Zivilschutz-ForschungSchriftenreihe der Schutzkommission beim Bundesminister des Innern

Herausgegeben vom Bundesamt für Zivilschutz Neue Folge Band 31

G. Schallehn und H. Brandis

Beiträge zur Isolierungund Identifizierung vonClostridium sp. und Bacillus sp.sowie zum Nachweisderen Toxine

ISSN 0343-5164

Herausgeber: Bundesamt für Zivilschutz,Deutschherrenstr. 93-95, 53177 BonnRedaktion: Birte Schönherr, Anita Boldt und Gisela KrugspergerDie Arbeit gibt die Meinung der Autoren wieder. Sie stellt keine Äußerungdes Herausgebers dar und ist auch nicht als solche auszulegen.

© 1998 by Bundesamt für Zivilschutz, BonnSatz: Fotosatz Froitzheim AG, Bonn

Inhalt

Einleitung und Aufgabenstellung 7

1 Miniaturisierte Systeme zur biochemischenIdentifizierung von Bakterien 9

1.1 Identifizierung von Clostridium-Spezies 91.1.1 MicroScanR (Baxter) und ATB 32A (API bioMerieux) 91.1.2 Titertek (Flow) 111.2 Identifizierung von Bacillus-Spezies 121.2.1 Konventionelle Methode 131.2.2 API 50CH und API 2OE (bioMerieux) 131.2.3 VITEK (bioMerieux) 13

2 Differenzierung und Identifizierung von Bakterien mit der,,Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie“ 17

2.1 Vorversuche 172.2 Anwendung der FT-IR-Spektroskopie zur Differenzierung

von Clostridium cochlearium, C. malenominatum,C tetanomorphum und C tetani 20

2.3 Erarbeitung von FT-IR-Referenzspektren für dieClostridium-Datei 23

2.4 Epidemiologische Untersuchungen mittels der FT-IR-Spektroskopie im Vergleich zu der Lysotopie und Pulsfeld-gelektrophorese an Staphylococcus aureus-Isolaten 32

3 Untersuchungen auf Clostridium difficile 373.1 Kultureller Nachweis 373.1.1 Cycloserin-Cefoxitin-Fructose-Agar (CCFA) zur Isolierung

von Clostridium difficile 373.2 Identifizierung 393.2.1 Norleucin-Tyrosin-Bouillonkultur zur Identifizierung von

Clostridium difficile mittels Gaschromatographie 393.2.2 Latex-Agglutinationstest (FrekaR MicroScreenR, Fresenius)

zur schnellen Identifizierung von Clostridium difficile-Bakterien 40

3.3 Antibiotika-Empfindlichkeit 43

4 Methoden zum Nachweis clostridieller Toxine 45

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4.1 Nachweis von clostridiellen Cytotoxinen mittelsLungenfibroblastenkultur 45

4.2 Verwendbarkeit der Lungenfibroblastenkultur als Ersatzfür den Tierversuch. Vergleich der Cytotoxizitätund Pathogenität von Stämmen verschiedenerClostridium-Spezies 46

4.3 Prüfung der Lungenfibroblastenkultur zum Routine-Nachweis von Clostridium difficile-Toxin im Stuhlvon Patienten 48

4.4 Vergleichende Prüfung eines käuflichen Latex-Agglutina-tionstestes (Culturette Brand CDT™, Marion Scientific)zum Nachweis von C. difficile-Toxin in Stuhlproben 49

4.5 Nachweis von C. perfringens-Enterotoxin mittelsVero-Zellenkultur 51

4.6 Vergleich von Vero-Zellenkultur, Latex-Agglutinationstestund ELISA zum Nachweis von C perfringens-Yinterotoxmin C. perfringens-Kulturen und Stuhl von Diarrhoe-Patienten 54

5 Nachweis von Tetanus- Antikörpern im Serum mittelsELISA 59

6 Analyse einzelner Toxine 616.1 Cytotoxinbildung von Clostridium-Stämmen aus

Stuhlproben von Patienten mit Verdacht auf Colitis 616.2 Analyse des von Clostridium butyricum gebildeten

Cytotoxins 616.3 Charakterisierung der Cytotoxine von Clostridium

oceanicum 636.4 Nachweis und Charakterisierung einer ADP-ribosyltrans-

ferase von Clostridium limosum 646.5 Nachweis und Charakterisierung einer ADP-ribosyltrans-

ferase von Bacillus cereus 65

7 Zusammenfassung und Empfehlungen 67

8 Bedeutung für den zivilen Bevölkerungsschutz 71

9 Literatur 73

Die Autoren 77

Danksagung 77

Einleitung und Aufgabenstellung

Clostridien sind überwiegend anaerobe, relativ große sporenbildendegrampositive Stäbchenbakterien, die in älteren Kulturen häufig gramnegativwerden. Einige Clostridium-Spezies (wie z. B. Clostridium perfringens) bil-den selten Sporen, außer in speziellen Nährmedien.

Clostridien kommen im Darm von Mensch und Tier, im Meer- und See-wasser, Erdboden, Staub, an der Kleidung und im Untersuchungsmaterialhäufig in Mischflora vor. Nur wenige Spezies sind menschenpathogen. Dar-unter sind

1. Erreger von schweren Wundinfektionen/Intoxikationen: Tetanus, Gas-brand/Gasödem. Es sind keine Seuchenerreger, da der Ausbruch derKrankheit an eine vorangegangene Verletzung gebunden ist oder durchendogene Infektionen (C. perfringens, C. septicum) erfolgt. Die Voraus-setzungen sind vor allem bei Erdarbeiten, Verkehrsunfällen, Kata-strophen und im Krieg oder bei intestinalen Operationen bzw. malignenErkrankungen gegeben.

2. Erreger von Nahrungsmittelvergiftungen: Botulismus (Intoxikation),Clostridium perfringens Typ A-Enteritis.

3. Erreger der Antibiotika-induzierten pseudomembranösen Colitis(PMC), die durch Clostridium difficile hervorgerufen wird.

4. Die anderen Clostridium-Spezies, die im klinischen Untersuchungs-material nachgewiesen werden, wurden früher oft als apathogen ange-sehen. Aufgrund mehrere Isolierungen aus Entzündungsprozessen oderaus Blutkulturen bei Sepsis nimmt man jedoch heute an, daß zumindesteinzelne Arten pathogenetische Eigenschaften besitzen und besondersbei Personen mit lokaler oder allgemeiner Immunschwäche von kli-nischer Bedeutung sind (SCHALLEHN, 1990, 1994; JUST et al., 1992a).

Zur Gattung Bacillus gehören relativ große ebenfalls sporenbildende gram-positive Stäbchenbakterien, die im Gegensatz zu den Clostridien aerob undnur fakultativ anaerob wachsen. Sie sind in der Natur weit verbreitet undspielen vor allem in der Bodenmikrobiologie und in der technischen Mi-krobiologie eine Rolle. In neuerer Zeit werden gelegentlich bei Patientenmit traumatischen Wunden oder Verbrennungen sowie bei malignen Er-krankungen unter immunsupressiver Therapie Bacillus-Spezies (B. cereus,B. circulans, B. licheniformis, B. macerans, B. sphaericus, B. subtilis u. a.) alsErreger schwerer Erkrankungen wie Meningitis, Sepsis, Bakteriämie, En-dokarditis gefunden (SCHALLEHN, 1994).

Es war das Ziel des Forschungsvorhabens (1974 bis 1994) „Schnelldiagnosevon Krankheitserregern, die für den zivilen Bevölkerungsschutz besondere

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Bedeutung haben“, die jeweils neuen Methoden der Mikrobiologie zurDiagnose der Anaerobierinfektionen und -Intoxikationen (wie Gasbrand,Gasödem, Tetanus, Botulismus, pseudomembranöse Colitis) und der Bα-cillus-Infektionen verwendbar zu machen und zu verbessern. Daher wurdeeine Reihe von Methoden zur Diagnostik, Züchtung, Identifizierung, Typi-sierung, Prüfung der Antibiotika-Empfindlichkeit, zum Toxin-Nachweis undzur Klärung der Toxigenese der Clostridien geprüft oder neu entwickelt undso beschrieben, daß sie in der Praxis anwendbar sind. Zusammen mit un-seren Erkenntnissen sind sie in die Erstellung der DGHM-Verfahrens-richtlinien für die mikrobiologische Diagnostik der Clostridien eingegangen(SCHALLEHN, 1990).

Unser weiteres Forschungsziel war, die Fourier-Transform-Infrarotspektro-skopie für die Schnelldiagnose von Clostridien nutzbar zu machen. Dazugehörte die Erarbeitung der Referenzspektren von definierten Bakterien-stämmen und der Aufbau der Datei für die Differenzierung und Identifizie-rung von Clostridium-Spezies, deren Diagnose mit konventionellen Me-thoden sehr langwierig ist.

1 Miniaturisierte Systeme zur biochemischenIdentifizierung von Bakterien

1.1 Identifizierung von Clostridium-Spezies

Zur Differentialdiagnose von Clostridien werden bisher verwandt: die Ko-loniemorphologie, Morphologie im Gram-Präparat, die Sporenbildung so-wie die biochemischen, wie saccharolytischen, proteolytischen Eigen-schaften, die Phosphatase-, Lecithinase-, Lipase-, Fettsäure- und Alkohol-bildung, die gaschromatografisch beurteilt werden (SCHALLEHN, 1990).

Die Schnellmethoden und miniaturisierten Systeme, die in den letzten Jah-ren für die Identifizierung anaerober Bakterien entwickelt wurden, arbeitenüberwiegend mit chromogenen Substraten zum Nachweis der in den Bak-terienzellen vorgeformten Enzyme (Esterasen, Glucosidasen, Aminopepti-dasen u. a.). Ein Wachstum der Bakterien während des Testes ist nicht er-forderlich.

1. 1. 1 MicroScanR (Baxter) und ATB 32A (API bioMérieux)

Parallel zur Entwicklung eines Mikroverfahrens zur biochemischen Identi-fizierung von anaeroben Bakterien, das wir über mehrere Jahre mit der Fa.Flow erarbeiteten, wurden die beiden auf dem Markt befindlichen Systemeder Firma Baxter (MicroScanR) und API bioMérieux (ATB 32A) auf ihreVerwendbarkeit überprüft.

Prinzip:

Eine dichte Suspension (McFarland 4) der auf Columbia-Agar gewachsenenTestbakterien in 3 ml Aqua dest. wird zu je 50 μl in Mikrotiterplatten ge-tropft, die verschiedene Substrate (MicoScanR: 24, ATB 32A: 29) gefrierge-trocknet enthalten. Nach 4stündiger aerober Inkubation bei 37°C werdendie biochemischen Reaktionen nach Zugabe von Reagenzien colorimetrischabgelesen und mittels eines Codebuchs ausgewertet.

Getestet wurden 27 Clostridium-Spezies mit insgesamt 132 Stämmen. Da-von waren 8 Spezies (33 Stämme) nicht im API-Codebuch enthalten.

Ergebnisse:

Im MicroScanR (Baxter)-System wurden von 14 Spezies (52 Stämme) 6Spezies (C bifermentans, C. butyricum, C. cadaveris, C. difficile, C. septicum,

C. sordellii) mit 27 Stämmen richtig identifiziert. Dagegen wurden nur 3 von6 Stämmen der 3 Spezies C. barati, C. innocuum, C. sporogenes richtig be-stimmt. Nicht identifiziert werden konnten 16 Stämme von den 4 Spezies: Chistolyticum, C. perfringens, C. subterminale, C. tertium, obwohl sie im Co-debuch enthalten waren. Insgesamt waren somit 19 von 52 Stämmen (36 %)mit dem MicroScanR-System nicht identifizierbar.

Mit dem ATB 32A-Kit (API bioMérieux) wurden 132 Stämme von 27 CIo-stridium-Spezies getestet. Davon waren 8 Spezies (C cochlearium, C. ha-stiforme, C. indolis, C. malenominatum, C. mangenotii, C. novyi, C. pu-trificum, C. tetanomorphum) im Codebuch nicht enthalten.

Von 109 Stämmen der im Codebuch aufgeführten Spezies wurden 80Stämme richtig identifiziert, das sind 73 %. Von den im API-System nichtenthaltenen 8 Spezies ergaben 14 von 23 getesteten Stämmen kein – somitrichtiges – Ergebnis. In 9 Fällen kam eine falsche Spezies heraus: Je 1 Stammvon C cochlearium und C putrificum wurden als C tetani und 6 Stämme vonC tetanomorphum als C bifermentans benannt. Ein weiterer C cochlea-nwra-Stamm ergab Fusobacterium nucleatum. Die Fehlerquote lag somitbeim API-System bei 29 %.

Beurteilung:

In beiden Systemen ist die Identifizierungsrate mit 64-71 % noch relativgering. Ein Grund dafür könnte darin liegen, daß von den ca. 40 im klini-schen oder lebensmittelhygienischen Untersuchungsmaterial vorkommen-den Clostridium-Spezies bisher nur 16 im MicroScanR- und 22 im ATB 32A-Codebuch berücksichtigt wurden.

Die Anwendung und Auswertung der miniaturisierten Identifizierungs-verfahren ist für den erfahrenen Mikrobiologen einfach, für den uner-fahrenen kann es leicht zu Fehlinterpretationen und falschen Identifizie-rungen u. a. bei C difficile und C ramosum kommen.

EISGRUBER (1992) weist darauf hin, daß die Ablesung der Farbre-aktionen ebenfalls zu Fehldeutungen führen kann, und empfiehlt interneLaborstandards.

Im Vergleich mit der konventionellen Identifizierungsmethode (2-5 Tage)sind die Ergebnisse mit den miniaturisierten Systemen (MicroScanR undATP 32A) innerhalb von 4 Stunden ablesbar, jeweils ausgehend von einergut gewachsenen Vorkultur.

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1.1.2 Titertek (Flow)

In Zusammenarbeit mit der Firma Flow befaßten wir uns mit der Entwick-lung eines semiautomatischen biochemischen Identifizierungssystems (Ti-tertek) für Clostridien. Das Testsystem bestand aus sieben verschiedenenTests zur Prüfung der Bildung von Indol, H2S, ß-Glucosidase, Urease, Orni-thindecarboxylase, Arginindihydrolase und Nitratreduktase, 23 Kohlenhy-drat-Fermentationsreaktionen und 61 chromogenen Substraten zum Nach-weis von Glucosidasen, Phosphatasen, Aminopetidasen und Proteasen ineiner Mikrotiterplatte.

Die Beimpfung der Testplatte, die die Substrate enthielt, erfolgte manuell,die Absorptionsmessung der Testergebnisse und die anschließende Analyseder Meßwerte waren computergesteuert.

Verfahren:

Es wurden 222 Stämme von 26 verschiedenen Clostridium-Spezies auf dieVerwertung dieser 91 Testsubstrate untersucht. Für die Beimpfung der Mi-krotiter-Testplatten wurden von Hefeextrakt-Cystein-Blutagar-Kulturendichte Bakteriensuspensionen (McFarland 1) in jeweils 10 ml vorreduzierterBasalbouillon (für die erste Hälfte der Platte) und 10 ml vorreduzierterNaCl-Lösung (für die 2. Hälfte der Platte mit den chromogenen Substraten)hergestellt. Mit Hilfe einer 8-Kanalpipette wurden die Substrate in der Mi-krotiterplatte mit je 100 μl der Bakteriensuspension beimpft. Die Bebrütungder Testplatten erfolgte anaerob 24 Stunden bei 37°C. Durch Vergleich derExtinktionswerte mit den mit dem Auge ermittelten ± -Ergebnissen wurdendie Schwellenwerte für die Bewertung der jeweiligen Tests festgelegt.

Ergebnisse:

Die Analyse der Ergebnisse zeigte, daß einige Tests keine oder nur eine ge-ringe Aussagekraft besaßen. Durch Eliminierung dieser Reaktionen konn-ten die 91 Ausgangssubstrate auf 25 reduziert werden (ARIAS RO-DRIGUEZ, 1990). Die Ergebnisse dienten als Grundlage für die Errichtungeiner Datenbank für das Identifizierungssystem.

Zum Vergleich der Ergebnisse wurden dieselben Stämme auf konven-tionelle Weise in der „Bunten Reihe“ (SCHALLEHN, 1990) getestet.

Nach dem erarbeiteten Identifizierungsprogramm konnten durch Re-Ein-gabe der ermittelten Daten von den 222 Teststämmen 208 richtig identifi-ziert werden. 10 Stämme wurden falsch identifiziert, bei 4 Stämmen warkeine Identifizierung möglich. Unabhängig von der Anzahl der Reaktionen

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konnten mit dem Titertek-Verfahren 5 Spezies, die sich biochemisch nur inden gebildeten Stoffwechselendprodukten (Fettsäuren), der Lipase oderGelatinase unterscheiden, nicht identifiziert werden: C. cochlearium, C. ha-stiforme, C. putrificum, C. sporogenes und C. subterminale.

