Deutsche Zeitschrift f. Nervenheilkunde, Bd. 176, S. 126--142 (1957)

Aus der Neurologischen Universit/~tsklinik Hamburg-Eppendorf und der Stiftung zur Erforschung der Spinalen Kinderlithmung und Multiplen Slderose

(Direktor: Prof. Dr. H. PETTE)

Zur Frage der Identitiit der Liquorproteine mit den Eiweil3k~rpern des Blutserums *

III. Die Mucoproteine des Liquors

Von

H. BAUER

Mit 4 Textabbildungen

(Eingegangen am 14. November 1956)

Alle/ilteren Verfahren zur Bestimmung des Liquoreiweil3gehaltes sind F~llungs- methoden, bei denen die quantitative Ablesung entweder durch Trfibungsmessung, sedimetrische Bestimmung des Niederschlages oder kjeldahlometrische Feststellung seines Stickstoffgehaltes erfolgt. Als F~llungsmittel dienen S~uren, Salze oder Kom- binationen beider.

Mit der Einffihrung yon Aussalzungsmethoden zeichnete sich das Bestreben ab, fiber den Gesamteiweil3gehalt hinausgehend einzelne Proteinfraktionen zu erfassen. Den Anstol3 hierzu gab die klassische Methode von NO~E-ArELT-Sc~uMM, nach welcher eine F~llung der Globuline durch halbgesi~ttigtes Ammonsulfat erfolgt. K/tFKA benutzte verschiedene Ammonsulfat-Konzentrationen zur Trennung yon Fibrinoglobulin, Euglobulin, Pseudoglobulin und Restglobulin. Eine der wichtigsten Methoden der klinisch-chemisehen Liquordiagnostik wurde die yon ihm angegebene Bestimmung des Albumin-Globulin-Quotienten, die eine Kombination yon Pikrin- s/~uref~llung und Ammonsulfat-Aussalzung darstellt. Nach dieser Methode wird der GesamteiweiBgehalt durch F/tllung der Liquorproteine mittels Esbach-Reagens und Ablesung der Niederschlagsh5he nach Zentrifugierung in einem SpezialrShrchen bestimmt. Zur Ermittlung des Globulin-Gehaltes werden die Globuline dureh halb- ges~ttigtes Ammonsulfat gef~llt, der abzentrifugierte Niederschlag in physiologischer KochsalzlSsung wieder aufgelfist und wie bei der Gesamteiweil~bestimmung mit Esbach-Reagens nach erneuter F~llung sedimetrisch gemessen.

In einer ausffihrlichen Arbeit fiber die praktische und theoretische Bedeutung der Eiweil3relation hat DEMM~. neben dem klinischen Fortschritt, den dieses Ver- fahren bedeutete, auch den Wert der hierdurch ermSglichten Fraktionierung der Proteine fiir die Liquorforschung im Sinne der funktionell-genetischen Studien KAFKAS aufgezeigt.

Ein analoges Verfahren wurde yon HEWITT angegeben, der die Gesamteiweil3e des Liquors durch Natriumwolframat und Schwefels~ure, die Globuline durch halb- gesattigtes Ammonsulfat f~llte und den ]~iweiflgehalt in beiden Fraktionen kolori- metriseh mit dem Reagens nach FOLzN-Wu bestimmte.

* Mit Unterstfitzung der National Multiple Sclerosis Society, New York.

Identiti~t der LiquorprGteine mit den EiweiBkSrpern des Blutserums. III . 127

STAR¥, KRAL U. WINTERNITZ fMlten in gleicher Weise wie HEWITT, bestimmten den EiweiBgehalt jedoch tiber Stickstoff mit dem l~esslerschen Reagens. Im Prinzip ahnlich waren die Methoden yon HALPElCN und MENDEL, die das EiweiB mit Trichlor- essigsi~ure und Natriumsulfat fallten.

Als Bezugswert fiir aUe Verfahren, auch die noch zu besprechenden kolorime- trischen, client die Kjeldahl-Bestimmung des Eiweil~stickstoffes. In Mikro-Anord- nungen ist sie auch zur serienm~iBigen Bestimmung des Liquor-Gesamtproteins herangezogen worden (ABELIN), hat sieh aber infolge ihrer technischen Umst~ind- lichkeit nicht in der Breite durchsetzen kLnnen. Es mu~ hervorgehoben werden, dab auch die mit der Kjeldahl-Methode gefundenen Werte letzten Endes yon der Art der EiweiBfiillung entscheidend abhangen.

Mit der Entwicldung der Elektrophotometrie haben Farbreaktionen in steigen- dem Ma2e zum Naehweis der Liquorproteine Verwendung gefunden. Sie beruhen im Prinzip auf dem kolorimetrischen Nachweis von Aminosauren, insbesondere Tyrosin (JOHNSTON U. GIBSON, MARRON, I)AUGHADA¥, LOWRY), yon Xantho- protein (DuENSlNG), Farbstoffadsorption an gefiilltes Eiwei[~ (BLHLE U. FISCHER, Fi)HR U. HINZ) oder der Messung des Biuret-Farbkomplexes, der durch Proteine mit alkalischen Kupfersalzen gebildet wird.

Mit der Angabe eines reproduzierbaren, stabilen Kupfertartratkomplexes durch WEICHSELBAUM wurde die Biuret-Reaktion zu einer praktischen Methode der quan- t i tat iven EiweiBbestimmung, die in zahlreichen wissenschaftlichen Laboratorien der ganzen Welt Verwendung gefunden hat. Die yon WEICHSELBAUM angegebene Methode zur Bestimmung der Serum- und Plasmaproteine wurden durch DITTE- ERANDT zur Anwendung fiir Liquorproteinbestimmungen modifiziert. EPSTEIN ver- wendete die Lehmansche Modifikation der Biuret-Methode zur quantitativen Be- stimmung yon Eiwei~fraktionen. In Deutschland haben sich HINSBERG U. GLEISS ausfiihrlich mit der Biuretreaktion befa[~t und die Methode zur Bestimmung der Liquorproteine empfohlen. Diese Autoren heben hervor, dal~ Farbstarke und Farb- ton der Biuretreaktion bei gleichen Gewichtskonzentrationen der untersuchten LLsungen gleich und unabhangig yon Mol-GrLBe und Aminosiiurezusammensetzung des Substrates seien. Der EinfluB yon Rest-Stickstoff und Harnstoff-Stickstoff auf die Biuret-Reaktion k6nne vernachl~issigt werden. Lediglich den in bestimmten Fallen gering vermehrten, nicht ausfiillbaren LiquoreiweiflkLrpern mit 2 oder mehr Carbamylgruppen diirfte ein geringer Einflul~ auf die Farbtiefe des Biuret-Farb- komplexes zugesprochen werden. Dadurch sei die obere Grenze der mit dieser Methode ermittelten Liquoreiweil3werte (45 rag-%) etwas hLher als der kjeldahlo- metrisch ermittelte (35 mg-%) anzusetzen.

