n h a b e n u n d d e n K ö r p e r h e f t i g e n o d e r s c h w a c h e n R e a k t i o n e n m i t u n n ü t z e m E n e r g i e -v e r b r a u c h a u s s e t z e n . D e m s c h w e r z u b e s c h a f f e n d e n L ä u s e - I m p f s t o f f s t e h e n b e z ü g l i c h d e r F r e m d s t o f f -a n t e i l e d i e a n d e r e n , a u s O r g a n z e r r e i b u n g e n b e r e i t e -t e n f l ü s s i g e n o d e r f e s t e n I m p f s t o f f e i n n i c h t s n a c h , s e l b s t w e n n s i e n a c h d e r G e w e b s z e r r e i b u n g d u r c h m e h r f a c h e s Z e n t r i f u g i e r e n m e h r m a l s v o n g r ö ß e r e n G e w e b s t e i l e n g e r e i n i g t w e r d e n . G e n a n n t s e i e n e in -f a c h e T r o c k e n i m p f s t o f f e , L u n g e n g e w e b s - I m p f s t o f f e u n d V e r s u c h s i m p f s t o f f e d e s P e r i t o n e u m s a u s r ö n t g e n -g e s c h ä d i g t e n M ä u s e n o d e r R a t t e n s o w i e d i e I m p f s t o f f e , d i e aus N d e r C h o r i o a l l a n t o i s d e s H ü h n e r e m b r y o s ge -w o n n e n w e r d e n .

2. D a s m i k r o s k o p i s c h e u n d e l e k t r o -n e n o p t i s c h e B i l d d e r F l e c k f i e b e r -v i r e n u n d d i e s i c h d a r a u s e r g e b e n -d e n n a c h t e i l i g e n E i g e n s c h a f t e n d e r

F l e c k f i e b e r - I m p f s t o f f e

Betrachtet man makroskopisch einen handels-üblichen Fleckfieber-Impfstoff. der nach O t t o und W o h l r a b aus Dottersackmaterial des Hühnerembryos gewonnen wird, so sieht man eine stark milchige, trübe Emulsion mit groben Partikeln. Im mikroskopischen Bild erkennt man

1 W . H a g e n , K l i n i k u . P r a x i s 1, 228 [1946]. 2 K o l l e - H e t s c h , B a k t e r i o l o g i e u . I n f e k t i o n s -

k r a n k h e i t e n , 1942.

außer einer relativ geringen Masse von Rickett-sien große Anteile von Gewebstrümmern, Dotter-sackmaterial, insbesondere Eiweiße (Abb. 1*).

Das übermikroskopische Bild3 zeigt neben außerordentlich groß erscheinenden Fremdstoffen die Fleckfieber-Rickettsien als organisierte Virus-körper von zellartigem Aufbau (Abb. 2) mit einem Exoplasten (1) und einem Bipol-Protoplasten (2), an dessen Polen mikrosomenartige Körnchen-anhäufungen (3, 4) liegen, die durch das Centro-plasma (5) verbunden sind. Der relativ starke Exoplast schließt den Innenkörper ein. Gelegent-lich beobachtete Loslösung des Exoplasten vom

m

0

Abb. 2. R i c k e t t s i e n , n a c h d e m e l e k t r o n e n o p t i s c h e n B i l d 3 g e z e i c h n e t .

Endoplasten (Abb. 2 c) kann auf elektronen-optische Einflüsse zurückgeführt werden oder durch Vitalprozesse hervorgerufen sein.

Von den kokkenförmigen Rickettsien kolloider Größenordnung abgesehen, schwanken die Zell-abmessungen des hier elektronenmikroskopisch betrachteten Fleckfieber-Virus zwischen den ein-zelnen Virus-Individuen. In der Längsachse wer-den Exoplastenlängen von 0,68 y. — 1,12 y. gemes-sen. Der bipolare Endoplast weist Längen von 0,52 jj. — 0,72 [i auf und die gekörnten Mikrosomen-flächen besitzen Längenwerte von 0,20 n — 0,24 yi.

Elektronenmikroskopisch sind organisierte Einzelteile des Viruskörpers nachweisbar. Durch bestimmte „Einzelteile" ist die Antigenwirkung zu erwarten. Alle anderen Virusteile sind genau so als Fremdstoffe für die Impfung anzusehen, wie die makroskopischen Eiweißreste des Dottersackes der Chorioallantois im Eier-Impfstoff.

Wenn bei der Injektion eines unreinen Impf-materials gelegentlich starke Reaktionen bei den

* A b b . 1 s. T a f e l , S. 196 a. 3 H . S i k o r a , Z . H y g . I n f e k t . - I v r a n k h . 124. 250

[1944]; H . E y e r u . H . R u s k a , Z . H y g . I n f e k t . -K r a n k h . 125, 483 [1944].

Impflingen auftreten, so kann man die Schuld dem großen Fremdstoffgehalt einschließlich der un-wirksamen Rickettsienteile zuschreiben. Die Rei-nigung der Impfstoffe durch Zentrifugieren führt nicht zu dem notwendigen Reinheitsgrad.

