644 G. GI~IES, ]ft. W. AL¥ und H. F. v. 0LDEnSHAVSE~: Zur Methodik der Papierelektrophorese. Klinische Wochenschrift

eines Zellreifungsvorganges zu sehen, wie man es bei einer homoplast ischen Ents tehung der E ry th rocy t en annehmen miigte, sondern ein Mitosei~quivalent. Auch die Kernauss togung ist ein biologisch ri£umlich und zeitlich determinierter Prozel3.

Da die Gesamtkernmasse der einzelnen Ery thro- blastengenerat ionen infolge der Suecedanteilungen praktiseh gleich grog b]eibt, entsprieht die ausgestoBene Kernmasse im groben der Kernmasse, die notwendig ist, den hemi-homoplast isch ents tandenen Teil der I4 1-Generation zur K 2-Generation zu regenerieren. Ohne diese quant i ta t ive Ableitung zu fiberfolgern, kann gesagt werden, dM3 zur Wahrung des materiellen Bestandes der Erythropoese optimale Bedingungen gegeben erscheinen. Sowohl die plasmatisehen I~ibose- nuc]eotide der basophilen Zellen wie die Kernmasse setbst stehen am Oft der notwendigen l~egeneration dieser in bedeutendem Umfang wieder znr Verfiigung (Abb, 10). Der 4--5t/~gige Erythroblastenkreis lauf scheint dem 125tggigen tIi~moglobinkSrperkreislauf eine Ar t celluli~rer Xa ta lysa to r zu sein. Der gesamte Kernstoffwechsel kann unter einem ~ in ima lau fwand in relativ kurzer Zeit ein Maximum an plasmatisehen Funkt ionselementen zur Bildung bringen.

Ein Zweifel 'am quant i ta t iven Gleichgewicht der Erythropoese erfibrigt sich.

Zusammen/assung. Es wurden die verschiedenen Hypothesen iiber die Ery th roey tenen t s tehung ange- ffihrt, die aus dem Zweifel an der quant i ta t iven Leistungsfi~higkeit des14nochenmarks gebildet wurden.

Dureh eine Bereehnung der Mengen-Zeit-Votumen- relationen der einzelnen Erythrob]astengenerat ionen, der Ret ieulocyten und der E ry th rocy t en gelang es, zu einer Vorstelhmg veto Gesamtvolumen des IQnoehenmarks zu kommen. Die Ergebnisse stehen, sowohl was das Gesamtvo]umen wie das Parenehym- und das Markblutvolumen anbetrifft , in Einklang mit ~lteren anatomisehen Arbeiten. Der Gesamtablauf der Erythropoese, seine Teilungs- und Reifungsphasen linden in diesem quant i ta t iven System eine den tat-

si~chlichen Z/~hl- und Megergebnissen entsprechende Determinierung.

Fiir die Berechnung der Erythroblastengenerat ions- zeit, der Mitosedauer und des I~eticulpcytenvo]umens wurden quant i ta t ive Grundlagen gegeben. Ffir die der t~etieuloeytenreifungszeit wurde eine reziproke I~e- lat ion zum ge t ieu loey tenvolumen gefunden.

Der Entkernungsvorgang wird innerhalb der he- teroplastisehen Teilungsfolge der Ery throblas ten als Mitose/~quivalent gedeutet , der Kreisluuf der Ery thro- blastenkernmasse als Ka ta lysa to r fiir die im Vergleieh zu ibm langlebige Erythroeytenmasse .

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ZUR METHODIK BEg PAPIERELEKTROPHORESE DES LIQUOR CEREBROSPINALIS. Von

G. GR~ES, F. W. A~Y und H. F. v. OLD]?]lgSItAUSEN. Aus der Medizinischen Unive~'sit~tsklinik 3[axburg a. d. Lahn (Direktor: ProL Dr. It. E. BecK).

Schon bald nachdem die Elektrophorese nach TISELIUS in die medizinische Forschung Eingang ge- funden hatte, untersuchten eine Reihe yon Autoren mit dieser Methode die EiweigkSrper des Liquor cere- brospinalis (HEssELVIK ~s, KABAT und Mitarbeiter ~9-21, Sc~En) und SC~EID ~6, B o o ¥ ~ some F!sK und 3/fig- arbeiter~2). Eine Auf t rennung in einzelne Globulin- frakt ionen gelang nur ausnahmsweise, weft die fiir eine Untersuchung notwendige Proteinmenge yon e twa 100mR nach einer L iquorpunkt ion nieht zur Verfiigung steht.

Neben der absoluten Menge ist auch die EiweilL konzentra t ion des Liquors fiir die Elektrophorese- methoden zn gering. Ni t Ausnahme yon B o o ¥ ~ engten daher alle Untersucher das Material ein.

Die in letzter Zeit entwiekelten Mikroelektro- phoreseapparaturen (LABHAtCW und STAUB ~2 bzw. A~TWEILE~ ~) erfordern geringere Proteinmengen. Dementsprechend waren auch die Auf t rennungen

besser, die L~Bt~A~T, SCHWE~Z~ und STAUB 23 s0wie EWERBECK n naeh Konzentr ierung der Liquores durch Dialyse gegen hypertonische kolloidale LSsungen bzw. durch Ultrafi l trat ion mit eiweigdichten Mem- branen erhielten. Sie reichen jedoch nicht an die in letzter Zeit mi t der Papierelektrophorese durch- gefiihrten Analysen her~n.