FRANK U. K6CHER kormten die Behauptung yon FINE, dab Albumin und Glo- bulin verschiedene Biuret-Werte gaben, nicht bestatigen. Kjeldahl- und Biuret- Werte gingen auch bei reinen Globulinen konform. Eigene Messungen an reinem Albumin und Globulin bestatigten die Feststellung yon FRANK U. KLCHER. WAWER- SIK U. BLCKLER fanden ebenfalls hLhere GesamteiweiBwerte mit der Biuret- Methode als durch die GesamteiweiBbestimmung nach KAFKA und die nephelome- triscbe Suffosalizylshuremethode CUSTERS. Die gleiche Feststellung ging aus einer eigenen Vergleichsstudie der Methode yon KAFKA, nephelometrischen Messungen yon Sulfosalicylsauresuspensionen, die dutch gummi arabicum stabilisiert wurden, und dem Biuret-Verfahren hervor.

Durchschnittswert fiir Gesamteiwei[~ in 100 normalen und pathologischen Liquors:

nach der Kafka-Methode 33 rag-% nach der Biuret-Methode 51 mg-°/o

128 H. BXU~R:

Diese Z~hlen zeigen, dal] die mit der Biuret-Methode gefundenen GesamteiweiB- werte in einem Liquor mit annahernd normalem Eiweil3gehalt im Durchschnitt etwa 40% hSher sind als die Werte, die man mit der Kafka-Methode erh~tlt. In einer entsprechenden GrSl~enordnung verh~lt sich die Differenz zwischen Biuret-Wert und den Gesamteiweil3werten, die man nach Sulfosalicyls~ure- bzw. Trichloressig- si~urefi~llungen findet (,,Biuret-Differenz"). Aus diesem Grunde hat sich die sonst fiir analytische Arbeiten gut bew~hrte, einfach durchzufiihrende Biuret-Bestim- mung in der klinischen Liquordiagnostik nicht durchgesetzt. Diese starke Differenz

Tabelle 1. Prozentualer Anteil der ,,Biuret-Di//erenz" am Gesamteiweifl des Liquors

Biuret Biuret Biuret- % d. Gesamt-Biuretwertes Prot. Nr. TC S-F~llung ungef~llt differenz gef~lltes Biuret-

Eiwei~ differenz

41 53

2032 43

1994 1988 1894

59 2037 2045

47 1866

58 2056

45 1941

54 55

1892 1889

16,4 20,6 24 26,2 28 29 29 30,8 32 38 39,1 40 41,5 43 61,8 62

110,9 133 138 164

30,4 38,3 45 43,2 42 42 48 50,8 49 56 52,8 55 58,1 59 81,7 8O

124 148 150 178

14 17,7 21 17 14 13 19 20 17 18 13,7 15 16,6 16 19,9 18 13,1 15 12 14

52,7 53,8 53,4 60,6 66,7 69,1 58,2 60,7 65,3 67,9 74,1 72,9 71,4 73,1 75,6 77,5 84,3 89,9 92,0 92,2

47,3 46,2 46,6 39,4 33,3 30,9 41,7 39,3 34,7 32,1 25,9 27,1 28,6 26,9 24,4 22,5 15,7 10,1 8,0 7,8

der Gesamteiwei[3werte findet man allerdings nur bei anni~hernd normaler Gesamt- eiwei~konzentration des Liquors. Mit Anstieg des Gesamteiwei~gehaltes f~llt die Differenz zwischen Biuret- und Kafka-Wert proportional ab (s. T~belle 1 u. 2).

Es mul~ somit angenommen werden, dal3 die pathologische Eiwei~vermehrung im Liquor quantit~tiv iiberwiegend durch Proteine zustande kommt, die mit Pikrin- s~ure fMlbar sind, w~hrend im normalen Liquor Biuretfarbstoffbildende Substanzen in betr~chtlicher Menge vorhanden sind, bei denen es sich entweder um schwer f~ll- bare Proteine oder Eiweil3spaltprodukte handelt.

In einer friiheren Arbeit wurde darauf hingewiesen, dal~ die in der Literatur angegebenen ,,Normalwerte" ftir Liquor-Gesamteiweil3 einer gro0en Schwankungs- breite (23--61 mg-%) unterworfen sind. Dieser gro~e Unterschied ist darauf zuriick- zufiihren, daI~

1. nicht immer klar definiert ist, ob mit dem Normalwert ein Durchschnltts- wert oder oberer Grenzwert gemeint ist.

2. die auf verschiedenen chemischen Grundlagen beruhenden N~chweisverfah- ren, wie bereits ausgefiihrt, verschiedene Eiweil~kompenenten erfassen, die zu unter- schiedlichen quantit~tiven Ergebnissen fiihren. Fiir die Vergleichbarkeit der yon

Identi tat der Liquorproteine mit den EiweiBkSrpern des Blutserums. III . 129

verschiedenen Untersuchern ermittelten Werte ware wiinschenswert, nicht nur einen allgemein anerkannten Bezugs-Standnrd Ms Grundlage zur Bewertung einer gegebenen Methode anzugeben, sondern much d~riiber Klarheit zu gewinnen, welche Komponenten des Liquoreiweil~-Spektrums erfal]t werden.