Beurteilung:

Das im Rahmen einer Dissertation entwickelte semiautomatische Identifi-zierungsverfahren verfügt gegenüber der herkömmlichen „Bunten Reihe“über einige Vorteile: Die ca. 1 Jahr lang haltbaren Mikrotiter-Testplattenlassen sich auf engstem Raum lagern. Die geringen Mengen an Medien undIndikatoren, die einfache Handhabung, die kürzere Inkubationszeit und diecomputergesteuerte Interpretation der Ergebnisse stellen gegenüber derarbeits-, zeit- und materialaufwendigen „Bunten Reihe“ entscheidendeVorteile dar.

Im Vergleich zu dem MicroScanR und ATB 32A-System mit einer 4stün-digen Inkubation unter aeroben Bedingungen ist das Titertek-Verfahrenlangsamer und arbeitsintensiver, da die Bebrütung 24 Stunden und anaeroberfolgen muß.

Eine Beurteilung der Identifizierungsgenauigkeit des neu entwickelten Ti-tertek-Verfahrens im Vergleich zu anderen auf dem Markt befindlichen Sy-stemen ist in diesem Stadium noch nicht möglich. Um darüber eine Aussagemachen zu können, müßten zusätzliche Clostridium-Stämme untersuchtwerden, denn die in dieser Studie getesteten Stämme dienten dem Aufbauder Dateibasis des Identifizierungsprogrammes. Die meist korrekte Spezies-Identifizierung ist daher kein überraschendes Ergebnis, sondern hatte indieser Studie nur die Funktion, das neu entwickelte Identifizierungs-programm zu überprüfen.

1.2 Identifizierung von Bacillus-Spezies

Da Bacillus-Arten zunehmend pathogene Bedeutung erlangen und auchöfter in klinischem Untersuchungsmaterial gefunden werden (WEIER,1988), haben wir 1991 begonnen, alle Stämme, die aus Blutkulturen isoliertwurden, biochemisch mit der konventionellen Methode, mit dem käuflichenAPI 50CH- und API 20E-System (bioMerieux) und über die Wachs-tumskinetik mit dem VITEK-Automaten (bioMérieux) zu identifizieren.Bisher wurden 139 Stämme aus klinischem Material untersucht, die 10 Spe-zies zuzuordnen sind.

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Methodik:

1.2.1 Konventionelle Methode

Bei der konventionellen Methode werden die kulturellen und biochemischenEigenschaften der Bazillen in Röhrchen oder auf Platten mit verschiedenenNährmedien getestet (i. G. 23 Parameter). Die Bebrütungsdauer beträgt1-5 Tage bei 37°C (CLAUS und BERKELEY, 1986).

1.2.2 API 50CH und API 2OE (bioMérieux)

Für den API-Test werden käufliche Plastikstreifen mit Mikroröhrchen ver-wendet, in denen Nährsubstrate (wie Kohlenhydrate und Derivate) gefrier-getrocknet vorbereitet sind; bei API 50CH für 50 biochemische Reaktionen,bei API 2OE für 20 biochemische Reaktionen. Von einer Kulturplatte wer-den die Inokula in Suspensionsmedium angefertigt und die schuhförmigenMikroröhrchen damit beimpft. Bei den API-50CH-Streifen besteht jedesMikroröhrchen aus einem aeroben Teil für die Assimilation und Oxidationund einem anaeroben Teil für die Fermentation. Die Dauer der Bebrütungbeträgt 48 Stunden bei 37°C für die mesophilen Bacillus-Arten. Die bio-chemischen Reaktionen können anhand von Farbumschlägen abgelesenwerden, die entweder spontan während der Inkubation oder nach Zugabeder Reagenzien entstehen.

Die Ablesung dieser Reaktionen erfolgt mit Hilfe der Ablesetabelle und dieIdentifizierung anhand der Prozenttabelle.

1.2.3 VITEK (bioMérieux)

Bei dem VITEK-Test wird eine Testkarte mit 30 Mikro-Meßküvetten, dieTestsubstrate enthalten, verwendet. Der VITEK-Apparat besteht aus einerFüll- und Verschlußstation, die mittels Unterdruck für die Befüllung derVITEK-Testkarten sorgt. Dafür wird das Röhrchen mit dem Inokulum ineinem Füllständer über ein Transferröhrchen mit der Testkarte verbunden.Anschließend wird die Testkarte hermetisch verschlossen.

In der Inkubations- und Ablesestation werden die VITEK-Testkarten in-kubiert und stündlich automatisch einem Ablesezyklus unterworfen. Die-sem Zyklus kann zu jedem beliebigen Zeitpunkt eine neue Testkarte, gleichwelcher Untersuchungsart, hinzugefügt werden, ohne daß der Untersu-chungsrhythmus verändert wird. Der Steuerungscomputer überwacht dielaufenden Untersuchungsgänge, speichert die Zwischenergebnisse und ver-arbeitet diese zu dem endgültigen Untersuchungsergebnis. Die meisten Er-gebnisse liegen nach 4-6 Stunden vor.

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Material und Methoden dieser 3 Verfahren wurden ausführlich in der Dis-sertation von IBERT (1993) beschrieben und – durch weitere Bacillus-Stämme ergänzt – veröffentlicht (IBERT et al., 1996).

Ergebnisse:

Die Ergebnisse der Identifizierung der 139 Bacillus-Stämme mit der kon-ventionellen Methode und dem API-Test stimmten in fast 100 % überein.Nicht ganz so eindeutig waren die Ergebnisse mit dem VITEK-Automaten:Wie aus der Tabelle 1 zu ersehen ist, wurden von den 20 getesteten B. cereus-Stämmen 6 als B. thuringiensis, von den 18 B. licheniformis-Stämmen 1 alsB. subtilis, 2 als B. species und von den 4 B. mycoides-Stämmen 1 Stamm alsB. cereus identifiziert. Nur die Stämme von B. megaterium, B. pumilus, B.subtilis waren mit allen 3 Methoden gleich gut zu identifizieren.

Beurteilung:

Nach den bisherigen Ergebnissen scheint der API 50CH-Testkit (in Kombi-nation mit dem API 20E-Testkit) in der Genauigkeit der konventionellenTestmethode vergleichbar zu sein. Der API-Test ist jedoch schneller: DieErgebnisse sind bereits nach 48 Stunden verfügbar, bei der konventionellenMethode nach 2-5 Tagen. Die Ergebnisse der VITEK-Methode lagen nach4-6 Stunden vor, waren jedoch z. T. fehlerhaft.

Nach der Literaturstudie von WEIER (1988) scheinen vor allem B. cereus,B. licheniformis, B. pumilus, B. subtilis und B. sphaericus pathogene Eigen-schaften zu besitzen. Auch aus unserem Untersuchungsmaterial wurdendiese Spezies relativ häufig isoliert.

Im Rahmen einer med. Dissertation soll jetzt anhand der Krankenge-schichten die pathogene Bedeutung dieser Isolate analysiert werden.

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Tab. 1: Identifizierung von Bacillus-Stämmen mit drei biochemischen Verfahren.

2 Differenzierung und Identifizierung vonBakterien mit der „Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie“

Bereits in den 50er Jahren wurde berichtet, daß Mikroorganismen unterstandardisierten Kultur- und Präparationsbedingungen reproduzierbare In-frarot-Spektren liefern (HAYNES et al., 1958; u.a.). Diese Idee griffenWissenschaftler im Robert-Koch-Institut Berlin um 1980 auf, mit dem Ziel,die Fourier-Transform-Infrarot (FT-IR)-Spektroskopie für die Schnelldia-gnose von Krankheitserregern nutzbar zu machen (GIESBRECHT et al.,1985).

Prinzip:

Von Kolonien der zu differenzierenden Bakterienkultur wird Material aufeinen Probenträger übertragen, kurz im Vakuum getrocknet und in das FT-IR-Spektrometer eingeführt. Das gemessene FT-IR-Spektrum wird mit ge-speicherten Referenzspektren über Computer verglichen und erlaubt so in-nerhalb von 10-15 Minuten die Identifizierung des Bakteriums.

2.1 Vorversuche

Zwischen 1984 und 1986 wurden in Zusammenarbeit mit dem Robert-Koch-Institut Berlin verschiedene Vorversuche durchgeführt, um zu prüfen,

1. ob die neue FT-IR-spektroskopische Differenzierungstechnik auch aufanaerobe Bakterien, z. B. Clostridium-Spezies, anwendbar ist und

2. ob auf der Grundlage einer Spektrendatei Identifizierungen vorgenom-men werden können.

3. Weiterhin sollte festgestellt werden, ob die Sporenbildung spektro-skopisch erkannt werden kann und

4. ob der Nährboden, der zur Anzüchtung der Bakterien verwendet wird,einen Einfluß auf die spektroskopisch erfaßbaren Lipopolysaccharideder Zellwand und somit auf das Gesamtspektrum hat.

Über eine Versuchsserie mit 12 Clostridium-Stämmen (S Spezies) soll hierzusammenfassend berichtet werden.

Verfahren:

Die Kultivierung der zu untersuchenden Clostridien erfolgte als Reinkulturauf Hefeextrakt-Cystein-Blutagar und Blutagar anaerob 22 Stunden 37°C,

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für die Versporung 6 Tage 37°C. Mit einer kalibrierten Pt-Öse wurden dieBakterien direkt vom Agar aufgenommen und im Eppendorfgefäß mit 30 μlAqua dest. suspendiert. Je 25 μl der Suspension wurden auf ein Feld desProbenträgers (ZnSe-Scheibe) aufgetragen. In einem Untersuchungsgangkonnten 15 Kulturen auf einen Probenträger aufgebracht und analysiertwerden. Der Probenträger wurde nach dem Trocknen im Vakuum in eineKüvette eingebracht und im FT-IR-Gerät gemessen. Dabei ergab jederBakterienstamm ein spezifisches Spektrum.

Alle Spektren wurden auf einen HP 1000-Prozeßrechner des Robert-Koch-Instituts übertragen und über die Programme IDENT und IRANA weiterverarbeitet.

Zum Vergleich der Spektren wurden die Korrelationskoeffizienten derkreuzkorrelierten Spektren berechnet und als sog. „Differenzierungs-indizes“ umdefiniert, die Werte von 0 bis 1 000 annehmen konnten. Beidiesem Verfahren wiesen die kleinsten Zahlenwerte auf die größte Ähn-lichkeit zwischen den Spektren der untersuchten Erreger hin. Per defini-tionem müßte der Vergleich identischer Spektren zu einem Differenzie-rungsindex von Null führen. In der Praxis konnte durch die Einhaltungkonstanter Präparationsbedingungen erreicht werden, daß gleiche (zu un-terschiedlichen Zeiten kultivierte) Mikroorganismen Spektren ergaben, de-ren Differenzierungsindizes deutlich unter 10 lagen.

Ergebnisse:

1. Die untersuchten 12 Clostridium -Kulturen ließen sich einfach, schnellund reproduzierbar sowohl zu spektroskopisch erfaßbaren Proben prä-parieren, als auch mittels der FT-IR-Spektroskopie vermessen. Die Er-gebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengefaßt.

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Tab. 2: Korrelationstabelle der Clostridien der „Referenzdatei“. Mit aufgenommen in dieTabelle wurden zwei unbekannte Proben A und B.

Neun der untersuchten Clostridium-Stämme (6 Spezies) zeigten un-tereinander eine starke Korrelation (erkenntlich an den relativ kleinenWerten der Differenzierungsindizes von 15 bis 87), d. h. diese Clostridienmüssen relativ eng miteinander verwandt sein.

Im Gegensatz dazu unterschieden sich C. malenominatum 2 und C. bi-fermentans NCTC 506 beträchtlich von den oben genannten Spezies(erkenntlich an den meist hohen Werten der Differenzierungsindizes, diezwischen 80 und 196 lagen).

Bemerkenswerterweise differierten C bifermentans NCTC 506 und C.bifermentans 27 spektroskopisch erheblich voneinander. Eine Über-prüfung der Stämme ergab, daß es sich tatsächlich um eine biochemischsehr ähnliche, jedoch nicht gleiche Spezies handelte, deren genetischeZugehörigkeit z. Zt. analysiert wird.

2. Auf der Basis der Spektren der ersten Meßserie wurde eine vorläufige„Spektren-Referenzdatei“ aufgebaut, mit deren Hilfe die Identifizierung„unbekannter“ Clostridien versucht wurde. Dazu wurden zwei CIo-stridium-Stämme, deren Identität dem Untersucher nicht bekannt war,

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spektroskopisch analysiert: Die kleinsten Differenzierungsindizes für Aund B (14 und 9) wurden durch Korrelation von A mit C bifermentansNCTC 506 bzw. von B mit C. perfringens 691 erhalten. A und B warendamit eindeutig identifiziert (A = C. bifermentans NCTC 506, B = Cperfringens 691).

3. Über die Differenzierung und Identifizierung hinaus konnten erste An-haltspunkte darüber gewonnen werden, daß via FT-IR-Spektroskopieauch der Versporungsprozeß von Clostridien erkannt und zeitlich ver-folgt werden kann. Diese Hinweise ließen sich am Beispiel der Diffe-renzspektren zweier unterschiedlicher, versporter bzw. nicht-versporterClostridium-Spezies (C bifermentans NCTC 506 und C perfringens 691)dokumentieren.

4. Erwartungsgemäß ergaben sich Unterschiede zwischen gleichen Kultu-ren, die auf Hefeextrakt-Cystein-Blutagar bzw. auf Blutagar gewachsensind (geringe Unterschiede bei C difficile 13720, große bei C septicum 28).Die Beibehaltung eines einheitlichen, möglichst gut standardisiertenNährbodens erscheint daher essentiell. Da hier der sogenannte Spektral-bereich der Polysaccharide für die Differenzierung genutzt wurde, deutendie Ergebnisse daraufhin, daß unterschiedliche Nährböden durchaus auchunterschiedliche Polysaccharid-Ausstattungen der Zellwand bedingenkönnen.

Beurteilung:

Diese Ergebnisse dokumentierten, daß mittels der FT-IR-Spektroskopieauch anaerobe sporenbildende Bakterien wie die Clostridien sehr schnellund sogar über die Speziesebene hinaus differenziert werden können. Dervorläufigen Spektren-Referenzdatei war zu entnehmen, daß auch eine ex-akte Identifizierung bis zur Stammebene möglich wurde. Diese Vorver-suchsbefunde waren ein weiteres Beispiel für die Leistungsfähigkeit derneuen Methode hinsichtlich der Differenzierung und Identifizierung vonMikroorganismen und ermutigte die Arbeitsgruppe am Robert-Koch-In-stitut und die Fa. Bruker zur Weiterentwicklung des FT-IR-Spektrometersund der Analysetechniken.

2.2 Anwendung der FT-IR-Spektroskopie zur Differenzierungvon Clostridium cochlearium, C. malenominatum,C. tetanomorphum und C. tetani

Unsere Versuche zur Differenzierung und Identifizierung von Clostridium-Spezies mit der Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FT-IR) konnten

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1988 in Zusammenarbeit mit dem Robert-Koch-Institut (Dr. Naumann)wieder aufgenommen werden (HELM et al., 1991). Es hatte zwischenzeit-lich eine Verzögerung gegeben, da alle bis dahin gespeicherten Daten aufeinen neuen Rechner übertragen werden mußten. Aus den damaligen Be-funden soll ein Beispiel herausgegriffen werden, das die Effektivität dieserMethode verdeutlicht:

Die 4 Spezies Clostridium cochlearium, C. malenominatum, C. tetanomor-phum und C. tetani sind biochemisch sehr ähnlich, was dazu führte, daß dieSpezies C. tetanomorphum in der letzten Auflage von Bergey's Manual ofSystematic Bacteriology (CATO et al., 1984) nicht mehr aufgeführt wurde.Das hatte zur Folge, daß in unserer Stammsammlung alle biochemisch ähn-lichen Stämme ohne Indolbildung unter C. cochlerarium, mit Indolbildungunter C. malenominatum eingeordnet wurden, mit der Feststellung, daß dieStämme in der Zuckerverwertung geringfügig heterogen waren.

Aufschlußreich für unsere Untersuchungen war nun, daß mittels der FT-In-frarotspektroskopie C. tetanomorphum von den 3 anderen Spezies C. coch-learium, C malenominatum und C. tetani unterschieden werden konnte. ImDendrogramm waren die Spezies und die dazugehörigen Stämme in ge-trennten Clustern lokalisiert (s. Abbildung 1).

