ZusammenfassungZunehmende Spezialisierung und im�mer aufwendigere Technologien inder Genomforschung machen es vorallem akademischen Labors immerschwieriger, alle für ihre Forschungnotwendigen Technologien vor Ortvorzuhalten. Das ursprünglich im Rah�men des Deutschen Humangenom�projekts mit Mitteln des BMBF eta�blierte RZPD Deutsches Ressourcen�zentrum für Genomforschung ermög�licht durch eine zentralisierte Bereit�stellung von Referenzmaterialien undServiceleistungen allen Molegeneti�kern und Genomforschern den Zugriffauf für sie essentielle Technologien.

EinleitungMit der Aufklärung der Struktur derErbsubstanz DNA durch Watson undCrick im Jahre 1953 wurden Medizinund Biologie revolutioniert. Dies stell�te den Startpunkt zur Entwicklungmolekularbiologischer Methoden dar,die auf der Manipulation der DNA be�ruhen. Bis Ende der 70er Jahre warder Einsatz DNA�modifizierender En�zyme (z.B. Restriktionsenzyme, Kina�sen, Ligasen) auf wenige Labors be�grenzt, die das Know�how besaßen,entsprechende Enzyme zu isolieren.Obwohl nur eine geringe Anzahl vonGruppen am Studium dieser Enzymeselbst interessiert waren, wurden siedoch bald von allen molekularbiolo�gisch arbeitenden Instituten als zen�trale Werkzeuge eingesetzt und dien�ten dazu, andere Untersuchungen, u.a. in der Humangenetik, zu ermög�lichen (genetische Kartierung, Gen�klonierung, molekulare Diagnostik

etc.). Erst mit der generellen Verfüg�barkeit dieser Enzyme konnte die Mo�lekularbiologie Ihren einzigartigenAufschwung nehmen, denn dadurchwaren die enzymatischen Werkzeugenicht länger der limitierende Faktor fürdiese Forschungsrichtung.

Parallel wurde eine wachsende Zahlvon Labortechniken als zentrale Ser�viceleistungen im kommerziellen undnicht�kommerziellen Bereich etabliert.Oligonukleotide wurden zunächst inden jeweiligen Instituten hergestellt,sind jedoch mittlerweile als käuflicheLaborreagenzien in den verschieden�sten Modifikationen erhältlich. Die Se�quenzierung von DNA gehörte nochEnde der Neunziger Jahre in nahezujedem molekularbiologischen Laborzur Basistechnologie, wobei Fluores�zenstechnologien die traditionelle ra�dioaktive Sequenzierung ersetzten.Die vollautomatisierte Fluoreszenzse�quenzierung hat einen enormen Durch�satz erzielt, der es erlaubte, das kom�plette menschliche Genom zu ent�schlüsseln. Aus ökonomischen Grün�den werden heute Sequenziervorha�ben aller Größenordnungen, vom ein�fachen Ansequenzieren von Plasmi�den über die Sequenzierung großerBAC�Klone bis hin zur Entschlüsse�lung vollständiger Genome, bei kom�merziellen Firmen bzw. akademischeSequenzierzentren (z.B. Sanger Cen�tre, Cambridge, UK) durchgeführt.Auch mit der Erstellung von Expres�sionsprofilen werden neuerdings Ser�viceleistungen verfügbar, die bishernur für wenige Institute einsetzbarwaren.

Diese Beispiele zeigen, wie ehemali�ge Kerntechnologien in zunehmen�dem Maße als externe Serviceleistun�gen genutzt werden und sich die For�schungsgruppen so auf die Verfol�gung ihrer eigentlichen biomedizini�schen Forschungsziele konzentrierenkönnen. Im Rahmen des Genompro�jekts wurden vielfältige neuartigeRessourcen hergestellt und verifiziert,die nun der Allgemeinheit zur Verfü�gung gestellt werden müssen, um de�ren Anwendungsmöglichkeiten vollausschöpfen zu können.

