Histochemie 30, 60--72 (1972) �9 by Springer-Verlag 1972

Zur Problematik der elektronenmikroskopischen Darstellung der Succinodehydrogenase

mit dem osmiophilen Tetrazoliumsalz TC-NBT

Gerd Egger

Institut ffir Histologie und Embryologie der Universits Graz (Vorstand: Prof. Dr. W. Burkl)

Eingegangen am l4. Februar 1972

Prob lems of the Elec t ron Microscopic Demons t r a t i on of Succinic Dehydrogenase wi th the Osmiophil ic Te t razo l ium Sal t TC-NBT

Summary. An investigation of heart muscle was made concerning the suitability of Thiocarbamyl nitro-BT (TC-NBT) for the electron microscopic demonstration of Succinic Dehydrogenase by means of a modified EPON embedding method. After cutting the tissue in small blocks and rinsing in buffer solution reaction products were found in the intracristal space, in the cristal membranes, in the outer space and in vesicles surroundet by a double membrane. The question is discussed, how far conclusions about the specific reaction products and the localisation of the SDH are possible.

Zusammen/assung. Die Verwendbarkeit von Thiocarbamyl nitro-BT (TC-NBT) ffir die elektronenmikroskopische Darstellung der Succinodehydrogenase wurde mit einer modifi- zierten EPON-Einbettungsmethode am Herzmuskel untersucht. Frische, mit der Klinge geschnittene GewebsblSckchen zeigten nach Auswaschen in PufferlSsung Reaktionsprodukte im intracristalen Raum, in den Membranen der Cristae, im Raum zwischen Aullen- und Innen- membran sowie in von Doppelmembranen umgebenen Vesikeln. Es wird zu der Frage Stellung genommen, inwieweit die spezifischen Reaktionsprodukte auf die Succinodehydrogenase und ihren Sitz schlieBen lassen.

Einf i ihrung

Nach ers ten unbefr iedigenden Versuchen, Succ inodehydrogenase (SDH) e lek t ronenmikroskopisch mi t Ka l iumte l l u r i t nachzuweisen (Mudd et al., 1956; Bar rne t t , 1957; B a r r n e t t u. Pa lade , 1957), ging m a n zu Tet razolen als I n d i k a t o r fiber. Es wurden zun/ichst NBT, MTT-Co und I N T verwendet , deren F o r m a z a n e eine ausre iehende E lek t ronend ich te besitzen, jedoch zur Kr i s t a l lb i ldung neigen, so da$ die Ablagerungen zu grobkSrnig waren (Durchmesser 400--700/~) , u m genaue u l t r a s t ruk tu re l l e Aufschlfisse zuzulasscn (Wohlrab u. Cossel, 1964). Besser waren die Ergebnisse mi t TNBT, das ein ann/~hernd amorphes F o r m a z a n l iefert (Tsou ct al., 1956). Sedar et al. (1962) erziel ten d a m i t an den Cristae von Herz- muske lmi tochondr ien R e a k t i o n s p r o d u k t e mi t e inem Durchmesser von rund 50/~ und Ogawa u. B a r r n e t t (1964) solche an den Cristae sowie an der Innen- membran . Dabe i reagier ten manche Mitochondr ien zur G/~nze, andere par t ie l l und ein Tell blieb reakt ions los ( , ,Heterogenei ty") . Unterschiedl ich reagierende Mitochondr ien lagen oft d i rek t nebeneinander . Als mSgliche Ursache daffir n a h m e n die Au to ren verschiedene Funkt ionszus t / inde bzw. ein verschiedenes Al te r der Zel lorganel len an. Ahnl iche Ergebnisse erhiel ten Rosa u. Tsou (1965).

Elektronenmikroskopische Darstellung der Succinodehydrogenase 61

Ein osmiophiles Tetrazol, das TC-NBT, das die Vorzfige erhShten elektronen- mikroskopischen Kontrastes und amorpher Formazanbildung hat, verwendeten Seligman et al. (1967). Eine Reaktion t ra t an den Cristae und der Innenmembran auf. Die Matrix blieb frei und Reaktionsprodukte im intracristalen Raum wurden einem sekund~ren Eindringen zugeschrieben. Bei Verwendung von Osmium- di~mpfen (60 ~ C) und der OTO-Methode zur KontrasterhShung (Seligman u. Wasserkrug, 1966) t ra t eine Heterogenit/it im Sinne einer ,,Alles-oder-Niehts- Aktivit~t" ohne Zwisehenstufen auf. Die Mitoehondrien mit maximaler Reaktion befanden sich in kontrahiertem und h~ufig deformiertem Zustand, wofiir alas abgelagerte Formazan verantwortlich gemacht wurde. Weglassung des Sub- strates verringerte das AusmaB der Formazanbildung nicht. Die Verfasser f/ihrten die unspezifische Reaktion auf die Anwesenheit endogener Substrate zuriiek. Hingegen fanden Haydon et al. (1967) bei gleiehen Inkubationsbedin- gungen Schw~rzungen der Matrix allein, w~hrend der intracristale Raum frei- blieb. Tsou et al. (1968) wieder erzielten mit Os-TNST Ablagerungen im intra- cristalen Raum.