Zur Vermeidung einer Sensibilisierung ist die Herstellung reinster Impfstoffe wünschenswert.

3. N e u e W e g e z u r E r f a s s u n g v o n A n t i g e n e n

Die bisher beschrittenen Wege zur Herstellung der Antigene bei Impfstoffen beschränken sich auf eine Erfassung der Erreger in toter oder lebender Form (oft durch Tierpassagen oder anderswie in ihrer Virulenz abgeschwächt), die in Aufschwemmungen isotonischer Lösungen dem Impfling zugeführt werden.

Aus den Viruskörpern (z.B. Rickettsien) las-sen sich nun die Antigene für Impfstoffe isolie-ren. Die Wirksamkeit der Impfstoffe ist nicht an die Anwesenheit der unversehrten Rickettsienkör-per gebunden. Durch die Verfahren zur Herstel-lung der Klarimpfstoffe lassen sich die bisher in den Impfstoffen vorgelegenen Verunreinigungen völlig beseitigen und wirksame Exo- und Endo-Antigene sowie ihre Trümmer gewinnen. Aus-gehend von dem Fleckfieber-Impfstoff aus Dotter-säcken, kann ein Klarimpfstoff erhalten werden, der 1. einen höchsten Reinheitsgrad aufweist, 2. als Impfstoff hochwirksam ist und 3. für dia-gnostische Zwecke vielleicht neue Möglichkeiten erschließt. Die serodiagnostische Verwendung der Klarimpfstöffe muß noch erprobt werden.

Zur Erfassung der Antigene von Fleckfieber-Impfstoff führen drei Hauptwege, die ihrerseits die Antigene jeweils in Komponenten getrennt oder ungetrennt gewinnen lassen. Es können zwei Gruppen von Antigenen erfaßt werden, die bei einer aktiven Immunisierung nach den Ausfüh-rungen von S i e g e r t 4 zwei Immunitätsfaktoren auslösen, eine „antiinfektiöse" und eine „anti-toxische" Komponente, die sich unabhängig von-einander ausbilden und einen verschieden hohen Grad ihrer Wirksamkeit erreichen können.

Je nach dem beabsichtigten Endzweck dienen drei kolloidchemische Arbeitsgänge zur Trennung der Antigene von den Ballaststoffen im Fleckfieber-Impfstoff: 1. Die Ultradispergierung, 2. die frak-tionierte Ultrafiltration, 3. das Adsorptions-Dekan-

4 R. S i e g e r t , Z . H y g . I n f e k t . - K r a n k h . 127, 512 —520 [1947] ,

tieren. Diesem hat eine Ultradispergierung voran-zugehen. Die 3 Arbeitsgänge werden im folgenden erläutert.

4. D i e U l t r a d i s p e r g i e r u n g v o n V i r e n

Als Ultradispergierung wird eine Feinstzertei-lung von an sich schon kolloiden Teilchen be-zeichnet, die in den Größenbereich hochmoleku-larer Systeme führt.

Die Ultradispergierung erfolgt mit einem Dispergiermittel, das als Schleifmittel wirkt. Es hat eine Korngröße, die im Bereich der Größen-ordnung der Rickettsien liegt.

Ausgangsmaterial für die Antigen-Gewinnung des Fleckfiebers durch Ultradispergierung war der aus Dottersäcken gewonnene Eier-Impfstoff5. Wird der Eier-Impfstoff in einen Mörser ge-bracht und lange Zeit mit dem Pistill gestoßen oder zerrieben, so verändert er sich nicht. Gibt man aber ein dispergierendes Mittel hinzu, so werden die Viren angegriffen. Dabei werden die Exoplasten der Viruskörper gesprengt und die Endoplasten zertrümmert. Ihre frei gemachten Endo-Antigene gehen in Lösung.

5. D i e f r a k t i o n i e r t e U l t r a f i l t r a t i o n d e r A n t i g e n e

Es wurde sowohl unbehandelter als auch ultra-dispergierter Eier-Impfstoff der fraktionierten Ultrafiltration unterworfen.

A l s F i l t e r w u r d e n s e l b s t h e r g e s t e l l t e u n d a u c h t e c h n i s c h e U l t r a f e i n f i l t e r s o w i e U l t r a f e i n f i l t e r m i t E i n s c h w e m m s c h i c h t e n b e n u t z t . Z u r B e u r t e i l u n g d e r T e i l c h e n g r ö ß e n d e s F i l t r a t s u n d d e s R ü c k s t a n d e s s i n d d i e F i l t e r d a t e n z u B e g i n n u n d a m E n d e d e r U l t r a -f i l t r a t i o n v o n b e s o n d e r e r B e d e u t u n g . Ü b e r K o n z e n -t r a t i o n s ä n d e r u n g e n d e r W i r k s t o f f e d e s A u s g a n g s -i m p f s t o f f e s u n d d e s K l a r i m p f s t o f f e s i n f o l g e d e r S i eb -w i r k u n g b e i k o n t i n u i e r l i c h e r U l t r a f i l t r a t i o n s o l l s p ä -t e r b e r i c h t e t w e r d e n .

