Molekularbiologie und Genetik

Dr. Thomas Seehaus

(c) 2007

Molekulare Genetik

Begriffe

GenetikVererbungslehre

BiotechnologieBiologische Vorgänge werden technisch nutzbar gemacht

GentechnologieBeschäftigt sich mit dem gezielten Eingriff in das Erbgut von Organismen, um Eigenschaften der Organismen zu verändern

GentherapieVersuch, eine Krankheit durch eine genetische Veränderung der Zellen des Patienten zu behandeln

Geschichte der Genetik und Molekularbiologie1800 Lamarck Lamarckismus: Vererbung erworbener Eigenschaften1839 Zelltheorie: die Zelle ist Grundeinheit des Lebens

1859 Theorie der Evolution auf Grund natürlicher Selektion

1860

1865 Mendel Mendelsche Gesetze der Vererbung1890 Boveri/Hunt Chromosomentheorie der Vererbung1944 Avery et al.

1953 Watson/Crick

1961 Entschlüsselung des genetischen Codes

1974 Entdeckung der Restrikionsendonukleasen

1982 Insulin: erster gentechnisch hergestellter Wirkstoff2000

Schleiden/SchwannDarwin/Wallace

Weitergabe vererbbarer Eigenschaften über Eizellen und Spermien

Desoxyribonukleinsäure (DNS) enthält die genetische InformationDoppelhelixmodell der DNA mit zwei komplementären Strängen von Nukleotidbasen

Nirenberg/MatthaeiArber/Nathans/Smith

Entschlüsselung des menschlichen Erbguts (3,2 Milliarden Basenpaare)

Frühe Theorien zur Vererbung

Jean Baptiste Lamarck (1744-1829)

1) Der ständige Gebrauch eines Organs stärkt, entwickelt und vergrößert dieses im Laufe der Zeit, während der Nicht-gebrauch ein Organ schwächt, verkleinert und schließlich verschwinden lässt.

2) Alles, was ein Lebewesen durch Gebrauch oder Nichtge-brauch eines Organs während seiner Entwicklung erwirbt oder verliert, wird durch die Fortpflanzung an die Nachkom-men vererbt, sofern beide Geschlechter gleichsinnige Abän-derung aufweisen, so dass Gebrauch und Nichtgebrauch von Organen ein wesentlicher Evolutionsfaktor für das Zustande-kommen der Anpassungen, der Vervollkommnung und Hö-herentwicklung sind.

Bibel

Beeinflussung der Zucht durch gestreifte Stöcke an der Wasserstelle. Wenn sich die Ziegen davor paaren und diese dabei sehen, sollten sie gefleckte Junge bekommen.

Jean Baptiste Lamarck

Bildquelle: http://home.tiscalinet.ch/biografien/biografien/

Die Zellentheorie➢ Schleiden (1839): alle Pflanzen bestehen aus Zellen➢ Schwann (1839): alle Tiere ebenfalls➢ Gemeinsam entwickeln sie die Zellentheorie:

➢ Membranen stellen allgemeine Zelleigenschaft dar➢ es gibt einzellige und mehrzellige Organismen➢ Zellen entstehen stets aus anderen Zellen durch Zellteilung.➢ alle Zellen sind in ihrem Grundbauplan und biochemisch im Wesent-

lichen gleich aufgebaut.➢ die Zelle ist die grundlegende Einheit für die Struktur und Funktion

der Organismen.➢ der grundlegende Metabolismus findet innerhalb der Zellen statt.➢ Genetisches Material und Erbinformationen werden bei der Zelltei-

lung weitergegeben.➢ ihre Entdeckung bilden die Grundlagen der Zellularpathologie von

Virchow (1850):➢ Krankheit basiert auf Störungen der Körperzellen oder deren Funk-

tionen

Die Evolutionstheorie

Alfred Russel Wallace (1823-1913)

Charles Darwin (1809-1882)

Charles DarwinAlfred Russel Wallace

Bildquelle: http://home.tiscalinet.ch/biografien/biografien/

➢ Lebewesen einer Population besitzen vererbbare, unterschied-lich gut an die Umwelt angepasste phänotypische Eigenschaften

➢ durch ständig wirkende Umwelteinflüsse erfolgt eine Auswahl bestimmter Phäno- und damit auch Genotypen

➢ mit der Zeit verändern sich sowohl Genotyp und Phänotyp➢ wichtiges Beispiel: Pflanzen- und Tierzucht!