Die Spezifit~t der Reaktion wurde von versehiedenen Untersuchern in Frage gestellt. Pearse u. Hess (1961) fanden Bindungen von NBT und MTT an Lipide, Proteine etc., Carmichael (1963) wies auf die Bildung von MTT-Co-Formazan durch Phospholipide him Nach Wohlrab u. Fuchs (1967) zeigten sieh Affinit~ten yon TNBT zu verschiedenen Zellstrukturen, wie Mitochondrienaul~enmembran, Membranen des ER, Grundplasmabezirken und Myofibrillen.

Die widerspriichlichen Resultate mit Tetrazolen fiihrten zu Versuchen mit einem anderen Reduktionsindikator. Eine urspriinglich yon Karnovsky (1964) zum Nachweis der Cholinesterase verwendete Ferricyanid-Methode wurde yon Ogawa et al. (1968) zur Darstellung yon Dehydrogenasen modifiziert. Ferricyanid wird nach der Reduktion bei Anwesenheit yon Kupferionen zum wasserunl5s- lichen, stark elektronendichten Kupferferrocyanid. Mit der Methode wurde eine Reaktion an den Membranen, dem Raum zwischen Aui]en- und Innenmembran und dem intracristalen Raum erzielt, nicht jedoch in der Matrix oder an der Matrixseite der Membranen. Die von Ogawa u. Barrnett (1964) besehriebene Heterogenitiit wurde ebenfalls beobachtet. Mit einer abge~nderten Methode konnten Kerpel-Fronius u. Hajos (1968) in Mitochondrienmembranen Reaktions- produkte von 40--80 A nachweisen. Matrix und intracristaler Raum blieben hin- gegen ffei. Eine Heterogenit~t t ra t insoferne auf, als die Mitochondrien an der Blockoberfl~che stark reagierten, wi~hrend in der Tiefe die Reaktion an St~rke abnahm oder gitnzlieh ausblieb. Unterschiedlich reagierende Cristae im selben Mitochondrium wurden dagegen nieht beobaehtet. Kalina et al. (1969) erhielten mit obiger Methode an den Cristae isolierter Mitochondrien Ablagerungen von 80--150 A Durchmesser, die zuerst an der Membranaul~enseite und sp~ter im intracristalen Raum auftraten. Die Ablagerungen t raten hiiufig an einander gegen/iberliegenden Stellen der beiden eine Crista bildenden Membranen auf.

Kri t ik an der Ferricyanidmethode /ibte Reiss (1969). Wenzcl et al. (1971) wendeten die Methode naeh Kerpel-Fronius u. Hajos (1968) in etwas abgei~nderter Form an. Sie fanden granul~re Niederschls von 50--80 A an der Innenmembran, zwischen AuBen- und Innenmembran und im intraeristalen Raum, jedoch nicht in der Matrix. Eine Heterogenititt t ra t nicht auf.

62 G. Egger:

Aus der Zusammenste l lung der L i t e ra tu rangaben geht hervor, da~ wir uns bezfiglich der Spezifiti~t der elektronenmikroskopischen Nachweismethoden der SDH heute noch auf sehr unsicherem Boden bewegen. I m Folgenden wird auf- g rund eigener Unte r suchungen zu einigen Problemen der Verwendbarkei t yon TC-NBT Stellung genommen.

Material und Methoden

Verwendet wurde das Inkubationsmedium nach Seligman et al. (1967). Als Substrat diente das BernsteinsKure-Dinatriumsalz Hexahydrat (FLUKA) in 0,1 M Konzentration; das TC-NBT wurde yon Dr. Harms (Leverkusen) bezogen. Als Versuchstiere dienten Wistar- ratten im Alter von 4--6 Monaten, die dutch Genickschlag und Carotisschnitt getStet wurden.

Ffir die lichtmikroskopischen Versuche wurden vom Herzen, z.T. auch yon anderen Organen unmittelbar nach dem Tod BlScke yon 1--2 mm a bzw. 15 ~ dicke Gefrierschnitte hergestellt und verschiedenen Behandlungsmethoden unterzogen, die im n~chsten Kapitel den Befunden vorangestellt werden.