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Dazwischen befanden sich 5 Clostridium-Stämme, deren Identität nochnicht klar ist. Wir haben noch weitere Isolate und Referenzstämme von C.cochlearium und C. tetanomorphum der FT-IR-Spektroskopie unterworfenund erhielten sehr gute, übereinstimmende Ergebnisse.

Parallel, aber unabhängig von dieser Analyse, konnte in Zusammenarbeitmit einer Göttinger Arbeitsgruppe (WILDE et al., 1989) C. tetanomorphummittels Zellwand- und DNA-Analyse als eigenständige Spezies identifiziertwerden.

Es wurden insgesamt 50 Clostridium -Stämme analysiert (3 C. cochlearium, 1C. malenominatum, 33 C. tetanomorphum, 8 C. tetani, 5 C. species). DieDNA-Homologie der homologen Stämme jeder Spezies betrug 82 %, wäh-rend die von C. tetanomorphum zu C. cochlearium und zu C. melanomina-tum nur 10-19 % betrug.

Trotz der ursprünglich falschen Benennung der Clostridium-Stämme (s. o.)konnten in beiden getrennt vorgenommenen Untersuchungen alle Stämmeeinwandfrei zu der richtigen Spezies zugeordnet werden.

Erwähnt sei weiterhin, daß unsere biochemischen Untersuchungen und dieSensibilitätsprüfungen gegen 20 Antibiotika die neue Zuordnung derStämme unserer Sammlung zu C. tetanomorphum ebenfalls voll bestätigten:C. tetanomorphum bildet neben Essig- und Buttersäure sehr viel Butanol,fermentiert Glucose, Maltose und Inosit schwach (pH 5,8) und hat eine etwa20fach geringere Empfindlichkeit gegen die Antibiotika Latamoxef undCefoperazon als die drei anderen Spezies, die asaccharolytisch sind und nurwenig Butanol produzieren.

Dieser Unterschied in der Butanolmenge ist sehr deutlich und kann alsDifferenzierungsmerkmal gelten. C. tetani bildet als einzige der 4 SpeziesGelatinase und ist somit von den anderen 3 unterscheidbar. Darüber hinauswaren 6 der 8 Stämme Tetanustoxin-Bildner.

Indolbildung war bei einzelnen Stämmen aller 4 Spezies vorhanden undkann somit nicht – wie in Bergey's Manual angegeben – zur Unterscheidungvon C cochlearium und C. malenominatum verwendet werden.

Aufgrund der hier erörterten Kriterien ist es nicht möglich, C cochleariumund C malenominatum zu unterscheiden. In dem Proteinmuster, ermitteltdurch die Polyacrylamidgel-Elektrophorese, ergaben sich jedoch deutlichunterscheidbare Banden zwischen den beiden Spezies, was für ihre Eigen-ständigkeit spricht. Da bisher jedoch nur 1 C. malenominatum-Stamm ana-lysiert wurde, sollen die Untersuchungen fortgesetzt werden.

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Beurteilung:

Die FT-IR-Spektroskopie scheint somit eine recht erfolgversprechendeMethode sowohl für die Schnelldiagnostik als auch für phylogenetischeStudien zu sein.

2.3 Erarbeitung von FT-IR-Referenzspektren für dieClostridium-Datei

In der Zwischenzeit wurde von der Fa. Bruker das FT-IR-Spektrometerweiterentwickelt, mehrfach umkonstruiert und mit einer EDV ausgestattet,die eine schnelle Auswertung der Spektren erlaubt.

Seit 1992 haben wir dank der Unterstützung der Schutzkommission ein ei-genes Gerät. Für die Einweisung in die Meßsoftware des FT-Infrarot-spektrometers und die Präparationstechnik für die Messung der Bakterienwurde 1992 ein spezieller 4 1/2-tägiger Schulungskurs von Dr. Naumann undseinen Mitarbeitern am Robert-Koch-Institut Berlin durchgeführt.

Die Handhabung der Geräte, die Vorbereitung und Messung der Probensind problemlos und schnell. Pro Arbeitsgang können 15 Proben (Bakte-riensuspensionen) auf eine ZnSe-Scheibe aufgetragen werden, kurz imVakuum getrocknet und innerhalb kürzester Zeit gemessen werden. Das aufdem Bildschirm erscheinende Spektrogramm kann automatisch ausge-druckt und in einem Rechner bearbeitet werden.

Zur Standardisierung der Meßtechniken und der Geräte wurden im Rah-men eines Ringversuches mit 10 Teilnehmern 14 verschiedene Bakterien-spezies mehrfach (10 χ ) unter vorgegebenen Kulturbedingungen gemessen.Ziel dieser Testmessungen war, die Geräte seitens der Fa. Bruker zu ver-bessern und so zu normen, daß später die Dateien wechselseitig benutztwerden können.

1993 und 1994 wurde unsererseits intensiv an der Erstellung der Referenz-spektren von definierten Clostridium-Stämmen und dem Aufbau der Datei fürdie Differenzierung und Identifizierung von Clostridium-Spezies mittels derFourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FT-IR-Spektroskopie) gearbeitet.Wir haben 29 Clostridium-Spezies mit 2 bis 20 Stämmen in die Unter-suchungen einbezogen, so daß sich eine Gesamtzahl von ca. 250 zu messendenStämmen mit insgesamt 3 500 Spektren ergab, die analysiert werden mußten.

Verfahren:

Die Kultivierung des zu untersuchenden Clostridium-Stammes erfolgte alsReinkultur zweimal im Dreiquadrantenausstrich auf Columbia-Agar mit

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Schafblut (Oxoid RPP 008 B) der Firma Unipath, der sich in Vorversuchenals besonders geeignet und von gleichbleibender Qualität erwiesen hatte.Die Bebrütung erfolgte anaerob 24 + 2 Stunden bei 37°C. Mit einer kali-brierten vibrierenden Platinöse wurden die Bakterienkulturen direkt vomAgar aufgenommen und im Eppendorfgefäß mit 80 μl Aqua dest. suspen-diert, wobei kein Agar mit überführt werden durfte. Außerdem war daraufzu achten, daß das Probenmaterial ausschließlich von zusammen-wachsenden Kolonien des 3. Quadranten der zweiten Passage stammte.Einzelkolonien veränderten das Ergebnis wegen des relativ höheren Anteilsan Zellwand.

Von der Bakteriensuspension wurden 35 μl auf ein Feld des Probenrades(ZnSe-Scheibe) gleichmäßig und ausfüllend aufgetragen. In einem Unter-suchungsgang konnten 15 Kulturproben auf einen Probenträger aufgebrachtund analysiert werden. Das Probenfeld 0 mußte immer leer bleiben, da es alsBlindwert diente. Der Probenträger wurde nach dem Trocknen im Vakuummit einer KBr-Scheibe als Küvette verschlossen. Die Messung der Probenerfolgte im FT-IR-Spektrometer IFS 25/B der Firma Bruker und wurde überein Computerprogramm gesteuert, in dem die Meßparameter standardisierteingegeben sind. Jeder Bakterienstamm ergab ein spezifisches Spektrum.

An die Präparation und Messung werden verschiedene Bedingungen ge-knüpft, um vergleichbare Ergebnisse zu gewährleisten. So muß eine be-stimmte Probendichte gegeben sein und beim Messen ein bestimmtes Ver-hältnis von Signal zu Grund-Rauschen bzw. Wasserdampf. Diese Parameterwerden durch Erstellung eines Quality-Testes überprüft.

Ergebnisse und Diskussion:

Vorbemerkung: Zur Erstellung einer Datei müssen die erhaltenen FT-IR-Spektren von Fehlmessungen bzw. „Ausreißern“ gereinigt werden. Hierzuwird die Clusteranalyse eingesetzt, die ein Dendrogramm berechnet, das wieein Stammbaum anhand festgelegter Merkmale Verwandtschaftsgrade auf-zeigt. Die Clusteranalyse vergleicht die zu untersuchenden Spektren imBereich ausgewählter Wellenzahlen, bei denen es zu einer optimalen Auf-trennung verschiedener Spezies eines Genus kommt.

Ein Cluster kann als optimal angesehen werden, wenn die verschiedenenMessungen eines Stammes nahe und gleichmäßig beieinander liegen (sieheAbb. 2, Cluster a). Es ist aber auch möglich, daß sich bei einem Stammmehrere Cluster bilden, z.B. durch unterschiedlich fortgeschrittene Spo-renbildung (siehe. C. putrificum Abb. 2) oder durch unterschiedliche Men-gen eingelagerter Reservestoffe. Liegt eine Messung des gleichen Stammesabseits (siehe Abb. 2, IMM00622.0), so ist sie als Fehlmessung einzuordnen.

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1. In den Abbildungen 2 bis 4 sind das Dendrogramm und die Spektren vonC. putrificum 4 dargestellt. Zu erkennen sind in der Abbildung 2 zweiCluster (a und b), die weit voneinander entfernt liegen, die aber in sichrelativ homogen sind. Vergleicht man die gemessenen Spektren der bei-den Cluster (Abb. 3 und 4), so ist zu erkennen, daß alle Messungen desClusters b erhöhte Signale bei folgenden Wellenzahlen aufweisen:1 279 cm-1, 767 cm-1, 728 cm-1, 703 cm-1 und 660 cm-1. Diese genanntenWellenzahlen sind dem Vorhandensein von Dipicolinsäure zuzuordnen.Da die Dipicolinsäure ein Hauptbestandteil der Sporen ist, kann mandavon ausgehen, daß die Kultur-Präparationen zu diesen Messungeneinen höheren Sporulationsgrad aufwiesen. Da die Sporulation einesStammes als natürliche Varianz anzusehen ist, müssen beide Cluster alsReferenz in die Datei eingehen.

25

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2. Nach Aussortieren der Fehlmessungen wurde von den verbleibendenMessungen des Referenzstammes erneut ein Cluster gebildet, aus dem 3Messungen mit möglichst hoher Varianz ausgewählt wurden. Bildete einStamm mehrere Cluster, so wurden aus jedem Cluster 3 Messungen aus-gewählt. Diese 3 gemessenen Spektren wurden auf einen gemeinsamenMaximalwert von 2,0 normiert, um den Einfluß unterschiedlich dichterProbenfilme auszuschließen. Davon wurde ein Mittelwert gebildet. Dieerste Ableitung dieses Mittelwertes ging als Referenz für den jeweiligenStamm in die Datei ein, die als Bestandteil eines „Identity-Tests“ dieDifferenzierung unbekannter Isolate erlaubt.

3. Für die Erstellung der vorläufigen Datei haben wir 29 Clostridium-Spe-zies mit 2 bis 20 Stämmen ausgewählt und nach dem oben beschriebenenVerfahren gemessen und analysiert. Von jedem Stamm wurden 8 bis 12Kulturen unter Verwendung verschiedener Columbia-Blut-Agar-Char-gen FT-IR-spektrometrisch analysiert, wobei sich insgesamt 3 500 Spek-tren ergaben. Eine vorläufige Datei zeigt Abbildung 5, in die wir jeweils2 Stämme einer Spezies aufgenommen haben. Bei allen Stämmen ergabsich im Dendrogramm eine einwandfreie Zuordnung zu der betreffendenSpezies.

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Abb. 5: Vorläufige Clostridium-Datei mit 29 Spezies.Dendrogramm für Messungen von jeweils zwei Stämmen einer Clostridium-Spezies:die verschiedenen Spektren der gleichen Spezies sind in einem Cluster zusammengefaßt.

4. Die Datei wurde von uns inzwischen mehrfach intern benutzt zur Be-stätigung von Clostridium-Isolaten aus der Routine und von DSM-Stäm-men, die wir zuvor biochemisch identifiziert hatten. In allen Fällenstimmte die FT-IR-spektroskopische mit der biochemischen Identifizie-rung überein.

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Gelegentlich kam es zu Zufallsbefunden, die die Effizienz der Methodeund ihre taxonomische Einsatzfähigkeit untermauern. So wurde uns einals C. lituseburense identifizierter Bakterienstamm zugeschickt, bei des-sen Differenzierung wir unterschiedliche Kolonien feststellten. Wir iso-lierten weiße und farblose Kolonien und führten von beiden FT-IR-spektroskopische Messungen durch. Die so erhaltenen Spektren vergli-chen wir in der Clusteranalyse mit unserer Datei. Das Isolat mit denweißen Kolonien ordnete sich im Dendrogramm eindeutig der SpeziesC. bifermentans zu, was mit der konventionellen biochemischen Identifi-zierung bestätigt werden konnte. Das Isolat mit den farblosen Kolonienbildete ein eigenes Cluster (siehe Abb. 6 a und 6 b). Biochemisch han-delte es sich bei diesem Isolat um C. lituseburense. Somit war der er-haltene Bakterienstamm eine Mischkultur aus C. bifermentans und C. li-tuseburense.

Ein zweites Beispiel war der Typstamm von C. putrificum (DSM 1734),der von uns biochemisch und FT-IR-spektroskopisch eindeutig alsC. sporοgenes identifiziert wurde. Da dieser Typstamm auch in anderenLabors als Kontrollstamm für die Identifizierung von C. putrificum-Iso-laten und für genetische Studien verwendet wurde, hat diese Verwechs-lung weltweit für Aufregung gesorgt, weil es daraufhin zu Fehlinter-pretationen der Spezies C. putrificum kam.

Beurteilung:

Nach unseren bisherigen Erfahrungen ist die FT-IR-Spektroskopie zurIdentifizierung von Bakterien auch von Clostridium-Spezies sehr gut ge-eignet. Ebenso erlaubt sie eine Differenzierung verschiedener Stämme einerSpezies, was wir an epidemiologisch interessanten Staphylococcus aureus-Stämmen aus verschiedenen Untersuchungsmaterialien und Infektions-quellen zeigen konnten (siehe Kapitel 2.4, S. 31 ff).

Die Bedienung des FT-IR-Spektrometers, die Vorbereitung und Messungder Proben (Bakterien) sind problemlos und schnell. Zur Standardisierungder Verfahrensweise wurden vom Robert-Koch-Institut Berlin (P. D. Dr.Dieter Naumann) detaillierte Angaben in einem Arbeitsjournal nieder-gelegt, worin auch auf Fehler und deren Vermeidung hingewiesen wird. ProArbeitsgang können 15 Proben (Bakterienstämme) innerhalb kürzester Zeit(45 Minuten) gemessen werden. Das auf dem Bildschirm erscheinendeSpektrogramm kann automatisch ausgedruckt, in einem Rechner bearbeitetund ggf. in eine vorhandene Referenzdatei zwecks Identifizierung des Bak-teriums eingegeben werden.

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Ausgehend von einer Reinkultur dauert die Identifizierung eines CIo-stridium-Stammes einen Tag, mit den bisherigen biochemischen Methoden 3bis 5 Tage.

Abb. 6 a: Identifizierung von C. lituseburense 972 (Mischkultur).Im Dendrogramm der vorläufigen Clostridium-Datei bilden die Spektren vonC. lituseburense 972 farblos ein Extra-Cluster, während die von C. lituseburense 972weiß sich eindeutig in das Cluster von C. bifermentans einfügen (vgl. auch Abb. 6 b).

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Außer den Anschaffungskosten des FT-IR-Gerätes und des Zubehörs fallenfür die Probenanalyse über die Routine hinaus keine zusätzlichen Kostenan.

Abb. 6 b: Identifizierung von C. lituseburense 972.Ausschnitt des betreffenden Bereiches von Abb. 6 a.

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2.4 Epidemiologische Untersuchungen mittels der FT-IR-Spektroskopie im Vergleich zu der Lysotopie undPulsfeldgelektrophorese an Staphylococcus aureus-Isolaten

Da in den letzten Jahren Infektionen durch Methicillin-resistente Staphy-lococcus aureus (MRSA)-Stämme, die meistens multiresistent sind, auch indeutschen Kliniken immer häufiger vorkommen, ist aus epidemiologischerSicht eine schnelle, klare Abgrenzung verschiedener Infektionsgeschehenund deren Aufklärung wichtig. Dies ist seit Jahrzehnten mittels der Lysoto-pie möglich. Es zeigte sich, daß bestimmte MRSA-Typen in weit ausein-anderliegenden Regionen vorkamen, andere dagegen nur lokal begrenztauftraten. Dabei spielte die Patientenverlegung eine entscheidende Rolle.Ziel der durchgeführten Untersuchungen war, zu klären, ob diese Befundedurch die Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) und die FT-IR-Spektroskopiebestätigt werden können (LENZ et al, 1994).

