Zytochemische lokalisation und charakterisierung von phosphatabspaltenden fermenten im sarkotubulären system quergestreifter muskeln

Histochemie 10, 140--153 (1967)

Zytochemische Lokalisation und Charakterisierung yon phosphatabspahenden Fermenten

im sarkotubuliiren System quergestreifter Muskeln*

W. SCHULZE u n d A. WOLLENBERGER

Abteilung ftir Zellbiologie des Instituts fiir Kreislaufforschung der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Berlin-Buch

Eingegangen am 16. Februar 1967

Summary. The electron microscopic localization and differentation of nucleosidephos- phatases in the trunk and tail musculature of Mollienesia sphenops and in the diaphragm of rats and mice was achieved by the use of the lead precipitation method following preliminary fixation of the tissues in glutaraldehyde and osmium tetroxide. Lead phosphate deposits in the sarcotubular system were heaviest in the terminal cisternae of the sarcoplasmic reticulum and occurred there in the presence of a number of nucleosidephosphates, ATP being a preferred substrate. The transverse tubules exhibited no nucleosidephosphate splitting activity, in contrast to the plasma membrane of the sarcolemma, in which a Na + and K+-dependent ATPase was demonstrated. Lead phosphate accumulation in the terminal cisternae was not influenced by the calcium concentration in the incubation medium. I t was markedly inhibited by N-ethyl maleinimide and p-ehloromercuribenzoate, but was insensitive to ouabain which, on the other hand, abolished the Na+-K+-dependent ATPase reaction in the plasma membrane.

A highly selective deposition of lead phosphate in the transverse tubules was seen following incubation in medium containing p-nitrophenyl phosphate. This observation is discussed in relation to other evidence concerning differences in the properties of the plasma membrane and the transverse tubules.

Zusammen]assung. Lokalisation und Differenzierung von nukleosidphosphatspaltenden Reaktionen in Schnitten und B16ckchen aus der Rumpf- und Schwanzmuskulatur von Mol. lienesia sphenops und dem Diaphragma von Maus und Rat te wurden mit der Bleipr~zipi- tationsmethode nach Osmiumtetroxyd- und Glutaraldehydvorfixierung untersucht. Der Bleiphosphatniederschlag, als Folge der Inkubation, ist vorwiegend in den lateralen Vesikel der Triaden lokalisiert. Das T-System zeigt im Gegensatz zur Plasmamembran der Muskelzelle keine, auch nicht durch Na + und K + aktivierbare Nukleosidphosphatasereaktion. Ca-Ionen in Gegenwart von Mg ver~ndern die Bleiakkumulation nicht. N-Athylmaleinimid und p-Chloromercuribenzoat vermindern die Bleiphosphatbildung der lateralen Vesikel. g-Stroph- anthin hat hierauf keine Wirkung, inaktiviert aber die Reaktion der Plasmamembran. In den lateralen Vesikeln werden aul~er ATP noch CTP, GTP, ITP, UTP, ADP und IDP gespaltcn. Der Grad der Hydrolyse ist jedoch geringer als nach ATP und auch innerhalb dieser Substratreihe abgestuft.

Eine selektive Blciablagerung im T-System wird nach Inkubation von p-Nitrophenyl- phosph~t als Substrat gefunden. Dieser Befund wird im Zusammenhang mit anderen unterschiedlichen Eigenschaften yon Plasmamembran und T-System diskutiert.

D e m s a r k o p l a s m a t i s c h e n l~e t i ku lum k o m m t eine besondere B e d e u t u n g bei de r S t e u e r u n g v o n K o n t r a k t i o n u n d E r s c h l a f f u n g der me i s t en que rges t r e i f t en Muske ln d u r c h R e g u l i e r u n g de r C a l c i u m i o n e n zu (vgl. PORTER, 1961 ; RUS~A, 1963 ; HAS- SELBAC~L 1964; PEACHEY, 196b; PODOLSKY, 1965). E i n e F r e i s e t z u n g v o n Calc ium-

* Teile dieser Arbeit wurden auf der III . Gesamttagung der Gesellschaft fiir experimentelle Medizin der DDR in Leipzig, 20.--22.5. 66, vorgetragen.