Aufgrund der aus den Vorversuchen gewonnenen Erfahrungen wurde dann ffir den elek- tronenmikroskopischen SDH-Nachweis der folgende Weg eingehalten: Vom sofort ent- nommenen Herzen wurden B15cke yon etwa 1 mm a aus der Muskulatur des linken Ventrikels geschnitten und

A. im Medium 40, 60 und 90 min lang bei 37 ~ C inkubiert, B. zuerst in Natriumphosphatpuffer pH 7,4 10 min lang bei 4~ gewaschen und an-

schlieBend im Medium ohne Saccharose 40 min lang bei 37 ~ C inkubiert. Die Weiterffihrung der nach A und B behandelten Bl6cke war gleich: Sie wurden nach der

Inkubation 3 • 5 rain in Phosphatpuffer bei 4 ~ C gewaschen (nach je 5 min Pufferwechsel), im Milloniggemisch (Millonig, 1962) 1 h lang bei 4~ fixiert, in 2% ungepufferter, w~flriger OsmiumtetroxydlSsung 1 h bei 37 ~ C nachfixiert, in Aqua dest, zuerst 5 min bei 37 ~ C, dann 2real 10 min bei Zimmertemperatur gewaschen und in der steigenden Athylalkoholreihe je 15 min entw~ssert. Die B15cke kamen anschlieBend in reines TERPINEOL als Intermedium (Mitteilung yon Prof. Dr. G. Kellner, Histologisch-Embryologisches Institut Wien) 2real 15 rain, in Terpineol-Epon 1 : 1 6 h, in reines Epon (Epon 812, Serva) 6 h. Einzelheiten der Auswahl des Materials fiir die Untersuchungen, Blockorientierung etc. sind unter Punkt 1 und 4 im n~chsten Kapitel angeffihrt. Die Schnitte wurden auf einem Reichert OUM2 Ultra- mikrotom hergestellt, auf unbefilmte 45 ~ Kupfernetze aufgezogen, z.T. kontrastiert, und mit einem Siemens Elmiskop I untersucht. Die OriginalvergrSBerungen betrugen bis zu 40O00mal.

Kontrollreaktionen wurden durchgeffihrt: a) Unter Weglassung des Substrates, b) unter Weglassung des Tetrazoliums, c) lmter Weglassung des Substrates und des Tetrazoliums.

Vorversuche

Es wurden zuerst orientierende Versuche durchgeffihrt, u m im Verein mi t den aus der Li te ra tur bereits bekann ten Fak ten die opt imalen methodischen Voraus- bedingungen fiir den elektronenmikroskopischen SDH-Nachweis mi t TC-NBT zn ermitteln. Wohlrab u. Cossel (1964) f i ihrten 4 Punk te an, die bei der Inter- pre ta t ion yon Formazanablagerungen zu beachten sind: 1. Die Eindringt iefe der Tetrazole ins Gewebe. 2. Die Stabil i t~t des Formazans gegenfiber Fixierungs-, EntwKsserungs- und Einbe t tungsmi t te ln . 3. Die Abgrenzbarkei t der Formazane yon anderen in der Zelle vorhandenen e lektronendichten bzw. osmiophilen St rukturen . 4. Die Auswirkung der PrKparation auf den Erha l tungszus tand der feingeweblichen St rukturen .

Diesen 4 Kri ter ien mSchte ich noch anffigen : 5. Die Verlagerung des Reaktions- produktes vom Reaktionsort . 6. Die unspezifische Redukt ion des Indikators .

Elektronenmikroskopische Darstellung der Succinodehydrogenase 63

ad 1. Herzmuskel: Nach 40, 60 und 90 min langer Inkubation der B15cke im substrat- haltigen wie im substratfreien Medium wurden hiervon 15 ~ dicke Gefrierschnitte angefertigt.

Es zeigte sich, daI~ die Eindringt iefe des TC-NBT 30 40 ~ betrug und bei den verschiedenen Inkuba t ionsze i t en ungef/~hr gleich war. Dieser Befund wurde sp/iter bei der e lektronenmikroskopischen Pr/~paration ber/icksichtigt.

ad 2. Herzmuskel : 15 ~z dicke Gefrierschnitte wurden im Medium mit Substrat inkubiert, z.T. osmiert und anschlieBend verschiedenen Fixierungs-, Entw~sserungs- und Einbettungs- mitteln sowie den Komponenten von EPON 812 ausgesetzt. Dabei erwies sich TC-NBT- Formazan gegeniiber Formol, Glutaraldehyd, Osmiumtetroxyd, )~thylalkohol, Terpineol und den Komponenten des Epons stabil, wurde hingegen auch nach Osmierung durch Azeton und besonders durch Propylenoxyd zum GroBteil herausgelSst. Ein blasser Blauton der Schnitte blieb erhalten, der lichtmikroskopisch auf eine zarte F/~rbung der Mitochondrien zuriickzuffihren war.