Material und Methoden:

Für die Untersuchungen wurden S. aureus-Isolate herangezogen, die ausklar gegeneinander abgrenzbaren Infektionsgeschehen oder aus unter-schiedlichen Untersuchungsmaterialien jeweils eines Patienten stammten.Alle S. aureus-Stämme wurden unter Standardbedingungen mit dem inter-nationalen Phagensatz und wenn erforderlich, mit regionalen Zusatzphagentypisiert. Parallel dazu wurde ihr Resistenzverhalten gegenüber 16 Chemo-therapeutika geprüft (LENZ, 1991).

Für die Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) wurden die vorbehandeltenBakterienzellen in Agaroseblöcke eingebettet. Nach einer Lysozym-Lyso-staphinbehandlung wurde die DNA der Zellen in dem Agarosegel präpa-riert und dann mit der Restriktionsendonuclease Sma I gespalten. DieDNA-Fragmente wurden in einem CHEF-PRII-System (BioRad, Mün-chen) separiert. Anschließend wurden die Gele nach Färbung mit Ethi-diumbromid fotografiert.

Die Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie wurde, wie zuvor be-schrieben, von S. aureus-Stämmen durchgeführt, die 20 Stunden bei 37°Caerob auf Caso-Agar gezüchtet worden waren.

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Abb. 7: Mittels Lysotypie und FT-IR-Spektroskopie erbrachter Nachweis eines bestimmtenMethicillin-resistenten S. aureus (MRSA)-Typs (Lysotyp III 54/85) bei 2 Patientenund an Gegenständen einer Intensivstation. Der Penicillin-(PE)-resistente 5. aureus-Stamm 89/94 zeigte dagegen ein anderes Phagenreaktionsmuster und ein separatesFT-IR-Cluster.

Ergebnise und Diskussion:

1. Bei einer kleineren Epidemie auf einer Intensivstation wurden aus demTrachealsekret mehrerer Patienten und von Gegenständen aus der Pa-tientenumgebung kurz nacheinander MRSA-Stämme mit gleichem Pha-genreaktionsmuster (III 54/85) isoliert. Bei einem Patienten kam es imLaufe der Erkrankung zur Ausbildung eines Abszesses; aus diesemwurde ein nicht multiresistenter S. aureus-Stamm isoliert, der ein völliganderes Phagenreaktionsmuster (III 6/47/53/83A) besaß als die MRSA-Stämme. Auch das Bandenmuster aus der PFGE dieses Stammes hobsich klar gegen das der übrigen S. aureus-Stämme ab. Wie das Dendro-gramm der FT-IR-Spektroskopie zeigt (Abb. 7), lagen die MRSA-Stämme in einem Cluster zusammen, von dem der nicht multiresistenteStamm klar getrennt war.

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Abb. 8: Verbreitung des MRSA-Lysotyps 29/(83A)/(D11)/192 (BN-Typ) in Deutschland.Die Typisierung erfolgte mit der FT-IR-Spektroskopie: die 7 S. aureus-Stämme des„BN-Typs“ sind identisch, da sie ein Cluster bilden und scharf getrennt sind von demS. aureus-Stamm 34, der einem anderen Lysotyp zugehört.

2. In den Jahren 1992 und 1993 kam es zum vermehrten Vorkommen vonMRSA-Stämmen in zahlreichen Bonner Kliniken. Mit Hilfe der Lysoto-pie konnte gezeigt werden, daß sich ein bestimmter MRSA-Typ (29/(83A)/(D11)/192), kurz „BN-Typ“ genannt, durch Verlegung von Pa-tienten aus einer Intensivstation ausgebreitet hatte. PFGE und FT-IR-Spektroskopie bestätigten diese Beobachtung. Später stellte sich heraus,daß das Vorkommen dieses MRSA-Typs nicht auf den Bonner Raumbeschränkt war; er wurde auch an verschiedenen Orten im Saarland, inBayern und in Hessen nachgewiesen. Dieser zunächst nur mit der Lyso-topie erhobene Befund konnte durch die PFGE und die FT-IR-Spektro-skopie (Abb. 8) erhärtet werden.

3. Bei einem an Sepsis erkrankten Patienten konnten zeitlich nacheinanderaus einem Wundabstrich, aus Blut, Sputum und einem NasenabstrichMRSA-Stämme isoliert werden, die das gleiche Phagenreaktionsmuster

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und in der PFGE das gleiche Bandenmuster ergaben; auch im Dendro-gramm der FT-IR-Spektroskopie bildeten die Stämme ein Cluster(Abb. 9).

4. Bei einem zweiten Sepsis-Patienten wurde mittels der Lysotypie, derPFGE und der FT-IR-Spektroskopie nachgewiesen, daß in der Zentral-venenkatheder(ZVK)-Spitze der gleiche S. aureus-Stamm vorlag wie inder Blutkultur, sich dagegen in der Wunde des Patienten ein andererS. aureus-Stamm befand (Abb. 10).

Abb. 9: Ergebnisse der Lysotypie und der FT-IR-Spektroskopie von S. aureus-Stämmen ausBlut und anderen Untersuchungsmaterialien eines Patienten: die 4 Isolate (gleichesLysisbild und Resistenzmuster) bilden ein Cluster im Dendrogramm.PE Penicillin G, OX Oxacillin, ME Methicillin, CZ Cefazolin, CT Cefotaxim, GE Gentamicin, ER Erythromycin,IM Imipenem, CP Ciprofloxacin

Beurteilung:

Aufgrund dieser Ergebnisse kann die FT-IR-Spektroskopie als eine weiteresehr leistungsfähige, schnelle Methode zur Aufklärung epidemiologischerZusammenhänge, insbesondere bei Krankenhausinfektionen, angesehen

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werden. Sie ist bedeutend schneller und preiswerter als die PFGE, die sichdeshalb nur bedingt für Routineuntersuchungen eignet.

Abb. 10: Bestätigung des Verdachtes einer katheterassoziierten S. aureus-Sepsis mittelsLysotypie und FT-IR-Spektroskopie: der aus dem Wundabstrich am 13. 9. isolierteStamm unterschied sich deutlich sowohl in der Lysotypie als auch in der FT-IR-Spektroskopie von dem aus der ZVK-Spitze und aus dem Blut des Patientenstammenden.

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3 Untersuchungen auf Clostridium difficile

Clostridium difficile wird gelegentlich in eitrigen Gewebsinfektionen ge-funden, vor allem aber als Erreger von Diarrhoe, Colitis und pseudomem-branöser Colitis nach Antibiotikatherapie des Patienten (KARSTEN, 1983).

Ausgelöst werden diese Erkrankungen durch die von C difficile gebildeten 2Toxine, dem Enterotoxin (Toxin A) und dem Cytotoxin (Toxin B), wobeidas Enterotoxin (Toxin A) auch eine, jedoch etwa tausendfach schwächere,Cytotoxizität besitzt. Es wurden bisher keine C difficile-Stämme gefunden,die nur eines der beiden Toxine bildeten, so daß man annimmt, daß für dieToxin-Bildung der gleiche Genbereich verantwortlich ist (ROLFE undFINEGOLD, 1988).

Die mikrobiologische Diagnostik einer C. difficile-Erkrankung kann ausdem Stuhl auf zweierlei Art erfolgen:

1. durch den kulturellen Nachweis des Erregers;2. durch den Nachweis der Toxine.

Der serologische Nachweis von Antikörpern im Patientenserum eignet sichnicht für die Diagnose einer pseudomembranösen Colitis, da die Bildungvon Antikörpern von Patient zu Patient sehr unterschiedlich erfolgt und derAntikörpertiter keine Relation zur Schwere der Erkrankung bietet(ROLFE und FINEGOLD, 1988).

Im Katastrophen- und Verteidigungsfall dürfte die pseudomembranöseColitis infolge vermehrter und weniger kontrollierter Antibiotikagaben we-sentlich häufiger auftreten, als es in Normalzeiten der Fall ist. Es ist daherwichtig, selektive Nährböden und Methoden zum Toxinnachweis zur Verfü-gung zu haben und die Antibiotika-Empfindlichkeit des Erregers zu kennen.

3.1 Kultureller Nachweis

Die Isolierung von C. difficile aus Stuhlproben erfolgt am besten über anti-biotikahaltige Selektivmedien, die das Wachstum der normalen Darmflorahemmen.

3.1.1 Cycloserin- Cefoxitin-Fructose-Agar (CCFA) zur Isolierung vonClostridium difficile

Der Cycloserin-Cefoxitin-Fructose-Agar (CCFA) wurde von GEORGE etal. (1979) zum mikrobiologischen Nachweis von Clostridium difficile ausStuhlproben entwickelt.

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Er enthält neben Nähragar, Fructose und Eigelb-Emulsion die beiden An-tibiotika Cycloserin (500 μg/ml) und Cefoxitin (16 μg/ml), gegen die C. dif-ficile resistent ist. Er ist in etwas abgewandelter Form inzwischen von Uni-path und anderen Firmen erhältlich.

Auf CCF-Agar wächst C. difficile nach 40-48 Stunden anaerober Bebrütungbei 37°C in 2-5 mm großen gelblich cremigen Kolonien, leicht erhaben, mitfransigem, gelegentlich auch glattem Rand und gelbgrüner Fluoreszenz un-ter UV-Licht.

Methodik:

Die Spezifität dieses Selektivnährbodens und damit seine Verwendbarkeitzur routinemäßigen Stuhlprobenuntersuchung auf C. difficile wurden ge-prüft, indem 78 an die Medizinal-Untersuchungssteile des Instituts für Me-dizinische Mikrobiologie und Immunologie Bonn gesandte Stuhlproben aufCCFA ausgestrichen und die Nährböden nach 48 Stunden anaerober Be-brütung bei 37°C auf Wachstum von Bakterien und Pilzen, insbesonderevon Clostridium-Spezies, neben C. difficile, untersucht wurden (ZINK,1984).

Ergebnisse:

Neben zahlreichen grampositiven und -negativen Stäbchenbakterien, Kok-ken, Sproßpilzen wurden Clostridium-Spezies wie C. carnis (1), C. cochlea-rium (2), C. difficile (2), C. innocuum (2), C. perfringens (1) und C ramosum(14) isoliert. Auch ein C. tertium- und C. cochlearium-Laborstamm wuchsenauf CCFA.

Alle isolierten Stämme wurden biochemisch und gaschromatographischidentifiziert und im Mikroverdünnungstest auf ihre In-vitro-Empfindlich-keit gegen Cefoxitin und andere Antibiotika getestet.

Die MHK-Werte von Cefoxitin für diese Stämme lagen alle über 16 μg/ml,der Konzentration also, die der CCF-Agar enthielt.

Beurteilung:

Die Selektivität dieses Nährbodens für C. difficile ist demnach nicht be-sonders groß. Auch die von GEORGE et al. (1979) als Identifizierungs-kriterien angegebene CCFA-Verfärbung nach gelb und grünliche Fluores-zenz der C. difficile-Kolonien unter UV-Licht erwiesen sich als relativunspezifisch. Der CCFA kann demnach nur zur Anreicherung und Vor-

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selektierung von C. difficile (Dauer: 20-48 Stunden) dienen, für die Identi-fizierung müssen jedoch weitere biochemische Tests und der Nachweis derToxinbildung angeschlossen werden.

3.2 Identifizierung

Da die konventionelle Identifizierung der Clostridien 5-10 Tage dauert,haben wir 2 Schnellmethoden zur Identifizierung von C. difficile geprüft, diesich als recht brauchbar erwiesen: den gaschromatographischen Nachweisvon Capronsäure und p-Kresol, die von C difficile aus Norleucin und Tyro-sin (NT-Bouillon) gebildet werden, und den Latex-Agglutinationstest(FrekaR MicroScreenR, Fresenius).

3.2.1 Norleucin- Tyrosin-Bouillonkultur zur Identifizierung vonC. difficile mittels Gaschromatographie

Die von NUNEZ-MONTIEL et al. (1983) entwickelte Methode zurSchnellidentifizierung von C. difficile beruht auf dem gaschromato-graphischen Nachweis von Capronsäure und p-Kresol, die von C. difficileaus Norleucin und Tyrosin gebildet werden. Es interessierte uns, wie spezi-fisch dieser Nachweis ist.

Verfahren:

Als Vorkultur wurde Tarozzi-, Rosenow- oder Hackfleischbouillon mit denTeststämmen der Clostridium-Spezies beimpft und 24 Stunden anaerob bei37 0C bebrütet. Von dieser Vorkultur wurde 1 ml in 9 ml Norleucin-Tyrosin-(NT)-Bouillon überführt. Nach 24-48stündiger Bebrütung bei 37°C imGasPakR-Topf wurden die flüchtigen Fettsäuren im Kulturüberstand nachAnsäuerung auf pH 2 mit 2,5 ml Ether ausgeschüttelt. 1 μl des Etherex-traktes wurde anschließend gaschromatographisch auf flüchtige Fettsäurenund p-Kresol analysiert.

Ergebnisse und Beurteilung:

Es wurden 37 verschiedene Clostridium-Spezies mit insgesamt 67 Stämmenin dieser NT-Bouillon getestet. Capronsäure konnte in der Kultur von 6Clostridium-Spezies nachgewiesen werden (C. bifermentans, C. difficile,C. cochlearium, C. oceanicum, C. sordelliu C. sporogenes). Aber außerC difficile bildete keine Spezies p-Kresol. Somit kann dieser Test als sehrspezifisch eingestuft werden und erlaubt auch ohne weitere biochemischeDifferenzierung die Identifizierung von C. difficile und den Ausschluß an-derer Clostridien. Die Dauer des Tests beträgt ca. 2-3 Tage.

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3.2.2 Latex-Agglutinationstest (FrekaR MicroScreenR, Fresenius) zurschnellen Identifizierung von Clostridium difficile-Bakterien

Die Anzüchtung von Clostridium difficile aus dem Patientenstuhl und dieIdentifizierung des Bakteriums ist ein langwieriger Prozeß, der sich mitkonventionellen Methoden über 1-2 Wochen erstreckt.

Zur Beschleunigung der Identifizierung von C difficile wurde von der Fa.Fresenius ein Latex-Agglutinationstest (FrekaR MicroScreenR C. difficile)entwickelt und auf den Markt gebracht. Mit diesem Agglutinationstest kön-nen C difficile-Bakterien nach ihrer Anzüchtung aus dem Patientenstuhl so-wohl von der Selektivagarplatte als auch aus der Anreicherungskultur in Cy-closerin-Cefoxitin-Bouillon (20 Stunden 37°C) identifiziert werden.

Testprinzip:

Latex-Partikel sind mit spezifischen IgG-Antikörpern gegen C difficile-Zellwandantigene gekoppelt. 1 Tropfen dieses Reagenzes wird auf demObjektträger entweder mit 1 Tropfen der Selektivbouillonkultur oder miteiner Suspension der Bakterienkolonie von einem festen Nährmedium ge-mischt. Innerhalb von 2 Minuten agglutinieren die Latex-Partikel zu großen,sichtbaren Klumpen. Fehlt diese Agglutination, so ist C difficile als Erregerauszuschließen.

Zur Kontrolle wird das C. difficile-Reagenz mit 1 Tropfen phys. NaCl-Lo-sung vermischt und auf Agglutination überprüft. Eine Autoagglutinationder Testkultur soll ebenfalls mit phys. NaCl-Lösung ausgeschlossen werden.

Wir hatten uns die Aufgabe gestellt, die Spezifität dieses Testes zu überprüfena) mit bekannten Clostridium-Stämmen, b) mit Patientenstuhlproben.

a) Wir untersuchten insgesamt 161 Stämme von 27 uns verfügbaren CIo-stridium-Spezies mit dem Latex-Reagenz und verwendeten sowohlBouillon- als auch Plattenkulturen.

Ergebnisse:

Wie aus der Tabelle 3 zu ersehen ist, agglutinierten alle 13 C. difficile-Stämme mit dem Reagenz, aber auch die Kulturen von C. bifermentans,C clostridioforme (1/4), C glycolicum, C ramosum, C sordellii wiesenKreuzreaktionen mit den C. difficile-Antigenen im Reagenz auf.

Weiterhin agglutinierten ebenfalls einzelne Stämme von C hastiforme,C. perfringens und C subterminale (in Bouillonkultur oder auf Hefeex-trakt-Cystein-Blutagar angezüchtet).

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Tab. 3: Zur Spezifität des Latex-Agglutinationstestes (FrekaR MicroScreenR C. difficileFresenius).

Hefeextrakt-Cystein-BlutagarTarozzi- bzw. Fleischbouillon

Beurteilung:

Diese Ergebnisse besagen, daß bei einem positiven Ausfall des Latex-Agglutinationstestes nicht unbedingt auf C. difficile geschlossen werdenkann. Zur Sicherung der Ergebnisse sollten eine Subkultur der Bakterienauf CCF-Agar erfolgen und die Kolonien erneut mit dem Kit getestetwerden, wie die Fa. Fresenius empfiehlt.