In der vorliegenden Arbeit wird als Liquor-Eiweil~ die Gesamtmenge der Biuret-Farbstoff gebenden Substanzen im Trichloressigsi~ure-(TCS)-Niederschlag des

Tabelle 2. Vergleich der Liquor-Eiwei[3werte bei Bestimmung dutch die Ka/ka.Methode und die Biuret-Methode nach Fiillunff durch Trichlor-Essigs~iure

Kafka-E. gef~tllter Biuret-Wert Prot. -Nr. rag- % nag- %

2105/51 703/51

1894/51 2082/51 2129/51

462/53 1988/51 1994/51 1990/51 2033/51 2037/51 21o4/51

748/53 755/53 708/53

1979/51 2647/51 484/53 483/53

1941/51 705/53

1986/53 1892/51 1889/51 1991/51

O,8---- 19,2 0 , 8 ~ 19,2 1 , 0 : 2 4 1,0 = 24 1 , 0 ~ 24 1,0 ~ 24 1 , 2 ~ 28,2 1,2 = 28,2 1 , 2 ~ 28,2 1,2 = 28,2 1,2 ~ 28,2 1,2 ~ 28,2 1,2 ~ 28,2 1 , 2 ~ 28,2 1 , 2 ~ 28,2 1 , 4 = 33,6 1 , 4 = 33,6 2,0 = 48 2,1 ~ 50,2 2,2 = 52,8 3 , 2 - 76,8 3,8 = 91,2 5,0 ~ 120 5,2 = 124,8 6,4 ~ 153,6

22 25 26 24 25 26 29 28 36 22 28 22 33 24 28 29 38 53 47 62

105 128 138 164 186

nativen Liquors bezeichnet. Wie bereits ~ngegeben, entspricht der damit gemessene Wert dem kjeldahlometrisch nach TCS-Fallung bestimmten. Das Ergebnis ist in engen Grenzen reproduzierbar. Die TCS-Fallung eignet sich far klinische Zwecke und l~outinebestimmungen besser als die fiir besondere Fragestellungen verwendete Perchlorsaure-Fallung, da der Trichloressigs~ure-Niederschl~g schon bei gewShn- lichen Tourenzahlen (3000 U/rain) yore Oberstand quantitntiv zu trennen ist. Die WiederauflSsung im Biuret-Reagens bereitet keinerlei Schwierigkeitem

Methodik: 1,0 ml Liquor wird mit 0,5 ml 20%iger Trichloressigsi~ure versetzt, 10 min stehen gelassen und bei 3000 U/rain 10 min l~ng zentrifugiert. Der ldare Uberstand wird abgegossen und die W~nde des ZentrifugierrShrchens mit Filter- papier ausgetupft. Aufl6sen des Niederschlages in 1,0 ml Biuret-Reagens -]-1,0 ml physiologischer N~C1-L6sung. Nach ~zsttindigem Stehen wird bei 546 m# und einer Schichtdicke yon 10 mm gemessen.

Dtsch. Z. Nervenheilk., Bd. 176 9

130 H. BAUER:

1. Fraktionierte Fiillungen zur Erfassung der schwer fiillbaren Liquorproteine

Um die Frage weiter zu kl~ren, welehe schwer f~llbaren Substanzen dureh die Differenz zwisehen Biuret-Wert vor und naeh Behandlung des Nativ-Liquors mit Proteinf~tllungsmitteln erfaBt werden, wurden syste- matische Untersuchungen mit Bestimmung der Biuret-Werte im Nativ- liquor und im gef~llten Eiwei~ vorgenommen. Zur F~llung der Liquor-

Tabelle 3

Nativ- TCS- HCI O,- PWS- PWS- F~llung F~llung aus Prot. Nr. Liquoro/ F~ l lung Ftillung aus TCS-t3 ItC104-t2 rag- /o rag- % rag- % rag- % rag- %

43 43,2 45 81,7 47 52.8 54 124,0 55 148,0 57 32,4 58 58,1 59 50,8

D 74

26,2 20,3 61,8 55,6 39,1 34,4

110, 9 104, 2 133,0 128,0 22,2 17,4 41,5 37,3 30,8 26,0

58,2

5,0 3,3 9,3 15,4 5,6 9,9 7,0 13,2

10,6 8,2 4,9 7,8 4,0 4,4 14,5

52,4 6,25 9,04

,,Biuret-Differenz" 74 - - 58,2 = 15,8 74 - - 52,4 = 21,6

Anteil der P WS-Fra]ction an der Biuret-Di//erenz

6,25 = 39% nach TC S-Fiillung 15,8 ~

9,04 = 42% nach HC104-F~llung 21,6-

proteine wurde zuniichst Trichloressigs~ure verwendet, da dieses F~I- ]ungsmittel zur Pr~zipitation von Proteinen generell verwendet wird, Vergleiche mit quantitativen Angaben der Literatur erlaubt und die Eiweii3niederschl~ge sich leicht abzentrifugieren lassen. Die Trichlor- essigs~ure ist aui]erdem als stickstoffreies F~llungsmittel sowohl ffir Kjeldahl-Bestimmungen wie ffir die Biuret-Reaktion gut geeignet. Pikrin- s~ure, die als Esbach-Reagens nach der Kafkaschen Methode ffir die Liquoreiweil~bestimmung viel verwendet worden ist, kommt als F~llungs- mittel wegen ihrer intensiv gelben Farbe, die den Biuret-Nachweis stSrt, nicht in Frage.

Zur Aufschlfisselung der Differenz zwischen ungefiilltem und gefiilltem Liquor (,,Biuret-Differenz"), wurde versucht, aus dem (Jberstand naeh Fiillung der Liquorproteine mit Trichloressigs~ure durch andere F~llungs- mittel weitere Komponenten abzugrenzen. Es gelang dabei, durch F~l- lung mit Phosphor-Wolframs~ure sine Fraktion zu gewinnen, deren Biuretwert fiber ein Drittel der Biuret-Differenz ausmachte (Tabelle 3).

Iden t i t / i t der Li~luorproteine m i t den EiweiBkSrpern des Blu t se rums . I I I . 131

I . . . . . .