D i e F i l t r a t i o n s g e s c h w i n d i g k e i t v e r r i n g e r t s i c h s t a r k m i t d e r F i l t r a t i o n s z e i t u n d A u f g u ß m e n g e , d a d i e g r o ß e n B a l l a s t - E i w e i ß m e n g e n d e s E i e r - I m p f s t o f f e s m i t d e r Z e i t d i e F i l t e r p o r e n v e r s t o p f e n . A d s o r p t i o n s -w i r k u n g e n s c h e i n e n i m b e s o n d e r n * v o r z u l i e g e n , d a a u c h d a s R ü h r e n d e s A u f g u s s e s k e i n e Ä n d e r u n g e n d e r F i l t r a t i o n s z e i t b r i n g t . D i e g r o ß e n A d s o r p t i o n s w i r -k u n g e n b e i d e n f e i n e n P o r e n r a d i e n i m a n g e w a n d t e n F i l t e r b e r e i c h w e r d e n s c h o n v o n E 1 f o r d 6 b e s o n d e r s

5 D e r E i e r - I m p f s t o f f w u r d e z u e r s t v o m S ä c h s . S e r u m w e r k d u r c h H r n . D r . B u d d e u n d f ü r s y s t e -m a t i s c h e U n t e r s u c h u n g e n v o m S t a a t s i n s t . f . e x p . T h e -r a p i e , P r o f . D r . R . O t t o u n d D r . R . S i e g e r t , d a n -k e n s w e r t e r w e i s e z u r V e r f ü g u n g g e s t e l l t .

6 W . J . E l f o r d , J . P a t h o l . B a c t e r i o l o g y 34 [ 1 9 3 1 ] .

Filter-dicke

in cm

Hohl-raum-volu-

men W

in cm3

Mittl. Poren-radius

r s in'(ifi

Bezeichng.für Filter-dicke

in cm

Hohl-raum-volu-

men W

in cm3

Mittl. Poren-radius

r s in'(ifi

Rück-stand

R

Filtrat

F

1. V o r f i l t r a t i o n Papierfilter . . . 0,016 0,670 1700 RO F0

2. G r o b - S t u f e Ultrafeinfilter grob 0,015 0,816 34 RT

3. M i t t e l - S t u f e Ultrafeinfilter mittel 0,152 0,817 22 R, F x 2

4. F e i n - S t u f e Ultrafeinfilter fein 0,009 0,657 5 R 3 F x s

T a b . 1. F i l t r a t i o n s s c h e m a .

h e r v o r g e h o b e n . A u ß e r d e m s i n d S i e b w i r k u n g e n d e r F i l t e r u n d E i n s c h w e m m f i l t e r b e i d e n v o r l i e g e n d e n U l t r a f i l t r a t i o n e n b e t e i l i g t .

I m o b i g e n F i l t r a t i o n s s c h e m a ( T a b . 1) w e r d e n f ü r e i n e f r a k t i o n i e r t e U l t r a f i l t r a t i o n d ie F i l t e r d a t e n , ins-b e s o n d e r e d ie m i t t l e r e n P o r e n r a d i e n , a n g e g e b e n , d ie d e r I m p f s t o f f z u p a s s i e r e n h a t t e . D a s S c h e m a w u r d e j e n a c h V e r s u c h s l a g e a b g e w a n d e l t b e n u t z t o d e r v ö l l i g a b g e w a n d e l t b e i B e n u t z u n g v o n E i n s c h w e m m f i l t e r n .

M i k r o s k o p i s c h u n d u l t r a m i k r o s k o p i s c h l a s s e n s ich d i e F r a k t i o n e n au f a n w e s e n d e R i c k e t t s i e n ü b e r p r ü f e n .

Z u m T i e r v e r s u c h g e l a n g t e n s o w o h l d i e F i l t e r r ü c k -s t ä n d e R a l s a u c h d ie F i l t r a t e F . S ie w u r d e n q u a l i -t a t i v u n d q u a n t i t a t i v au f i h r e n G e h a l t a n A n t i g e n -K o m p o n e n t e n u n t e r s u c h t .

D i e z e i t r a u b e n d e u n d m ü h e v o l l e f r a k t i o n i e r t e U l t r a -filtration d u r c h v e r s c h i e d e n e F i l t e r s t u f e n k a n n d u r c h V e r w e n d u n g e i n e s e i n f a c h e n F i l t e r s o d e r e i n e s g r o -b e n U l t r a f e i n f i l t e r s m i t H i l f e e i n e r E i n s c h w e m m -s c h i c h t v e r e i n f a c h t w e r d e n . I m L a u f e d e s F i l t r a t i o n s -v o r g a n g e s f o r m i e r t s ich d i e s e E i n s c h w e m m s c h i c h t a u s B a l l a s t - E i w e i ß u n d Z u s a t z m a t e r i a l . D e r m i t t l e r e P o r e n r a d i u s d i e s e r S c h i c h t w i r d m i t f o r t s c h r e i t e n d e r F i l t r a t i o n s t e t i g k l e i n e r . E s k ö n n e n so z u v e r s c h i e d e -n e n F i l t r a t i o n s z e i t e n v e r s c h i e d e n e F r a k t i o n e n d e s A u f g u s s e s e r h a l t e n w e r d e n .