Da außer C difficile nur C. ramosum gegen Cefoxitin resistent ist, wach-sen die anderen 4 Clostridium-Spezies nicht auf CCF-Agar.

Die Spezifizität des Testes wird erhöht, wenn für die Anzucht von C. dif-ficile gleich Selektivmedium verwendet wird.

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Darüber hinaus lassen sich C. bifermentans und C. sordellii auf Eidotter-agar durch die Produktion der Lecithinase von C. difficile unterscheiden.

Diese zusätzlichen Tests verzögern jedoch die Befundmitteilung minde-stens um 1-2 Tage, so daß die Diagnose frühestens am 3. Tag gestelltwerden kann.

b) 50 Stuhlproben von 42 Patienten wurden in Cefoxitin-Cycloserin-Fruc-tose-Bouillon aufgeschwemmt und über Nacht bei 37°C anaerob be-brütet. Je 1 Tropfen von diesen Bouillonkulturen wurde dann mit je 1Tropfen Latex-Reagenz auf Objektträgern auf Agglutination geprüft.Zum Vergleich wurde der C. difficile-Cytotoxin-Gehalt der Stuhlprobenmittels Lungenfibroblasten-Zellkultur getestet (Methode s. Kap. 4.1,S. 45).

Ergebnisse: (s. Tab. 4)

Die Stuhlproben von 21 Patienten waren in beiden Tests positiv: Sie ent-hielten C. difficile-Bakterien bzw. C. difficile-Toxin. Die Proben von 19Patienten waren in beiden Tests negativ. 2 Proben waren im Toxintestnegativ, im Agglutinationstest jedoch positiv. Die Erklärung dafür war,daß die beiden Stuhlproben C. ramosum enthielten, die mit dem Latex-Reagenz agglutinierten. Entsprechende Kontrollen (13 toxinbildendeund 2 nicht toxinbildende C. difficile-Stämme) wurden mitgeführt undergaben eindeutige Ergebnisse.

Tab. 4: Nachweis von C. difficile-Toxin mittels Zellkultur* und C. difficile-Bakterienmittels Latex-Agglutination+ in Stuhlproben von 42 Patienten.

humane embryonale LungenfibroblastenFa. Fresenius

Beurteilung:

Die Ergebnisse besagen, daß der Latex-Agglutinationstest im negativenFall ein eindeutiges Ergebnis liefert, im positiven Fall ist ein zusätzlicherCytotoxin-Nachweis anzuraten, um nichttoxinogene C. difficile-Stämme

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und andere kreuzagglutinierende Clostridien auszuschließen. Da dieReaktionen sehr gut ablesbar sind, ist der Test als Alternative zum Toxin-Nachweis mittels Zellkultur durchaus geeignet.

3.3 Antibiotika-Empfindlichkeit

Da eine Vielzahl von Antibiotika verdächtigt worden ist, Auslöser einerpseudomembranösen Colitis gewesen zu sein, interessierte uns die Antibio-tika-Empfindlichkeit unserer C. difficile- und weiteren Clostridium-lsolateaus dem Stuhl von Diarrhoe-Patienten.

Für die Testung der isolierten Clostridium-Stämme wurden die Antibiotikaausgewählt, die während der Primärerkrankung den Patienten verabreichtworden waren, wie Cefoperazon, Ceftazidim, Erythromycin und Lamo-xactam.

Da eine C difficile-Infektion mit Vancomycin erfolgreich therapiert wird,haben wir Vancomycin in unsere Testungen mit einbezogen (s. Tabelle 5).

Ergebnis:

Die im Mikroverdünnungstest ermittelte minimale Hemmkonzentration(MHK) zeigte, daß eine Resistenz bestand

- gegen Cefoperazon bei 8 von 11 C. difficile- und bei 15 von 21 C. ter-tium,-Stämmen,

- gegen Ceftazidim bei allen Stämmen von C. butyricum und C. tertiumsowie bei 10 von 11 C difficile- und 6 von 15 C. paraputrificum-Stäm-men,

- gegen Erythromycin bei 1 von 11 Stämmen C. difficile und 2 von 21C. tertium,

- gegen Lamoxactam bei allen 11 C. difficile-Stämmen und 1 C. tertium-Stamm.

Gegen Vancomycin waren alle Stämme der 4 Spezies empfindlich.

Beurteilung:

Die C. difficile-Isolate waren überwiegend resistent gegen Cefoperazon,Ceftazidim und Lamoxactam. Es kann somit nicht ausgeschlossen werden,daß die Therapie mit einem dieser Antibiotika die C. difficile-Erkrankungbei dem betreffenden Patienten ausgelöst hat.

43

Keine Resistenz bestand bei den 11 Isolaten und weiteren 13 C. difficile-Stämmen unserer Sammlung gegen Penicillin G, Ciprofloxacin, Vancomycinund die Imidazolderivate (Metronidazol, Ornidazol, Tinidazol). Diese An-tibiotika können für eine erfolgreiche Therapie angewendet werden. Überdie Cytotoxizität der Clostridium-lsolate wird auf S. 61 berichtet.

Tab. 5: Anzahl der resistenten Clostridium-Stämme. Testung der Antibiotika-Empfindlichkeit im Mikroverdünnungstest (Schaedler-Bouillon anaerob 37 °C).

44

4 Methoden zum Nachweis clostridieller Toxine

Üblicherweise werden zum Nachweis clostridieller Toxine Mäuse ver-wendet, für den Nachweis der Pathogenität von Clostridien Meerschwein-chen. In der letzten Zeit hat sich gezeigt, daß sich a) Zellkulturen, b) mitspezifischen Antikörpern beladene Latexpartikel und c) das ELISA-Ver-fahren zur Bestimmung von Toxinen eignen. Es wurde deshalb geprüft, in-wieweit diese Methoden zum Nachweis und zur Bestimmung der clo-stridiellen Toxine verwendbar sind und ob dadurch der Tierversuch zumNachweis der Pathogenität und zur Identifizierung der Gasödemerregeroder zum Nachweis von Tetanus- bzw. Botulinum-Toxin entbehrlich wird.Dies würde einer wesentlichen Forderung des Tierschutzes entsprechen.

4.1 Nachweis von clostridiellen Cytotoxinen mittelsLungenfibroblastenkultur

Methode:

Clostridium-Stämme wurden 48-72 Stunden bei 37°C in Tarozzi- oderHackfleischbouillon bebrütet, die Kulturüberstände sterilfiltriert und bis zurVerwendung bei 4 0C aufbewahrt. Als Zellkulturen wurden 2 Tage altemenschliche embryonale Lungenfibroblasten (HEF) in Mikrotiterplattenverwendet, die nach Beimpfung mit 10-100 μl toxinhaltigem Kulturfiltrat24-72 Stunden bei 37°C im CO2-Brutschrank inkubiert wurden und dannauf cytopathische Veränderungen durchgesehen wurden.

Als Kontrollen dienten die entsprechenden sterilen Nährmedien.

Ergebnisse:

Es wurden 243 Stämme unserer Stammsammlung von 36 Clostridium-Spe-zies in die Untersuchungen einbezogen und auf Cytotoxinbildung geprüft.Bei 15 Spezies fanden sich cytotoxinbildende Stämme.

Die Veränderungen und Schädigung der Lungenfibroblasten durch dieseCytotoxine wurden photographisch festgehalten und vergleichend aus-gewertet (SCHALLEHN und WOLFF, 1988). Dabei stellte es sich heraus,daß die cytopathischen Veränderungen, hervorgerufen durch die be-treffenden Clostridium-Toxine, Spezies-spezifisch und so charakteristischwaren, daß sie direkt zur Spezies-Identifizierung mit herangezogen werdenkonnten. Die beobachteten cytopathischen Effekte (CPE) in humanen em-bryonalen Lungenfibroblasten ließen sich im Vergleich mit der Zellkon-trolle folgendermaßen charakterisieren:

45

C. chauvoei: feines Zellnetz, strichförmige ZellenC difficile: RundzellenC. hastiforme: lochartig aufgerissener ZellrasenC. histolyticum: Zellen semikolonartigC. limosum: grob-netzartiger Zellrasen mit kleinen ZellaggregatenC. novyi Typ A: längliche Zellen, aufgelockerter RasenC. novyi Typ B: Rundzellen und feine LangzellenC. oceanicum: ungeordnete strichförmige ZellenC putrificum: Lochherde, langgezogener ZellverbandC. ramosum: Rundzellen, starke Auflockerung des ZellrasensC. septicum: strichförmige ZellenC. sordellii: zerrissener Zellrasen, Lang- und RundzellenC. sporogenes: schollenartig zerrissener ZellrasenC. subterminale: Streifung des Zellrasens mit WirbelnC. tetani: feinlöchriger Zellrasen, ungeordnete Zellagerung.

Beurteilung:

Der Nachweis von Cytotoxinen mittels Zellkulturen ist relativ einfachdurchführbar und gut reproduzierbar. Er erfordert wenig Zeit und Material;er ist deshalb in ungünstigen Zeiten (Katastrophen, Krieg) praktikabel. DieErgebnisse sind innerhalb 20 und 48 Stunden verfügbar.

4.2 Verwendbarkeit der Lungenfibroblastenkultur als Ersatzfür den Tierversuch. Vergleich der Cytotoxizitätund Pathogenität von Stämmen verschiedenerClostridium-Spezies

Im Zusammenhang mit der Prüfung von Zellkulturen zum Nachweis clo-stridieller Cytotoxine wurde untersucht, inwieweit die Cytotoxizität mit derPathogenität der Clostridium -Stämme übereinstimmte und ob der Tier-versuch durch die Zellkultur ersetzt werden kann (SCHALLEHN undWOLFF, 1988).

Ergebnisse:

Es wurden 243 Stämme von 36 Clostridium-Spezies auf Cytotoxin-Produk-tion geprüft. Unter den gewählten Versuchsbedingungen bildeten die toxi-nogenen Stämme der menschen- bzw. tierpathogenen Clostridium-SpeziesC. chauvoei, C. difficile, C. histolyticum, C. novyi, Typ A, Typ B, C. septicumund C tetani in Hackfleischbouillon während der Bebrütungszeit von 48Stunden (37°C) ein Cytotoxin für humane embryonale Lungenfibroblasten.

46

Der Cytotoxingehalt der Kulturen wurde nur qualitativ bestimmt. Die fürMeerschweinchen bzw. Mäuse atoxischen Stämme dieser Clostridium-Spe-zies produzierten in keinem Fall ein Cytotoxin.

Die Cytotoxizität der C. novyi-Kulturfiltrate beruhte auf dem Vorhanden-sein des Alpha-Toxins: Alle Filtrate der nicht Alpha-Toxin bildendenStämme von C. novyi Typ A und Typ B zeigten, ebenso wie Typ D, keineCytotoxizität. Dagegen waren die 11 durch Bacteriophagen von Typ A bzw.Typ B zur Alpha-Toxinproduktion konvertierten C. novyi-Typ-D-Stämmecytotoxisch. Nach Untersuchungen von RUTTER und COLLEE (1969) er-wies sich für die Austitrierung des Alpha-Toxins der Zellkulturtest als sen-sibler als der Mäuse-Letalitätstest.

Unerwartet war, daß die beiden als pathogen geltenden Spezies C. perfrin-gens und C. novyi Typ D (C. haemolyticum) in den Hackfleisch- und Tarozzi-Bouillon-Kulturen kein auf Lungenfibroblasten wirkendes Cytotoxin bil-deten, obwohl die geprüften C. perfringens und C novyi- Typ-D -Stämmeaufgrund ihrer starken Lecithinase-Bildung im Meerschweinchenversuch zutödlich verlaufenden Gasödem-Erkrankungen führten.

Weitere Cytotoxin bildende Stämme fanden sich bei den Spezies C. ha-stiforme, C. limosum, C. oceanicum, C. putrificum, C. ramosum, C. sordellii,C. sporogenes und C subterminale. Die cytopathischen Veränderungen wa-ren sehr spezies-spezifisch und korrelierten mit der Tierpathogenität derStämme. Kein Cytotoxin konnte in den Kulturfiltraten von C. absonum,C. barati, C. bifermentans, C. botulinum (atoxisch), C. butyricum, C. cada-veris, C. carnis, C. clostridioforme, C. cochlearium, C. glycolicum, C. in-nocuum, C. malenominatum, C. mangenotii, C. paraputrificum, C. putrefa-ciens, C. rectum, C. tertium, C. tetanomorphum und C. tyrobutyricum nach-gewiesen werden. Diese Spezies werden gelegentlich aus menschlichemUntersuchungsmaterial isoliert, eine pathogene Wirkung konnte (C carnisausgenommen) aber bisher noch nicht sicher bewiesen werden.

Beurteilung:

Die Ergebnisse haben gezeigt, daß für den Nachweis des Alpha-Toxinsvon C. novyi und gewisser Cytotoxine die Lungenfibroblastenkultur ge-eignet und ausreichend ist. Sie kann aber bei anderen Toxinen den Tier-versuch nicht generell ersetzen. Dies wurde besonders deutlich bei denKulturen von C perfringens und C. novyi Typ D (C. haemolyticum), diereich an gewebeschädigenden und letal wirkenden Enzymen (Leci-thinasen, Proteinasen etc.) sind, die die Lungenfibroblasten jedoch nichtzu schädigen vermochten.

47

Die Dauer des Toxinnachweises mittels Zellkultur und die mittels Tier-versuch sind gleich lang und betragen 1-2 Tage.

4.3 Prüfung der Lungenfibroblastenkultur zum Routine-Nachweis von C difficile-Toxin im Stuhl von Patienten

In Kenntnis der Veröffentlichung von BORIELLO (1978) und aufgrundunserer Erfahrungen über die Möglichkeit, Clostridium difficile-Toxin inZellkulturen nachzuweisen, haben wir diesen Test auf die Verwendbarkeitzur Diagnostik geprüft.

Methode:

Erbsgroße Stuhlproben von Diarrhoe-Patienten wurden mit einem Holz-stäbchen in 2,5 ml Pepton-Bouillon aufgeschwemmt und bei 4 200 xg 30Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde sterilfiltriert (Millipore0,45 μlη) und in Mengen von 50 μl auf 100 μl menschliche embryonale Lun-genfibroblasten (HEF)-Kultur in Mikrotiterplatten getestet. Nach 24- bis72stündiger Bebrütung bei 37°C im CO2-Brutschrank wurden die Zellkul-turen auf cytopathische Veränderungen durchgesehen. Im positiven Fallkam es zur Abrundung der Lungenfibroblasten. Als Kontrollen dientenPeptonbouillon, ein C. difficile-Toxinfiltrat, sowie die Neutralisation mitC. difficile- oder C. sordellii-Antitoxin (Wellcome).

Ergebnisse

Von 56 getesteten Stuhlfiltraten enthielten 29 Cytotoxine, die die Lungen-fibroblasten schädigten. Aber nur 6 zeigten die typischen, für C. difficilecharakteristischen Rundzellen, während bei 23 andersartige Zellverände-rungen (CPE) auftraten, die nicht auf C. difficile-Toxin schließen ließen.Mittels Neutralisationstests mit spezifischem C. difficile-Antitoxin konntedie Spezifität dieser Ergebnisse bestätigt werden.

Da dieser Test auch für den Zivilschutz von Bedeutung ist, haben wir dieUntersuchungen ausgedehnt und konnten den Test mit Erfolg in die Rou-tine-Diagnostik integrieren.

Die Zahl der unter dem Verdacht auf C. difficile-Diarrhoe bzw. pseudo-membranöser Colitis eingesandten Stuhlproben ist, wie Tabelle 6 zeigt, seit1986 stark angestiegen, von 120 im Jahr 1986 auf 680 1987 und 1 772 1988,wobei 1986 25 %, 1987 9 % Cytotoxin-positiv waren und 1988 nur 3,7 %.Dieser niedrige Prozentsatz läßt vermuten, daß die einsendenden Ärzte

48

auch oft ohne klinische Indikation die Untersuchung auf C. difficile „derVollständigkeit halber“ erbeten haben.

Tab. 6: Anzahl der untersuchten Stuhlproben bei Verdacht auf C. difficile-Erkrankungen.

Jahr

1986

1987

1988

Anzahl

120

680

1772

Cytotoxin-Nachweis*% positiv

25

9

3,7

Mittels Zellkultur (hum. embryonale Lungenfibroblasten).

Beurteilung:

Humane embryonale Lungenfibroblastenkulturen sind zum Nachweis vonC. difficile-Cytotoxin im Stuhl von Patienten mit Diarrhoe oder pseudo-membranöser Colitis gut geeignet.