Fermente im sarkotubul~ren System 141

ionen aus den lateralen Zisternen des sarkoplasmatischen Retikulums, die vermut- lich durch eine im einzelnen noeh nicht aufgekls Erregungsfibertragung aus dem eng benachbarten, mit dem Sarkolemm verbundenen tubuliiren System aus- gelSst wird, ffihrt fiber die Aktivierung des Aktomyosinsystems zur Kont rak t ion des Muskels. Der Rficktransport der freigesetzten Ionen in ihre Ausgangsposition be~drkt die Erschlaffung (HASSELBACH und WEBER, 1965). Die hierfiir ben6tigte Energie liefert ein durch Ca ++ stimuliertes Mg++-abh/~ngiges ATPase-System, das in einer im wesentlichen aus Membranen des sarkoplasmatisehen Retikulums zusammengesetzten Mikrosomenfraktion des Skeletmuskels gefunden wurde (HAsSELBACH und MAKINOSE, 1961; 1962). Histochemisch konnten ENGEL (1963), TICE und ENGEL (1964; 1966), PADYKULA und GAUTHI]~R (1963), GAUTHIER und PADYKVLA (1965) und ZEBE (1965) im Skeletmuskel und SOMM]~R und SPACH (1964), ESS~E~, NOVIKOFF und QUINTA~A (1965) und I%OSTGAARD und BEH~KE (1965) im t terzmuskel mit der yon WACHST~IN und MEIS~L (1955) beschriebenen Methode eine durch Mg++ aktivierte Nukleosidphosphatase in best immten Teilen des sarkoplasmatischen l~etikulums nachweisen. Die licht- und elektronenmikroskopischen, mit unterschiedlichen Vorbedingungen und an verschiedenem Ma- terial durchgeffihrten Experimente geben jedoch kein einheitliches Bild fiber genaue Lokalisation innerhalb des sarkotubul~ren Systems und gestat ten keine Differenzierung der verschiedenen nukleosidphosphatspaltenden Fermentsysteme. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb an dem feinstrukturell so exakt beschriebenen Rumpfmuskel yon Mollienesia sphenops (F~ANZ~I-A~MsTRO~G und Pon- T]~, 1964) und dem Diaphragmamuskel yon Rat te und Maus (BuB]~ZER, 1966) diese Frage unter Benutzung einer bereits frfiher erprobten Methode (ScHuLZ~ und WOLLE~ERGER, 1963; 1965b) noch einmal einer genauen Prfifung unter- zogen. Insbesondere wurde versucht, durch die seldctive Darstellung phosphat- abspaltender Fermente eine histochemisehe Di//erenzierung der Komponenten des sar~otubul~iren Systems und der sonstigen Membransysteme der Muskelzelle zu erreichen.

Material und Ylethodik

Gewebestfickchen vom Diaphragma adulter Laborm~use und Wistarratten und vom Rumpf- und Schwanzmuskel des Aquariumfisches ,,black Mollie" (Mollienesia sphenops) wurden nach Dekapitierung herausgeschnitten und entweder sofort am Gefriermikrotom eingefroren oder fiber Eis in kleine B15ckchen yon maximal 1 mm Durchmesser zerlegt. Nach Anfertigung yon 40--120 ~ dicken Gefrierschnitten kamen die Schnitte und B15ckchen in die LSsungen zur Voffixierung. Ffir die elektronenmikroskopische Preparation blieb das Gewebe 3 min in 1%iger OsmiumtetroxydlSsung nach CAVLFIELD (1957) oder 10 rain in 2 %igem, gepuffertem Glutaraldehyd (SABATINI, B]~SCH und BARRI~ETT, 1963). Die bis zu 10 ~ dicken Kryostat- sclmitte (System Dittes-Duspiva) wurden ffir die lichtmikroskopische Verarbeitung in FormalinlSsung nach HOLT und HmKS (1961) fixiert. Nach grfindlichem Auswaschen bis zu 30 min bei 0~ in 12,5 mM Tris enthaltender 0,25 M SaccharoselSsung yon pH 7,2 wurden Schnitte und B15ckchen ffir 2 0 ~ 0 min bei 37~C (Fischmuskel auch bei ca. 20~ in einem Standardinkubationsmedium folgender Zusammensetzung inkubiert: 12,5 mM Tris, 2,5 mM Magnesiumsulfat, 2,5 mM Tris ~- oder Dinatrium-ATP, 2,5 oder 5 mM Blei~cetat und entweder

Abki~rzungen : Tris 2-Amino-2-oxymethylpropan-l,3-diol, PCMB p-Chloromercuribenzoes~ure, NEM

N-~thylmaleinimid, ATP Adenosintriphosphat, CTP Cytidintriphosphat, GTP Guanosin- triphosphat, ITP Inosintriphosphat, UTP Uridintriphosphat, ADP Adenosindiphosphat, IDP Inosindiphosphat, PNPP p-Nitrophenylphosphat, NTPase Nukleosidtriphosphatase, NTP Nukleosidtriphosphat.