Ffir die elektronenmikroskopische Pr/ iparat ion wurde zur Entw/isserung daher ~ thyla lkohol genommen. Anstelle des Propylenoxyds wurde als In t e rmed ium

Terpineol verwendet.

ad 3. Bei der angewandten Nachweismethode kSnnen elektronenmikro- skopische Schw/irzungen sowohl durch an Zel lkomponenten gebundenes reines Osmium, durch osmiertes Formazan, abet auch durch subs tan t iv gebundenes Tetrazol ium hervorgerufen werden, da das reduzierte wie das nichtreduzier te TC-NBT in gleichem Mal~ osmiophil sind. Hingegen ist im Lichtmikroskop die Unterscheidung des ann/ ihernd Iarblosen TC-NBT von seinem rStlichen Mono- formazan und dem blauviole t ten Diformazan mSglich (Beneke u. Simon, 1961). U m die subs tant ive Haf tung (Pearse u. Hess, 1961; Rosenbaum, 1964) yon nichtreduzier tem Tetrazol ium zu prfifen, wurde neben dem Herzmuskel noch folgendes Material un te r such t : Skelettmuskel, Leber, Niere, Nebennierenr inde, Milz, Fettgewebe, markhal t iger Nerv, Ery throzyten .

15 ~t dicke Gefrierschnitte yon obigen Geweben bzw. Ausstriche von Erythrozyten kamen auf UV-durchl~ssige Deckgl/iser und wurden 30 rain lang bei 37 ~ C im substrathaltigen wie im substratfreien Medium inkubiert, anschlieBend grfindlich (5 x 5 min) in Phosphatpuffer bei 4 ~ C gewaschen, 10 min lang in 10% Formol fixiert und fiber Leitungswasser und Aqua dest. in Glyceringelatine eingeschlossen. Ein Teil der im substratfreien Medium inkubierten Schnitte wurde mit einer Philips UV-Lampe (HP 3202) 10 min lang im Abstand yon 25 cm bestrahlt. Danach wurden Schnitte aus dem substrathaltigen und dem substratfreien Medium ohne und mit Bestrahlung miteinander verglichen. UV-Licht ffihrt zur Reduktion yon Tetrazolen durch Disproportionierung (Weygand u. Frank, 1948). Die Bestrahlung ist daher eine einfache Methode, substantiv gebundenes Tetrazolium in Schnitten zu reduzieren und lichtmikroskopisch sichtbar zu machen. Makroskopisch waren die Schnitte aus dem substrat- haltigen Medium je nach Material mehr oder minder stark blauviolett (Diformazan des TC-NBT), die aus dem substratfreien Medium blal~ rStlich gef/~rbt (Monoformazan). Nach UV- Bestrahlung trat bei letzteren ein Farbumschlag verschiedenen AusmaBes ins Blauviolette ein. Bei manchen Organen (Leber, Milz, Blur, Nerv) war der Farbton nach der Bestrahlung intensiver als in Vergleichsschnitten aus dem substrathaltigen Medium. Die mikroskopische Untersuchung ergab unspezifische Bindungen yon TC-NBT an die Erythrozytenmembran, das Sarkolemm des Skelettmuskels, an das Myelin und Lipidtropfen in Leber und Neben- nierenrinde sowie an lichtoptisch nicht abgrenzbare Cytoplasmabezirke.

Frei yon TC-NBT blieben bei allen untersuchten Objekten die Kerne und die Fasern des Bindegewebes.

Im substrathaltigen Medium inkubierte Herzmuskelschnitte zeigten makroskopisch eine kr/iftige blauviolette Farbe, die ausschlielllich durch eine intensive F/irbung der Sarkosomen hervorgerufen wurde. Alle anderen Strukturen waren ungef~rbt.

64 G. Egger:

In Schnitten aus dem substratfreien Medium waren die Sarkosomen zart rosa und ver- fiirbten sich nach UV-Bestrahlung ins Violette. Zudem trat an den Myofibrillen eine schwach violett getSnte Querstreifung in Erscheinung.

Um sicher zu gehen, dab diese Verfs der Sarkosomen nicht allein auf eine Weiter- reduktion unspezifisch gebildeten Monoformazans, sondern auf substantiv gebundenes Tetra- zolium zurfickzuffihren war, wurden Versuche mit kurzen Inkubationszeiten yon 2 rain bzw. nach Auswaschen der Schnitte (10 min in Phosphatpuffer bei 4 ~ C) yon 5 min durchgefiihrt. Die Schnitte aus dem substrathaltigen Medium zeigten unter diesen Bedingungen zart violett gefs Mitochondrien. Schnitte aus dem substratfreien Medium waren giinzlich ungefi~rbt; UV-Bestrahlung lie~ die Mitochondrien in zart-violettem Farbton hervortreten.

Demnach kommen substantive Bindungen an Mitochondrien schon nach kurzer Zeit zustande. Pearse u. Hess (1961) stellten fest, daI~ solche Bindungen in erster Linie zwischen Tetrazolen mit einer p-Nitrophenylgruppe an N~ und unges~ttigten Verbindungen eintreten, wie sie reichlich in Membranlipiden vor- liegen. Da TC-NBT die obige Gruppe aufweist, kann der gleiche Vorgang ange- nommen werden. Ffir eine Bindung an Membranen sprechen auch die oben ange- ffihrten ]ichtmikroskopischen Befunde. Nach Wohlrab u. Fuchs (1967) treten substantive Bindungen yon TNBT nur an der AuBenmembran, nicht an der Innenmembran und den Cristae auf.

ad 4. Die Inkubation unfixierter, mit der Klinge geschnittener Herzmuskel- blSckchen yon ca. 1 mm 8 GrSl~e ergab eine kr~ftige Enzymreaktion bei guter Strukturerhaltung, wiihrend eine Vorfixation die Enzymt~tigkeit im Sinne einer Schws bis g~nzlichen AuslSschung beeinfluSt, je nach verwendetem Fixans und Fixierzeit (Sabatini et al., 1963 ; Fasske, 1964). Die Verwendung yon Gefrier- schnitten ist wegen der Gefahr der Zellzerst6rung und Enzymverschwemmung problematisch (Sedar u. Rosa, 1961).