Wie unsere ausgedehnten Untersuchungen gezeigt haben, sind die durch dasC. difficile-Cytotoxin hervorgerufenen Veränderungen der Lungen-fibroblasten, die sich in Form von Rundzellen äußern, so eindeutig undcharakteristisch für C. difficile-Cytotoxin, daß eine Verwechslung mit dencytopathischen Effekten (CPE) der Cytotoxine anderer Clostridium-Speziesausgeschlossen ist. Auch Salmonellen und andere pathogene Darm-bakterien stören die Reaktion nicht, wie Mono- und Mehrfachinfektionengezeigt haben.

Die Ergebnisse sind innerhalb von 20 und 48 Stunden verfügbar.

4.4 Vergleichende Prüfung eines käuflichenLatex-Agglutinationstestes(Culturette Brand CDT™, Marion Scientific)zum Nachweis von C. difficile-Toxin in Stuhlproben

Von der Firma Marion Scientific USA wurde 1986 ein Latex-Schnelltest inForm eines Objektträger-Agglutinationstests zum Nachweis von C difficile-Toxin angeboten. Dieser Test wurde von uns im Vergleich mit dem Toxin-Nachweis mittels Zellkulturen auf Spezifität und Praktikabilität geprüft.

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Das Prinzip des Latex-Tests beruht darauf, daß Latex-Partikel mit spezifi-schen C. difficile-Antikörpern beladen sind, die mit C. difficile-Toxin/Anti-gen im Überstand von Stuhlprobenaufschwemmungen agglutinieren. Wel-che Toxinkomponenten dabei nachgewiesen werden, ist noch unklar undwird von der Fa. Marion Scientific untersucht, nachdem sich herausgestellthat, daß es sich nicht, wie ursprünglich angegeben, um Toxin A handelt(LYERLY und WILKINS, 1986).

Material und Methoden:

Erbsgroße Stuhlproben von Diarrhoe-Patienten wurden mit einem Holz-stäbchen in 2,5 ml Pepton-Bouillon aufgeschwemmt und bei 4 200 xg 30Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde sterilfiltriert (Millipore0,45 μm) und

a) in Mengen von 50 μl auf menschlichen embryonalen Lungenfibroblasten(HEF)-Kultur in Mikrotiterplatten getestet. Nach 20- bis 72stündigerBebrütung bei 37°C im CO2-Brutschrank wurden die Zellkulturen aufcytopathische Veränderungen (CPE) durchgesehen. Als Kontrollendienten Pepton-Bouillon und ein C. difficile-Toxinfiltrat.

b) Parallel dazu wurden die Sterilfiltrate im Latex-Test geprüft. Entgegender Vorschrift der Firma wurde mit 1/10 der Testvolumina gearbeitet. 5 μlLatex-Reagenz wurden mit 10 μl Stuhlfiltrat vermischt und zusammenmit den gleichzeitig angelegten „positiv“- und „negativ“-Kontrollendurch Schwenken des Objektträgers (3 Min.) auf Agglutination geprüft.Die Beurteilung der Agglutination erfolgte gegen eine Lichtquelle undwurde nach dem Grad der Stärke (+/ + /0) bewertet.

Von allen Stuhlproben wurden anaerobe Kulturen angelegt. Die daraus ge-züchteten Clostridium-Stämme wurden biochemisch und über ihre Fett-säurebildung gaschromatographisch identifiziert, worüber nachstehendausführlich berichtet wird.

Ergebnisse:

Es wurden 1986 68 Proben nach beiden Verfahren geprüft. Diese Probensetzten sich zusammen aus 60 Stuhlproben von 39 Patienten, bei denen derVerdacht der pseudomembranösen Colitis bestand, und 8 C. difficile-Kul-turfiltraten. In 87 % stimmten die Ergebnisse überein: 18 Stuhlproben(30 %) waren in beiden Tests positiv, 34 Stuhlproben (57 %) in beiden Testsnegativ. 8 Filtrate (13 %) ergaben unterschiedliche Ergebnisse: In dem Stuhlvon 4 Patienten konnten C. difficile-Bakterien und mittels Zellkultur C. dif-ficile-Toxin nachgewiesen werden, jedoch nicht mittels Latex-Agglutination.

50

Bei den 4 weiteren Patienten fielen die Ergebnisse umgekehrt aus: In derZellkultur erzeugten die Filtrate nur unspezifische CPE (Lochbildung,Zellaggregate), während im Latex-Test eine geringe Agglutination (±) zubeobachten war. In den 8 C. difficile-Kulturfiltraten (Kontrollen) konntenach beiden Testmethoden Toxin nachgewiesen werden.

Bei insgesamt 113 untersuchten Stuhlproben (1986/1987) stimmten zu 78 %die Ergebnisse der Zellkulturen und die des Latex-Agglutinationstestsüberein. In 18 Fällen war der Toxinnachweis in der Zellkultur positiv, imLatex-Agglutinationstest negativ und in 7 Fallen umgekehrt.

Beurteilung:

Der Toxinnachweis mit dem Latex-Agglutinationstest ist zwar einfacher undschneller (in 3-5 Min.) durchführbar, aber teurer (25 Tests 750 DM) undungenauer (s. u.) als die Zellkultur. Hinsichtlich der Methode erwiesen sichdie mitgelieferten Papierobjektträger als zu rauh und zu glänzend, die an-gegebene Testmenge (Tropfen) zu groß (Gefahr des Ineinanderlaufens). UmReagenzien zu sparen, wählten wir mit Erfolg eine kleine Tropfengröße undGlasobjektträger.

78 % der Proben ergaben in den Testsystemen übereinstimmende Ergeb-nisse, während im Latex-Test 6 % falsch positiv und 16 % falsch negativwaren im Vergleich mit den Ergebnissen der Zellkultur. Dies bestätigten dievon LYERLY und WILKINS (1986) sowie von PETERSON et al. (1986)und KELLY et al. (1987) veröffentlichten Ergebnisse, die sie bei der Prü-fung dieses käuflichen Latex-Reagenzes im Vergleich mit Zellkultur- undELISA-Test erhalten haben.

4.5 Nachweis von C. perfringens-Enterotoxin mittelsVero-Zellenkultur

Bestimmte Stämme von C. perfringens bilden während der Versporung infleischhaltigen Gerichten ein Enterotoxin, das häufig – besonders in Eng-land und den USA – Ursache von Nahrungsmittelvergiftungen ist.

Der Enterotoxinnachweis war lange Zeit nur tierexperimentell über denDarmschlingenversuch möglich. Dies ist routinemäßig nicht praktikabel.Japanische und amerikanische Mikrobiologen (MATSUDA et al. sowieMcCLANE und McDONEL) fanden 1979 heraus, daß das Enterotoxin cy-topathische Effekte in Vero-(African green monkey kidney)-Zellenkulturenhervorruft. In der Folgezeit nutzte man diese Erkenntnisse zur Entwicklung

51

eines Tests zur Diagnose des Enterotoxins, bei der die Zellkulturen inMikrotiterplatten angezüchtet werden. Wir haben uns die Aufgabe gestellt,

1. diesen Test auf Praktikabilität zu prüfen und

2. zu untersuchen, wieviele unserer C. perfringens-Stämme, die aus Wun-den, Stuhl und Erde isoliert worden sind, Enterotoxin bilden.

Methodik:

20 Stunden alte C. perfringens-Kulturen in Fleischbouillon werden in Thio-glycolatmedium überimpft (1 : 10), 20 Min. bei 75°C zur Abtötung der ve-getativen Zellen und zur Stimulierung der Enterotoxinbildung erhitzt unddann über Nacht (ca. 20 Stunden) bei 37 0C anaerob im GasPak-Topf be-brütet. Diese Kulturen werden danach in Bouillon nach DUNCAN undSTRONG (1979) überimpft, in der sie während der 20stündigen Bebrütungbei 37°C versporen und Enterotoxin bilden sollen. Die erhaltene Kulturwird zentrifugiert (30 Min., 4 200 xg), der Überstand sterilfiltriert (Millipore0,45 μ) und bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahrt.

Als Zellkulturen werden 2 Tage alte Vero-Zellen in Mikrotiterplatten ver-wendet, die nach Beimpfung mit 5 μl (Verd. 1 :10) bis 50 μl (Verd. 1 : 2) to-xinhaltigem Kulturfiltrat 20-48 Stunden bei 37°C im CO2-Brutschrank in-kubiert und dann auf cytopathische Veränderungen durchgesehen werden.Im positiven Fall werden die länglich-ovalen Vero-Zellen durch das Ente-rotoxin aus dem Zellverband gelöst und erscheinen abgerundet und unge-ordnet.

Als Kontrollen dienen unbeimpfte Zellkulturen, das DUNCAN-STRONG-Medium, ein sicher C. perfringens-Enterotoxin-haltiges Filtrat und Anti-Enterotoxin-Serum.

Ergebnisse:

Es wurden 187 Stämme von C. perfringens getestet (PIEPER, 1988). Davonstammten 132 aus Varia-Untersuchungsmaterial, 22 Stämme aus Stuhl- und33 aus Erdproben.

150 Stämme erwiesen sich als hitzeunempfindlich und 37 Stämme als hit-zeempfindlich, d. h. die Kulturen dieser 37 Stämme wurden durch den Hit-zeschritt (75°C, 20 Min.) in der Thioglykolatbouillon abgetötet. Die Unter-suchung dieser Stämme auf Enterotoxinbildung erfolgte deshalb ohne denHitzeschritt.

52

Von den 150 hitzeunempfindlichen Stämmen bildeten 34 % Enterotoxin,66 % nicht, von den hitzempfindlichen 86 % und 14 % nicht (vgl. Tab. 7).Der Nachweis des Enterotoxins erfolgte in einer Konzentration von 5 bis50 μl Kulturfiltrat auf 50 μl Vero-Zellen. Die Konzentration von 10 μl erwiessich als günstig für die Beurteilung des cytopathischen Effektes und zurUnterscheidung starker, schwacher bzw. negativer Enterotoxinbildung.

Tab. 7: Fähigkeit zur Enterotoxinbildung bei Clostridium perfringens Typ A.+ = positiv, ± = schwach positiv, 0 = negativ

hitzeunempfindlicheStämmehitzeempfindlicheStämme

Anzahl

150

%

37

%

+

8

5

6

16

Enterotoxinbildung+

44

29

26

70

0

98

66

5

14

Der cytopathische Effekt trat nicht auf, wenn vor der Beschickung der Vero-Zellen 10 μl Anti-Enterotoxin-Serum in den Testansatz gegeben wurde.

Da hitzeempfindliche C perfringens-Stämme bisher selten bei Nahrungs-mittelvergiftungen gefunden wurden – sie werden durch den Kochprozeßmeist eliminiert -, soll auf die Analyse dieser Ergebnisse hier verzichtetwerden.

Bei den 150 hitzeunempfindlichen Stämmen handelte es sich um 96 Isolie-rungen aus verschiedenem Untersuchungsmaterial (Varia), um 21 aus Stuhlund 33 aus Erdproben. Die Rate der Enterotoxinbildung betrug 40 %(Varia) bzw. 33 % (Stuhl) und lag mit 21 % am niedrigsten bei den aus derErde isolierten Stämmen (vgl. Tab. 8).

Tab. 8: Enterotoxinbildende Stämme von C. perfringens Typ A.

Isolierungenaus

VariaStuhlErde

Gesamtzahl

Gesamt

962133

150

Anzahlpositiv+/±3877

52

positivin%403321

34

53

Beurteilung:

Der Enterotoxin-Nachweis mittels Vero-Zellenkultur ist relativ einfachdurchführbar und gut reproduzierbar. Er dauert 20-48 Stunden. Es wurdeweiterhin geprüft und festgestellt, daß die 2tägige Vorzüchtung der Vero-Zellen für den Test nicht unbedingt erforderlich ist. Das gleichzeitige Ein-tropfen der Vero-Zellen und des Test-Kulturfiltrats in die Mikrotiterplattelieferte das gleiche Ergebnis. Im positiven Fall sterben die Vero-Zellendurch das Enterotoxin gleich ab und können während der anschließendenInkubation keinen Zellrasen bilden. Dieses Verfahren hat den Vorteil, daßder Test unverzüglich angesetzt werden kann, ohne daß Mikrotiterplattenmit Zellkulturen in Vorrat gehalten werden müssen.

Der Enterotoxintest mittels Vero-Zellenkultur ist auch in Zeiten un-günstiger hygienischer Situationen (Katastrophe, Krieg), in denen mit einerZunahme derartiger Nahrungsmittelvergiftungen zu rechnen ist, praktika-bel, da er wenig Zeit und Material erfordert. Es muß bei der Beurteilung derErgebnisse jedoch beachtet werden, daß etwa ein Drittel der C. perfringens-Stämme allgemein Enterotoxin-Bildungsvermögen besitzt, wie unsere Un-tersuchungen gezeigt haben.

Der Nachweis der Enterotoxinbildung ist wegen der schwierigen Verspo-rung von C. perfringens ein langwieriger Prozeß und erfordert 3 Tage.

4.6 Vergleich von Vero-Zellenkultur, Latex-Agglutinationstestund ELISA zum Nachweis von C. perfringens-Enterotoxinin C. perfringens-Kulturen und Stuhl von Diarrhoe-Patienten

Wie bereits dargelegt, ist die Nahrungsmittelvergiftung durch C perfringensein besonderes Problem vor allem in Großbritannien, wo sie nach der Sal-monellen-Gastroenteritis an zweiter Stelle steht. Über Erkrankungen inDeutschland liegen wegen fehlender Meldepflicht bzw. statistischer Er-fassung keine Zahlen vor. Es muß aber auch in Deutschland besonders inZeiten ungünstiger Situationen mit einer Zunahme derartiger Nahrungs-mittelvergiftungen gerechnet werden. Deshalb ist es wichtig, eine ver-läßliche Methode für den Nachweis des die Krankheit auslösenden Entero-toxins zu kennen, vor allem auch zur Abgrenzung gegen andere Diarrhoen.

Wie wir berichteten, ist die Zellkultur mit Vero-Zellen eine geeignete undbrauchbare Methode zum Enterotoxin-Nachweis. Seit 1986 ist ein Latex-Agglutinationsreagenz der Fa. Oxoid im Handel erhältlich. Nach Unter-suchungen von BERRY et al. (1986) soll dieser Test die gleiche Spezifitätund Sensibilität wie der ELISA haben.

54

Wir stellten uns deshalb 1987 die Aufgabe, im Rahmen der Untersuchungenfür die Schutzkommission die 3 Methoden vergleichend zu prüfen.

Methodik:

a) Die Methodik des Vero-Zellenkulturtests wurde im Abschnitt 4.5, s. S. 52ausführlich dargelegt. In allen 3 Testverfahren wurde das von den ver-sporten C. perfringens-Kulturen gebildete Enterotoxin in Form von KuI-turfiltrat bzw. Kulturüberständen eingesetzt.

b) Die Durchführung des Latex-Agglutinationstests erfolgte in V-förmigenMikrotiterplatten (Greiner). Der Testkit der Fa. Oxoid („Reversed pas-sive Latex-Agglutination, PET-RPLA“) enthält: Kontroll-Enterotoxin,Verdünner (PBS), Latexreagenz sensibilisiert mit spezifischem Kanin-chen-IgG gegen C. perfringens-Enterotoxin, Latexreagenz gekoppelt annormales Kaninchen-IgG (unspezifisch, Kontrollreagenz).

Für jede Probe wurden 2 Reihen der Mikrotiterplatte benötigt, in denenje eine geometrische Verdünnungsreihe mit 25 μl des Probenmaterials inPBS-Puffer angelegt wurde. Die 1. Reihe wurde mit dem spezifisch-sen-sibilisierten, die 2. Reihe mit dem unspezifischen Latexreagenz versetzt.Nach vorsichtigem Mischen der Reagenzien in der Mikrotiterplatte aufeinem Schüttler wurde die Platte, mit Aluminium- oder Klebefolie ver-schlossen, in einer feuchten Kammer 20-24 Stunden bei Raum-temperatur inkubiert. Mittels eines Mikrotiterspiegels wurde die Ag-glutination abgelesen. Eine Agglutination soll nur in der 1. Reihe auf-treten, während die 2. Reihe negativ bleiben soll. Stuhlfiltrate könnenmanchmal mit dem Kontrollreagenz reagieren. In diesem Fall gilt derTest nur dann als positiv, wenn der Agglutinationstiter mit dem sen-sibilisierten Latexreagenz mindestens eine Stufe höher liegt als mit demKontrollreagenz.

c) Sandwich-ELISA-Verfahren

Als Reagenzien werden für den ELISA benötigt: als gereinigte Sub-stanzen C. perfringens-Enterotoxin (PE), Anti-C perfringens-Entero-toxin-IgG (Anti-PE-IgG vom Schaf) und Anti-CPE-IgG-Peroxidase-Konjugat, die uns von Dr. Notermans, Bilthoven/Niederlande, freundli-cherweise zur Verfügung gestellt wurden, des weiteren entero-toxinhaltige Überstände von C. ρ erfringens-Kulturen, Stuhlfiltrate undÜberstände von Stuhlproben, die mit 0,02 % NaN3 versetzt wurden.