E i n e i n z i g e s E i n s c h w e m m f i l t e r k a n n f ü r e i n e be-s t i m m t e M e n g e I m p f s t o f f e r f a h r u n g s g e m ä ß b e n u t z t w e r d e n , o h n e d a ß d ie P o r e n g r ö ß e e i n e n u n t e r e n k r i -t i s c h e n W e r t e r r e i c h t , b e i d e m d ie w i r k s a m e n A n t i -g e n e d a s F i l t e r n i c h t m e h r p a s s i e r e n . D e r u n t e r e k r i -t i s c h e W e r t l i e g t noch o b e r h a l b d e r K o n g o r o t - D u r c h -l ä s s i g k e i t d e r F i l t e r . D a s d e u t e t d a r a u f h i n , d a ß e in-z e l n e E i w e i ß m o l e k ü l e d a s F i l t e r p a s s i e r e n , d i e A n t i -g e n e s o m i t P r o t e i n e s e in k ö n n e n . Mi t d e n n o r m a l e n a n a l y t i s c h e n c h e m i s c h e n M i t t e l n s i n d d i e s e P r o t e i n e b i s h e r m a k r o c h e m i s c h n i c h t n a c h w e i s b a r g e w e s e n .

D i e M e m b r a n d a t e n d e r E i n s c h w e m m f i l t e r s i n d den M e s s u n g e n n u r r e l a t i v z u g ä n g l i c h . E i n e i n m a l f o r -m i e r t e s F i l t e r , d a s e i n e g e w ü n s c h t e F i l t e r e i g e n s c h a f t

b e s i t z t , k a n n z u r V e r g l e i c h s m e s s u n g b e n u t z t w e r -den , d. h . e s k a n n m i t e i n e m U l t r a f e i n f i l t e r v e r g l i -c h e n w e r d e n , d a s e i n e ä h n l i c h e D u r c h l a u f z e i t , W a s s e r -d u r c h l ä s s i g k e i t ode r e i n e n ä h n l i c h e n m i t t l e r e n P o r e n -r a d i u s b e s i t z t w i e d a s E i n s c h w e m m f i l t e r . D i e s e s be-s t e h t a u s v e r s c h i e d e n e n i n h o m o g e n e n S c h i c h t e n . A u f d e m U l t r a f e i n f i l t e r l a g e r t e i n e f e i n e Sch ich t , d ie s ich a u s f e i n s t e n o r g a n i s c h e n u n d a n o r g a n i s c h e n Kol -l o i d e n z u s a m m e n s e t z t u n d n o c h in d e n P o r e n h o h l -r a u m d e s h o m o g e n e n U l t r a f e i n f i l t e r s h i n e i n r a g t . D i e s e f e i n e S c h i c h t i s t d i e e i g e n t l i c h w i r k s a m e F i l -t r a t i o n s s c h i c h t , d i e a l s F i l t e r s d e b w i r k t . I h r e an -n ä h e r n d e D i c k e w i r d a n s c h l i e ß e n d e r m i t t e l t . "Über d e r F e i n s c h i c h t l i e g e n S c h i c h t e n a u s g r ö b e r e n Kol -l o i d e n , d e r e n P o r e n g r ö ß e n f ü r den U l t r a f i l t r a t i o n s -v o r g a n g u n w i r k s a m s ind .

F ü r h i e r b e n u t z t e E i n s c h w e m m f i l t e r e r g a b e n s ich n a c h d e r U l t r a f i l t r a t i o n v o n .50 cm 3 E i e r - I m p f s t o f f E 1 S 1 f o l g e n d e M e m b r a n d a t e n :

1. M e ß f l ü s s i g k e i t : a q u a des t . m i t V i s k o s i t ä t -rj = 1,0046 • 1 0 - 5 c m - i s e c - i b e i 20 0 C.

2. G e m e s s e n e D i c k e des n a s s e n F i l t e r s : d g = 0,3866 cm. 3. N a ß g e w i c h t : Ga = 10,4458 g. 4. T r o c k e n g e w i c h t : G t = 3,7245 g. 5. Gn—Gt = 6,7213 g. 6. F i l t e r r a d i u s : r f = 1,965 cm. 7. F i l t e r f l ä c h e : F = 12,125 cm2 . 8. D a s E i n s c h w e m m f i l t e r v e r h ä l t s ich w i e e in homo-

g e n e s U l t r a f e i n f i l t e r m i t e i n e m m i t t l e r e n P o r e n -r a d i u s r 3 = 34 fi[x (s. w e i t e r u n t e n ! ) . E s i s t z u be-r ü c k s i c h t i g e n , d a ß d e r P o r e n r a d i u s m e h r f a c h g r ö ß e r s e i n m u ß a l s d i e filtrierten A n t i g e n - K o m -p o n e n t e n 7.

