546 S H O R T ( OMMUNI( :.\ 1"1( )N

8 S. BOUCHILLOUX, ~I. I((ILI_AND, J . TORRt{SANI, M. I(oQtrV;S i,;'r S. IASSII?ZKV, l¢i.ck~m. I;iopkv< ~qcta, 93 (1964) 15.

9 M. i) . POUI.IK, i\7(.l[lll'F, IS ( ) (1957 ) 1477. IO A. M. I'~ATZ, \ ¥ . J . I)REYI'tR E'r C. B. ANFINSFN, .]. t¢iol. (:t.'JJl., 234 (l()5c)) 2 ' ; 9 7 I I P. M. HARRISON ET T. ttI)VM,XNY. J. 31,d. IHol., 4 (tO()2) -'3(). 12 | ( . A. PIEZ ET l - MORRIS. . ' t~m!. 14iochcm., t (l()¢~o) I87.

Re~u le 3 aoflt, I9O 5

l;iochim. Biophys..4cta, i1 t (1<~05} 5t3 54 o

so: 23 z79

Zur Bildung wasserliislicher Metaboliten aus Oestron in

Rattenlebermikrosomen

Die Leber vermag Oestrogene in wasserl6sliche, mit organischen L6sungsmitteln nicht extrahierbare Stoffwechselprodukte umzuwandeln. Dabei handelt es sich in erster Linie um Glucuron- und Schwefels~iurekonjugate der Hormone und ihrer Meta- boliten. Zu ihrer Biosynthese sind neben einer mikrosomalen UDP-Glucuronyl t rans- ferase (EC 2.4.1.17) bzw. einer 16slichen Sulfokinase (EC 2.8.2.I) gewisse Cofaktoren (UDP-Glueurons~iure, ATP) erforderlieh 1. Jedoch aueh in Abwesenheit derartiger Stoffe bildet die Mikrosomenfraktion wasserl6sliehe Oestrogenmetaboli ten ; ihre Natur und der Meehanismus ihrer En ts tehung sind noch ungekl~irt 2-6.

[i6-14C!Oestron (50 m/~Mol) wird mit Mikrosolnen 4 aus 400 mg Leber weiblicher Wis tar ra t ten in Gegenwart yon o.25 mMol Nicotinsttureamid und 1.8/~Mol N A D P H bei 37 ~' und pH 7.4 in o.I M Tris-HC1 Puffer (Endw)lumen 4 ml) inkubiert. Stoppt man naeh 15 Min mit I N Salzstture, so bleiben naeh wiederholter Ex t rak t ion des Ansatzes mit peroxydfreiem ]~ther und F~illung der Proteine mit o.6 N Perchlors~ure in der wtissrigen Restphase durchsehnitt l ieh 2 % der eingesetzten Radioaktivitti t zuriick. Verwendet man 15000 . ~,-Lrberstand anstelle yon Mikrosomen 4, so erh6ht sich die Ausbeute wasserl6slicher Produkte auf IO %, bei l~tngeren Inkubationszei ten (2-3 Std.) bis auf 4o %. Zugleich werden 3o-5o % der Radioaktivitt i t irreversibel an Proteine gebunden a '~. Der die Bildung wasserl6slicher Metaboliten stinmlierende f]*berstandsfaktor ist dialysabel und hitzestabil.

Die mit 15ooo • g-l~Tberstand entstehenden polaren Produkte lassen sich aus der NaCl-geslittigten wfissrigen Phase bei verschiedenem pH unterschiedlich leicht mit n-Butanol extrahieren. Wtthrend bei pH 7.4 22.3 % ausgeschiittelt werden k6nnen, sind es nach Zusatz yon I N NaOH nur 8.0 %, nach Zusatz yon IO N HCI dagegen 62.7%. S/iulenchromatographie der wfissrigen Phase an Ecteola (Ameisenstiure- Stufengradient) liefert mindestens fiinf radioaktive Banden, die dutch Papierchro- matographie im System Bu tano l -E i se s s ig -Wasse r (4: I :5, v/v/v) noeh weiter auf- gespalten werden k6nnen. Das Ergebnis der S~iulenehromatographie bleibt unver- /indert, wenn man die w~issrige Phase zuvor mit Pronase oder fl-Glucuronidase (EC 3.2.i .3I) inkubiert. In der Papier-Hochspannungselektrophorese wandert nahezu die gesamte Radioaktivit t i t unter Aufspal tung in mehrere Banden bei pH 4 zur Anode, bei pH 1.8 dagegen zur Kathode.