Es wurden nur solche Stuhlproben verwendet, in denen kulturell C. per-fringens nachweisbar war. Das Probenmaterial wurde im ELISA unver-dünnt und in den Verdünnungen 1:2, 1:5, 1:10 getestet. Als Nega-

55

tivkontrollen dienten alle verwendeten Puffer, Kulturmedien und derKulturüberstand eines sicher nicht Enterotoxin bildenden C. perfringens-Stammes, der unverdünnt eingesetzt wurde.

In zahlreichen Vorversuchen wurden die Versuchsbedingungen opti-miert. Es zeigte sich, daß die Mikrotiterplatten der Fa. Nunc als ELISA-Platten am besten geeignet waren.

Der ELISA setzt sich aus mehreren Schritten zusammen, die hier nurkurz wiedergegeben werden sollen: Nach jedem Schritt erfolgte ein in-tensives Waschen der Mikrotiterplatte mit PBS + Tween 20. Nach Ad-sorption des Anti-CPE-IgG über Nacht an die feste Phase (Mikrotiter-platte) erfolgte die Zugabe der Proben und Inkubation (90 Min. beiRaumtemperatur, RT), die Zugabe des Konjugats IgG-Peroxidase (In-kubation 90 Min. RT) und die Substratreaktion durch Zugabe von Ami-nosalicylsäure (Inkubation 30 Min. RT). Gestoppt wurde die Reaktionmit NaOH-Lösung. Die Farbentwicklung wurde bei 450 nm mit einemELISA-Reader gegen einen Substratleerwert gemessen und der Entero-toxingehalt semiquantitativ errechnet.

Versuche und Ergebnisse:

20 C. perfringens-Stämme wurden in die Untersuchungen einbezogen undim Vero-Zellenversuch, dem Latex-Agglutinationstest und Sandwich-ELISA vergleichend untersucht. Es zeigte sich, daß alle 3 Methoden repro-duzierbare Ergebnisse lieferten, wie aus den Kontrollen ersichtlich war.

Wie Tabelle 9 zeigt, war der Enterotoxin-Nachweis mittels Zellkultur bei70 % der Stämme positiv, mittels Latex-Test bei 75 % und mittels ELISAnur bei 30 % der Stämme.

Tab. 9: Zur Spezifität der 3 Methoden zum C. perfringens-Enterotoxin-Nachweis.

Methode

Vero-Zellen

Latex-Test

ELISA

Enterotoxin-Nachweispositiv/Gesamtzahl in %

14/20

15/20

6/20

70

75

30

Außer den C. perfringens-Stämmen wurden 19 Patientenstuhlproben imVero-Zellenversuch, Latex-Test und ELISA miteinander verglichen. Da von3 Patienten 2 bzw. 3 Stuhlproben eingesandt wurden, wurden insgesamt 19

56

Stuhlproben von 15 Diarrhoe-Patienten auf C. perfringens-Enterotoxin ge-prüft.

Ergebnisse:

Bei 15 Stuhlproben ergaben alle 3 Methoden das gleiche negative Ergebnis.Bei 4 Proben waren der Latex-Test positiv, der Vero-Zellentest und ELISAnegativ.

Beurteilung:

Abgesehen davon, daß die untersuchte Zahl für eine statistische Aus-wertung zu gering ist, muß bei der Beurteilung offen bleiben,

1. welche Testmethode als zuverlässiger Bezug gelten kann,

2. ob der Latex-Agglutinationstest wirklich spezifisch ist oder ob in demVerfahren ein positiver Reaktionsausfall durch unspezifische Be-standteile der Kulturen bzw. Stuhlproben hervorgerufen wird.

Arbeitstechnisch sind der Vero-Zellen- und der Latex-Test gleichwertig, dieErgebnisse sind beim Latex-Test jedoch etwas schneller verfügbar. Da derELISA noch nicht käuflich erhältlich war, war der Arbeitsaufwand ver-gleichsweise zu hoch.

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5 Nachweis von Tetanus-Antikörpern im Serummittels ELISA

Tetanus wird ausgelöst durch das Toxin von Clostridium tetani und ist nachwie vor eine Erkrankung mit hoher Letalität, an der jährlich 400 000 undmehr Menschen nach Angaben der WHO sterben. Die wirksamste pro-phylaktische Maßnahme gegen Tenatus ist die aktive Immunisierung mitTetanus-Toxoid. In der Regel wird ein ausreichender Immunstatus durchdie Grundimmunisierung und Auffrischimpfungen erreicht. Der Anti-toxintiter im Serum des Geimpften kann mittels ELISA (Enzymimmu-noassay) in IE/ml quantitativ gemessen werden (SCHRÖDER undKUHLMANN, 1990).

Wir hatten uns die Aufgabe gestellt, zwei der z. Zt. käuflichen ELISA-Testsvon Virotech und Melja zur Bestimmung von Tetanus-IgG-Antikörpern imBlut geimpfter Personen auf Praktikabilität und Genauigkeit zu überprüfen.

Das Prinzip der Tests ist nahezu identisch: Der im Humanserum gesuchtefür das Tetanus-Toxin spezifische IgG-Antikörper bildet mit dem auf demMikrotiter-Teststreifen fixierten Antigen (Tetanus-Toxoid) einen Immun-komplex. Überschüssiges Serum wird durch Waschen entfernt. Der zurück-gebliebene Immunkomplex verbindet sich mit dem zugefügten Enzym-Konjugat. Nach weiterem Waschen und Zugabe der Substratlösung entstehtdurch die Enzymaktivität eine blaue oder orange Färbung (je nach Substratund Enzym). Die Enzymreaktion wird mittels Schwefelsäure gestoppt. DieFarbintensität wird im EIA-Photometer gemessen.

Die Auswertung der Meßdaten erfolgt über eine Eichkurve, die mittelsStandardseren bei jedem Versuch erstellt wird.

Ergebnisse:

Wir haben bisher ingesamt 115 Serumproben auf Tetanus-Antikörper un-tersucht

- 47 Proben mit Virotech- 68 Proben mit Melja, davon- 20 Proben mit beiden Verfahren.

Die Titerwerte zeigten eine gute Übereinstimmung bei Parallelunter-suchungen und hatten mit beiden Verfahren etwa die gleiche Titerhöhe.

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Beurteilung:

Nach unseren jetzigen Erfahrungen ist das Verfahren von Melja dem vonVirotech in folgenden Punkten überlegen: Die Versuchsdauer beträgt nur105 Min. gegenüber 200 Min. Die für die Eichkurve nötigen Stan-dardserumverdünnungen sind vorgegeben, alle Lösungen und Puffer sindgebrauchsfertig. Nur die Waschlösung muß verdünnt werden. Dies spartnicht nur Zeit, sondern erhöht auch die Genauigkeit.

Bei dem ELISA von Virotech traten verschiedentlich Schwierigkeiten da-durch auf, daß das Reaktionssystem sehr pH-empfindlich ist. Da alle Rea-genzien mit A. dest. verdünnt werden müssen, wurde bei einem zu sauren A.dest. das Testergebnis gestört, z.B. erkenntlich an einer sehr niedrigenEichkurve oder keiner meßbaren Gelbfärbung.

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6 Analyse einzelner Toxine

6·1 Cytotoxinbildung von Clostridium-Stämmen ausStuhlproben von Patienten mit Verdacht auf Colitis

Da 1980 von STURM et al. über einen toxinogenen C. butyricum-Stamm alsErreger einer neonatalen nekrotisierenden Enterocolitis berichtet wordenist, haben wir im 2. Halbjahr 1987 parallel zur Analyse der Krankenge-schichten von 60 Patienten mit Verdacht auf pseudomembranöser Colitis dieClostridium-Stämme auf Cytotoxinbildung untersucht, die allein oder zu-sammen mit C. difficile aus dem Stuhl dieser Patienten isoliert worden sind(DOLL, 1991).

Bei den Isolaten handelte es sich neben 11 Stämmen von C. difficile vorallem um C butyricum (22 Stämme), C. paraputrificum (15 Stämme) undC. tertium (22 Stämme).

Ergebnisse und Beurteilung:

Es zeigte sich, daß außer C. difficile 8 der 22 C. butyricum-, 5 der 15 C pa-raputrificum- und 9 der 21 C. tertium-Stämme Cytotoxine bildeten, die dieembryonalen Lungenfibroblasten sichtbar schädigten.

Somit ist nicht auszuschließen, daß neben C. difficile noch weitere CIo-stridium-Spezies für Diarrhoe bzw. Colitiden verantwortlich sein können.Diese Untersuchungen werden fortgesetzt, da sie neuartige Befunde dar-stellen und für den Zivilschutz von Bedeutung sind.

Über die Antibiotika-Empfindlichkeit dieser Clostridium-Stämme wurde inAbschn. 3.3, s. S. 43 berichtet.

6.2 Analyse des von Clostridium butyricum gebildetenCytotoxins

Wie wir berichteten, bildeten 8 von 22 getesteten Clostridium butyricum-Stämmen, die aus Stuhlproben von Patienten mit Verdacht auf pseudo-membranöse Colitis isoliert worden waren, Cytotoxin, das mittels Lungen-fibroblastenkultur nachgewiesen wurde.

Zusammen mit 7 Neuisolaten haben wir die 22 Stämme nochmals überprüftund fanden heraus, daß unter optimalen Züchtungsbedingungen (24 Stun-den 37 0C, Fleischbouillon) sogar 13 der 22 und die 7 neuen Stämme zur

61

Cytotoxin-Produktion befähigt waren. Die Cytotoxin-haltigen Kulturfiltratehatten einen pH-Wert von 6,2-6,4.

Die Cytotoxine von Stamm 61 und Stamm 63 wurden näher analysiert. Siewaren noch in einer Verdünnung von 10-5 cytopathisch wirksam und ther-mostabil (95 0C, 10 Min.). Die Ablesung der Zellkultur erfolgte nach 24 und48 Stunden, wobei der CPE nach 48 Stunden am deutlichsten ausgeprägtwar.

Zwischenzeitlich wurde von POPOFF et al. (1987) berichtet, daß das vonihnen isolierte Cytotoxin von C. butyricum mit der Buttersäure, die von denBakterien gebildet wird, identisch ist.

Wir haben daraufhin in sehr umfangreichen Experimenten überprüft, obdieser Befund für die von uns nachgewiesenen Cytotoxine auch gilt. Dabeierhielten wir folgende Ergebnisse: Buttersäure, als Butyrat der PYG-Bouil-lon zugesetzt (Kontrolle) – die Konzentration war ca. 5- bis lOfach höher alsdie in der C butyricum-Kulturbouillon -, erzeugte nach 24 Stunden keine,nach 48 Stunden deutliche cytopathische Effekte (CPE), während die Kul-turfiltrate von 3 Clostridium-Spezies, wie C. absonum, C. beijerinckii,C. perfringens, die auch Buttersäure als Stoffwechselendprodukt in ver-gleichbarer Menge wie C. butyricum bilden, keine CPE der Lungen-fibroblasten hervorriefen.

Weiterhin haben wir erfolgreich versucht, die Buttersäure quantitativ ausder Cytotoxin-haltigen Kulturbouillon mit Ether auszuschütteln, so daß siegaschromatographisch nicht mehr nachweisbar war. Besonders sorgfältigwurde der pH-Wert kontrolliert und auf pH 7 eingestellt, bevor der Cytoto-xintest auf den Zellkulturen erfolgte.

Ergebnisse:

Die Buttersäure-freien Kulturfiltrate von C. butyricum Stamm 60, 61 und 63waren in gleicher Weise cytotoxisch wie die unbehandelten Kulturfiltrate,unabhängig vom Kulturmedium (Fleischbouillon oder Pepton-Hefeextrakt-Glucose-Bouillon). Diese Versuche wurden mehrfach und auch mit anderenC. butyricum-Stämmen wiederholt, alle führten zum gleichen Ergebnis.Daraus können wir folgende Schlußfolgerungen ziehen:

1. Das Cytotoxin von C. butyricum ist nicht identisch mit Butyrat, es wirdauch nicht von Butyrat in seiner Aktivität stimuliert.

2. Es ist bis pH 3 säure- und bis 95 0C (10 Min.) hitzeresistent, auch nachEntfernung der Buttersäure aus dem Kulturfiltrat.

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3. Das Cytotoxin wird während der Bebrütung von C. butyricum bei 37 0Cinnerhalb von 1-3 Tagen gebildet, optimal in einem Titer von 10-5 nach24 Stunden.

4. Es hat keine Bacteriocinaktivität gegen C. butyricum, jedoch gegen 1Stamm von 3 C. pasteurianum-Stämmen. In der Literatur wird vonCLARKE und MORRIS (1976) diese Bacteriocinempfindlichkeit eben-falls erwähnt.

Eine weitere Beobachtung bei den experimentellen Arbeiten war, daßC. butyricum-Stämme durch häufige Subkultivierung ihre Fähigkeit zur Bil-dung von Cytotoxin verlieren. Somit ist erklärlich, warum unter unserenKulturen der Stammsammlung ein geringerer Anteil von Cytotoxinbildnernwar, als unter den Neuisolaten.

6.3 Charakterisierung der Cytotoxine vonClostridium oceanicum

Wie schon erwähnt, wurden bei einigen sogenannten apathogenen CIo-stridium-Spezies (C sporogenes, C. oceanicum, C. ramosum u.a.) mittelsZellkultur Cytotoxine im Kulturfiltrat nachgewiesen. Da diese Clostridienrelativ häufig in Wunden gefunden werden, man aber bisher über ihre Pa-thogenese fast nichts weiß, haben wir versucht, diese Cytotoxine zu isolierenund zu analysieren, was sich aber als recht arbeitsaufwendig erwies.

Die Ergebnisse der Untersuchungen der Cytotoxine von C. oceanicum wur-den im Rahmen einer Diplomarbeit dargelegt (DICKGREBER, 1986). Eshandelte sich um zwei Cytotoxine, die aus den Sterilfiltraten der 48stün-digen Kulturen von C. oceanicum in Tryptose-Hefeextrakt-Glucose-Bouil-lon gewonnen werden konnten. Sie riefen auf humanen embryonalen Lun-genfibroblasten- und Vero-Zellenkulturen charakteristische cytopathischeEffekte (CPE) hervor. Die Cytotoxine wurden mittels Kationenaus-tauscherchromatographie und Gelfiltration angereichert und gereinigt.

Beide Cytotoxine unterschieden sich im Hinblick auf ihr Molekulargewichtnur geringfügig (1000-5 000 Dalton). Sie waren extrem hitzestabil(> 100 0C) und weder durch Proteasen und Lipasen noch durch DNasen undRNasen inaktivierbar. Eine reversible Inaktivierung konnte lediglich beieiner pH-Erniedrigung auf < 5 festgestellt werden. Der Reinheitsbeweiswurde mit Hilfe einer HPLC-Gelfiltration durchgeführt, da sich die Toxinenach erfolgter Polyacrylamid-Gelelektrophorese nicht mit Coomassie Bril-liant R 250 oder Silbernitrat anfärben ließen.

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In Kaninchen zeigten die isolierten Cytotoxine aufgrund ihres geringenMolekulargewichts keine immunogene Wirkung. Antikörper konnten we-der mit dem Agardiffusionstest nach OUCHTERLONY (1958) noch mit-tels der Neutralisation der cytotoxischen Aktivität nachgewiesen werden.

Die Cytotoxine besaßen weder eine Bacteriocin- noch eine Hämolysin-Ak-tivität.

Worauf die Cytotoxizität beruhte, konnte nicht geklärt werden.

6.4 Nachweis und Charakterisierung einerADP-ribosyltransferase von Clostridium limosum

Im 2. Halbjahr 1990 haben wir insgesamt 118 Stämme von 20 Clostridium-Spezies auf die Bildung von ADP-ribosyltransferase überprüft. Das Inter-esse an diesem Enzym als Pathogenitätsfaktor ist in den letzten Jahren sehrgewachsen, seitdem man weiß, daß die Wirkung des Diphtherie- und desCholeratoxins mit einer ADP-ribolysierenden Aktivität verbunden ist.ADP-ribolysierende Faktoren konnten außerdem bisher bei C. botulinum(Cl- und C3-Faktor), bei C. perfringens, C. spiroforme und einem Stammvon C. difficile nachgewiesen werden (HATHEWAY, 1990).