Phosphatpuffer und Indikator stellen ein unphysiologisches Milieu dar, das, wie im Abschnitt ,,Elektronenmikroskopische Untersuchungen" angeffihrt wird, an den Zellorganellen Ver~nderungen iihnlich jenen bei hypox~mischen Schiidi- gungen hervorrief (Sulkin u. Sulkin, 1965). l~ber die Toxizit~t von Tetrazolen finden sich Literaturangaben bei Reiss (1967).

Die von Seligman et al. (1967) empfohlene Behandlung mit Osmiumdi~mpfen ist nach eigenen Untersuchungen nicht nur umst~ndlich, sondern ruft auch zu- s~tzliche starke ZellzerstSrungen hervor, was vermutlich auf die hohe Temperatur (60 ~ C) zurfickzuffihren ist. Geeigneter erwies sich eine phosphatgepufferte 1%ige OsO4-L6sung nach Millonig (1962) bei 4 ~ C, die eine schonende Fixierung bewirkt. Eine Nachbehandlung mit 2% ungepufferter OsO4-L6sung bei 37~ ffihrt zu einer ffir den elektronenmikroskopischen Nachweis gfinstigen kri~ftigen Osmierung des TC-NBT, die durch Millonig allein nicht erreicht wird.

Ob der Erhaltungszustand eines eingebetteten B16ckchens ffir die feinstruk- turelle Untersuchung geeignet ist, wurde lichtmikroskopisch an mit Toluidinblau gef~rbten Orientierungsschnitten (Trump et al., 1961) yon 1,5 ~z Dicke ermittelt. Es wurden nur direkt an der Oberflhche liegende, womSglich noch yon Endo- mysium bedeckte unversehrte Muskelfasern ausgew~hlt, da beschs Fasern elektronenmikroskopisch z.T. starke Degenerationserscheinungen an den Mito- chondrien erkennen lassen. Ungefs Orientierungsschnitte zeigen ferner, ob gut erhaltene Zellen eine deutliche Enzymreaktion aufweisen, da das osmierte

Elektronenmikroskopische Darstellung der Succinodehydrogenase 65

TC-NBT an seiner dunkel g rauv io le t t en F a r b e kennt l ich ist. Der Block wurde dann so ge t r immt , dal~ die freie Zelloberfl/~che im Df innschni t t erfal~t wurde.

ad 6. Der h is tochemisehe Nachweis von E n z y m e n ist bekann t l i ch ein in- d i rekter . Eine Topis ierung des E n z y m s setz t voraus, da$ sich das Reakt ions- p r o d u k t a m Ort der l~eakt ion oder zumindes t in u n m i t t e l b a r e r Nachba r seha f t absetz t . F o r m a z a n e sind wasserunlSslieh, jedoch je nach T y p versehieden l ipid- 15slich. Zur Demons t r a t i on der LipidlSsl ichkei t yon T C - N B T - F o r m a z a n wurde folgender in v i t ro-Versuch durchgeff ihr t :

E iner schwaeh a lkal i schen w~$rigen TC-NBT-LSsung wurde SpeiseS1 und als R e d u k t i o n s m i t t e l Aseorbins/~ure bzw. H y d r o c h i n o n beigeffigt. Schf i t te l t man die LSsung, so geht das en t s t andene F o r m a z a n sofort in die Lip ide fiber und f/~rbt sie b lauvio le t t . Analoge Vorg/~nge in der Zelle, wie LSsung in den Membran- l ip iden oder L ip id t ropfen , s ind durchaus denkbar .

ad 6. 15 ~ dicke Gefrierschnitte vom Herzmuskel zeigten nach 30 min Inkubation im Medium mit Substrat starke Diformazanbildung in den Mitochondrien, im Medium ohne Sub- strat schwache Monoformazanbildung. Wurden hingegen B15cke yon 1--2 mm a inkubiert, und von diesen 15 ~ dicke Gefrierschnitte hergestellt, so war die Reaktion in den Schnitten von BlScken aus dem substratfreien Medium denjenigen aus dem substrathaltigen an St~rke ann~hernd gleich. Dabei fiel eine Verschiedenheit der Farbintensit~t auf: B15cke aus dem substrathaltigen Medium zeigten einen intensiveren Farbton direkt unter der Blockoberfl/iche, w~hrend diejenigen aus dem substratfreien Medium oberfl/ichlieh blasser waren, hingegen in dem Bereich, der an das nichtdurchdrungene Blockinnere grenzt, an Farbintensit~t ge- wannen. 10 min Auswaschen in Puffer bei 4 ~ C vor der Inkubation verhinderte bei den B15cken aus dem substratfreien Medium die Formazanbfldung weitgehend. Eine geringgradige rosa F~rbung der Mitochondrien war allerdings auch dann noch zu verzeichnen. Die B15cke aus dem substrathaltigen Medium zeigten eine kr/fftige Reaktion.