Daher wurde das RZPD (Ressourcen�zentrum/Primärdatenbank) bereits1995 als zentrale Infrastruktur im Deut�schen Humangenomprojekt (DHGP)gegründet. Es war zunächst angesie�delt am Max�Planck�Institut für mole�kulare Genetik, Berlin, und am Deut�schen Krebsforschungszentrum, Hei�delberg, und ist seit dem Jahr 2000als „RZPD Deutsches Ressourcen�zentrum für Genomforschung“ eineeigenständige gemeinnützige Einrich�tung. Seine originäre Aufgabe bestehtnach wie vor darin, Forschungsgrup�pen mit standardisierten biologischenReferenzmaterialien von gleichblei�bend hoher Qualität zu versorgen, so�mit den technischen Fortschritt derProjekte zu katalysieren und zu einermöglichst effizienten Nutzung der ver�fügbaren Ressourcen für die Genom�forschung beizutragen. Gleichzeitigwerden die mit diesen Materialien ge�nerierten experimentellen Daten in ei�ner Primärdatenbank zusammenge�führt und miteinander verknüpft, umsie wiederum der Wissenschaftsge�meinschaft zur Verfügung zu stellen.

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Zentrale Ressourcen und Serviceleistungen für die Molekulargenetik

Bernhard Korn, Johannes Maurer

RZPD Deutsches Ressourcenzentrumfür Genomforschung GmbH, Berlinund Heidelberg

Das Angebot des RZPD wird weltweitvon über 8.000 Nutzern in Anspruchgenommen.

Verfügbare Materialien am RZPDBei der Etablierung von Forschungs�projekten, die komplette Genomeuntersuchen und dazu kloniertes Ma�terial in Anspruch nehmen, ist die Be�reitstellung dieses klonierten Materi�als zu einem essentiellen Faktor fürden schnellen und reibungsarmenFortgang der Projekte geworden.Aber auch Forschungsaktivitäten, dieeinzelne Gene und deren Proteine imDetail charakterisieren, benötigenentsprechende rekombinante Kloneals Ausgangsmaterial.

Da die Herstellung der entsprechen�den Materialien sowohl kosten� alsauch zeitintensiv ist, werden dieseKlone vom RZPD zentral auf nicht�kommerzieller Basis zur Verfügunggestellt. Dies beschleunigt zum einendie Forschungsaktivität, da die ent�sprechenden Grundlagenmaterialiennicht redundant in vielen Laborsgleichzeitig bzw. mehrmals hergestelltwerden müssen, zum anderen könnenQualität und Quantität dieser Materi�alien durch den Einsatz von in derProduktion und Qualitätsmanagementerfahrenem Personal erheblich ver�bessert werden. Strenges und ko�stenintensives Qualitätsmanagement,wie bspw. die Sequenzverifizierungvon Klonsets, ist nur möglich, da diezentral bereitgestellten Materialienvielen Nutzern zugute kommen.

Die Materialien werden zu gleichenBedingungen, ohne Einschränkungen

für Publikationen und Patentanmel�dungen, allen akademischen undkommerziellen Gruppen zur Verfü�gung gestellt. Daher ist es möglich, inVeröffentlichungen darauf Bezug zunehmen und die Verteilung entspre�chender Produkte dem RZPD zuüberlassen. Diese Art der zentralenMaterialverteilung wird gegenwärtig inden USA als sehr wünschenswert ein�geschätzt und soll über die entspre�chenden forschungsfördernden Insti�tutionen unterstützt werden (siehedazu „Data Hoarding Blocks Progressin Genetics“. Science 2002, 295,599).

Genomische und cDNA!Bibliothe!ken, Klondistribution: Das RZPD be�sitzt eine der größten Klonsammlun�gen weltweit, die durch eine klonbe�zogene Primärdatenbank ergänztwird. Derzeit lagern in über einhun�dert –80°C�Gefrierschränken mehr als400 genomische und cDNA�Bibliothe�ken, zusammengenommen über 35Mio. Klone von 32 verschiedenenSpezies, insbesondere des Menschenund relevanter Modellorganismen.Diese Bibliotheken bilden die Basisfür das Produkt� und Serviceangebotdes RZPD. Als eines von weltweit fünfautorisierten Verteilungszentren bie�tet das RZPD zudem Zugriff auf diegesamte I.M.A.G.E.�Klonkollektion.Neben sehr gut charakterisierten Bi�bliotheken, die in den großen interna�tionalen Genomforschungsprojektengenutzt werden, bietet das RZPD eineeigene Kollektion von über 160 gewe�bespezifischen, vorwiegend humanerund muriner cDNA�Bibliotheken.