In unseren Untersuchungen fanden wir unter den 118 geprüften Stämmennur bei 2 von 6 C limosum-Stämmen eine ADP-ribosyltransferase, die demC3-Exoenzym von C botulinum ähnlich ist. Die beiden C. limosum-Stämmewaren Isolate aus einem Lungen- bzw. Hirnabszeß von Patienten, die ver-storben sind. Das Enzym wird optimal in Fleischbouillon während 48 Stun-den bei 37 0C gebildet und kann aus dem sterilen Kulturüberstand gewonnenwerden. Die Prüfung der Enzymaktivität, die Reinigung und Charak-terisierung der ADP-ribosyltransferase wurde von JUST vorgenommen:

Das C. limosum-Exoenzym hat ein Molekulargewicht von ca. 25 000 Da undeinen isoelektrischen Punkt von 10.3. Die spezifische Aktivität der ADP-ri-bosyltransferase ist 3.1 nmol/mg/min mit einer Km für NAD von 0,3 μΜ. Diepartielle Aminosäuresequenz-Analyse der tryptischen Peptide ergab etwa70 % Homologie mit dem C3-Exoenzym von C. botulinum. Das neuisolierteExoenzym modifiziert selektiv die kleinen Guanosintriphosphat (GTP)-bindenden Proteine der Rho-Familie in den humanen Thrombozytenmem-branen wahrscheinlich an derselben Aminosäure (Asparagin 41) wie C3(JUST et al., 1992a).

Bisher gelang es nicht, bei dem Stamm C. limosum 2 Bakteriophagen nach-zuweisen, die mit der Enzymproduktion in Verbindung stehen könnten.

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Mutanten dieses Stammes, die mit Acridinorange gewonnen wurden, bildendas Enzym nicht mehr. Sie können aber in der exponentiellen Wachs-tumsphase durch Zusatz des sterilen Kulturfiltrates von C. limosum 2 wiederzur Enzymproduktion konvertiert werden. Die Versuche werden fortge-setzt.

6.5 Nachweis und Charakterisierung einerADP-ribosyltransferase von Bacillus cereus

Die Versuche zum Nachweis von ADP-ribosyltransferase konnten mit Er-folg auf Bacillus-Stämme ausgedehnt werden. Insgesamt untersuchten wir30 Stämme von Bacillus-Spezies. Unter den zuerst geprüften elf aus Blut-kulturen isolierten Bacillus-Stämmen fand sich ein Bacillius cereus-Stamm,der ADP-ribosyltransferase in Fleischbouillon bei 37 0C bildete. Das Exo-enzym wurde isoliert, gereinigt und charakterisiert (JUSTet al., 1992b).

Wie bisherige Versuche ergaben, ist es in einigen physiologischen Eigen-schaften wie dem isoelektrischen Punkt (10.3-10.6) und der Km für NAD(0,3 μΜ) ähnlich dem C3-Enzym von C botulinum und der ADP-ribosyl-transferase von C. limosum. Es scheint aber strukturell verschieden zu sein,da es immunologisch mit diesen beiden Enzymen nicht identisch ist. DasMolekulargewicht der B. cereus-ADP-ribosyltransferase liegt zwischen28 000 und 32 000 Da. Dieses Enzym katalysiert die Inkorporation vonADP-ribose in die 22 kDa Proteine der Blutplättchenmembran. Es modifi-ziert dieselben Substrate wie C3 und das C. limosum-Exoenzym, d. h. dieniedermolekularen GTP-bindenden Proteine der Rho-Familie, die in dieRezeptorregulation der Mikrofilamente des Zytoskeletts involviert sind.

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7 Zusammenfassung und Empfehlungen

Anmerkung: Die Ergebnisse der von 1974 bis 1983 im Rahmen des For-schungsvorhabens durchgeführten Versuche wurden in einem Zwischenbe-richt 1983 ausführlich dargelegt (veröffentlicht in Bd. 20 Zivilschutz-For-schung, hrsg. vom Bundesamt für Zivilschutz) und sind in der Zusammen-fassung mit erwähnt. Die in [ ] gesetzten Zeichen weisen auf Kapitel desZwischenberichts [Zb] bzw. auf Kapitel dieses Bandes hin.

Zur Züchtung der Clostridien sind käufliche Medien der Firmen Difco,Oxoid, Merck ebenso geeignet wie selbst hergestellte Leberbouillon nachTarozzi, Hackfleischbouillon oder Hefeextrakt-Cystein-Blutagar. Die bio-chemische Identifizierung der Clostridien mittels Prüfung des Kohlen-hydratabbaues, der Lecithinase- und Lipase-Bildung sollte in jedem Falldurch die gaschromatographische Analyse der im Kulturmedium gebildetenflüchtigen Fettsäuren ergänzt werden. Denn nur diese Methode erlaubt dieIdentifizierung von Clostridium-Spezies, die biochemisch sehr ähnlich sind,wie z.B. C. tertium und C. ramosum [Zb]. Darüber hinaus kann die gas-chromatographische Analyse der Fettsäuren erfolgreich eingesetzt werdenzum Nachweis von Anaerobiern in Blutkulturen bei Sepsis (FELTEN,1984). Die clostridielle Sepsis ist relativ häufig und verläuft meistens tödlich(SCHALLEHN und BRANDIS, 1985).

Die käuflichen miniaturisierten biochemischen Systeme (Baxter und APIbioMerieux), die in den anaeroben Bakterienzellen bereits vorgeformteEnzyme nachweisen, ermöglichen innerhalb von 4 Stunden die Identifizie-rung von Clostridium-Isolaten. Die Identifizierungsrate war jedoch mit 64bis 71 % noch zu gering [1.1.1 u. 1.1.2]. Dagegen ergab das API-50CH- undAPI-20E-System (bioMerieux) bei der Identifizierung von Bacillus-lsolatenfast 100 % gleiche Ergebnisse wie die konventionelle Methode und ver-kürzte obendrein die Identifizierungszeit von max. 5 Tagen auf 2 Tage. DerVITEK-Automat (bioMerieux) erbrachte trotz der größeren Schnelligkeit(4 bis 6 Stunden) keine vergleichbar guten Ergebnisse (1.2.1-3).

Eine neue erfolgversprechende Schnellmethode für die Differenzierung undIdentifizierung von Bakterien innerhalb von Minuten ist die Fourier-Trans-form-Infrarotspektroskopie, die auch auf anaerobe sporenbildende Bakte-rien angewendet werden kann, wie unsere Vorversuche mit Clostridium-Spezies ergaben [2.1 u. 2.2]. Nach unseren bisherigen Erfahrungen ist dieFT-IR-Spektroskopie zur Identifizierung von Clostridien sehr gut geeignet.Zur Erstellung der dafür erforderlichen Clostridium-Datei wurden 3 500Spektren von insgesamt 250 Stämmen analysiert. Die vorläufige CIo-stridium-Datei umfaßt 29 Spezies mit je 2 Stämmen [2.3].

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Die FT-IR-Spektroskopie erlaubt weiterhin eine Differenzierung ver-schiedener Stämme einer Spezies, was wir an epidemiologisch interessantenmultiresistenten Staphylococcus aureus-Stämmen aus verschiedenen Un-tersuchungsmaterialien und Infektionsquellen zeigen konnten [2.4].

Clostridium perfringens, der häufigste Gasbranderreger, kann aufgrund sei-ner Zell- und Koloniemorphologie, der Phosphatase- und Lecithinase-Bil-dung leicht von den anderen Gasödemerregern unterschieden werden. Eineserologische Typisierung von C. perfringens mittels Objektträger-Agglu-tination und die Typisierung mit Bacteriocinen ist möglich. Da jedoch sehrviele serologische und Bacteriocintypen von C. perfringens existieren, sindbeide Methoden für epidemiologische Studien sehr aufwendig und nurSpeziallabors vorbehalten [Zb].

Das Enterotoxin von C. perfringens, das gelegentlich zu Nahrungsmittel-vergiftungen führt, kann erfolgreich und relativ schnell mittels Vero-Zel-lenkulturen oder eines Latex-Agglutinationstests (Unipath) nachgewiesenwerden [4.5 und 4.6].

Zum schnellen Nachweis von C septicum und C. chauvoei, dem Para-rauschbrand- bzw. Rauschbranderreger, in Gewebematerial oder Blut eig-net sich besonders die fluoreszenzmikroskopische Identifizierung mittelskäuflicher Fluorescein- bzw. Rhodamin-markierter Antisera (Wellcome).Auch für C novyi sind Fluorescein-markierte Antisera im Handel. Da dasC. novyi-Gasödem jedoch als Toxinämie ohne Einbruch der Erreger in dieBlutbahn verläuft, ist die erwähnte Methode der mikroskopischen Identifi-zierung schwer und selten anwendbar [Zb].

Wie von uns gezeigt wurde, ist die Bildung des letal wirkenden Alpha-Toxinsvon C. novyi an die Infektion des Bakteriums mit spezifischen Bakterio-phagen gebunden. Diese Phagen können auch Stämme des Typs D (C. hae-molyticum), die in der Natur kein Alpha-Toxin bilden, zur Alpha-Toxin-produktion konvertieren [Zb].

Das Alpha-Toxin von C. novyi wirkt auf humane embryonale Lungen-fibroblasten cytotoxisch und kann mittels dieser Zellkultur auch quantitativbestimmt werden unter Einsparung des Mäuse-Letalitätstests. Die Zell-kultur aus embryonalen humanen Lungenfibroblasten erwies sich generellals sehr geeignet zum schnellen Nachweis von clostridiellen Cytotoxinen.Die hervorgerufenen cytopathischen Veränderungen sind Spezies-spezi-fisch und können zur Spezies-Identifizierung verwendet werden. DieseZellkultur kann aber nicht generell den Tierversuch zum Nachweis derVirulenz von Clostridien ersetzen, da die Lecithinase, das Haupttoxin vonC. perfringens, keine cytopathische Wirkung auf Lungenfibroblasten zeigte[4.1 u. 4.2].

C. difficile, der Erreger von Diarrhoe und pseudomembranöser Colitis, kannaus Stuhlproben auf dem Cycloserin-Cefoxitin-Fructose-Agar (CCFA) an-gereichert werden und mittels eines Latex-Agglutinationstests (Fresenius)oder in der Norleucin-Tyrosin-Bouillonkultur mittels Gaschromatographieidentifiziert werden. Seine Toxine A und B sind neutralisierbar mit C. sor-dellii-Antitoxin. Das Toxin B ruft einen charakteristischen cytopathischenEffekt in Zellkulturen von humanen embryonalen Lungenfibroblasten her-vor. Dieser Test kann zum schnellen Nachweis von C. difficile-Toxin imStuhl von Patienten verwendet werden und ist spezifischer als der Latex-Agglutinationstest (Marion Scientific) [4.2 bis 4.4].

Zur Bestimmung von Tetanus-Antikörpern im Serum zur Ermittlung desImpfschutzes eignen sich die auf dem Markt befindlichen ELISA-Tests(MeIj a, Virotech) [5].

Wie wir in Untersuchungen über das Vorkommen und die Verbreitung vonClostridien im menschlichen Untersuchungsmaterial festgestellt haben,werden neben pathogenen Clostridien häufig sogenannte apathogene CIo-stridium-Spezies bei Wund- und anderen Infektionen gefunden. Ihre kli-nische Bedeutung ist noch unklar, da sie häufig aus mischinfizierten Pro-zessen isoliert werden [Zb].

Bei einigen dieser Clostridien konnten wir Cytotoxine nachweisen und sienäher charakterisieren (C butyricum, C. oceanicum). Bei 2 C. limosum-lso-laten aus einem humanen Hirn- bzw. Lungenabszeß fanden wir eine ADP-ribosyltransferase, die Ähnlichkeit mit dem C3-Toxin von C. botulinum hatund auch eine gewisse Verwandtschaft zu der ADP-ribosyltransferase vonBacillus cereus aufweist [6.1 bis 6.5].

Soweit wir feststellen konnten, waren alle isolierten Clostridien gegen Pe-nicillin G empfindlich, so daß Penicillin G zur Therapie bei Gasbrand,Gasödem und clostridiellen Mischinfektionen weiterhin u. a. als ein Mittelder Wahl angesehen werden kann [Zb]. Für die Therapie von C. difficile-Colitis gilt entsprechendes für Vancomycin [3.3].

Zur Prüfung der Antibiotika-Empfindlichkeit eignet sich vorzüglich derMikroverdünnungstest, der in Mikrotiterplatten mit Schaedler-Bouillondurchgeführt wird. Er ist platz-, zeit- und materialsparend und gut reprodu-zierbar [Zb].

Inwieweit molekularbiologische Methoden (PCR etc.) zum Nachweis undzur Identifizierung von Clostridien eingesetzt werden können, müssen zu-künftige Untersuchungen zeigen.

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8 Bedeutung für den zivilen Bevölkerungsschutz

In Katastrophen- und Kriegszeiten ist damit zu rechnen, daß es unter derBevölkerung zu schweren Wundinfektionen und Intoxikationen (Lebens-mittelvergiftungen) kommt. Neben Eitererregern spielen dabei die to-xinbildenden Bakterien (Clostridien) als Erreger von Gasbrand, Gasödem,Tetanus, Botulismus, pseudomembranöser Colitis u. a. eine Rolle. Es ist da-her unbedingt erforderlich, unsere Kenntnisse über diese Erreger und ihreToxine vor allem im Hinblick auf eine Schnelldiagnose und zweifelsfreieIdentifizierung zu erweitern und zu vertiefen, da nur eine schnelle thera-peutische Maßnahme lebensrettend ist.

Gerade in den letzten Jahren hat die Entwicklung von Schnellmethodeneinen weiteren Fortschritt gemacht. Die neuen Methoden müssen jedochauf ihre Zuverlässigkeit und Praktikabilität in Katastrophenzeiten überprüftund, wenn nötig, abgewandelt werden, um einsatzbereit zu sein. UnsereUntersuchungen haben dazu einen wichtigen Beitrag geleistet, der auch fürdie Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie zur Verfahrens-richtlinie für die „Isolierung und Identifizierung von Clostridien“(SCHALLEHN, 1990) wurde und damit Eingang in die bakteriologischenRoutinelabors gefunden hat.

Auch in Katastrophenzeiten ist die mikrobiologische Diagnostik der Clo-stridium- und Bacillus-Infektionen Aufgabe der Universitätsinstitute fürMedizinische Mikrobiologie, der Medizinaluntersuchungsämter und derniedergelassenen Ärzte für Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie.

Weiterführende Identifizierungen der Clostridien und Bazillen, der Nach-weis von Toxinen, die Typisierung der Bakterienstämme für epidemiologi-sche Untersuchungen ist jedoch aus Kostengründen überwiegend nurin Konsiliar- und Speziallaboratorien möglich (z. Zt. Dr. H. P. Schau,TMLVUA Erfurt, Prof. Dr. G. Schallehn, Institut für Medizinische Mikro-biologie und Immunologie Bonn).

Vorrangig ist jedoch im Verletzungsfall die frühzeitige sorgfältige Wund-versorgung, um der Entwicklung eines Gasbrands/Gasödems in zer-trümmerten, verschmutzten Wunden vorzubeugen. Ein bakteriologischerBefund kann dann meist nicht abgewartet werden. Denn im Gegensatz zueiner Infektion mit Tetanuserregern besteht bei einer Wundinfektion mitGasödemerregern, je nach der Schwere der Weichteilverletzungen und derStörung in der Blutzirkulation, keine nennenswerte Inkubationszeit.

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Inwieweit molekularbiologische Methoden (PCR etc.) zum Erregernach-weis, ähnlich wie in der Diagnostik von Virusinfektionen, auch in der Bak-teriologie eingesetzt werden können, muß in Zukunft geprüft werden.

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Die Autoren

Brandts, Henning

em. Prof. Dr. med. desInstituts für Medizinische Mikrobiologieund Immunologie der Universität BonnZedernweg 353125 Bonn

Schallehn, Gisela

Prof. Dr. rer. nat.AOR des Instituts für Medizinische Mikrobiologieund Immunologie der Universität BonnEttighofferstr. 5053123 Bonn

Danksagung

Für die technische Hilfe bei den Versuchen danken wir Frau Ursula Klanke,Frau Monika Frechen und Frau Dipl.-Biol. Britta Herding-Sotzeck sowie fürdie finanzielle Unterstützung der Schutzkommission beim Bundesministerdes Innern.

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