~0 ¢~10 ~ ¢~0

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D t s c h . Z. N e r v e n h e i l k . , Bd . 176

~ r - " ~ ~ 1 ~ i i i

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9*

132 H. BAUER:

Entsprechende F~llungsversuche wurden yon WINZLER, DEVOR, MEHL U. SMYTH im menschlichen Plasma durehgefiihrt. Diese Autoren isolierten durch Phosphorwofframs~ure-(PWS)-Fi~llung aus Trichloressigs~ure- (TCS) bzw. Perchlorsi~ure-(HC10a) (]bersti~nden eine Eiweil~fraktion, die

einen hohen Gehalt an Tabelle 5

Biuret-Wert PWS-Fraktion Prof. mr. Nativ-Liquor

mg-% rag-%

43 47 57 58 59 78 86/1 86/2

117 120 121 122 123 298 299 3OO 307 311 312 430 432 433 435 436 445/6

D

43,2 52,8 32,4 58,1 50,8 37,0 62,7 42,8 50,1 45,6 36,3 69,4 66,6 38,2 39,6 32,3 56,1 65,0 37,0 39,6 41,6 36,3 33,0 46,2 42,9

46,1

Anteil der P WS-Fraktion der Gesamt-Biuretwert des Liquors 14~2°/o

Kohlenhydraten, Hexos- amin und Schwefel aufwies. WINZLER und Mitarbeiter bezeichneten die so gewon-

5,0 nene Eiweil3fraktion als Mu- 5,6 coprotein. Sie konnten die 4,9 Praktion auch durch Aus- 4,0 4,4 salzung des ~berstandes 6,04 mit Ammonsulfat gewinnen 9,7 und zur elektrophoretischen 6,6 Wanderung bringen. Es 6,4

11,5 zeigten sich dabei minde- 6,75 stens 3 Banden im Phero- 9,3 gramm, womit erwiesen 8,2 war, da~ es sich nicht um 4,8 6,3 ein einheitliches Protein 7,8 handelte. 9,2 WINZLER und Mitarbei-

10,3 ter stellten lest, dal~ durch 5 , 9 5 Fi~llung mit 0,75 n HC10 4 3,7 5,3 eine hShere Ausbeute an 4,2 Mucoproteinen zu erreichen 5,7 war als nach TCS- oder Sul- 6,5 fosalieylsi~uref~llung. Aus 5,8 diesem Grunde gingen auch 6,56 wir dazu fiber, in den wei-

teren Versuchen HCIO 4 als Fifllungsmittel ffir die Li- quoreiweil3e zu verwenden.

Wie Tabelle 3 zeigt, ergibt diese F~llung einen etwas hSheren Anteil der Liquor-PWS-Fraktion am Gesamteiweil~ als bei der TCS-Fi~llung, eine Beobachtung, die mit den Ergebnissen der Plasmaversuche WINZ- L~RS fibereinstimmt.

Vor eingehenderen Untersuchungen der aus dem HClO4-~]berstand des Liquors gewonnenen PWS-Frakt ion wurden Neutralisationsversuehe durchgeffihrt (Tabelle 4), um den Verbleib der restlichen 60% der Biuret- Differenz im PWS-?]berstand nachzuweisen. Wie die Tabelle 4 zeigt, ergeben die Biuret-Fraktionen

Identitat der Liquorproteine mit den EiweiBk6rpern des Blutserums. III. 133

1. Trichloressigs~ure-Niederschlag H- Trichloressigs~ure-~berstand, 2. Perchlorsi~ure-Niederschlag ÷ Perchlorsi~ure-t~berstand, 3. Perchlorsi~ure-Niedersehlag ÷ PWS-Niederschlag ÷ PWS-~berstand Werte, die den im ungefiillten Liquor festgestellten BiuretgesamteiweiB- werten entsprechen.

Es ist somit erwiesen, a) dal~ rund 40~o der Biuret-Differenz des Liquors in der PWS-Fraktion

zu erfassen sind, b) da$ die restlichen 60% aus nieht fi~llbaren, im PWS-~bers tand naeh-

weisbaren Substanzen be- stehen. In weiteren Analysen wurde

die PWS-Fraktion des Liquors n~her untersucht und mit den Plasma-Mucoproteinen WINZ- 98 LERS verglichen. 100

101 Eine ~bersicht yon 25 Li- 110

quoranalysen (Tabelle 5) zeigt, 126 dab der Anteil der PWS-Frak- 453 tion an der Gesamtmenge der 455 die Biuret-Reaktion gebenden 456

457 Substanzen des Liquors 14,2 458 betr~gt. Zum Vergleich werden die entsprechenden Werte yon D 10 Serum-Analysen angeffihrt (Tab. 6). Hier betr/~gt der Anteil der PWS-Fraktion nur 0,82 %.

Tabelle 6

Biuret-Wert P W S - F r a k t i o n Prot . Nr. Na t iv - Serum

rag- % rag- %

6960 63,2 6560 72,8 6350 49,3 6100 55,5 6700 46,2 5940 39,6 6140 50,1 6540 34,3 6560 36,9 6600 79,2

6445 52,7

Anteil der PWS-Frakt ion am Gesamt-Biuret des Serums 07820/0

Aus diesen Befunden geht deutlich hervor, da6 der Anteil der schwer f~llbaren Proteine im Liquor rund 15mal hSher ist als im Serum.

2. Kohlenhydrat- und filucosamingehalt der schwer f~illbaren Liquorproteine

Es wurde nun der Nachweis angestrebt, da~ die Liquor-PWS-Fraktion den dutch WINZLER aus dem Blut mittels PWS-F~llung gewonnenen Mucoproteinen entsprach. Zur Charakterisierung wurde der Kohlen- hydratgehalt der Perchlors~ure- und PWS-Fraktionen im Serum und Liquor bestimmt.

Als Methode zur KoMenhydratbestimmung in den Eiweil~fraktionen wurde zun~chst die Tryptophan-Methode yon SHETL~ in der yon WINZLER angegebenen Modifikation benutzt.

LSsungen: 7%ige PercMors~ure; 5%ige Phosphorwolframs~ure in 2 n Salzs~ure; 77%ige Schwefels~ure; 22%ige :N%CO a, ges~ttigt; 1% w~13rige Tryptophan-LSsung. Das Tryptophan wird vorsichtig in der W~rme gelSst und dutch eine Glasfritte

134 H. BAUER:

filtriert. Filterpapier daft nicht verwendet werden. Die klare LSsung wird im Ktihlraum aufbewahrt.