Seit Einffihrung der Papierelektrophorese 5, s, i0, 2s ist es mSglieh, mi t Prote inmengen yon unter 1 mg exakte Trennungen dnrchzufiihren. Die ersten Unter- suchungen dieser Ar t liegen yon SCR~mDE~ und WALL]~IUS 27 vor, die die Liquores durch Dialyse gegen hypertonisehe DextranlSsung konzentrierten. E s s ] ~ und Mitarbeiter s-l° engten das N[aterial anfangs dureh gleichzeitige Vakuumt rocknung und Dialyse gegen Puffer, sp/iter durch Ultrafil tr~tion mit eiweigdichten Fil tern ein, bevor sie die P~pierelektrophorese aus- fiihrten. Einen grunds~tzlioh ~nderen Weg zur Kon- zentr ierung gingen BirCHER, MATZELT und PETTE 3'4.

Jg. 31, Iteft 27/28 G. Gll:[E8, t ~. W. AL¥ und H. F. v. O L m ~ s m t v s ~ : Zur Methodik der Papierelektrophorese. ~45 15.3nli 1953

Sie fgllten die Liquorproteine in der Kglte mit Aeeton. Der Niedersehlag wurde mit geringen Puffermengen aufgenommen und papierelektrophoretiseh getrennt.

A u g e r FISK und l~litarbeitern 1~ besehrieben die beiden letztgenannten Arbeigsgruppen a, ~, s-~o 2 Frak- tionen, die ftir normale Liquores eharakteristiseh sind. Es handelt sieh um eine vor dem Albumin wandernde Bande, die yon B/~c~IE]~ und Mitarbei- ter a'~ mit, V bezeiehnet wurde und mn die sogenannte r-?~rak*ion, die zwisehen den fl- und 7-Globulinen liegt.

Soweit jedoeh yon den oben zitierten Autoren Normahverte yon gesunden Probanden angegeben sind, weiehen diese erheblieh voneinander ab. Verant- wortlieh daffir sind hauptsgchlich Mgnget der Kon- zentrierungsverfahren.

Wir haben uns zungehst unabhgngig yon diesen Untersuehungen seit Ende 195I mit dem Problem der Konzentrierung und Papierelektrophorese yon Li- quotes besehgftigt. Bis auf das Fgllungsverfahren yon B~)c~E~ und Mi~rbeiter a,~, das wir wegen teehniseher Sehwierigkeiten niehf ausfiihren konnten, haben wir Mle iibrigen Konzentrierungsmethoden nachgepriift und konnten niemals reproduzierbare Ergebnisse erhalten. Die Ultrafiltra~ion sehien uns dasjenige Konzentrierungsverfahren zu sein, welches die Liquorproteine am wenigsten beeinflugt. Wir untersuehten daraufhin die FehlermSglichkeiten dieser Methode. Dabei gelang es uns, ein einfaehes, zeit- sparendes und aueh f/Jr Routineuntersuehungen ge- eignetes Verfahren zur Konzentrierung yon Liquores auszuarbeiten. Die Konzentrate wurden mit der Papierelektrophorese naeh G~Ass~:a~s Imd Mit. arbeiter ~-~s un*ersueht.

Untersuchungsmethoden. 1. Die Einengung der Liquores.

a) Dureh Ultrafiltr~tion: Die Eiuengung des Liquors erfolgt in modifizierten Thiessen-Apparaturen mit Ultrafein- filtern * dureh Abpressen yon Wasser und eeht gelSsten Sub- sta.uzen mit 3 ~tii Stiekstoff bei + 2--40 C im Kiihlsehr~nk. Die Einengung ist beendet, wenn ei~t serumahnliehes Konzen- trat auf dem Filter liegt. Keinesfalls dart bis zur Troekene filtriert werden. Wenn nbtig wird das Konzentrat mit 1 bis 2 Tropfen Veronal-Natriumaeetatpuffer naeh Mic~a~LIS p~ 8,6, Ionenstarke ~ 0 ,1# a,ufgenommen. Dieser Puffer wird aueh fur alte anderen Arbeitsgange benutzt. Trfibe Konzentrate werden verworfen. Das Filtrat mug eiweiBfrei sein.

b) Dureh Gefriertroeknung: Die Liquores werden naeh Dialyse gegen neutrales Wasser bei 0,02 mm Hg Druek und einer Verdampfungstempera, tur yon - - 2 0 ° C getroeknet. Gegen Ende der Troeknung wird die Temperatur auf etwa -~ 200 C erhSht**. Die getroekneten Liquorproteine werder~ unmittelbar vor der Papierelektrophorese in dem oben ge- nannten Puffer gel6st.

2. Analysen~ethoden. a) Die Papierelektrophorese: Die Elektrophorese wird

naeh dem Verfahren yon G ~ a s s ~ a ~ und Mitarbeiter ~s in den -v'o~ WIELAND "~ angegebener~ Iontophoresekammern aus- gef/ihrg. Die Platinelektrode~ sind dureh ein L~byrinthsystem yon den Puffergef~gen ~bgeteilt. Getrennt wird mi~ unstabili- siertem Gteichstrom yon etwa 85 V (gemessen am Streifen). Der Miehaelis-Puffer wurde n~eh 2 Lgufen geweehselt. Bei der photometrisehen Auswertung der gefgrbten und differenzierten Streife~ werden solehe mi~ Extiuktio~e~ yon fiber 0,8 ver-

* ttergestellt yon der l~embranfil~ergesellschafg der Sartoriuswerke in ~6ttingen, der wtr far dm l'~bertassung yon Vltrafeinfittern mit ver- schiedenen PorengrSl~en nnd Ffltra~ionsgeraten danken.

** Herrn Dr. g. SeHtrsez~ (Beln'ing-Werke Marburg) m6ehten wit ffir dm Durehf~ihrung der Gefriertroeknungen nnseren besonderen Dank ans- spreehen.

worferL (GRASSMANN und HA~mr~*s). In die erhaltenen Ex- tinktionskurver~ werden G~usssche Verteilungskurven ein- gezeichnet und ansehtiel~end planimetrisch ausgewertet. Die Anfgrbungen der einzelr~en Frgktiouen werden als gel~tiv- prozente der Gesamtfgrbung angegeben.

b) EiweiBbestimmurlgen: Dm Eiweil3freiheit des Liquor- filtrates wird qualitativ mit der Sulfosalieylsgureprobe ermittelt.