10"

142 W. SCHULZE und A. WOLLENB~RGER:

30 mM Tiron (Natrium-3,5-brenzkatechinsulfonat) oder 30 mM Kaliumnatriumtartrat (v. DEIMLING, 1964). Der pH-Wert betrug 7,2--7,4. In einer Anzahl von Versuchen wurde dieses Medium wie folgt abgeiindert:

1. Natrium- und Kaliumionen wurden ausgelassen oder als Chloride in molarem Ver- haltnis bis zu 10:1 (Na+:K +) zugegeben. Die maximale Natriumkonzentration betrug 150 mM.

2. Mg ++ wurde durch 18,2 oder 0,5 mM CaC12 ersetzt, oder CaC12 wurde zusitzlich verab- reicht.

3. AuBerdem wurde die Wirkung von 2,5 mM p-Chloromercuribenzoesiure (PCMB), 1 mM N-~thylmaleinimid (NEM) getestet und das Gewebe mit verschiedenen Konzentrationen (1, 0,5 und 0,1 mM) g-Strophanthin (Ouabain) vorbehandelt und/oder inkubiert.

4. ATP wurde ausgelassen oder durch ~quimolare Mengen yon CTP, GTP, ITP, UTP, ADP, IDP und PNPP ersetzt ~.

Die inkubierten Schnitte und B15ckchen wurden zun~chst in Tris-SaccharoselSsung bei Zimmertemperatur kurz gewaschen und dann entweder ffir 2 Std in 6% igem gepuffertem Glutaraldehyd und nach lingerem Auswaschen far weitere 1~/2 Std in Osmiumtetroxyd oder g..leich bis 21/~ Std in l%igem Osmiumtetroxyd nachfixiert. Die Priiparate wurden fiber Athanol oder Aceton entwissert und in Vestopal (Firma M. Jiger, Schweiz) eingebettet. Nach dem I-Ierstellen der Ultradtinnschnitte mit einem LKB-Ultrotom wurde mit dem Standard- elektronenmikroskop SEM 3 des Werks ffir Fernsehelektronik, Berlin-SchSneweide, bei 60 oder 80 kV mit 30--50 ~ Objektivblenden mikroskopiert. Ffir die lichtmikroskopische Betrachtung wurden die Sehnitte nach der Entwicklung mit Ammoniumsulfid wie fiblich weiterbehandelt.

Ergebnisse Die l ich tmikroskopischen Unte r suchungen d ien ten in ers ter Linie als Kon-

t ro l len zu den e lek t ronenmikroskopischen Ergebnissen, mi t denen sie bis auf wenige, wel ter un t en zu besprechende Punk te , f ibereinst immen. Da sie aul~erdem gute Ube re in s t immung mi t den von ZEBE (1965) und GAUTHIER und PADYKVLA (1965) beschr iebenen Resu l t a t en zeigen, soll im folgenden haupts~chl ich auf die elek- t ronenmikroskop i schen Ergebnisse eingegangen werden.

Inkubation im Standard-A T Pase-Medium

Nach der I n k u b a t i o n yon Schni t t en und B16ckchen der mat O s m i u m t e t r o x y d oder G l u t a r a l d e h y d vor f ix ie r ten Rumpf - und Schwanzmusku la tu r yon Molliene.sia sphenops im S t a n d a r d - A T P a s e - M e d i u m l inden sich auf e inem paral le l zur L/ings- r i ch tung der Myofibr i l len geffihrten Df innschni t t Ble iablagerungen vor al lem in den regelm/il~ig in HShe der Z-St re i fen im interf ibri l l / i ren R a u m angeordne tcn Tr i aden (Abb. 1, 2 u. 3). Schon bei r e la t iv schwacher VergrSBerung is t s ichtbar , dal~ die Ble iab lagerungen die la te ra len Vesikel und n icht die zent ra len Anschni t t e des T - S y s t e m s bedecken. Besonders in dem m i t G lu t a r a ldehyd vor f ix ie r tem und 1/inger inkub ie r t e ln Gewebe l iegt der Ble iphosphatn iederschlag aul3erdem fiber b e s t i m m t e Abschn i t t e der Myofibr i l len ve r s t reu t (Abb. 2 u. 3) und vereinzel t an der P l a s m a m e m b r a n der Muskelzelle (Abb. 6a).