9. W a s s e r d u r c h l ä s s i g k e i t : D = 26,5 • 10—5 cm 3 / cm 2 • sec • g/cm2 .

D a s E i n s c h w e m m f i l t e r k a n n a l s U l t r a f e i n f i l t e r a u f -g e f a ß t w e r d e n , d e s s e n w i r k s a m e S i e b d i c k e a u s e i n e r q u a s i - h o m o g e n e n S c h i c h t b e s t e h t m i t e i n e r D i c k e d, d i e s ich a u s v o r s t e h e n d e n W e r t e n n a c h f o l g e n d e m A n s a t z a n g e n ä h e r t b e r e c h n e n l ä ß t 8 :

r3 = /24 D d v I W ,

w o r3 = m i t t l e r e r P o r e n r a d i u s in cm b e i u n o r i e n t i e r -t e r P o r e n s t r u k t u r , D = W a s s e r d u r c h l ä s s i g k e i t in cm 3 / cm 2 • s ec • g / c m 2 , TJ — H 2 0 - V i s k o s i t ä t in g • cm—1

• sec—1 b e i 20° C b e d e u t e n . U n b e k a n n t s i n d : d = M e m b r a n d i c k e = W i r k d i c k e

d e r S i e b s c h i c h t d e s E i n s c h w e m m f i l t e r s u n d W = H o h l -r a u m v o l u m e n .

E s i s t r 32 = 24 D D 7] / W; Wr3

2 = 24 D d TJ . D a s H o h l r a u m v o l u m e n i s t 9

7 H . B e c h h o l d , Z. H y g . I n f e k t . - K r a n k h . 112, 413 [1931]; K o l l o i d - Z . 55, 197 [1931].

8 E . M a n e g o 1 d u . K . K a 1 a u c h , K o l l o i d - Z . 86, 96 [1939].

9 N. B j e r r u m u . E . M a n e g o 1 d , K o l l o i d - Z . 42, 103 [1927].

N a c h E i n s e t z e n v o n W f o l g t :

g gr

V r f ' r , ' = 24 ( « „ _ < ? , ) > • , « = 24 Dd>Fv\

' 24 D

W e r d e n d ie g e m e s s e n e n W e r t e e i n g e s e t z t , so e r g i b t s i c h f ü r d a s E i n s c h w e m m f i l t e r d ie D i c k e d d e r w i r k -s a m e n S i e b s c h i c h t m i t e i n e m P o r e n r a d i u s v o n 34 nn z u

d -100,1 [i = 100,1 • 1 0 - 4 cm.

A u s e i n e m V e r g l e i c h z u r g e m e s s e n e n D i c k e dg d e s E i n s c h w e m m f i l t e r s g e h t h e r v o r , d a ß n u r e i n e f e i n e S c h i c h t d e s E i n s c h w e m m f i l t e r s f ü r d i e U l t r a f i l t r a t i o n v e r a n t w o r t l i c h i s t . S i e b e s t e h t a u s e i n e r l e i c h t de-f o r m i e r b a r e n S c h i c h t v o n G e w e b s e i w e i ß d e r I m p f -s t o f f l ö s u n g .

M a x i m a l e P o r e n r a d i e n l a s s e n s i ch b e i E i n s c h w e m m -filtern n i c h t e i n w a n d f r e i b e s t i m m e n , d a d i e f e i n e F i l t e r s c h i c h t z u l e i c h t z e r s t ö r t w i r d . D a s H o h l r a u m -v o l u m e n d e r w i r k s a m e n S i e b s c h i c h t i s t n i c h t be-s t i m m b a r , d a i h r e N a ß - u n d T r o c k e n g e w i c h t e n i c h t m e ß b a r s ind .

D a s H o h l r a u m v o l u m e n des g a n z e n E i n s c h w e m m -f i l t e r s i s t n a c h d e r n o r m a l e n F o r m e l n i c h t e x a k t def i -n i e r t , d a d a s F i l t e r i n h o m o g e n is t . D e r W e r t f ü r d i e D i c k e d e r S i e b s c h i c h t i s t d e s h a l b n u r e i n N ä h e r u n g s -w e r t , d e r d i e u n g e f ä h r e G r ö ß e n o r d n u n g a n g i b t .

Der Vergleichswert, der den Porenradius r 3 = 34 [Iii liefert, hat für die Beurteilung der fil-trierten Impfstoff-Komponenten dieselbe Bedeu-tung wie der Meßwert der Porenradien der Ultra-filter. Aus der fraktionierten Ultrafiltration und der Ultrafiltration mit Einschwemmfilter folgt, daß den wirksamen Antigenen mehrere Teilchen-größen zuzuordnen sind:

1. Antigen-Komponenten AJ, die die antiinfek-tiöse Immunität des Fleckfiebers auslösen: Sie passieren Porenradien bis 34 Über die Pas-sage kleinerer Porenradien zwischen 34 und 5 PLJJL kann erst später berichtet werden. Poren-radien r 3 = 5 m». halten die Antigen-Komponenten A J zurück. Die Antigen-Komponenten AJ sind unempfindlich gegen Adsorption durch organische und anorganische Ultrafeinfilter.