Jährlich werden vom RZPD weltweitca. 60.000 Klone verteilt.

Hochdichte!Arrays: Zur Herstellungvon jährlich über 5.000 Hochdichte�Arrays wird die am RZPD etablierteausgefeilte Robotertechnologie einge�setzt. Die meisten Bibliotheken oderKlonkollektionen werden in Abhängig�keit vom aufzubringenden Materialentweder auf Nylon� oder PVDF�Membranen (22cm x 22cm) angebo�ten. Dabei werden 27.648 individuelleKlone jeweils doppelt „gespottet“. DieMembranen sind sowohl für Chemil�umineszens als auch für radioaktiveDetektionsmethoden geeignet undkönnen je nach Experiment bis zuzehn mal wieder verwendet werden.Verfügbar sind Koloniemembranen fürkonventionelle Hybridisierungsexpe�rimente, Proteinmembranen für Anti�körperscreening (gegenwärtig nureine Bibliothek aus humanem fötalenHirn verfügbar, das Angebot wird je�doch ausgebaut) sowie DNA�Mem�branen von sog. Unigene�Sets für dasExpression Profiling (s.u.). Als Micro�arrays werden zur Zeit kleine Klonkol�lektionen wie bspw. Indication Arrays(s.u.) oder individuell angefertigte Ar�rays angeboten.

Unigene!Sets: Die Vielzahl der vorlie�genden EST�Klone führt zwangsläufigauch zu einer hohen Redundanz. Op�timal sind daher Klonkollektionen, beidenen jeweils ein Klon exakt einemGen bzw. einem aus der vorliegendenEST�Sequenzinformation bioinforma�tisch zusammengefassten Clusterentspricht. Das RZPD verfügt übersogenannte Unigene�Sets von

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Abb 1 Klonlagerung am RZPDÜber 35.000.000 Klone werden in ca. 120 Gefrierschränken bei –80°C verwaltet. Um das schnelle und eindeutigeAuffinden eines Klons aus der umfangreichen RZPD�Sammlung zu gewährleisten, wird ein Barcode�gestütztes Lo�gistik�System eingesetzt, in das jede einzelnen Verpackungseinheit und jede einzelnen Mikrotiterplatte einbezogenist. Jeder Klon besitzt zudem einen eindeutigen RZPD�Klonnamen.

Mensch, Maus und Ratte. Zur Her�stellung solcher Sets wird aus jedemCluster ein einzelner repräsentativerKlon ausgewählt. Diese Unigene�Setswurden teilweise in Kollaboration mitdem DKFZ, NCBI und Max�Planck�In�stitut für molekulare Genetik erstellt(Mensch, Maus) oder importiert (Rat�te). Durch Sequenzverifizierung derausgewählten Klone (beim humanenSet abgeschlossen, bei der Mausgegenwärtig in Arbeit) wird die Qua�lität dieser Sets weiter erhöht.

Indication Arrays: Das RZPD erstelltin enger Kollaboration mit medizini�schen Fachleuten Sets von Klonen,die Relevanz für bestimmte Krank�heitskomplexe haben, sogenannte„Indication�Arrays“. Durch die Reprä�sentation von nur 400 bis 1 500 Ge�nen, die in der Ausprägung bestimm�ter medizinischer Formenkreise betei�ligt sein können, sowie durch um�fangreiche, zusätzliche Hintergrund�informationen zu den Genen (OMIM:www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/, Swis�sprot: www.ebi.ac.uk/swissprot/, GeneOntology: www.geneontology.org) wirddie Expressionsanalyse dieser Arraysdeutlich vereinfacht. Onco� und Im�muno�Arrays sind bereits verfügbar,Neuro�, Herz�Kreislauf� und andereArrays sind in Vorbereitung.