Zur groben Absehgtzung des LiquoreiweiBgehaltes wird die PA~Dvsehe Reaktion angestellf.

Die Kjeldahlbestimmung erfolgt in einer Modifikation der Methode yon WAC~-Eg und PAI~NAS 2~ (s. GEDIGKlS).

Der LiquoreiweiBgehalt wird aus der Differenz zwisehen Liquorreststiekstoff und Gesamtstiekstoff ermittelt. Ein eventueller EiweiBgehalt des Filtrates bei der Ultrafiltration wird aus der Differenz zwisehen Liquorreststiekstoff und dem Gesamtstickstoff des Filtrates berechnet.

Die Xanthoproteinreaktion zur Bestirnmung des Li- quoreiweiBes wird naeh der Originalmethode yon E])ERL~ 7 ausgefiihrt.

Zur Bestimmung des EiweiBgehMtes der Liquorkonzen- trate wird diese ~¢[ethode modifiziert. In ein bei 5 ml geeiehtes Reagensglas werden zu 0,5 ml physiologischer Koehsalzlbsung mit einer 5~kropipette 0,01 mI Konzentrat zugegeben. Dann werden 0,5 ml 25% Salpetersgure zupipettiert. Nach 5 rain Stehen in koehendem Wasser und ansehliel~endem Ab- kfihlen unter Leitungswasser werden 0,5 ml 20% Natronlauge zugefiigt and mit Wasser bis zur Marke &ufgef/illt. Die Ab- lesung erfolgt im Pulfrichphotometer mit dem Filter S 43 oder im Elko-II-Photometer mit dem Filter 8 42 E. Mittels einer Eiehkurve werder~ die aufzutragenden Konzentragmengen direkt abgelesen.

3, Die Auswertung***. Von jeder MeBreihe wird das ~rithmetisehe l~Iittel (M),

die Streuung (cs), der mittlere Fehler des ~it tehvertes (aM) and der mittlere Fehter der Streuung (~) hir die jeweiligen Fraktionen erreehnet.

Die signifikante Differenz der Mittelwerte zweier MeB- reihen wird wie fibIieh mit der Formel

. . . . . . tDif~.

ermittelt. Die Differenzen werden als signifikant angegeben, werm die tD~ff-Werte dnreh eine ~'bersehreitungswahrsehein- liehkeit yon unter 2% gekennzeiehnet waren. Die Uber- sehreitungswahrseheh~liehkeit ~drd unter Bertieksiehgigung der Anzahl der Einzelmessungen aus der FIS~E~seher~ t-Ta- belle entnommen.

Untersuchungen zur Methodik .

Wir arbeiten, wen• nieht besonders erwghnt, mit Lumballiquor. Wenn das Material Blutbeimengungen enthglt, iiberdeeken die Plasmaeiweit?kSrper wegen ihrer rund 200faeh hSheren Konzentration die Li- quorpoteine. Bei 10 ml UntersuchungsmateriaI sind naeh dem Zentrifugieren in spitzen Zentrifugen- glgsern noch Blutverdiilmungen vo~ 1:10000 im Se- diment erkennbar, wie wir an Verdiinnungen mit physiologiseher KoehsalzlSsung zeigen konnten. In diesem GrenzfM1 ist die Konzentration der Serum- proteine auch bei eiweigarmen, normalen Liquores geringer Ms 2 % des Liquorproteins und fiir die Liquor- elektrophorese nieht st6rend.

Steril aufgefangenes Material hglt sieh ohne Ver- gnderung der Eiweil~zusammensetzung im K~hl- sehrank his zu 14 Tage.

Da fiir die Papierelektrophorese stets gleiehe Proteinmengen nStig sind, kommen je naeh der Ei- w e i B k o n z e n t r a t i o n des U n t e r s u e h u n g s m a t e r i M s ver - s eh i eden grol~e L i q u o r m e n g e n z u r E i n e n g u n g . E i n e g r e b e S e h g t z u n g des E i w e i g g e h a l t e s m i t de r PAxD:c- s ehen R e a k i d o n r e i e h t dabe i aus (s. un t en ) .

*** Far die Iler~tung bei der statisfischen Auswertung sind w~r tterrn Prof. Sol,¢tt (Universi~ts-Prauenklinik ~Iarburg) sehr zu Dank verpflichtet.

646 G. GtlIEs, F. W. ALY und It. F. v. O~])]~RS~LaUS]~g: Zur Methodik der Papierelektrophorese. Klinische Wochenschrift

Filter der PorengrSl?en unger etwa 7,7 m/~ sind eiweiBdieht. Um in dieser Beziehung sicherzugehen, w~hten wir fiir unsere Routineuntersuehungen Mem- branen mit einer Porengr5ge von etwa 6,5 m/~. Die Filtrationsgesehwindigkeit ist yon der angegebenen PorengrSge deutlich abh~ngig.

Tabelle 1. A~swertung yon 16 Bestimmungen eines Serums (Spalte a)und 16 Bestimmungen des gleichen Serums naeh dessen Verdiinnung 1:200 mit Miehaelispu//er PH 8,6, 0,1 # u ~ Wiederkonzentrierung mitteIs Ultra/iltration (Spalte b). A u/ge~iihrt werden das arlthmetische M ittel ( M ) , die Streuung (a ) und die mittleren ~ehler der Mittdwerte ((~2d) der JFralctlonen.