Die I n k u b a t i o n na t ive r B15cke l iefert unspezif ische l~esultate, die nach G o d d a r d u. Sel igman (1953) sowie Sel igman et al. (1967) auf das Vorhandense in , ,endogener S u b s t r a t e " im Gewebe zurfickzuffihren sind. Spezifische Resu l t a t e s ind demnach erst nach Auswaschen der B15cke zu erwar ten , wodurch die , ,endo- genen S u b s t r a t e " en t fe rn t werden.

Elektronenmikroskopisehe Untersuehungen Bei allen B15cken konn ten nach den verschiedenen Inkuba t ionsze i t en und

-bedingungen t ro tz der pr/~paratorisehen Vors ieh tsmaBnahmen in den Zellen Ver/~nderungen festgestel l t werden, wie sie nach hypox/~mischen SehKdigungen au f t r e t en : Quellung des sa rkop lasmat i schen Ret ieu lums, Vakuolenb i ldung und Sph/~risehwerden der Mi toehondr ien sowie degenera t ive Ersehe inungen an den Cristae.

Nach Methode A behandelte B16cke

Elek t ronend ieh tes R e a k t i o n s p r o d u k t t r a t innerha lb der Mi toehondr ien auf, wobei eine ausgesproehene Heterogenit /~t festzustel len war : E in Teil der Mito- chondr ien reagier te f ibe rhaup t nieht , auch n ieh t nach 90 min daue rnde r Inku- bat ion. U n t e r den reagierenden Mi tochondr ien konn ten alle Zwischenstufen bis zur m a x i m a l e n R e a k t i o n angetroffen werden. Die , ,schwache R e a k t i o n " t r a t in F o r m mult ip ler , diffuser Scha t t en auf, die an und u m die Membranen lagen, und zwar sowohl an der Mat r ixse i te wie im in t rac r i s t a len Raum. Meist waren beide Membranen einer Cris ta an e inander gegenfiberl iegenden Stel len betroffen

5 Histochemie, Bd. 30

66 G. Egger: Elcktronenmikroskopische Darstellung der Succinodehydrogcnase

Abb. 1. Nativer Block, 40 min inkubiert. ,,Schwache Reaktion" (1). Die Darstellbarkeit der Membran ist an solchen Often herabgesetzt. St~irkere l~eaktionen bei 2. Kontrastiert Uranyl-

acetat-Bleicitrat nach Reynolds. 100000 x . 80 KV. (verkleinert auf 9/10)

(Abb. 1) und bei max ima le r R e a k t i o n war die gesamte Matr ix ann/~hernd gleich- m/~Big mi t e lek t ronendich tem Mater ia l gefiill t (Abb. 2).

Mi tochondr ien mi t max ima le r Reak t ion zeigten eine auff~llige K o n t r a k t i o n sowie die Tendenz, sich breitf l i ichig an Nebens t ruk tu ren , insbesondere Nachbar - mi tochondr ien , anzulegen, was m i t u n t e r zu bizarren Verformungen fi ihrte. Dieses Verha l t en zeigten die Mi tochondr ien mi t schwacher his fehlender Yteaktion nicht.

W/~hrend Os04 fixierte, ohne Te t razo l ium inkubie r te Kont ro l l schn i t t e das gewohnte Bi ld der Mitochondr ien lieferten, zeigten die Membranen der Cristae

Abb. 2. Nativer Block, 40 min inkubiert. Mitochondrien verschiedener Reaktionsst/irke nebeneinander. Mitochondrien mit ,,maximaler Reaktion" sind deutlich kontrahiert. Daneben reagieren auch yon Doppelmembranen umgebene Vesikel (Pfeil). Unkontrastiert. 50000)<.

80 KV. (verkleinert auf 6/7 )

Abb. 3. Nativer Block, 60 min inkubiert. Mitochondrien mit ,,maximaler Reaktion". Die Cristae sind z.T. schlecht oder gar nicht dargestellt (1), vielleicht degeneriert. Daneben ein Mitochondrium, das kaum Reaktionsprodukt zeigt (2). Unkontrastiert. 80000x. 80 KVo

(verkleinert auf ~/~)

5*

A b b . 2 u . 3

Abb. 4 u. 5

G. Egger: Elektronenmikroskopische Darstellung der Succinodchydrogenase 69

nach Inkubation im tetrazoliumhaltigen Medium Besonderheiten: Ihre Dar- stellbarkeit war an Orten der schwachen Reaktion meist herabgesetzt oder auf- gehoben. In Mitochondrien mit maximaler Reaktion waren die Membranen oft kontrastarm oder traten nut in Teilbereichen schiirfer hervor. Der intracristale Raum enthielt ohne feststellbare Regel tells Schw~rzungen, teils war er yon sol- chen frei. Die Reaktion an der Innenmembran zeigte sich weniger deutlich. Die Zahl der Mitochondrien mit maximaler Reaktion nahm an vergleichbaren Ge- websorten nach l~ngeren Inkubationszeiten zu (Abb. 3).