Genomische und cDNA!Pools:Pools stellen eine attraktive Alternati�ve zu Hochdichte�Arrays dar. Ein ein�faches und effizientes Pooling�Sche�ma erlaubt das Screening vollständi�ger genomischer und cDNA�Biblio�theken via PCR durch eine bequemeProzedur in zwei Schritten. „PrimaryPools“ bestehen aus gereinigter DNAder Vektorkonstrukte aller Klone vonacht 384er Mikrotiterplatten einer ge�nomischen oder cDNA�Bibliothek.Sobald man mit entsprechendenPCR�Primern ein positives Signal ineinem „Primary Pool“ erhalten hat,kann der entsprechende „SecondaryPool“ geordert werden, der aus denindividuell gepoolten Mikrotiterplatteneines „Primary Pools“ sowie aus ge�poolten Spalten und Zeilen aller achtMikrotiterplatten eines „PrimaryPools“ besteht. Dies erlaubt die ein�deutige Identifizierung eines indivi�duellen Klons. Allein im Jahr 2001

wurden über 26.000 Pools beimRZPD geordert.

RZPD!ServiceleistungenViele moderne Technologien der Mo�lekularbiologie erfordern einen hohenapparativen und technologischenAufwand, den kleinere Arbeitsgrup�pen oftmals nicht aufbauen können.Auch die geforderte Interdisziplinaritätvon Genetik, Biomedizin, Biologie,Chemie, Informatik und Ingenieur�technik kann nur in entsprechendgroßen Zentren aufgebaut und lang�fristig unterhalten werden. DiesesProblem wird durch die zentrale Be�reitstellung von Serviceleistungendurch das RZPD gelöst.

Screening!Service: Hierbei werdendie beim RZPD verfügbaren Hoch�dichte�Arrays mit Sonden gescreentund das Ergebnis dem Auftraggebermitgeteilt. Anschließend können dieentsprechenden Klone beim RZPDgeordert werden. Dieser Service rich�tet sich v.a. an kleine Labors, die die�se Technik nur gelegentlich nutzenoder selbst nicht die entsprechendenInfrastrukturvoraussetzungen haben.

Expression Profiling Service: Insbe�sondere auf dem Gebiet der Erstel�lung von Expressionsprofilen, einerTechnologie, die z.Z. in vielen Frage�stellungen eine immer wichtigere Rol�le spielt, ist ein zentraler Service wün�schenswert. Expressionsprofile defi�nieren im Allgemeinen die „genes ofinterest“, d.h. aus dem Pool allerGene eines Genoms werden eine An�zahl von Genen (typischerweise 50bis 2.000) identifiziert, die für weiter�gehende Experimente interessant er�scheinen, es erfolgt also eine Priori�sierung. Damit ist die Erstellung vonExpressionsprofilen oft ein erster An�satz in einer komplexen Fragestel�lung. Nachdem die Expressionsprofi�le erstellt sind wird diese Technologieallerdings oft nicht mehr benötigt,bzw. nur noch zur statistischen Absi�cherung der Ergebnisse herangezo�

gen. Da die Kosten für den Aufbauund mittelfristigen Betrieb dieserTechnologie, unabhängig von Typ derverwendeten Plattform, immer deut�lich über 500.000 € liegen, erscheintes oft nicht ratsam, Expression Profi�ling als Methode zu etablieren, son�dern schneller und effizienter, auf eineServicestation zurückzugreifen, diediese Technologie bereits etabliert hatund sie sofort für die unterschiedlich�sten Fragestellungen einsetzen kann.Die aus PCR�amplifizierter DNA her�gestellten Unigene Hochdichte�Arrayswerden von der Heidelberger RZPD�Servicegruppe als Sonde für die Ana�lyse von Genexpressionsstärke in Ab�hängigkeit von Gewebe, Entwick�lungsstadium, Medikamentengabeetc. eingesetzt. Alle Klone, die aufdiese Art identifiziert werden, sind amRZPD als Einzelklone verfügbar oderkönnen durch RZPD Re�arraying�Ro�boter zu Subsets des Unigene�Setszusammengestellt werden.