1,3 1,5 0,5 0,6 0,5 0,8 0,5 aM 0,3 0,4 0,12]0,1510,13 0,2 7 0,14

Dureh ¥ergleichsuntersuehungen mit Serum ist geprfift worden, ob Membranfilter eventuell selektiv EiweiBk6rper best immter Fraktionen adsorbieren, wie SCHEID und Mitarbeiter ~ annehmen. In der ersten

Tabelle 2. Auswertung einer 12/achen Papierelektrophorese eines Mischliquorkonzentrates. Au]gefi~hrt werden die Mittel. werte (M), die Streuung ((~) und die mittleren ~ehIer der

Mitlelwerte (aM) der Fra~tionen.

M G

(Y M

V-F. A1b. fi

3,8 0,3 0,08

52,0 2,3 0,7

6,5 9,0 0,7 0,8 0,2 0,2

12,5 1,0 0,3

4,6 10,8 0,4 1,0 0,1 0,3

Versuehsreihe haben wir dureh 16faehe Best immungen elektrophoretiseh die prozentuMen Anteile der ein- zelnen Fraktionen eines Serums ermittelt . An- sehlieBend ist ein anderer Teil dieses Strums mit dem oben angegebenen Puffer 1:200 verdfinn~, mi t IIilfe

Tabelle 3. Ergebnisse der Papierelektrophoresen der I/amballiquores yon 15 ~qeurologisch gesunden Personen mit ~o~'malen Serumeiwei[3werten

Patient I ¥-F.

Net. Bo.

Eek. :Eo. Seh~. Seha. E. He. Ko. Ba. Fr. Ar. Schn. Pa.

4,4 5,8 4,1 1,4

[ 4,3 4,4 5,9

I 5,9 3,0 5,4 2,5 3,7 7,5 3,1 3,3

Mi~telwert~ (M) . . I 4,3 Streuung (a) . . . . i 1,6 Mittlerer Fehler des

Mittelwer~es (aM). 0,4

Alb~

61,8 47,6 50,0 51,9 50,5 56,0 56,9 62,8 48,2 45,5 47,2 50,8 46,3 57,4 49,2 51,3 5,5

1,5

4,1 5,4 5,6 6,9 5,6 9,7 4,6 10,6 5,4 7,1 4,8 5,2 4,7 7,1

5,7 6,8 7,0 9,4 6,8 9,0 6,0 13,8 7,3 9,4 7,7 8,2 7,5 11,1 4,3 9,0 5,8 8.4 1,2 2]4

0,3 0,7

13,9 18,7 17,9 17,7 14,4 15,4 12,2 12,4 15,7 20,7 18,2 16,2 21,4 23,4 17,6 17,1 3,2

0,9

T

5,4 7,6 7,5

10,6 8,7 6,9 5,4 4,1 8,0 6,1 6,3 4,7 6,4 9,3 7,1 6,8 1,8

0,5

der Ultrafiltration eingeengt und elektrophoretiseh untersucht worden. Dieser Versuch ist ebenlalls 16fach mit 8 verschiedenen frischen oder mehrfaeh gebrauchten Filtern vorgenommen worden. In der Tabelle 1 kommen die Mittelwerte (M), die Streu- ungen (~) und die mittleren Fehler der Mittel-

werte (aM) beider Analysengruppen dieses Vergleiehs- versuehes zur Darstellung.

Die grithmetisehen Mittel st immen mit Ausnahme der ~l-Fraktion, die eine geringe ErhShung naeh der Xonzentrierung aufweist, fiberein. Aueh die Streuungen beider Mel3reihen zeigen keine signifikanten Unter- sehiede.

Bei Filtrationsversuehen fiber 24--48 Std. zeigt sieh, dab bei l~ngerer Konzentrierungszeit Versehie- bungen in der Eiweigzusammensetzung auftreten. Sehon nach 8 Std ist ein deutlieher Anstieg der ~2" Frakt ion erkennbar, der sich mit der Zeit verst~rkt.

Bei Doppelfiltrationen an Liquores mit versehie- denen Filtern, die neu oder mehrfaeh gebraueht sind, st immen die Ergebnisse der Elektrophoresen aus- nahms]os iiberein.

U m die Einengung mittels Ultrafil tration mit einer anderen Methode zu vergleiehen, haben wit die mit unserer Methode erhaltenen Konzentrate yon Li- quores mit erhShtem Eiweiggehalt denen naeh Ge- friertroeknungen des gleiehen MateriMs gegenfiber. gestellt. Die Ergebnisse sind innerhalb der Fehler- breite identiseh. Bei Gefriertroeknungen yon nor- malen Liquores gelingen bisher keine einwandfreien elektrophoretisehen Trennungen.

Wir ffihren die P~pierelektrophorese naeh G~ASS- MA~-~ und Mitarbeiter 1~-16 dutch. Bei dieser Methode mfissen stets etwa gleiehe Proteinmengen getrennt werden. Wir seh~tzen deshalb vor der Elektrophorese den EiweiBgehalt des Konzentrates mit der oben be- sehriebenen modifizierten Xanthoproteinre~ktion ab.

Die P~eproduzierbarkeit der Elektrophorese yon Liquores hubert wir dutch eine 12faeh-Bestimmung an einem Misehliquorkonzentrat gepriift. Die Ergeb- nisse sind in Tabelle 2 aufgeffihrt.

Vorgehen bei der routinemiifligen ~2quorelektrophorese. Der Liquor wird 10 Min. bei 3000 Umdrehungen/Min.

zentrifugiert Wenn im Sediment Ery~hrocyten sichtbar sind, wird das l~Igterial verwoffen. Dann wird die Pxb~Dvsche Re~ktion ausgefiihr~. Bei nega- ~ivem Ausfa.lt miissen 8--10 ml weiterverarbeitet werden.

I ~ Die Einengung wird, wie oben beschrieben, durch I~Ttrafittration vorgenoramen. ])as Filtrat darf mit Sulfosalicyls~ure keine Trfibungen

5,0 geben. Der Eiweiggehalt des Konzentrates wird 7,6 mit der modifizierten Xan~hoproteinreaktion 5,5 bestimmt. Anschliegend wird die Papierelektro- 3,6 phorese nach G ~ A s s ~ vorgenommen. Bei 6,6 einem EiweiBgeha.It des Konzentrats yon etwa 7,8 7% werden zur Elektrol0horese 0,006 ml auf- 7,8 4,8 getragen.