Die biologische Evolutionstheorie erklärt und beschreibt Ursprung, Entwicklung und Vielfalt des Lebens

Die Mendelschen Gesetze

Der Augustiner-Mönch Gregor Mendel (1822 – 1884) war an der Frage interessiert, wie es zur Ausprägung der vielen verschiedenen Merkmale in der Natur kam. Gezielt begann er Kreuzungen zwischen Erbsenlinien mit sieben verschiedenen Merkmalen und erwartete eine Mischung der Merkmale. Zu seiner Überraschung aber musste er feststellen, dass die Merkmale bestehen blieben und sich weiter vererbten.1865 berichtet Gregor Mendel vor dem Naturforschenden Verein in Brünn über seine „Versuche an Pflanzen-Hybriden". Er hatte Regeln für die Vererbung von Eigenschaften entdeckt.

Gregor MendelBildquelle: www.jic.bbsrc.ac.uk/ germplas/pisum/zgs4f.htm

1. Mendelsches Gesetz

Gesetz von der Uniformität unter Einschluss der Reziprozität

Kreuzt man zwei reine Linien miteinander, die sich in einem oder mehreren Allelenpaaren unterscheiden, so erhält man eine F1-Generation, deren Angehörige einen einheitlichen Phänotypus aufweisen (Uniformität). Dabei ist es gleichgültig, welche der beiden reinen Linien man als Vater und welche man als Mutter verwendet (Reziprozität).

Intermediäre Vererbung eines Merkmals.R = Gen für rote Blütenfarber = Gen für weiße BlütenfarbeRR,rr = Genotyp der Eltern

rrr r

RRR Rr RrR Rr Rr

rrr r

RRR Rr RrR Rr Rr

Dominante Vererbung eines Merkmals

2. Mendelsches Gesetz

Gesetz von der Spaltung

Kreuzt oder selbstet man F1-Hybride, die in einem Allelenpaar heterozygot sind, so spaltet die F2 in bestimmten Zahlenverhältnissen phänotypisch auf.

Bei einem monohybriden dominant-rezessiven Erbgang erhält man eine Spaltung von 3:1, dominantes Merkmal : rezessives Merkmal.

Bei einem intermediär monohybriden Erbgang erhält man eine Spaltung von 1:2:1, Merkmal des einen Elters : Merkmal der F1 : Merkmal des anderen Elters.

Dominant-rezessiver Erbgang

RrR r

RrR RR Rrr Rr rr

RrR r

RrR RR Rrr Rr rr

Intermediär monohybrider Erbgang

3. Mendelsches Gesetz

Gesetz von der unabhängigen Kombination

Kreuzt man zwei reine Linien miteinander, die sich in mehr als einem Allelenpaar voneinander unterscheiden, so spaltet bei der Weitergabe über die Generationen jedes Allelenpaar unabhängig vom anderen. Dabei können in der F2 neue Merkmalskombinationen auftreten.

phänotypisches Spaltungsverhältnis:

AB : Ab : aB : ab 9 : 3 : 3 : 1

Abb. aus: Watson, Die Moleklarbiologie des GensKreuzung von Erbsen: grün glatt x gelb runzlig

Kernmaterial ist Träger der Erbinformationen

➢ 1869 entdeckt Friedrich Miescher die Nukleinsäure in einem Extrakt aus Eiterzellen und nennt sie „Nuclein“

➢ Albrecht Kossel entdeckte, dass Nuclein aus vier Bausteinen und Zuckermolekülen aufgebaut ist

➢ 1889 bennnt Richard Altmann das Nuclein auf-grund seiner chemischen Eigenschaften in Nukle-insäure um

➢ 1929 erkennt Phoebus Levene, dass die Nuklein-säure aus Desoxyribose, Phosphorsäureresten und den vier organischen Basen Adenin, Guanin, Cyto-sin und Thymin besteht. Er prägt den Begriff 'Nu-kleotid' für die Baueinheiten der Nukleinsäure.