Aus/i~hrung: Der Liquor wird mit der gleichen Menge 7°/oiger HC104 versetzt, 10 min stehen gelassen und hochtourig abzentrifugiert. Beim Serum verwendet man die 2,5fache Menge an HC104. Vom klaren Filtrat wird abpipettiert und mit gleicher

Tabelle 7. Kohlenhydratgehalt tier HCIO~- und PWS-Fraktion des Liquors ( T r y ptopha n- Met hode)

UngeftLllter Liquor [ HC10~-Niedersehlag PWS-Niedersehlag

Prot. Nr.

67 70 71 78 86/1 i 86/2!

122 i 123 1 307 311 312

D

Biuret KH ;/~I rag- % rag- % B i u ~

37,0 62,7 42,8 69,4 66,9 56,1 65,0 37,0

Biuret mg- %

24,8 305,0 208,0

17,5 45,6 25,8 52,8 46,6 33,0 46,2 16,2

KH rag- %

0,82 6,5 4,46 1,18

1,28 1,68 0,87 1,57 0,82

Bi~et

3,3 2,1 2,1 6,7

2,4 3,6 2,6 2,9 5,1

3,4

Biuret mg- %

6,54 17,4 13,2 6,04 9,7 6,6 9,3 8,2 9,2

10,3 5,95

KH KH mg- % Biuret

1,06 16,2 3,4 19,5 2,66 20,2 1,28 21,2 2,85 29,4 1,73 26,3 0,99 10,7 0,95 11,6 1,52 16,5 2,22 21,9 0,83 14,0

i 18 ,9 i

Tabelle 8. Kohlenhydratqehalt der HCIO 4- und PWS-Fraktion des Serums (Tryptophan.Methode)

Prot.-Nr.

98 100 101 110 126

D

Ungef~lltes Serum

Biuret mg-%

6960 6560 6350 6100 6700

KH mg-%

HC10,-Niederschlag t

Biuret KH rag-% rag-% B ~ e t -

2,7 1,7 3,5 2,3 1,9

2,4

Biuret mg- %

PWS-Niederschlag %

KH Biuret

KH mg- %

13,9 14,8 11,3 10,9 7,7

7200 198 6860 117 6400 223 5800 134 6500 125

63,2 72,8 49,3 55,5 46,2

22 20,4 23,1 19,7 16,6

20,4

Menge PWS versetzt. Man litBt ca. 15--25 min stehen, bis sich ein flockiger Nieder- schlag gebildet hat, zentrifugiert bei 3000 U., wiischt mit PWS und zuletzt mit ab- solutem Alkohol. Nachdem man den Alkohol vorsichtig dekantiert hat, werden 0,5 ml Wasser und 0,5 ml ges~ttigte SodalSsung zu dem Niederschlag pipettiert. Wenn sich der Niederschlag restlos gelSst hat, stellt man das Gliischen in ein Eisbad, pipettiert 7,0 ml 77~oige H2S04 hinzu, l~Bt 15 min stehen, pipettiert 1,0 ml eis- gektihlte Tryptophanl5sung hinzu, schiittelt gut durch und stellt dann das Glaschen, das zum SchluB mit einem Kiihlaufsatz versehen wird, in ein siedendes Wasserbad. Die Kochzeit wird mit der Stoppuhr gemessen. Nach genau 20 rain wird fiir 10 min im Eisbad abgektihlt und nach weiteren 15 min bei 548 m/~ und 10 mm Schichtdicke

Identit~t der Liquorproteine mit den Eiwei{3kSrpern des Blutserums. III. 135

gemessen. Zur Eichkurve verwendet man eine ~quimolare L6sung yon d-Galaktose und d-Mannose.

Diese Analysen erg~ben, dab die schwer f~llbaren Eiweil~anteile, die man in der PWS-Frak t i on erfai~t, einen wesentlich hSheren Kohlen-

Tabelle 9. Kohlenhydratgehalt der HCIOa- und P WS-Fraktion des Liquors ( A nthron- M ethode )

Prot. -Nr.

423 424 427 428 430 432 433 435 436 445/6 447/8 451/2

Ungefiillter Liquor

Biuret KH I~H mg- % rag- % -Biuret

48,2 2,18 4,52 58,1 2,13 3,66 58,1 2,66 4,58 52,1 2,19 4,19 39,6 2,02 5,02 41,6 2,35 5,65 36,3 1,71 4,7 33,0 1,07 3,3 46,2 1,39 3,1 42,9 1,60 3,7 44,9 1,76 3,9 38,9 1,28 3,3

D 4,13

HC10,-Niederschlag

Biuret rag- %

27,7 37,6 40,6 35,3 22,8 20,1 20,4 14,2 29,4 19,5 22,8 20,8

KH me-% BY~t

2,24 1,60 1,87 2,30 0,79 0,87 0,66 0,91 0,99 0,79 0,89 0,67

8,1 4,3 4,6 6,5 3,5 4,0 3,2 6,4 3,3 4,0 3,9 3,2

4,6

PWS-Niedersehlag

~ KH K°/~I

3,7 0,73 19,6 5,3 0,73 13,7 4,2 0,43 10,1 5,7 0,62 10,9 6,5 0,77 11,9 5,8 0,68 11,8 6,6 0,68 10,3 7,4 0,85 11,5

! 12,5 i

Tabelle 10. Kohlenhydratgehalt der HCIO 4- und PWS-Fraktion des Serums " A nthron- M ethode )

453 454 455 456 457 458

D

Ungef~lltes Serum i %

Biuret i KH KH rag-% i rag-% B ~

I

5940 ~ 123 2,08 5450 194 3,55 6140 131,2 2,14 6540 120 1,84 6560 155 2,36 6 6 0 0 210 3,18

I

HC10,-Niedersehlag

Biuretl KH K/~I mg- ~ rag- % Biuret

5910 5380 5490 6340 6400 6560

i10 1,87 145,5 2,71 107,1 1,84 108,8 1,72 139 2,17 154,2 2,35

PWS-Niederschlag %

Biuret KH ° KIt rag- % mg- Vo Biuret

39,6 4,26 10,8 116,1 25,6 22,0 50,1 7,69 15,3 34,3 4,91 14,3 36,9 6,40 17,4 79,2 17,5 22,1

15,3

hydra tgeha l t aufweisen als die mittels Perchlors~ure oder Trichloressig- s~ure gef~llten Proteine. Aus dem Vergleich mit den eatsprechenden Serum-EiweiB-Frakt ionen ist zu entnehmen, dab der Kohlenhydra t - gehalt der PWS-Frak t i on im Liquor rund 6 real, im Serum 8real hSher als der Kohlenhydra tgeha l t der Perchlors~urefraktion war (Tabelle 7 u. 8). Der SchluI~ lag somit nahe, dal3 die PWS-Frak t ionen yon Blut und Liquor ~hnlich seien.