8,7 Untersuchungen zur Frage der Normalwerte 6,5 6,0 der Liquorprotein/raktionen, des Vorkom- 7,9 mens der V- und z-Fralct~onen im Liquor 3,4 und der Wanderungsgeschwindigkeit 8,0 der Liquor2roteine. 6,9

Die mit unserer Liquorelektrophorese- 6,3 t,7 methode an lumbal entnommenen Liquores

yon 15 neurologisch gesunden Personen 0,4 mit normMen Liquorwert, en und normalem

Serumeiweigbild durehgeffihrten Elektro- phoresebestimmungen sind in Tabelle 3 aufgeffihrt. In einigen NormMf~llen sind yon uns 2 y-Fraktionen gefunden worden. Ohne Ausnahme haben wit die V- uud T-Frak~ionen naehgewiesen, yon denen wit die V-Fraktion im Gegensatz zu Ew~]~B]~c]~ it aueh im A~awc]~InEnsehen Mikroelektrophoreseger~t darstellen

Jg, 31, Hctt 27128 (~. GIgIES, F . ~T. ALY l i n d H . F. v , OLDEt~SK&IISEN: Z u r M e t h o d i k d e r Papierelektrophorese. 647 15 Jnh 1953

kSm~en. Dariiber hinaus haben wir beide Frak- tionen auch in einer Reihe yon deutlich patholo- gischen Liquores gefunden. An normMem und patho- togisehem Material ist die relative H5he der V- Fraktion zum GesamteiweiBwert in Beziehnng gesetzt worden. Die tIShe dieser Bgnde nimmt bei Zu- nahme des Gesamtproteins ab (Abb. 1). Analog ver- h~lt sieh aueh die ~-Fra.ktion.

Mit der Papierelektrophorese kann man die Wan- derungsgeschwindigkeit yon Fraktionen nicht direkt messen, lediglich ein Verg]eieh mit Substanzen be- kannter Wanderungsgeschwindigkeit erlaubt Schlfisse darfiber (GICASSMANN 17). ]3el unserem Versueh hat uns nicht die absolute Wanderungsgeschwindigkeit der Liquorproteine interessiert, sondern deren Verh~ltnis zu den Serumfraktionen. Dazu haben wir Liquor- konzentrat und Serum eines Patienten gemeinsam auf einen Papierelektrophoresestreifen ~ufgetragen. Bei diesen Mischelektrophoresen zeigt sich, dab die ent- spreehenden Liquor- und Serumfraktionen stets ge- meins~m wandern (s. Abb. 2).

Digcussion. Die Vorbedingung ffir jedes Konzentrierungs-

velffahren yon Liquores ist, dat] die EiweiBkSrper weder in ihrer Zusammensetzung noch in ihrer mole- kularen Struktur ver~ndert werden. Wenn sich eine Methods aueh fiir routinemi~Bige Bestimmungen eignen soll, mug sie aul3erdem einfaeh und schnell auszuffihren sein. Diese Bedingungen sind bei der von uns bearbeiteten U]trafiltrationsmethode weitgehend erffillt. Die zur Elektrophorese notwendige Xonzen- tratmenge lggt sieh je nach Eiweil3gehalt des Aus- gangsmaterials aus 2--9 ml Liquor in 1 bis 4 Std. gewinnen. Die Frage, inwieweit Struktur und Zu- sammensetzung der Proteine bei der Ultrafiltration gewahrt bleiben, haben wir eingehend untersucht.

Es zeigt sich, dub aul~er einer ganz geringen Er- hShung in der ~-Frak t ion s~mtliehe ~ez%e bei Seren vor und nach Ultrafiltration identisch sind. Dieser Be- fund wird dureh den Vergleieh mit der Gefiertroek- hung bestatigC. Die beobachtete ~-Abweiehung bei der Ultrafiltration ist so gering, dab sie innerhalb der Streuungsbreite sines biologischen Materials liegt.

Weil die Streuungen der Elektrophoresen yon Serum v o r u n d nach Verdfinnung und ~Viederkonzen- trieren durch Ultrafiltration keine signifikan~en Un- terschiede zeigen, kann gefolgert werden, dal~ die Ultrafiltrationsmethode gut reproduzierbar ist und nur eine geringe Fehlerbreite aufweist. Daffir spreehen weiterhin die Ergebnisse naeh Doppelfiltrationen yon Liquor mit versehiedenen ])~fltern.

Bei zu lange durehgeffihrten fiber 8 Std. dauernden Ultrafiltrationen sehen wir einen Anstieg der ~z- Globuline. Im Gegens~tz dazu besehreibt Ewv.~- BECK ~ bei seinen Ultrafiltrationsversuehen, die 12 bis 24 Std. dauern, einen AbfalI der ~- Globulins. Aueh bei B ~ e H ~ und Mitarbeiter ~,~ fallen die ~-Globuline naeh der Aeetonfi~Ilung ab. Wir k6nnen ffir diese differenten Ergebnisse bisher keine Erkli~rung geben.

Die Versuehe zeigen jedenfalls, dal3 bei einer kurz- dauernden Filtration, wie wir sis hier besehrieben haben, kaum Denaturierungserseheinungen zu erwarten und damit die Fehlerm6gliehkeiten geringer sind.

Wit w~hlen ffir die Elektrophorese des Liquors das yon GRASSMANN und N]tarbeiter ~ - ~ entwickelte

Klinische Wochenschrift, 31. Jahrg.