2. Antigen-Komponenten AT, die die anti-toxische Immunität des Fleckfiebers auslösen: Sie werden durch Porenradien r 3 = 34 zu-rückgehalten. Die Antigen-Komponenten AT sind sehr empfindlich und werden leicht durch orga-nische Ultrafeinfilter, aber wenig durch anorga-nische Kolloide adsorbiert. Sie können in Klar-impfstoffen durch „Adsorptions-Dekantieren" er-halten werden.

Allgemein kann schon jetzt gesagt werden, daß die Antigen-Komponenten A J eine Größe haben, die kleiner ist als die der Bakteriophagen und größer als die des Oxyhämoglobins. Die Größen-ordnung der Antigen-Komponenten AT scheint zunächst im Bereich de? Bakteriophagengröße zu liegen, da die Ultrafeinfilter mit Porenradien r 3 = 34 {jl̂ l nicht passiert werden. Es besteht je-doch auch die Möglichkeit, daß die Antigen-Kom-ponenten AT infolge ihrer geringen Größe, die im Bereich der Enzym-Größen 4—10 npi liegen kann, äußerst leicht bei Ultrafiltrationsprozessen adsorbiert werden.

Die folgende Tab. 2 gibt eine Übersicht der hier interessierenden Größenklassen:

Pap ie r f i l t e r -Poren rad ius 6000 — 50 (xfi M e m b r a n f i l t e r - P o r e n r a d i u s 3000 — 20 „ U l t r a fe in f i l t e r -Poren rad ius 100 — 1 „ E i n s c h w e m m f i l t e r - P o r e n r a d i u s . . . . 1 0 0 — 0,1 „ Rickettsia prowazeki s t a b f ö r m i g . . . 1120 — 680 „ Rickettsia prowazeki k o k k e n f ö r m i g . . 680 — 200 „ Bact. prodigiosum > 750 „ B a k t e r i o p h a g e n > 65 „ A n t i g e n - K o m p o n e n t e n A J des F leck-

f i ebe r s < 34 > 5 „ Oxyhämog lob in ( P f e r d ) > 10 „ A n t i g e n - K o m p o n e n t e n A T des F leck-

f i ebers ? E n z y m e 4 — 10 „

T a b . 2. Ü b e r s i c h t d e r G r ö ß e n k l a s s e n .

Die Wirksamkeit der Antigen-Komponenten der Fleckfieber-Impfstoffe wurde durch S i e g e r t 4 er-probt ; die Ergebnisse sind z. Tl. veröffentlicht. Die Antigen-Komponente A J des Fleckfieber-Impfstof-fes wurde in Infektionsversuchen nach voran-gegangener Immunisierung an Meerschweinchen, die Antigen-Komponente AT mit dem H e n d e r -s o n - Test10, einer Toxin-Antitoxin-Neutralisation, an weißen Mäusen geprüft.

Die Antigen-Komponenten AT, die bisher mit-tels der Ultrafiltrationen für Klarimpfstoffe nicht faßbar sind, lassen sich trotzdem im Klarimpf-stoff anreichern, der durch „Adsorptions-Dekan-tieren" mit vorausgegangener Ultradispergierung gewonnen wird.

6. D a s A d s o r p t i o n s - D e k a n t i e r e n

Aus den Darstellungsweisen zur Reingewin-nung von Vitaminen, Enzymen, Fermenten und

10 R. H e n d w s o n , N a t . I n s t . H e a l t h , B u l l . 33, 183 [1945].

kolloiden Eiweißkomplexen sind die Adsorptions-verfahren an festen Adsorbentien bekannt (chro-matographische Analyse). Dabei werden die Nutz-stoffe durch Adsorption angereichert und die Ballaststoffe abgeschieden.

Als „Adsorptions-Dekantieren" wird ein umge-kehrtes Verfahren bezeichnet, bei dem Ballast-stoffe, durch feinste kolloide Schwebstoffe ad-sorbiert, sich absetzen und die Nutzstoffe sich durch Dekantieren der überstehenden Lösung ge-winnen lassen. Die kolloiden Schwebstoffe müssen nur im Ausgangssol durch Ultradispergierung er-zeugt oder eingebracht werden und aus einem Material relativ hoher Dichte bestehen.

Als Ausgangsstoff diente der Eier-Impfstoff E 131. Er wurde 24 Stdn. unter Zusatz von Disper-giermittel ultradispergiert. Es bildete sich ein kol-loider adsorbierender Schwebstoff, der im Laufe einiger Tage sedimentierte und die Ballaststoffe aus dem Sol entfernte.

Über dem Sediment steht der Klarimpfstoff, der die gewünschten Antigen-Komponenten A J und AT enthält, ohne daß die fraktionierte Ultra-filtration zur Anwendung kommt. Wenn der Her-stellungsgang so geleitet wird, daß Ausgangs-menge und Endmenge gleich sind, so erhält man Klarimpfstoffe, die ausreichend antiinfektiös sind und antitoxische Eigenschaften bei der Immunisie-rung auslösen. Es lassen sich auch Anreicherun-gen, Konzentrate, gewinnen, über die später be-richtet wird.