Inkubier t man 116-a4C !Oestron und N A D P H stat t mit I5OOO - g-{;~berstand

Biochim. Hiophys..4cla, ill (1()~5) 54 () 54,~

SHORT COMMUNICATIONS 547

mit der Mikrosomenfraktion und verschiedenen Aminos~iuren (Glycin, Serin, Lysin, Glutamins~iure, Prolin, Cystein, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin), so wird die Radio- aktivit~t der w~issrigen Phase nut in Gegenwart von Cystein signifikant erh6ht. Den gleichen Effekt erzielt man mit Glutathion oder Thioglykols~iure. W~ihrend sich die mit Glutathion entstandenen radioaktiven Produkte weder bei pH 7.4 noch bei pH 1.5 mit Ather extrahieren lassen, k6nnen die mit Thioglykols~iure gebildeten Metaboliten bei pH 1. 5 vollst~indig ausge~tthert werden; bei pH 7.4 bleiben sie dagegen in der w/issrigen Phase (Tabelle I). Alle drei Sulfhydrylverbindungen hemmen die Bindung radioaktiver Stoffwechselprodukte an Proteine (Tabelle I). Ahnlich wirkt Thiouracil, das jedoch als relativ schwer 16sliche Substanz nicht zu einer Vermehrung wasser- 16slicher Metaboliten ffihrt (Tabelle I, No. 7 und 8). Der Bruttoumsatz des Oestrons wird durch Cystein, Glutathion, Thioglykols~ture und Thiouracil nicht wesentlich be- einflusst. Auch die Geschwindigkeit des Oestronverbrauchs und der 2-Hydroxylierung wird durch Glutathion nicht ver~tndert; es verschiebt sich lediglich das Verh~tltnis zwischen wasserl6slichen und proteingebundenen Metaboliten. Mit steigender Glutath- ion-konzentration geht die Proteinbindung in dem Masse zurfick, wie die Ausbeute an wasserl6slichen Produkten zunimmt (Tabelle I, No. 9-13). Lebermikrosomen m~inn- licher Ratten bilden auch ohne ~berstand oder Sulfhydrylverbindungen mehr wasser- 16sliche Oestronmetaboliten als Lebermikrosomen weiblicher Tiere (Tabelle I, No. I und 2). Durch einmaliges Waschen der Mikrosomen mit o.25 M Saccharosel6sung wird die Aktivit~it der w~issrigen Phase um mehr als 5o % gesenkt, w~ihrend die Protein- bindung ansteigt (Tabelle I, No. 4).

Die hier mitgeteilten Befunde machen es wahrscheinlich, dass Lebermikrosomen die Umwandlung von Oestron in Metaboliten katalysieren, welche in unspezifischer

TABELLE I

BILDUNG VON POLAREN METABOLITEN AUG OESTRON IN RATTENLEBER MIKROSOMEN

Bfldung wasserlOslicher und proteingebundener Metaboliten aus [16-14C]Oestron mit Leber- mikrosomen weiblicher (No. i) und mAnnlieher Wistarratten (No. 2-14) unter verschiedenen Bedingungen. Pro Ansatz (2 ml} Mikrosomen aus 2oo mg Leber, 3o m/,Mol [16-14C]Oestron (entspr, 6.o6-lO 4 Impulse/Min), o.125 mMol NieotinsAureamid und 2 /~Mol NADPH. pH 7.4 (o.i M Tris-HCl Puffer); 37 °. Zweistiindige Inkubation unter Luftzutritt. Die Versuche 2-14 wurden mit der gleichen Mikrosomenpr~paration durchgeffihrt.

No. Bedingungen z~'therextraktion bei pH

% der eingesetzten Aktivitdt

Wasserldslich Proteingebunden

i N o r m a l a n s a t z ~ 1.5 3-7 58-7 2 N o r m a l a n s a t z (~ I '5 I I "4 31 .O 3 N o r m a l a n s a t z 7-4 lO.6 27.2 4 G e w a s c h e n e M i k r o s o m e n 1. 5 4.8 47.8 5 Z u s a t z y o n 2 m M o l T h i o g l y k o l s i i u r e 1. 5 2.2 4.3 6 Z u s a t z v o n z m M o l T h i o g l y k o l s i i u r e 7.4 22-4 4 .0 7 Z u s a t z y o n 2 m M o l T h i o u r a c i l 1.5 3.4 6.0 8 Z u s a t z y o n z m M o l T h i o u r a c i l 7.4 4 .I 5.7 9 Z u s a t z y o n o . i m M o l G l u t a t h i o n 1. 5 2o. 7 17. 7