Aui3er in Mitochondrien trat Reaktionsprodukt noch in Vesikeln auf, die yon einer Doppelmembran umhfillt waren und einen Durchmesser yon 0,2 ~ und darunter aufwiesen. Das sarkoplasmatische Reticulum reagierte nicht.

Die Kontrollen aus dam substratfreien Medium wiesen keine Unterschiede gegenfiber jenen mit Substrat auf, dagegen zeigten Kontrollen ohne Tetrazolium die oben beschriebenen Erscheinungen nicht.

Nach Methode B behandelte Bl6cke

Sie wiesen gleichfalls eine Art Heterogenit~t auf: Nicht alle Mitochondrien bzw. nicht alle Cristae in einem Mitoehondrium zeigten eine Reaktion. Elektronen- dichtes Reaktionsprodukt wurde im intraeristalen Raum angetroffen, der an diesen Stellen deutlich erweitert war. Weniger dichte Schw/~rzungen bewirkten weniger starke Erweiterungen. Im Bereich der Ablagerungen waren die Mem- branen starker geschw~rzt als an Orten ohne solche (Abb. 4). Seltener trat Reaktionsprodukt zwisehen Aui3en- und Innenmembran auf. Die Matrix blieb g~nzlich frei. Eine Kontraktion der Mitochondrien wie bei den nach A behandelten B15cken konnte nicht beobachtet werdcn.

Die Kontrollen ohne Substrat zeigten mancherorts geringf/igiges Reaktions- produkt im intracristalen Raum (Abb. 5), das aber sowohl an Menge wie auch an Dichte welt hinter dem der B15cke aus dem substrathaltigen Medium zurfickblieb. Dieser elektronenoptischen Reaktion entspricht offensichtlich lichtoptisch eine geringgradige Rosafitrbung der Mitochondrien durch Monoformazanbildung (s. oben unter Punkt 6).

Diskussion

Die SDH ist wegen ihrer zentralen Stellung im Energiehaushalt eines der meistuntersuchten Enzyme. Da sie einen Bestandteil der Mitochondrienmembran darstellt (vide SjSstrand u. Barajas, 1970), kSnnte die genaue Kenntnis ihres Sitzes im ultrastrukturellen Bereich unsere Vorstellungen fiber den Bau von Membranen wesentlich bereichern. Leider stehen diesem Wunschziel heute noch erhebliche Mi~ngel in der Methodik und Unsicherheiten in der Auswertung elektronenmikroskopischer Befunde entgegen. Die vorliegende Untersuchung zielte darauf ab, einige mSgliche FehIerquellen kritisch zu beleuchten.

Abb. 4. Gewaschener Block, 40 rain inkubiert. Reaktionsprodukt im erwciterten intra- cristalen Raum und in der Membran (1), im Raum zwischen Aul3en- und Innenmembran (2) und in yon einer Doppelmembran umgebenen Vesikeln (3). Unkontrastiert. 50000 • 80 KV.

(verkleinert auf 5/6 ) Abb. 5. Gewaschener Block, ohne Substrat 40 rain inkubiert. Reaktionsprodukt tritt gering-

fiigig im erweiterten intracristalen Raum auf. Unkontrastiert. 40000 • 80 KV. (verkleinert auf 5/6 )

70 G. Egger:

Das osmierte Formazan ist nur an seiner Elektronendichte erkennbar. Elek- tronendicht ist aber auch das an Zellkomponenten gebundene Osmium und osmiertes, substantiv gebundenes TC-NBT. Weiters mug sichergestellt werden, inwieweit die Formazanbildung durch die SDH erfolgt, und schliel~lich mill]ten, um den ultrastrukturellen Sitz zu erfassen, die Formazanablagerungen am Reaktionsort liegen bleiben.

An Zellkomponenten gebundenes Osmium 1/iBt sich durch Kontrollversuche ohne Tetrazolium feststellen, l~ber die Abgrenzung des oxydierten vom redu- zierten Indikator geben lichtmikroskopische und biochemische Methoden Auf- schlul3. Die an Mitochondrien gebundene Menge nichtreduzierten Tetrazoliums ist nach lichtmikroskopischen Befunden gering. Die Bindung erfolgt zum GroB- tell an Membranlipide (Pearse u. Hess, 1961), nach Untersuchungen von Wohlrab u. Fuchs (1967) mit TNBT nur an die Aul3enmembran der Mitochondrien, also an Zellorte, die selbst osmiophil sind, so dal3 die geringe Menge substantiv ge- bundenen Tetrazoliums im elektronenmikroskopischen Bild kaum hervortrit t .