7. D i e n e u e n K l a r i m p f s t o f f e

S i e g e r t 4 hat dargelegt, daß die Fleckfieber-immunität nach aktiver Immunisierung sowohl aus einer „antiinfektiösen" als auch einer „antitoxi-schen" Komponente besteht. Beide Schutzreaktio-nen können sich je nach der antigenen Zusammen-setzung des Impfstoffes unabhängig voneinander und in verschiedener Stärke ausbilden. Die Fleck-fieberimmunität beruht im wesentlichen auf dem Gehalt des Organismus an „antiinfektiösen" Anti-körpern, die gegen den Erreger selbst gerichtet sind und damit das Angehen einer Infektion ver-hüten. Die „antitoxischen" Schutzstoffe dagegen werden erst nach etwaiger Durchbrechung des „antiinfektiösen" Impfschutzes wirksam, wenn der Erreger sich im Organismus vermehrt und Toxine bildet. Die dann ermöglichte Giftneutralisation führt zu einer Abschwächung der Krankheits-erscheinungen. Hieraus ergibt sich die Forde-

rung, daß jeder Impfstoff beide Antigenkomponen-' ten in optimaler Menge enthalten soll. Die Prüfung dieser Komponenten erfolgt im „Infektionsver-such" an immunisierten Meerschweinchen und im „Neutralisationstest" nach Henderson, wobei die neutralisierende Wirkung von Meerschweinchen-Immunseren gegenüber einer ganz bestimmten Giftmenge einer Rickettsienemulsion an weißen Mäusen ausgewertet wird11.

Unter diesen Gesichtspunkten wurden die Klar-impfstoffe auf ihre antigene Wirkung geprüft. Sie wiesen, wie in Tab. 3 zusammenfassend darge-stellt ist, verschiedene Immunisierungsergebnisse auf, je nach ihrer Herstellungsweise. Alle durch fraktionierte Ultrafiltration aus gelblich dickflüs-sigen Dottersackimpfstoffen gewonnenen Klar-impfstoffe erzielten eine gleich wirksame „anti-infektiöse" Immunität bei Meerschweinchen wie die Ausgangsimpfstoffe, während sich — im Gegen-satz zu dem unbehandelten Ausgangsmaterial — keine „antitoxische" Schutzkraft entwickelte. Wäh-rend also im Klarimpfstoff die eine wirksame „antiinfektiöse" Immunität auslösende Antigen-Komponente A J erhalten blieb, war die die „anti-toxische" Immunität bewirkende Antigen-Kompo-nente AT durch den Filtrationsprozeß verloren-gegangen. Somit erfüllte der auf diese Weise er-zielte Klarimpfstoff nicht die an ihn zu stellenden Anforderungen. Dagegen gelang es, durch Ad-sorptions-Dekantieren einen Klarimpfstoff herzu-stellen, der beide gewünschten Antigen-Komponen-ten in ähnlicher Stärke aufwies wie das Aus-gangsmaterial. Er ist in Tab. 3 als Klarimpfstoff L 106 D 1 bezeichnet.

In der folgenden Tab. 3 sind aus einer großen Versuchsreihe zur Herstellung von Klarimpfstof-fen vier derselben angeführt. Die Tabelle läßt die angewandten Arbeitsgänge und die Eigenschaf-ten der Klarimpfstoffe erkennen.

Bei allen Impfstoffen liegt eine Komponente A J vor, die die antiinfektiöse Komponente bei der Immunisierung auslöst. Danach ist die Kompo-nente A J sehr stabil gegenüber mechanischen Be-anspruchungen bei der Ultradispergierung, sie wird weder bei der Ultrafiltration noch beim Ad-sorptions-Dekantieren adsorbiert. Weiter ist sie bis 600 C hitzebeständig und gegenüber Phenol resistent.

Die Komponente AT, die die antitoxische Kom-11 R . 0 1 1 o u . R . S i e g e r t , A r b . S t a a t s i n s t . e x p .

T h e r a p . G e o r g - S p e y e r - H a u s , F r a n k f u r t a . M . 1947.

Klarimpfstof fe: Ausgangs-Impfs to f f : E 131

L 7 9 / 8 0 L 8 4 / 8 6 L 85 L 106 D1 L 106 R 0

(Sed.)

Ultradispergiert (Zeit in Stdn.) • . Ultrafiltriert Adsorptions-dekantiert Hitzesteril is iert bei 60° C . . . . AJ-Komponente -aus lösend + . . . AT-Komponente-aus lösend - f 1 AT-Komponente-nicht-aus lösend 0 ) Anti toxint i ter n. H e n d e r s o n . .

24 ja

nein 3 X 1 Stde.