Die R e a k t i o n der P l a s m a m e m b r a n is t in der Diaphragmamuske lze l le (Abb. 7 a) wesent l ich in tens iver als in der des , ,black Mollie". Obwohl die Tr i adenanordnung im Zwerchfel lmuskel durch die un te r den vor l iegenden Inkuba t ionsbed ingungen ebenfal ls reag ierenden Mitochondr ien (PADYKULA und GAUTHIER, 1963) verdeck t

2 ATP und ADP wurden vonder Firma Boehringer und Soehne, Mannheim, CTP, GTP, UTP, ITP, IDP und PNPP yon Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., bezogen.


ist, werden die in diesem Muskel in einer Sarkomere doppelt vorhandenen Triaden (vgl. BUBE~ZE~, ]966) gut markiert. Auch hier ist der zentrale T-Anteil ohne Reaktion (Abb. 7 a).

Auf st~rkeren Vergr6Berungen von nicht ganz parallel getroffenen L~ngs- schnitten des Rumpfmuskels yon Mollienesia sphenops sind die Profile der Triaden fiber einen grSfieren, oftmals mehrere Mikron langen Bereich zu verfolgen. Die

Abb. 1. L~ngsschnitt eines 3 min in Os04 vorfixierten, 30 minim St~ndardmedium inkubierten 60 ~-Gefrierschnittes aus dem Rumpfmuskel yon Molliene~ia 8phenops. Bleiablage- rungen zu beiden Seiten des T-Systems in den lateralen Bl~schen der Triaden. VergrS[~erung:

25000:1

Anschnitte des T-Systems sind s~mtlich ohne Fermentreaktion (Abb. 4). Die Blei- ablagerungen liegen je nach St~rke der Reaktion mehr oder weniger angereichert unter Aussparung eines ca. 200--400 A breiten Zwischenraumes parallel zu der aus der Wandung des T-Systems und der lateralen Zisternen gebildeten Membran- struktur innerhalb der letzteren (Abb. 4). In li~nger inkubierten Sehnitten (40 min) ist fast die gesamte Fl~che der lateralen Vesikel, einschliel~lieh der dem T-System zugewandten Membran, mit Bleiphosphat bedeckt. Die anderen angeschnittenen Profile des Sl~-Systems zeigen, wie besonders auch aus der Abb. 1 und 5 hervor- geht, nach OsO4-Vorfixierung keine, nach Glutaraldehydvorfixierung vereinzelte Bleikristallite (Abb. 2). Obwohl FRANZ~I-AaMST~ONG und PORTER (1964) ffir den Black-Mollie-Muskel eine im Vergleich zu anderen Muskeln grol~e Zahl von Uber- gi~ngen der T-Systeme in das Sarkolemm beschrieben, gelang uns weder im mit Os04 noch im mit Glutaraldehyd vorfixierten Gewebe eine gute Darstellung dieser

10b t t istochemie, Bd. 10

Abb. 2. Li~ngsschnitt eines 10 min in 2%igem gepuffertem Glutaraldehyd vorfixierten 60 tz- Gefrierschnittes vom black Mollie-Rumpfmuskel nach 40 min Inkubat ion im Standard- ATPase-Medium. Die im Vergleich zur OsO4-Vorfixierung etwas gr5bere Bleiphosphat-

ablagerung liegt vorwiegend in den lateralen Vesikeln der Triaden. Wenige Stellen des SR-Systems (Pfeile) zeigen Reaktion. VergrSBerung: 25000:1

Abb. 3. Liingsschnitt nach Behandlung wie Abb. l, 40 rain Inkubat ion yon 1 mm-Gewebe- bl6ckchen des black Mollie-Muskels. Starke Anreicherung yon Bleikristalliten in den er- weiterten lateralen Vesikeln (Pfeile). Die Ablagerung ist auf die dem T-System zugewandten Pole derVesikel beschr~nkt. Vereinzelte Blcipartikel an der Grenze zwischenA-und I-B~ndern

W. SCHULZ~ und A. WOLL]~CBnRGER: Fermente im sarkotubul/iren System 145

Abb. 4. Eine Triade st/h'ker vergrSl3ert. Die Membranen des T-Systems sind ohne keaktion. Die Bleiablagerungen liegen unter Aussparung eines ca. 25 m~ breiten Spaltes in den lateralen Vesikel. Glutaraldehydvorfixierter 60 ~- Gefrierschnitt aus dem Rumpfmuskel yon black Mollie.

Standardinkubation. Vergr5Berung: 45000:1

Abb. 5. Durch Anderung des Myofibrillenverlaufes bedingte Darstellung von T-Membranen und Anschnitten des SR-Systems. Der Bleiphospha~niederschlag ist parallel zum T-System orientiert. Die fibrigen bl~schenfSrmigen Anschnitte des SR-Systems sind ohne Reaktion.