Affymetrix!Service!Provider: Alter�nativ bietet das RZPD einen auf demAffymetrix�System basierenden Ex�pression Profiling Service an. DasRZPD besitzt als eines von weltweitnur sechs Zentren den Status einesAffymetrix Service Providers, d.h. esist von Affymetrix autorisiert, sein Sy�stem für ein Screening mit AffymetrixGeneChip® Oligonukleotid�Arrays fürDritte zu nutzen. Der Kunde hat dabei– analog zum Unigene�basierten Ex�pression Profiling Service – die Wahl,das Proben�Labelling selbst vorzu�nehmen oder dies durch das RZPDdurchführen zu lassen. Die Verknüp�fung der auf dem Affymetrix Gene�Chip® repräsentierten Gene mit denKlonen des RZPD Unigene Sets er�gänzt in optimaler Weise die amRZPD vorhandene Expertise zur Ana�lyse differentieller Genaktivität.

Automatisierungsservice (Picking,Spotting, Re!arraying): Der multipa�rallele Re�arraying Roboter des RZPDerlaubt die effiziente Entnahme eines

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Abb 2 Scanbild!Ausschnitt eines RZPD ImmunoArrays Gezeigt ist der Array, der ca. 1.200 PCR�Produkte trägt, dieGene repräsentieren, die in Immunreaktionen und Apoptose in�volviert sind, nach einer komplexen Hybridisierung mit fluore�zenzmarkierten Proben.

definierten Klonsets aus den Mikroti�terplatten einer beliebigen Genbiblio�thek zur Zusammenstellung beliebigerSubsets (z.B. die Erstellung nicht�re�dundanter Klonsets oder Subsets alsErgebnis einer Expression ProfilingSerie). Durch gerichtetes Re�arrayingist zudem z.B. die Erstellung vektor�spezifischer oder primerspezifischerSubsets in einer Mikrotiterplatte mög�lich. Auch die Überführung individuel�ler Klone einer Genbibliothek inMikrotiterplatten („Picken“) sowie dieErstellung von Hochdichte�Arrays(„Spotten“) ist als Auftragsarbeitmöglich.

Hochdurchsatz PCR!Amplifizie!rung: Die PCR�Kapazität des RZPDliegt bei über 25.000 Amplifikationenpro Tag. Die Amplifikation erfolgt im96er oder 384er�Mikrotiterplatten�Format, wobei in der Regel eine Aus�beute von 50�100 ng/µl erreicht wird.Auch der Einsatz modifizierter Primer(z.B. Aminolink) ist möglich. Die Qua�lität jedes PCR�Produkts wird auf ei�nem Gelsystem kontrolliert undelektronisch dokumentiert.

Herstellung von cDNA!Bibliothe!ken: cDNA�Bibliotheken sind nachwie vor das wichtigste Ausgangsma�terial zu Studien der Gene und ihrerFunktion. Das RZPD bietet die Her�stellung verschiedener Arten von Bi�bliotheken an (z.B. repräsentativecDNA�Bibliotheken, ‘full�length’ cDNA�Bibliotheken, random primed cDNA�Bibliotheken) und unterstützt so dieunterschiedlichen Anwendungsmög�lichkeiten für Functional Genomics.Der cDNA�Bibliotheken�Service ist fürWissenschaftler von besonderem In�teresse, die einen schnellen Zugriffauf qualitativ hochwertige cDNA wün�schen und dabei die langjährige Ex�pertise des RZPD nutzen möchten.Der RZPD�Bibliotheken�Service um�fasst: Gesamt� und polyA+�RNA�Iso�lierung, analytische und präparativecDNA�Synthese, Ligation und Trans�formation, Komplexitätsanalyse. Zujedem Schritt erfolgt eine entspre�chend dokumentierte Qualitätskon�trolle.