+

0

24 ja

nein 0

+ +

0

0 ja

nein 0 +

0

24 nein ja 0 + +

1 : 16

24 nein ja 0 +

+ 1 : 2

T a b . 3. H e r s t e l l u n g u n d W i r k u n g e i n i g e r n e u e r K l a r i m p f s t o f f e . D i e s e w u r d e n m i t 0 , 5% P h e n o l v e r s e t z t .

ponente bei der Immunisierung auslöst, kommt nur in Klarimpfstoffen vor, die nach dem Verfahren des Adsorptions-Dekantierens hergestellt sind. Die Komponente AT ist unempfindlich gegenüber der Ultradispergierung. Sie ist sehr empfindlich gegen-über Ultrafiltrationen, bei denen sie organischen Adsorbentien ausgesetzt ist. Dagegen verhält sie sich neutral gegenüber den anorganischen Ad-sorbentien, die beim Adsorptions-Dekantieren zur Anwendung kommen. Diese Tatsache wird unter-strichen durch einen negativen Ausfall des Hen-derson-Testes ab Antitoxintiter > 1 : 2 , der mit dem Sediment L 106 R0 des Adsorptions-Dekantierens gewonnen wird. Nach früheren Versuchen ist die Komponente AT wärmeempfindlich und wird nach Messungen von Siegert schon bei Temperaturen von > 48° C zerstört. Die Komponente AT ist phenol-resistent.

Über die Natur der Komponenten kann bisher gesagt werden, daß es sich um Proteine verschie-dener Größen handelt, die im Abschnitt über die Ultrafiltration der Antigene gekennzeichnet sind.

Die neuen Klarimpfstoffe haben ein wasserkla-res Aussehen. Im Tyndall-Kegel ist eine äußerst schwache Lichtstreuung wahrnehmbar. Eine 10-proz. wäßrige Sulfosalicylsäurelösung gibt eine nur im Tyndall-Kegel sichtbare schwache Trü-bung, die auf einen bestimmten Gehalt an Pro-teinen hinweist. Über das kolloidchemische Ver-halten und die physikalisch-chemische Natur der Klarimpfstoffe soll später berichtet werden. Die Haltbarkeit der Klarimpfstoffe ist hinreichend er-wieseri. Sie sind im Gegensatz zu den normalen Eier-Impfstoffen des Fleckfiebers kaum tempera-» tur- und kälteempfindlich. Sie eignen sich zum Ge-brauch in allen Klimaten, ohne daß besondere Lagerbedingungen eingehalten werden müssen.

Nach einer Lagerzeit von 1 Jahr bei den jahres-zeitlichen Schwankungen in einem ungeheizten Raum waren sie voll wirksam. Die Zukunft wird erweisen, ob Klarimpfstoffe ohne die leicht zer-setzlichen Ballasteiweiße und Fremdstoffe norma-ler Fleckfieber-Impfstoffe noch an ein bestimm-tes Verwendbarkeitsdatum gebunden sind. Die Verimpfung der Klarimpfstoffe beim Menschen * soll in den üblichen Dosen von 0,5, 0,5 und 1,0 cm3

erfolgen. Über die Dosierung beim Impfen mit Konzentraten erfolgt besondere Mitteilung.

Die Erfahrung beim Impfen am Menschen wird lehren, inwieweit durch die Verwendung des Klar-impfstoffes eine bisherige, auf Fremdstoffen be-ruhende Belastung des Körpers vermieden wird. Außer der Vermeidung sensibilisierender Eigen-schaften hat ein Klarimpfstoff auf den Impfling keine abstoßende, ekelerregende Wirkung wie ein gelblich-dickflüssiger Eier-Impfstoff. Weiterhin darf man annehmen, daß der Klarimpfstoff eine Anaphylaxie vermeidet, deren Fehlen für weitere Impfungen von Bedeutung ist.

D i e s e A r b e i t w u r d e 1944 b e g o n n e n i m e h e m a l i g e n K o l l o i d c h e m i s c h e n I n s t i t u t d e r T e c h n . H o c h s c h u l e D r e s d e n , in Z u s a m m e n a r b e i t m i t d e m e h e m a l i g e n H y g i e n i s c h e n I n s t i t u t D r e s d e n . N a c h d e m B r a n d e v o n D r e s d e n w u r d e n d i e A r b e i t e n im Med . -B io l . L a b o r a t o -r i u m P o p p e n h a u s e n a . d. W a s s e r k u p p e b e e n d e t , in Z u s a m m e n a r b e i t m i t d e m P a u l - E h r l i c h - I n s t i t u t u n d G e o r g - S p e y e r - H a u s z u F r a n k f u r t a . M., w o d i e i m m u n -b i o l o g i s c h e A u s w e r t u n g d e r I m p f s t o f f e v o n H r n . D r . R . S i e g e r t i n d a n k e n s w e r t e r W e i s e d u r c h g e f ü h r t w u r d e .

H r n . G e h . M e d . - R a t P r o f . R . O t t o s e i f ü r d i e i m m u n -b i o l o g i s c h e M i t a r b e i t , H r n . P r o f . E . M a n e g o l d f ü r d i e k o l l o i d c h e m i s c h e n A n r e g u n g e n b e s t e n s g e d a n k t .

F ü r d i e s o r g f ä l t i g e D u r c h f ü h r u n g d e r l a n g w i e r i g e n V e r s u c h s r e i h e n d a n k e i ch m e i n e r m e d . - t e c h n . A s s i s t e n -t i n , F r l . G u n d e l B a r k h a u s e n .