IO Z u s a t z y o n 0.5 m M o l G l u t a t h i o n 1.5 28. 4 6.6 i i Z u s a t z y o n I.O m M o l G l u t a t h i o n 1. 5 38.4 4.1 12 Z u s a t z y o n 2.o m M o l G l u t a t h i o n 1. 5 33.3 3.1 13 Z u s a t z y o n io .o m M o l G l u t a t h i o n 1. 5 36.2 2.2 14 Z u s a t z y o n 2.o m M o l G l u t a t h i o n 7-4 3 ° .8 3.3

Biochim. Biophys. Acta, i i i (1965) 5 4 6 - 5 4 8

548 SHORT COMMUNICATI( )N>

Weise von n iedermolekularen Su l fhydry lve rb indungen oder Mikrosomenpro te inen fiber SH-Gruppen gebunden werden, wobei wasserl6sliche Stoffwechselprodukte ent- s tehen k6nnen. Die N a t u r der die Bindung eingehenden Oes t ronabk6mml inge ist noch unbekann t . Obwohl verschiedene Beobach tungen darauf h indeuten , dass sic im Verlauf der mikrosomalen 2 -Hydroxy l i e rung des Oestrons gebi ldet werdenT, 8 ist cs nach vorl iegenden Befunden und Ergebnissen von anderer Seite 9 wenig wahrschein- lich, dass es sich um o-Chinone handel t . Die exper imente l len Da ten sprechen eher ffir rad ika l i sche Zwischenprodukte .

Biochemisches Ins t i tu t des Deutschen Krebsforschungszentrums, Heidelberg, und Max-Planck-[ns t i tu t f i i r Biochemie, Miinehen (Deutschland)

ERICH HECKER GERNOT WALTER

FRIEDRICH MARKS

i H. BREUER, Vitamins Hormones, 20 (1962) 285. 2 G. RUMNEY, Federation Proc., 15 (1956) 343. 3 E. HECKER UND S. M. A. D. ZAYED, Z. Physiol. Chem., 325 (1961) 209. 4 E. HECKER UND F. MARKS, Z. Physiol. Chem., 34 ° (1965) 229. 5 C. LAZIER UND P. H. JELLINCK, Can. J. 13iochem. Physiol., 43 (1965) 281. 6 P. H. JELLINCK UND I. LUClEER, J. Endocrinol., 32 (1965) 9I. 7 F. MARKS, Dissertation, UniversitSt Mi~nchen, 1964. S.3If.f. 8 E. HECKER END F. MARKS, Biochem. Z., im Druck. 9 P. H. JELLINCK, Biochim. Biophys. Acta, 78 (I963) 778.

Eingegangen am 5. August , 1965

Biochim. Biophys. Acta, I 1 ~ (I965) 546-548

SC 23 Z72

Biosynthesis of thymidine diphosphate L-rhamnose in Escherichia coli K-12

In Ente robac te r iaceae , the m u t a t i o n which t ransforms smooth wild t ype in to rough s t ra ins results in a loss b y cell wall l ipopolysacchar ide of i ts "S-specific s ide- cha ins" . These s ide-chains are known to conta in f requent ly , in Escherichia coli as well as in Salmonel la , sugars such as mannose, rhamnose , fucose, and 3 ,6-dideoxyhexoses; the loss of these s ide-chains leaves a " r o u g h - t y p e " or "RI I core" l ipopolysacchar ide , conta in ing only glucose, galactose, a ldoheptose , 2-keto-3-deoxyoctonic acid, and glucosamine as monosacchar ide uni ts 1,~.

E. coli K - I 2 and all i ts subs t ra ins are rough organisms; t h e y show auto- agg lu t ina t ion in saline, and in none of t hem have any specific O-ant igens been de- t e c t ed 3. Al though s t ra in K - I 2 p re sumab ly der ives from a smooth organism, this parent s t ra in is not known.

The b iosynthes is of L-rhamnose involves two steps 4. F i r s t TDP-glucose is con- ve r ted into TDP-4-ke to-6-deoxyglucose ; then the l a t t e r is t r ans fo rmed into TDP- rhamnose. OKAZAKI et al.* r epor t ed t h a t a subs t ra in of I{-12, s t ra in Y-Io , had a metabol ic block in the second of these steps. I t is t e m p t i n g to specula te t ha t this defect might be the cause of the roughness of K - I 2 strains. I f rhamnose is an integral componen t of the S-specific s ide-chains of cell wall l ipopolysacchar ide in the hypo- the t ica l smooth pa ren t s t ra in of K- I2 , the inab i l i t y to synthesize TDP- rhamnose

Biochim. Biophys. Acta, i R l (i905) 548--551