136 H. BAUER:

Die Bestimmung der proteingebundenen Kohlenhydrate naeh der Tryptophan-Methode bot insofern Schwierigkeiten, als t~gliche Eichun- gen zur Erzielung ausreichend genauer MeBwerte nicht zu umgehen waren. Wesentlich besser zu handhaben ist die inzwisehen fiir die Be- stimmung der proteingebundenen Kohlenhydrate in K6rperflfissigkeiten durch v. HOLT ausgearbeitete, in der II. Mitteflung dieser Studie be- schriebene Anthron-Bestimmung. Zur KontroUe der mit der Tryptophan- methode gefundenen Werte wurden daher die gleichen Versuche auch mit der Anthron-Methode ausgefiihrt (Tabelle 9 und 10).

Es ergaben sieh dabei grunds~tzlieh gleiche Beziehungen: Sowohl im Serum wie im Liquor enthielt die PWS-Fraktion das Mehrfache an pro- teingebundenen Kohlenhydraten im Vergleich zu Nativ-Serum bzw. -liquor und den entsprechenden HClO-4Niederschl~gen. Bemerkenswert ist, dab sowohl nach der Tryptophan- wie der Anthron-Bestimmung der proteingebundenen Kohlenhydrate die PWS-Fraktion des Liquors in ihrem KoMenhydratgehalt etwas niedriger liegt als die entsprechende Serum-Fraktion, eine Tatsache, die zusammen mit den noch zu bespre- chenden Abweichungen des Glucosamingehaltes daffir spricht, dab dei PWS-Fraktionen yon Serum und Liquor nicht ganz gleichartig sind. Insgesamt steht aber nach diesen Analysen lest,

1. da{3 sowohl im Serum wie im Liquor eine schwer fi~llbare, kohlen- hydratreiche Fraktion zu finden ist,

2. dai3 der auf Gesamteiweil3 bezogene Anteil dieser Fraktion im Liquor wesentlich hSher ist als im Serum und rund ein Drittel der Biuret- Differenz des Liquors erkl~rt.

Um die PWS-Fraktion weiter zu charakterisieren, wurden in weiteren Untersuchungen Glucosamin-Bestimmungen im Nativ-Liquor, Perchlor- s~ure-Niederschlag und PWS-Niederschlag vorgenommen. Hierffir war eine Hydrolyse im sauren Medium erforderlich, deren optimale Bedin- gungen hinsichtlich Temperatur, Dauer und S~urekonzentration in Vor- versuchen am Serum ermittelt wurden. Als optimal erwies sich eine 4stfindige Hydrolyse in 2 n HC1 bei 98 °.

Die Bestimmung des Glucosamins erfolgte naeh der bereRs beschrie- benen Modifikation der Methode yon ELSON U. MOROAN.

Aus TabeUe 11 geht hervor, dab auch der Glucosamingehalt der Li- quor-PWS-Fraktion h6her als derjenige der HClO4-Fraktion ist. Durch ihren Glucosamingehalt, der h6her als 4% liegt, ist somit die PWS-Frak- tion des Liquors aueh naeh der Klassifikation K. MEYERS chemisch der Gruppe der Mucoproteine zugeordnet.

Als Sammelbegriff flit die sicher sehr heterogene Gruppe der koMenhydrat- reichen Proteine hat sich in der Literatur die Bezeichnung ,,Glucoproteide" oder ,,Glykoproteide" eingebiirgert.

Identit~t der Liquorproteine mit den Eiweil3k6rpern des Blutserums. III . 137

K. MEYER hat eine Klassifikation vorgeschlagen, naeh welcher diese Stoffklasse in 3 Hauptgruppen unterteilt wird: 1. die neutr~len und sauren glueosaminhaltigen Mueopolys~ccharide, in denen das Polysaceharid mehr oder weniger lest mit einer hoehmolekularen Komponente verbunden ist, 2. die Mucoide oder Mueoproteine, in denen eine feste chemische Verbindung zwisehen Polysaccharid und Peptid- anteil besteht und deren Glueosamingehalt mehr als 4% betr~gt, endlieh 3. die

Tabelle 11. Glucosamingehalt des Liquors

283 295 296 297 298 299 300 307 311 312 423 424 427 428 430 432 433 435 436 445/6 447/8 451/2

D

! Ungef~llter Liquor Prot. I I N'r. I Biuret Glucm

- ' m g - %

34,4 1,54 39,6 1,6 44,9 1,5 37,6 1,24 38,2 1,87 39,6 1,8 32,3 1,77 56,1 2,6 65,0 2,8 3%0 2,02 48,2 2,08 58,1 1,94 58,1 2,16 52,1 1,60 39,6 1,84 41,6 1,80 36,3 1,27 33,0 2,07 46,2 2,20 42,9 1,74 44,9 2,06 38,9 1,97

% Glcm Biure~

4,5 4,04 3,34 3,3 4,9 4,5 5,5 4,6 4,3 5,5 4,32 3,34 3,73 3,06 4,65 4,33 3,5 6,3 4,8 4,1 4,6 5,1

ttC10,-N'iederschlag %

Bturet Glucm Glcm mr- % rag- % Bhlr~

17,5 22,0 0,178 0,8 32,0 21,8 23,1 28,4 17,8 33,0 1,6

1,5 46,2 16,2 2,0 27,7 1,09 37,6 0,99 40,6 1,21 35,3 1,42 22,8 1,28 20,1 1,65 20,4 1,08 14,2 2,1 29,4 1,4 19,5 1,8 22,8 1,9 20,8 1,8

0,52 0,71 0,33 0,30 0,38 0,49 0,51 0,29 0,33 0,22 0,30 0,41 0,35 0,43 0,37

1,48

PWS-Niederschlag

~ Olucm Gl°~m

4,8 0,18 3,7 6,3 0,26 4,1 7,8 0,24 3,1 9,2 0,45 4,9 L0,3 0,66 6,4 5,9, 0,35 5,7

3,7 0,44 12,0 5,3 0,34 6,44 4,2 0,25 5,9 5,7 0,44 7,7 6,5 0,45 6,9 5,8 0,40 6,9 6,6 0,39 6,0 7,4 0,49 6,6

6,17

Glykoproteine, denen K. MEYER die kohlenhydrathaltigen Albumine und Globuline zuordnet, deren Gehalt mit weniger als 4% Glucosamin angegeben ist.