➢ 1944: Oswald Avery, Colin McLeod und Maclyn McCarty weisen nach, dass Nukleinsäuren die Speicher der Erbinformation sind und nicht wie bis dahin angenommen Proteine.

Friedrich MiescherBildquelle: Wikipedia

Die Chromosomentheorie der Vererbung

Thomas Hunt Morgan (1866-1945): manche Erbeigenschaften werden gekoppelt wei-tergegeben, keine Segregation nach dem 3. Mendelschen Gesetz. Annahme: sie befinden sich auf dem gleichen Träger der Erbinformation. Diese Kopplungseinheiten werden wiederum nach den Regeln Mendels vererbt. Dies konnte bei den Riesenchromosomen von Drosophila (Taufliege) im Lichtmikroskop beobachtet werden.

Thomas Hunt Morganhttp://home.tiscalinet.ch/biografien/biografien/morgan.htm

Theodor Boverihttp://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/d09/boveri.htm

Chromosomen (= Farbkörperchen):in bestimmten Phasen des Zellzyklus auftretende, anfärbbare Gebilde im Zellkern. Ihre Verteilung in der Meiose legt eine Verbindung zu der Verteilung der Erbinformationen nach den Mendelschen Gesetzen nahe.

Theodor Boveri (1862 - 1915) formulierte anhand dieser Beobachtung die Chromosomentheorie der Vererbung.

Geschlechtsvererbung

Ein weiterer Beweis für die Chromosomentheorie war die Aufklärung der Vererbung des Geschlechtes über die Geschlechts-Chromosomen X und Y (Gonosomen).

Beim Menschen und einigen anderen Tieren sind die Gonosomen deutlich in der Größe verschieden und können daher lichtmikroskopisch leicht beobachtet werden.

Ihre Verteilung in Meiose und ihre Kombination bei der Befruchtung entsprechen den Regeln Mendels.

Abb. aus: Watson, Die Molekularbiologie des GensVererbung des Geschlechts über X und Y-Chromosom

DNS überträgt Erbeigenschaften

Oswald Theodore Avery (1877-1955) und McLeod () bewiesen mit bekapselten (virulenten) und unbekapselten (avirulenten) Pneumokokken, dass DNS (Desoxyribonukleinsäure) der Träger der Erbinformationen ist.

Pneumokokken: Streptococcus pneumoniae (ein Erreger der Lungenentzündung)

Oswald Theodore Averyhttp://home.tiscalinet.ch/biografien/biografien/avery.htm

Struktur der DNA I

Struktur der DNA/RNA

Struktur der DNA

Die Replikationder DNS

– Die Verlängerung des DNS-Einzelstrangs durch die DNA-Polymerase I verläuft immer in 5' – 3' Richtung

– Grund:– Reaktionsenergie wird vom ein-

zubauenden Nukleotid geliefert– die Abspaltung des Pyrophos-

phats liefert die Energie zum Aufbau der Bindung

– Triphosphat hängt am Kohlenstoffatom 5 der Ribose

– das Wasserstoffatom für die Pyrophosphat-Abspaltung stammt von der freien 3'-Hydroxyl-Gruppe des zu verlängernden Strangs

– Die beiden Stränge verlaufen anti-parallel

Abb. aus Watson, Die Molekularbiologie des Gens

Die Replikation der DNS

➢ Der Mechanismus der Kettenver-längerung bedingt den Ablauf der Replikation

➢ der 5'-3'-Strang ('+') kann kontinuierlich repliziert werden

➢ bei den großen eukaryontischen Chromosomen findet die Synthese jedoch auch in Abschnitten statt

➢ der Gegenstrang ('-') muss in kleinen Fragmenten (Okazaki-Fragmente) synthetisiert werden

➢ die Teilstücke werden durch das Enzym Ligase verknüpft

➢ die Replikationsgabel wandert über den DNS-Doppelstrang

➢ Replikation ist semikonservativDer Replikationsvorgang. Anfang unten rechts.