Papierelektrophoreseveriahren, weft das dort angege- bene Amidosehw~rz 10 B yon den bisher fiir Protein- farbungen empfohlenen Farbstoffen die intensivste Fiirbung zeigt. Es genfigen deshalb 0,5 rag Protein ffir eine Analyse.

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300 #~o 500 ~ % Zl~yoreipVel~ , . - - i -

Abb. i. Abszisse: Liquorgesamteiweil~ in Milligramnl-Prozent bestimmt mit der Xanthoproteinreaktion nach ]~DERIJE. Ordinate: I/elativprozente

der Vorfraktiou.

Wie G~ASSMA~N und HANNIO 15 zeigen, sind Elektrophoresestreifen mit Extinktionen fiber 0,8 mit dem yon ihnen angegebenen Elphor-H-Photometer nicht mehr genau auswertbar. Die Wefts werden zu

kbb. 2. PapiereIek~rophoresen eiaes Serums wad eines Liquors und einer Mischung der beiden. Die Elektrophoresestreifen sind neben den bei der photometrischen Auswertung erhaltenen Extinktionskurven abgebildet.

niedi'ig angezeigt. Sind zu viel Proteins aufgetragen worden, kornmt es wegen der h~iufig beobaehteten AlbuminerhShung bei pathologisehen Liquores ganz besonders ]eieht zu diesen hohen Extinktionen. ]st dagegen zu wenig EiweiB aufgetragen worden, so werden die Globutinfraktionen entspreehend weniger deutlieh dargestellt. Mit Hflfe der Eiweigbestimmung im Konzentrat wird diese Sehwierigkeit fiberwunden,

41c

648 G. G~IES, F. W. AnY und H. F. v. OLDERSHAUSEN: Zur Methodik der Papierelektrophorese. Klinische Wochenschrift

es kSnnen dadurch stets geeignete Proteinmengen auf- getragen werden. Auf diese Weise sind wit ausnahms- los zu auswertbaren Elektrophoresen gekommen.

Der Beweis der Proportionalit~t der bei der Messung erfaBten gebundenen Farbstoffmenge mit dem Proteingehalt einerseits yon normalen und andererseits yon pathologischen Liquores, soMMe zMMschen den Fraktionen untereinander steht noeh aus. Die yon GI~ASSMANN und H A ~ m as bei Seren beschrie- bene relativ gute ~bereinst immung der Anfgrbbarkeit der eflazelnen Fraktionen unterehaander lggt sich nicht ohne weiteres atd den Liquor iibertragen, weft die Frage der Gleiehheit yon Liquor- nnd Serum- proteinen bJ:sher noeh nieht geklgrt wurde.

Bisher sind yon LABHART und Mitarbeiter ~, SCHNEID!~Zll und ~hrAnLE~US~V, Bi~cJ~Ea und Mit- arbeiter 4 sowie ESSEn ~° elektrophoretiseh ermittelte

Tabelle 4. Vergleich der lgormalwerte yon LABttART, SCt~VEIZER uftd STAUB, Se~NEn)E~ und WALLESr~US, BffeHE~ und Mitarbeiter, 8owfe EssE~ mit unseren

NormaIwerten.

LA]~KagT U. Mit~rb. (1951) Mikroelektrophoresen . . - -

Semi]SIDER u. W. (1951) Papierelektrophoresen . ---

Bt~el~E~ u. Mitarb. (1952) Papierelektrophoresen . 4,4

EssE~ (1952) I Papierelektrophoresen . 1,2

Eigene Werte . . . . . . 4,3

70,0

56,5

49,7

56,1 51,3

9,8

15,4

4,7 7,5 5,8 8,4

30,0

15,8

11,5

24,1 17,1

Aeetonfgllungsmethode yon BigCHIrR und Mitarbei- ter a, ~ und unserem Verfahren noeh ein qualitativer Untersehied zum Ausdruek, In den bei diesen Autoren abgebildeten Mischelektrophoresen sind die Wande- rungsgesehMMndigkeiten der Liquorglobulinfraktionen mit Ausnahme des #-Globulins gegeniiber den ent- sprechenden Serumfraktionen versehieden, worauf B~CRE~ ~ in der Bespreehung seiner Ergebnisse hin- weist. Die ~-Globuline seiner Liquorkonzentrate sind hgufig dreigipfelig. Wit haben mit unserer Konzentrie- rungsmethode bei gleieher Elektrophoreseteehnik diese Befunde nieht best,~tigen k6nnen. Sowohl bei pathologischen wie aueh bei normalen Liquores ent- sweeheu die Wanderungsgesehwindigkeiten der Liquor- proteinfraktionen den entspreehenden Serumfraktionen des gleiehen Patienten (s. Abb. 2). Grunds~t.zlieh gleiehe WanderungsgesehMMndigkeiten der Liquor- and Serum-

ffaktionen warden sehon yon HESSEI- VIK ls, SCHEID und SCHEID 25 U. a. in der Tisetius-Apparatur gemessen.

Eine ehemisehe Charakterisierung I Y der V-Fraktion ist unseres Wissens bis I heute noeh nieht ver6ffentlicht worden.

~ b e r das Auftre~en dieser Fraktion sind MMr zu gleiehen Sehliissen wie Bi?CHS,~

- - 18,0 und Mitarbeiter 4 gekommen. Es be- steht nach unseren Befunden eine

8,0 11,0 deutliehe Abhangigkeit zMMsehen der 6,4 HShe dieser Bande und dem Gesamt-

6~ 6,3 eiweiBwert, in dem Sinne, dab diese Fraktion bei hSherem EiweiBgehMt

relativ niedriger wird und sehtieBlieh nieht mehr zur Darstellung gelangt (s. Abb. 1). In gleieher Weise verhiilt sieh die r-Fraktion. AIs weitere Stiitze ffir die Hypothese, dag die V-und w-Fraktion bei hSherem Gesamteiweil3 zwar vorhanden sind, jedoeh iiber- deekt werden, ist der Befund yon GF~ASSMANS/~ anzu- fiihren, der bei pr/~parativen Trennungen mit der yon ihm angegebenen Apparatur aueh im Serum Spuren eines der V-Fraktion entspreehenden KSrpers vor dem Albumin fund. Bei der gewShnliehen Elektrophorese in der TIsELIcs-Apparatur gelang der Naehweis dieser Frakt ion nur ausnahmsweise.