Zu dieser Klassifikation mul~ bemerkt werden, dM3 sie in manchen Punkten iiberholt ist, so z. B. durch die Tatsache, dab weitere Fraktionierung des Albumins die Beimischung eines Seroglycoids als Ursache des vermeintlichen Kohlenhydrat- gehaltes dieser Proteinfraktion ergeben hat (ScHuLTZE). Im Grol~en und Ganzen bietet abet die Meyersche Einteilung eine brauchbare Grund]age fiir die weitere Unterteilung der groi~en Gruppe der kohlenhydratreiehen Proteine.

Allerdings ergibt ein Vergleich mit dem Glucosamingehalt der PWS- Frak t ion im Serum, dab die PWS-Fra k t i on des Liquors wesentlich weni- ger Glucosamin enth~lt (Tabelle 12). Der prozentuale Anteil des Gluco- samins am Biure t -Wert ( ~ Eiweil3) der L iquor -PWS-Frak t ion ist um fund die Hiiffte geringer als im Serum.

138 H. BAUER:

Erw~hnenswert ist die FeststeUung, dal~ der relative Glucosamin- gehalt des Nativ-Liquors hSher liegt als derjenige des Nativ-Serums:

Glucosamin/GesamteiweilL Quotient des Nativ-Liquors 4,62 Glucosamin/Gesamteiweii~- Quotient des Nativ- Serums 1,61. Dieses Verhalten erkl~rt sich zum Teil daraus, dal~ der prozentuale

Anteil der glucosaminreichen PWS-Frakt ion an den EiweiBkSrpern des

Tabelle 12. Gluco~aminffehalt des Serum8

453 455 456 457 458

D

Ungef~tlltes Serum

~ Glucm GIc % m

5,94 107,1 1,80 6,14 96,8 1,58 6,54 94,2 1,44 6,56 85,8 1,31 6,60 102,0 1,55

1,54

HC10,-Niederschlag %

Biuret Glucm Glcm mg- % rag- % ~

5,91 92,0 1,56 5,49 90,2 1,52 6,34 80,1 1,26 6,40 125,1 1,95 6,56 110,0 1,68

1,59

PWS-Niedersch]ag %

Biuret Glucm Glcm mg-% mg-% Biuret

39,6 4,94 12,5 50,1 6,5 13,1 34,3 3,9 11,3 36,9 4,87 13,2 79,2 10,7 13,5

12,7

Tabelle 13. Glucosamingehalt des membran-eingeengten Liquore und des Liquor/iltrat8

427 428 445/6 451/2 459/60 461

D

Eingeengter Liquor

Prot.-Nr. ! Biuret Glucm rag-% rag-%

~ ~ 26,0 I7,6 15,7 12,6

5,3 6,9

I L

Liquor-Filtrat %

Glcm Biuret

2,59 2,08 3,18 3,7

2,9 3,1

2,93

Biuret mg-%

19,8 13,2 15,2 15,8 16,5 21,1

Glucm rag- %

1,63 0,96 0,85 1,10 1,13 1,09

% Glcm Biuret

8,3 7,28 5,6 6,9 6,9 5,2

6,69

Liquors etwa 15mal hSher ist als im Serum. Des weiteren konnte gezeigt werden, dab es sich auch bei der Restfraktion der Biuret-Differenz des Liquors (----- PWS-~bers tand) um eine glucosaminreiehe Fraktion handelt.

Da die Erfassung und Preparat ion der PWS-~bers t~nde ffir weitere Analysen Schwierigkeiten bereitete, versuchten wir, die entsprechende Liquorfraktion durch eine Trennung mittels Collodinmmembranen zu erfassen. Wir gingen dabei yon der durch MIES angegebenen Methode zur Liquoreinengung aus. In Abweichung yon seinem Verfahren wurden die Collodiumhfilsen nicht gegen RingerlSsung dialysiert, sondern zur Unter- druckfiltration gegen Luft verwendet. Das Filtrat wurde aufgefangen und wie bei den F~llungsversuehen der Biuret/Glucosamin- Quotient des ein- geengten Liquoreiwei~es und des Filtrates bestimmt. Die in Tabelle 13

Identit~t der Liquorproteine mit den EiweiBk6rpern des Blutserums. III. 139

verzeichneten Ergebnisse dieser Versuchsreihe zeigen deutlich, dab der Glucosamingehalt der Biuret-Farbstoffbildenden Substanzen des Fil- trates doppelt so hoch ist wie der des in der Membran verbliebenen, ein- geengten Liquoreiweil~es. Da in der Membran auch die glucosaminreichen Mucoproteine zurfickgehalten werden, ist der Glucosamingehalt des membraneingeengten Proteins h6her als nach Perchlors~urefi~llung. So- mit darf gefolgert werden, dab der relativ h6here Gehalt an Glucosamin durch die Stoffe der Biuret-Differenz (Mucoproteine und EiweiBspalt- produkte) bedingt ist.