Die Genauigkeit der Replikation

➢ Die DNA-Polymerase I macht bei der Replikation nur etwa einen Fehler pro 10 Millionen Basenpaaren

➢ Links sehen Sie eine Sequenz von nur 1.000 Basen

➢ Um die Genauigkeit der DNA-Polymerase I zu erreichen, müssten Sie 10.000 solcher Seiten abschreiben, dabei an-stelle von T ein A, von A ein T, von C ein G und von G ein C schreiben. Und dürften dabei nur einen Fehler machen!

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Photolyase entfernt Pyrimidin-Dimere

Photolyasereaktion

Postreplikations-Reparatur I

Postreplikations-Reparatur II

Postreplikationsreparatur III

Das Holliday-Modell der Rekombination

➢Das Holliday-Modell erklärt die unterschiedlichen Ergebnisse der Rekom-bination

➢(e) Ausbildung der Über-kreuzung der Chromatiden (Chiasma)

➢(j) Es bestehen zwei Möglichkeiten zur Auflösung des Chiasmas

➢(k,l) Unterschiedliche Ergeb-nisse der Rekombination

Holliday – Modell -experimenteller Nachweis

Crossing over - Bruch und Wiedervereinigung

Crossing over - Kopiewahl („copy choice“)

Zentrales Dogma der Molekularbiologie

DNA <-> RNA -> Protein➢ ursprüngliches Dogma:

➢ 1) DNS wird immer anhand einer DNS-Matrize synthetisiert

➢ 2) RNS wird anhand einer DNA-Matrize synthetisiert

➢ 3) Proteinsynthese verwendet eine RNA-Vorlage

➢ Die Entdeckung der Reversen Transkriptase (Retroviren) hat je-doch gezeigt, dass auch die Synthese von DNA an einer RNA-Matrize möglich ist. Die Ähnlichkeit der Mechanismen von Replikation und Transkription

➢ Die Umkehrreaktion von 3) konnte bislang nicht nachgewiesen wer-den. Heiße Kandidaten dafür waren eine zeit lang die Prionen. Der sehr komplexe Vorgang macht eine „reverse Translation“ auch sehr unwahrscheinlich.

Transkription DNA -> RNA

➢ Umschreibung DNA in RNA

➢ RNA-Typen➢ mRNA (messenger RNA)

➢ transportiert Erbinformation zur Proteinbiosynthese ins Cytoplasma

➢ 1 Gen - 1 Enzym-Hypothese

➢ rRNA (ribosomal RNA)➢ strukturelle und funktionelle

Bestandteile des Ribosoms (Protein-RNS Komplex)

➢ tRNA (transfer RNA)➢ „Dekodierung“ der Erbin-

formation

Synthese der mRNA

➢ Prokaryonten➢ direkter Transport der mRNA zu den Ribosomen➢ oft lagern sich Ribosomen auch schon an entstehenden mRNA-

Strang an:➢ Translation beginnt schon vor Ende der Transkription➢ oft polycistronisch, Operon-Modell

➢ Eukaryonten➢ primäres Transkript: hn-RNA (heterogenous nuclear RNA) oder

pre-mRNA➢ Weiterverarbeitung zur mRNA:

➢ Splicing (Entfernen nicht kodierender Bereiche)➢ Capping (Schutzfunktion am 5'-Ende)➢ Poly-Adenylierung (Tailing, Schutzfunktion durch anhän-

gen von 80-250 Adenin-Resten an das 3'-Ende)➢ reife mRNA verlässt Kern durch Kernpore➢ Anlagerung an Ribosomen

RNA-Splicing, Capping, Poly-A

➢ Introns: nicht kodierende Bereiche innerhalb eines Gens➢ Exons: kodierende Anteile eines Gens➢ Cap: modifiziertes Guanin in 5'-5'-Phophodiester-Bindung

➢ Schutz vor Exonukleasen, Abbau in 5'-3' Richtung➢ Transport durch Kernporen➢ Initiation der Translation

➢ Poly-A: durch Poly(A)-Polymerase angehängt➢ Stabilisierung der mRNA, steuert Lebensdauer (Verkürzung)

Alternatives Spleißen

➢ Während des Spleißvorganges ent-scheidet sich, welche DNA-Sequenzen Introns und welche Exons sind

➢ Regulation erfolgt über Splicefaktoren (Proteine, die Signale auf der RNA er-kennen und die Auswahl der splice sites beeinflussen).