Mehrwert durch IntegrationNeben der Bereitstellung von Materi�alien und Serviceleistungen erarbeitet

das RZPD weiteren zusätzlichen Nut�zen, indem die Materialien vernetztwerden. Das RZPD hat dazu das „onegene – many clones (information ty�pes)“ Konzept entwickelt. Dabei wer�den die Informationen, die das RZPDfür jeden einzelnen Klon generiertbzw. importiert, gespeichert und inverarbeiteter Form allen Nutzern zurVerfügung gestellt. Dadurch kann derNutzer die für seine Fragestellung undfür sein experimentelles Design ambesten geeigneten Klone oder Infor�mationen auswählen.

Entsprechend der Struktur der Pri�märdatenbank ergibt sich auch dieMöglichkeit, die nun vorliegende Se�quenz des humanen Genoms zu nut�zen, um die derzeit bekannten Genemit weiteren genkorrelierten Daten zukombinieren. Die Umsetzung diesesModells geschieht derzeit in einer Ko�operation zwischen Max�Planck�Insti�tut für molekulare Genetik und RZPD.Die dabei entstehende „Genom�Ma�trix“ (www.genome�matrix.org) basiertauf den jeweils aktuellen Genannota�tionen der ENSEMBL Datenbank. Dieextrem umfangreiche Zusammenstel�lung weiterer vorliegender experimen�teller Daten und Datenbankeinträge,die zu den jeweils annotierten Genenvorliegen, geht von Maus in situ Da�ten, Gene Trap�Daten, Protein�Datenbis hin zu Krankheitsdaten des Index„Mendelian Inheritance In Man“. Die�se Datensammlung wird kontinuierlicherweitert und die Integration vorange�trieben. Einen solchen umfassendenEinblick in genbezogene experimen�telle Daten bei gleichzeitigem Zugriffauf hierzu verfügbares Klonmaterialerhält ein Nutzer weder bei akademi�schen Gruppen noch bei Firmen, diein der Regel nur einzelne Servicelei�stungen zur Verfügung stellen kön�nen.

AusblickDas RZPD hat durch sein umfassen�des Produkt� und Serviceangebot in�zwischen einen festen Platz in derdeutschen und internationalen Ge�nom� und Proteomforschung. So istdas RZPD bspw. Mitglied der Micro�array Gene Expression DatabaseGroup (MGED), einem internationalenKomitee für die Standardisierung derdurch Microarray�Experimente ge�

wonnenen Daten, sowie des von derHarvard Medical School koordiniertenFLEXGene�Konsortiums, dessen Zieldie exakte und vollständige Klonie�rung aller Gene des Menschen in Ex�pressionsvektoren ist. Auf nationalerEbene ist das RZPD über das Deut�sche Humangenomprojekt hinaus inviele weitere übergreifende For�schungsprogramme wie das Leitpro�jekt Molekulare Medizin des BMBF �Proteinstrukturfabrik, das DeutschePflanzengenomprojekt „GABI“ sowiedas Nationale Genomforschungsnetz�werk integriert und stellt seine grund�legenden Technologien und Ressour�cen zur Verfügung. Das RZPD wirdweiterhin seine Produkte entspre�chend den aktuellen wissenschaft�lichen Entwicklungen in der biologi�schen und medizinischen Forschunganpassen. Dabei zielt das RZPD alsgemeinnützige Einrichtung nicht aufdie Erwirtschaftung von Gewinnensondern auf die bestmögliche Anpas�sung an den sich wandelnden Bedarfder Forschergemeinde und ist dabeioffen für Kooperationen und Anregun�gen (www.rzpd.de).

KorrespondenzadresseDr. Bernhard KornRZPD Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung GmbHIm Neuenheimer Feld 50669120 HeidelbergTel. +49�6221�42 4700Fax +49�6221�42 4704korn@rzpd.de

Dr. Johannes MaurerRZPD Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung GmbHHeubnerweg 614059 BerlinTel. +49�30�32639 250Fax +49�30�32639 262j.maurer@rzpd.de

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