Die Bildung yon Formazan ist bei nativ inkubierten B16cken ffir SDH nicht spezifisch, sondern dfirfte auf verschiedene in den Mitochondrien ablaufende reduzierende Prozesse zuriickzufiihren sein, in erster Linie wohl auf die Enzym- systeme Zitratzyklus, Atmungskette und Fettsi~ureoxydation (Karlson, 1970). Spezifisch ist die Reaktion erst dann, wenn den Enzymsystemen die natiirlichen Substrate entzogen werden. Im Groben t//Bt sieh das dutch Auswaschen der B16cke erzielen, bessere Resultate werden vermutlich yon der Anwendung von Enzymblockern zu erwarten sein.

Fiir die genaue Enzymtopisierung ist welters Voraussetzung, dab TC-NBT direkt v o n d e r SDH reduziert wird. Von Lester u. Smith (1961) wurde jedoeh festgestellt, dal~ gereinigte SDH Tetrazolium nicht zu reduzieren vermag. Unter- suchungen versehiedener Tetrazole durch Slater et al. (1963) ergaben verschiedene Reduktionsorte an der Atmungskette, vom Ubichinon bis zur Cytochromoxydase. Ffir TC-NBT liegen dartiber bisher weder biochemische noch histochemische Untersuchungen vor. Da das Glied oder die Glieder der Atmungskette, die seine Reduktion bewirken, nicht bekannt sind, kann der Ort der Formazanablagerung zum Enzymort nicht in Beziehung gebracht werden. Man sollte daher bis zur Abkl/irung dieser Frage besser unverbindlich yon der Darstellung eines ,, Succinat- TC-NBT-l~eduktase-Systems" spreehen (vgl. Slater et al., 1963).

TC-NBT-Formazan ist gut lipidl6slich. Verlagerungen in Lipide wurden ftir versehiedene Formazane selbst in liehtmikroskopisehen Dimensionen festgestellt (z.B. yon Hayek, 1950; Stier, 1952; Neumann u. Koch, 1953). Die Beobaehtung, da$ bei nativen B16eken die sehwaehe Reaktion an Membranen, stKrkere Reak- tionen in deren weiterer Umgebung auftraten, maeht es wahrscheinlieh, dab die Membranen der Ort der Reaktion sind und im Ubersehuft gebildetes Formazan sekund/tr in die Matrix, den intraeristalen Raum und in den l~aum zwischen Aul~en- und Innenmembran gelangt. Bei gewasehenen B16eken, bei denen die Reaktion weitgehend spezifisch war, t ra t das Reaktionsprodukt nur in den beiden letztgenannten R/iumen und in den Membranen der Cristae auf - - ob hier primi~r entstanden oder in Membranlipide verlagert, kann nieht entsehieden werden.

Aus dem Gesagten geht hervor, dab die dem intracristalen Raum und der AuSenmembran zugewandte Seite der Innenmembran als Ort der spezifischen Enzymreaktion, aber aus dem vorhin angeffihrten Grund nieht unbedingt als

Elektronenmikroskopische Darstellung der Succinodehydrogenase 71

Sitz der S D H anzusehen ist. Diese Fo lgerung wird zus~tzlich durch g le ichlautende Ergebnisse mi t der F e r r i c y a n i d m e t h o d e (s. Einle i tung) und durch biochemische Un te r suchungen ges t i i t z t : Nach L~vy et al. (1967) bes i tz t nur die I n n e n m e m b r a n , n ich t aber die Au l ]enmembran die Akt iv i t i t t der A tmungske t t e .

E in wei terer Befund, der mi t Te t razolen wie mi t der F e r r i c y a n i d m e t h o d e erhoben werden konntc , is t die funkt ionel le He te rogen i t~ t der Mitochondr ien . Sie war sowohl in gewaschenen wie in na t iven B15cken festzustel len. Da die Zahl der Mi tochondr ien mi t max ima le r R e a k t i o n nach li~ngerer I nkuba t i onsz e i t zu- nahm, l iegt die A n n a h m e nahe, dab die unterschiedl ichen Reak t ionss t~ rken S tad ien for t schre i tender E n z y m t ~ t i g k e i t entsprechen, dai3 also die Mi tochondr ien in verschiedenen zei t l ichen l~hy thmen oder mi t verschiedenen Geschwindigkei ten a rbe i t en kSnnten. Auch eine schwankende Durchl~ss igkei t der Membranen fiir Subs t ra te , deren Vors tufen oder ffir den I n d i k a t o r k~me als Ursache ffir das unterschiedl iche Verha l ten in Frage .

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Dr. G. Egger Institut ffir Histologie Universit/~tsplatz 4 A-8010 Graz 0sterreich