Zusammen/assung. Es wurde eine einfache Me- rhode zur Konzentrierung des Liquor cerebrospinalis mit Hilfe der Ultrafiltration im Uberdruck beschrieben.

])as Liquorkonzentrat wurde mit der Papier- elektrophoresemethode yon G n ~ s s M ~ - und IvIit- ~rbeiter getrennt. Eine selektive Adsorption einzelner Proteinffaktionen an die Membranfilter wurde nicht beobachtet. In weiteren Untersuchungen MMrd zu anderen FehlermSglichkeiten Stellung genommen.

I)ie mit dieser Methode ermittelten Normalwerte der LiquoreiweiBfraktionen wurden mit denen anderer Autoren verglichen und die methodischen Unter- schiede erSrtert. Die beschriebene Methode erlaubt mit 2 - 9 ml Liquor Papierelektrophoresen 1--4 Std nach der Liquorentnahme vorzunehmen.

AuI Grund der kurzen Konzentrierungsdauer und des geringen apparat iven und arbeitsm~Bigen Auf- wandes seheint sich diese Methode besonders fiir routinemi~Bige Untersuchungen in der Klinik zu eignen.

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Normalwerte der Liquorproteinfraktionen verSffent- licht worden (Tabelle 4).

Unsere ~¥erte sind am besten mit denen yon Bi)cH]~ und Mitarbeiter 4 vergleiehbar, weft diese Autoren gleichfalls die Papierelektrophorese naeh GRASSMANN 16 anwenden. Die yon ihnen best immten Normalwerte sind im Gegensatz zu uns an suboeeipital entnommenen Liquores ermi~telt worden. Vielleicht erld~ren sieh daraus die grSgeren Untersehiede in den /~- und y-Fraktionen. Wir halten es jedoch fiir mSglieh, dab die Azetonf~llung gerade die//-Globuline als die Hauptlipoidtr~ger vergndert.

ESSE~ und Mitarbeiter s-l° fiihrten zun~chst die Konzentrierung des Liquors mittels Dialyse im Unter- druek dureh, bedienen sich jedoeh neuerdings der Ultrafiltration im L~berdruck. Sie engen ihre Liquores in besonders angegebenen Apparaturen bei 12 atii mi t ttilfe yon Seitzfiltern ein. Dabei werden die Liquorproteine fast bis zur Trockne gebraeht -and naeh Aufnahme in Puffer nach C~Ems~ und TISELIUS 5 elektrophoretiseh getrennt. Die mit diesen unter- schJedliehen Einengungsmethoden in 3 verschiedenen Publikationen angegebenen Normalwerte weichen von- einander ab, wobei die yon IEssE~ 1° zuletzt angege- benen Normalwerte unseren am n~tchsten kommen.

Die Unterschiede zu dewErgebnissen der anderen Untersucher diirften vorwiegend mit Denaturierungs- vorg~ngen bei den jeweilig angewandten Konzen- trierungsverfahren zu erkl~ren sein. Die Einengung dauerte bei diesen Autoren im allgemeinen nieht unter 1--14 Tage. Vergnderungen der Liquorproteine unter diesen Bedingungen sind naeh unseren Unter- suchnngen sieher anzunehmen.

Neben den oben angefiihrten quanti tat iven Ab- weichungen der Normalwerte kommt zMMschen der

Jg. 31, Itefg 27/28 H . F . v . O~D~S~VS~ ' , F. W. ALY und G. G~zns: Veranderungen der Liquor- und Serumproteine. 649 15. Juli 1953

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I~BER DIE ~ERANDERUNGEN DER LIQUOR- UND SERUMPROTEINE BEI DER TUBERKUL{}SEN MENINGITIS.

Von H. F . v. O ~ D ~ S ~ C S ~ - , F . W . A ~ y und G. G ~ s .

Aus der l~Iedizinischen Universit~tsk]inik ~ r b u r g a. d. Lahn (Direkt~r: Prof. Dr. H. E. BOCX).

Ube r die e lek t rophore t i seh naehweisbaren Serum- e iwe igvergnderungen bei der tuberku lSsen Meningit is haben EWE~BECK 6 sowie HARTNIANN ls an Hand yon B e s t i m m u n g e n m i t dem yon ANTWEILEI~ entwiekel~en Mikroe lek t rophoreseger i i t be r ieh te t . Dagegen s ind ein- gehendere e lek t rophore t i sehe Un te r suehungen mi t Li- quotes yon tuberku lSsen Meningi t iden , abgesehen yon E inze lbes t immungen (Sez~NEIDE~ mad WALLE~rCS; LA~HA~T, Sc~rw]~IZ~ und STAU~; EssEx, HEINZLE~ und WILD) bisher n ieh t mi tge te i l t worden. Dies is t s ieherl ieh vorwiegend auf methodisehe Sehwier igkei ten zuri iekzuffihren, die e iner rout inemiiBigen Durch- ff ihrung der L iquore lek t rophorese entgegenstehen.