➢ die ein-Gen-ein-Enzym-Hypothese gilt für Eukaryonten nicht streng. Eine DNA-Sequenz, also ein Gen, kann unter-schiedliche Proteine codieren.

➢ eine menschliche Zelle ist so in der Lage, mit ihren rund 33.000 Genen ein außerordentlich komplexes Proteom von 500.000 bis 1.000.000 Proteinspe-zies herzustellen

➢ Beachte: evolutive Bedeutung!

ribosomale RNA

➢ nicht kodierende RNA➢ Transkription wie mRNA, je-

doch keine Translation➢ Prokaryonten: 5, 16, 23 S➢ Eukaryonten: 5, 5,8, 18, 28 S➢ 16 S rRNA bindet Shine-Dal-

garno-Sequenz der mRNA -> Positionierung des Startco-don

➢ in allen Organismen vorhan-den

➢ rRNA ist hoch konservativ➢ idealer molekularer Chro-

nometer

Universeller Stammbaum des Lebens, auf Basis der rRNA-Sequenzen erstellt.

transfer RNA

➢ nicht kodierende RNA➢ „Dechiffrierschlüssel“ der ge-

netischen Information➢ Transkription wie mRNA➢ umfangreiches „processing“➢ zahleiche modifizierte Basen

(z.B. Pseudo-Uridin) ➢ verbindet Aminosäure (AS) mit

einem spezifischen Anticodon➢ in primären Proteinen 20 AS➢ daher 20 spezifische tRNAs

notwendig➢ Beladung tRNA mit AS durch

spezifische Enzyme

Der genetische Code

Nirenberg

● 64 mögliche Triplettcodons (43) kodieren nur 20 Aminosäuren + 3 Stopsignale

● -> „degenerierter Code“● jedes Protein beginnt mit einem Methionin● die Codons, die ein und dieselbe Amino-säure kodieren, beginnen oft mit den glei-chen Basen

● dritte Position ist für die Kodierung vieler Aminosäuren weniger wichtig: „wobble po-sition“

Matthei

Dechiffrierung des genetischen Codes mit Hilfe von synthetischen „mRNAs“ in zell-freien Extrakten

Proteinbiosynthese: Translation

➢ Initiation durch Bindung der mRNA an 16 S-rRNA (CAP, Shine-Dalgarno-Sequenz) an Ribosom

➢ Ribosom: „Übersetzungsmaschine“➢ synthetisiert primäres Protein anhand der mRNA-Sequenz

➢ drei tRNA-Bindungsstellen, die A-(Aminoacyl-), P-(Pep-tidyl-) und E-(Exit-)Stelle

➢ A bindet tRNA+AS➢ P überträgt AS auf wach-

sendes Polypeptid➢ bei E verläßt tRNA das Ri-

bosom

posttransalationale Modifikation

➢ nach Lösen vom Ribosom erfahren die meisten Protein noch um-fangreich Modifikationen:

➢ Ausbildung von Sekundär- und Tertiärstrukturen➢ Ausbildung von Quartärstrukturen (Komplexe)➢ Strukturänderungen durch Kontakt mit bestimmten Liganden➢ Transport an Zielort (posttransaltional, cotranslational, Membra-

nen, Vakuolen, Zellwand, etc.)➢ chemische Modifikationen

➢ Methylierung➢ Phosphorylierung➢ Modifikation von Aminosäuren➢ etc.

➢ Spaltung durch Proteasen (z. B. Aktivierung von Enzymen)➢ Struktur eines Protein nur sehr eingeschränkt aus DNA-Se-

quenz ableitbar!

Proteinsynthese am Endoplas-matischen Reticulum

➢ Signalsequenzerkennungspartikel (SRP) erkennt Signalsequenz➢ Bindung an Sec61-Kanal➢ Proteinsynthese durch Membran des Endoplasmatischen Reticulums