3. Papierelektrophoretische Untersuchung der schwer f~illbaren Liquorproteine

WINZLER hat gezeigt, dal~ die Isolierung einer mucoproteinreichen Serumeiwei~fraktion auch durch Aussalzung mit Ammonsulfat gelingt. Durch die PWS-F~llung werden die Mucoproteine denaturiert und wan- dern nicht mehr im elektrischen Felde. Da die Aussalzung ein wesentlich

Abb. 1. 200 m l Sammell iquor , F~tllung m i t 0,75 m ttC104, Dialyse gegen Lci t lmgswasser- F~llung des ]~berstandes duroh Ammonsul fa tsAt t igung, erneute Dialyse gegen Leitungs- wasser, Trockenfr ieren, Aufl6sung in Veronal -Na/Na-Aeeta t /HC1 Puffer, pH 8,6, Papier- elektrophorese. Vergleieh mi t e inem in derselben K a m m e r gefahrenen Liquor -Serum-

Misehstreifen

Abb. 2. Serum: - - F~ lhmg der Proteine durch Perchlors~ure, Neutra l is ierung des t?ber- s ta~des lind Aeeton~g~llung 1:4. W'anderung der so erfal~ten Mucoproteine fast ausschliefllich

in einer seharf begrenzten Bande im Bereich des at-Globulins

schonenderes Trennverfahren darstellt, wurde eine Gewinnung der Muco- proteine aus Sammel-Liquor auf folgende Weise angestrebt : Der Perchlor- s~ure-(~berstand wurde durch AmmonsulfatsKttigung gef~llt, der :Nieder- schlag gegen Leitungswasser dialysiert, trockengefroren, in der bei der

140 H. BAuER:

Elektrophorese benutzten Pufferl6sung wieder aufgel6st und eine Papier- elektrophorese durchgeffihrt (Abb. 1). Die gesamte Fraktion wurde un- scharf getrennt im Bereich der Globuline wiedergefunden, eine Albumin- bande fehlte vollkommen. Die Pherogramme zeigten, daI~ das gesamte Albumin durch Perchlors~ure gefi~llt wird, w~hrend ein Teil der Globuline

Abb. 3. Liquor : - - wie Serum in Abb. 2 aufgearbei te t . Der Haup tan t e i l der Prote ine aus dem HC104-I3berstand wande r t unschaxf begrenz t im Bereich der fl-Globulinfraktion

im ~berstand verbleibt und als PWS- bzw. Ammonsulfatfraktion ab- getrennt werden kann.

Da es durch Ammonsulfat-Aussalzung in der Ki~lte nicht gelang, gut abgesetzte Mucoproteinbanden im Pherogramm zu erzielen, wurde in

Abb. 4. a F~llung der Liquorprote ine mi t Perchlors~ure, Acetonf~llung der koh lenhydra t - reichen F rak t ion aus dem Obers tand. b Verdt innung des Serums auf Liquor-Eiweil~kon- zentra t ion, We i t e rve ra rbe i tung genau wie Liquor. Der Haup t t e i l der koh lenhydra t re iehen Liquor f rak t ion befindet sieh im a~-/~-v-Bereieh, im Serum hingegen fast aussehlie~lieh

in der a l -Frakt ion

weiteren Versuchen eine F~llung der Mucoproteinfraktion aus dem Perch- lors~ure-~berstand durch Aceton vorgenommen.

Die Serumproteine wurden durch Perchlors~ure gef~llt, hochtourig (15000 U/rain) abzentrifugiert, der (3berstand mit KOH neutralisiert, dalm mit Aceton (1 Tell ~Tberstand ~- 4 Teile Aceton) gefi~llt. Der Aceton- niederschlag wurde in Puffer gel6st und, um eine Zuordnung der Banden zu ermSglichen, zusammen mit einem Serum zur Elektrophorese an- gesetzt.

Identit~t der Liquorproteine mit den Eiweil3kSrpern des Blutserums. III. 141

Wie Abb. 2 sehr deutlich zeigt, konnte eine gute Wanderung der ace- tongef~llten Proteine aus dem Perchlors~ure-~berstand, bei denen es sich, wie oben nachgewiesen, um Mucoproteine handelt, erzielt werden. Es resultieren 1--2 scharf abgesetzte Banden, die jeweils dem a- und fl- Globulinbereieh entsprachen. Mit Regelm~l~igkeit war hierbei die erste (a)-Bande mit Abstand die st~rkere.

Es ist somit erwiesen, dab in der Papierelektrophorese die kohlen- hydratreichen Mucoproteine des Serums sich aussehlie~lieh im Bereich der a- und fl-Globuline befinden, in fiberwiegenderMenge im a-Globulin. Es gelingt durch diese Technik, die mit den Globulinfraktionen des Se- rums wandernden Mucoproteine zu isolieren und durch den Elektro- phorese-Versuch hinsiehtlich ihrer Wanderung n~her zu charakterisieren.

I m Gegensatz zu den Serum-Mucoproteinen wandert der grSl3te Teil der naeh der Winzlerschen Technik gewonnenen kohlenhydratreichen Proteinfraktion des Liquors in einem unscharfen Bereich zwischen a 2- und y-Globulinen, mit dem Maximum im fl-Bereich (Abb. 3). Dal3 es sich hierbei mit fiberwiegender Wahrscheinlichkeit nicht um einen pr~parativ bedingten Unterschied, sondern um eine durch den Charakter des Pro- teins bedingte Differenz handelt, konnte durch einen Kontrollversuch mit auf LiquoreiweiI3konzentration verdfinntem Serum nachgewiesen werden (Abb. 4). Bei gleicher Technik unterseheiden sich die schwer f~ll- b~ren, kohlenhydratreichen Proteine des Liquors yon der entsprechenden Serumfraktion 1. durch einen etwas niedrigeren Kohlenhydratgehalt , 2. einen niedi'igeren Glucosamingehalt und 3. Verschieden heiten der elektrophoretischen Wanderung.

Zusammenfassung

Durch fraktionierte F~Uung konnte nachgewiesen werden, dab die sog. ,,Biuret-Differenz" des Liquors zum Tell durch eine schwer f~llbare kohlenhydrat- und glucosaminreiche Fraktion bedingt ist, die der Gruppe der Mucoproteine zugeordnet werden kann. Der Anteil dieser Fraktion am Gesamteiweil3 des Liquors betr~gt das mehrfache der entsprechenden Serumfraktion. Die Mucoproteine des Liquors stellen eine elektropho- retisch uneinheitliche, zwischen den a 2- und fl-Globulinen wandernde Frakt ion dar, die sich yon den Serum-Mucoproteinen durch einen nied- rigeren Kohlenhydrat- und Glucosamingehalt unterscheidet.

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Dozent Dr. H. BAUER, Neurologische Universit~ts-Klinik, Hamburg-Eppendorf