Der P ro t e ingeha l t des Liquors is t im Vergleieh zum Serum sehr viel niedriger . AuBerdem is t es oft schwierig, grSBere L i q u o r m e n g e n zu erhal ten . Der Liquor selbst m u g tun l i ehs t un t e r s ter i len K a u t e l e n abgenommen sein (vgl.12). N u r eine sehr rasehe Ver- a rbe i tung ermSgl icht r ep roduz ie rba re Ergebnisse 1, 12

W i r haben eine Methode zur Konzen t r i e rung der L iquorp ro te ine mi t t e l s U l t r a f i l t r a t i on ira ~ b e r d r u c k un te r A n w e n d u n g yon Ul t r a f e in f i l t e rn* ausgearbei- te t , die sigh fiir Rou t ineun t e r suehungen eignet, wor- fiber andernor t s e ingehend be r ich te t w o m e n is t is. Mi t e iner Ausgangsmenge yon 2 - - 9 cm s Liquor wird d a m i t in 1 - - 4 S t d ein L i q u o r k o n z e n t r a t gewonnen, des pap ie re l ek t rophore t i seh nach dem Verfahren yon G~ASS~NX u n d u n d H A ~ m un te r such t wurde. Es lieBen sieh auf diese Weise gu te e tekt ropho- re t i sehe Trennungen der L iquorp ro te ine erzielen. Die Serumelek t rophorese wurde mi t Serum, das mSg- l iehs t a m gleiehen Tage wie der L iquor nf ieh tern ent- n o m m e n w o m e n war , ebenfal ls naeh der Methode yon G ~ A S S ~ r n n d 5{i tarbei ter %~0 durchgeff ihr t . Beson- de t e r ~Vert wurde auf I ~ n g s s e h n i t t u n t e r s u c h u n g e n gelegt, n m festzuste l len, ob sieh die e lek t rophore t i seh e rmi t t e l t en Liquor - und Serumeiweil3ver/~nderungen im Ver lauf der tuberku lSsen Meningi t is einzelnen X r a n k h e i t s s t a d i e n zuordnen lassen bzw. m i t bes t imm- t en k l in i schen Ver taufsformen oder anderwei t igen Li- quorvergnderungen in Beziehung gese tz t werden k6nnen.

* tterges~elt~ yon der ~[embranfiltergeselIschaf~ (Sartoriuswerke), GSttingen, der wit fiir die ]~berlassung definter~er Fitterchargen danken.

]LlinI~che Woehenschrift, 3I. 3ahrg.

Hie rzu haben wir eine E in te i lung der untersuehgen Liquores vo rgenommen en t sp reehend der L iquoren t - nahme a) im a k u t e n unbe ha nde l t e n S tad ium, b) im a k u t e n S t a d i u m w~hrend einer t ube rku los t a t i s ehen Behand lung yon 1 - - 4 Woehen , c) im s u b a k u t e n Sta- d ium w~hrend einer langeren, meis t fiber mehrere Monate sieh e r s t reekenden tube rku los t a t i s ehen Be- handlung , d) im ehronisehen S t a d i u m bei Vorl iegen einer klhaiseh noeh a k t i ve n 3/[enhlgitis, e) im kl iniseh wei tgehend inak t iven bzw. ausgehei l ten S tad ium.

Wir sind uns einer gewissen Willkiir beim Versueh, eh~e derartige Einteilung in verschiedene tfxankheitsstadien bei der tuberkul6sen Meningitis durehzufiihren, some der SehMerig- keiten nnd Fehlerm6glichkeiten eines derartigen Vorgehens durehaus bewul]t. Kelmen Mr doch kaum andere Krank- heiten, deren Verlauf yon so verschiedenartigen, oft kaum fibersehbaren Faktoren abhangig ist. Unter den marmigfal- tigen Einflfissen endogener Me exogener Art seien bier nur Konstitution, Lebensalter, Allergielage, Art und Ausdeb- hung des tuberkul6sen Grundprozesses, Auftreten yon se- kund/~ren meningitisehen Reaktionen (z. B. im AnsehluB an die intralumbale Verabreiehung yon Antibioticis, die Ent- stehung yon VerMebtmgen nnd Verwaehsungen oder die Ent- wiekhmg einer Araehnitis, eines Hydrocephalus und anderer Folgezust~nde aufgeffihrt.

Werm wir dennoeh zun~ehst den Versuch unternommen haben, Korrelationen zwischen dem Liquor- bzw. Serum- eiweillbild und versehiedenen Krankheitsstadien der tuber- kulSsen Meningitis zu ermitteln, so mug die dutch die auf- gefiihrten und andere Faktoren bedingte Heterogenit~t unseres Krankengutes und damit auch die nur eingesehr'~nkte Bedeutuxlg einer statistischen Analyse hervorgehoben und beaehtet werden. Wir haben allerdings diejenigen F/~lle aus unserer Betraehtung ausgesondert, die klinisch dutch ganz besoudere Verh~ltnisse ausgezeiehnet waren, Me etwa des gleichzeitige Vorliegen einer ausgepr~gten spinalen Araehnitis, Misehinfektionen mit anderen Erregern, eindeutige Rezidive oder subklinisehe Verl/~ufe einer tuberkutSsen 3Ieningitis. Naturgemhl3 sind alle Liquores, die aueh geringe, erst naeh Zentrifugieren erkennbare Erythroes~enbeimengungen ent- hielten, ausgesehlossen worden. Bei doppel~n oder mehr- faehen elektrophoretisehen Bestimmungen desselben Serums bzw. Liquors sind die jeweiligen arithme~isehen Mittelwerte benutz~ worden. Es verbleiben so yon einem ztm~ehst weir gr6Beren Material zur Beantwortung der Frage naeh der Konvlation yon Krankheitsstadium und Liquor- bzw. Serum- eiweigveranderungen 18 F/tile yon tuberkuI6ser h{eningitis mit ElektrophoI~sen yon 75 Liquores bzw. 63 Seren. Die Ergebnisse dieser Elektrophoresen sind statistiseh ausgewertet worden. Ermittelt wurden die arithmetisehen Niittelwerte (M), der mittlere Fehler des Mittelwertes (aiu) und die signifik~nte Differenz. Die signifikante I)ifferenz gegeniiber den Norm-

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