OsO~-Vorfixierung. Inkubation von 120 [z-Gefrierschnitten im Standard-ATP-Medium. VergrSBerung: 60000:1

Kontak ts te l len . Meist endeten die Tr iaden unmi t t e lba r un te r der P l a s m a m e m b r a n der Muskelzelle im subsarkolemmalen Raum.

Kon t ro l l i nkuba t ionen ohne Subs t ra t waren immer negativ. Eine spontane Hydrolyse des ATP, d.h. ohne Beisein yon Gewebe (ROSENTHAL, MOSES, BEAVER und SCHUFFMAN, 1966), l a n d un te r unseren Inkuba t ionsbed ingungen in Anwesen- heir yon 5 mM Bleiacetat nu r in geringem Maf3e start . Bei Zusatz von 2,5 mM pb++ u n d nach I n k u b a t i o n mi t 5 mM Pb ++ bei Z immer tempera tu r (ca. 20~ lag

146 W. SCHULZE und A. WOLLEiNBEI~GER:

sie jedenfal ls un te r der his tochemisch e r fagbaren Or thophospha tgrenzkonzen- t ra t ion . Die e lek t ronenmikroskopische Auswer tung dieser Inkuba t ionen zeigte keine yon den mi t 5 mM Pb ++ durchgeff ihr ten Versuchen abweichende Lokal i sa t ion des Ble iphosphats . Daher erscheint die Annahme berecht igt , dab eine evt]. du tch spon tane Hydro ly se des A T P gebi ldete unspezifische und ve rs t reu t l iegende Ble iphospha tab lagerung durch die nachfolgende Wei te rbehand lung (Spfilen,

Abb. 6a. l~umpfmuskel von Mollienesia sphenops. Feine Bleiphosphatablagerung Ms Zeichen einer Fermentaktivit~t an der Plasmamembran der Muskelzelle (Pfeile) und in den ]ateralen Vesikeln der Triade. OsO4-Vorfixierung. 60 ~- Gefrierschnitt. 30 rain Inkubation. Vergr6[~erung :

45 000 : 1

Abb. 6b. L~ngsschnitt durch den Rumpfmuskel yon black Mollie nach Vorbehandlung und Inkubation mit 10 a M g-Strophanthin. Die Bleiphosphatniederschl~ige sind in den laterMen Vesikel angereichert. Sie liegen nicht im T-System. Die sehr schwache Reaktion der Plasma- membran ist nach g-Strophanthin-EinfluB v611ig verschwunden. 3 min 0s04-Vorfixierung.

Inkub~tion im Standard-ATP-Medium. 120 [z-Gefrierschnitt. Vergr6gerung : 45 000 : 1

Nachf ixieren, Entwgssern , E inbe t ten) herausgewaschen wird. Einen s ta rken Aus- wascheffekt yon Ble iphospha t und -sulfid nach OsOa-Fixierung fanden schon R~ALE und LucIA~O (1964).

Veriinderung des Kationengehalts des Mediums Die vorgenommenen Vergnderungen der Menge der angebotenen Ionen ha t t en

auf dem in den Endbl / ischen des St~-Systems gefundenen Ble iphosphatnieder- schlag keinen Einflug. Die hier ]okalisierte Fe rmen tak t i v i t / i t is t im Gegensatz zu der jenigen in der P l a s m a m e m b r a n des Diaphragmamuske l s und des Herzmuskels


(WOLLENBERGER und SCHULZ]~, 1966) n ich t Na+- und K+-abh~ngig. Die meis t n ich t sehr in tens ive R e a k t i o n an der P l a s m a m e m b r a n der Muskelzellen yon b lack Mollie lie[~ sich durch Var ia t ionen des Na+-K+-Verh~ltnisses n ich t vers t~rken. Niemals wurden h ie rdurch ATP-spa l t ende R eak t i onen an den Membranen des T -Sys t ems hervorgerufen. Die P l a s m a m e m b r a n der D i a p h r a g m a m u s k e l bl ieb bei Auslassung yon Na + und K+ ohne Ble iphosphatn iederschlag . Zusatz yon Ca- Ionen

Abb. 7a. L~ngsschnitt durch eine Muskelzelle des Diaphragma. Bleiablagerungen markieren die vier lateralen Vesikel der beiden Triaden innerhalb einer Sarkomere. Aul]erdem liegen Bleiphosphatniederschl~ige an den Membranen der Mitochondrien, der Pinozytosebl~schen und Zellmembranen der Endothelzellen und an der Plasmamembran der Muskelzelle. 3 min OsO 4- Vorfixierung, 40 min Inkubation yon 1 mm-GewebeblSckchen im Standard-ATP-Medium.

VergrSBerung: 15000 : 1

zum S t a n d a r d m e d i u m ver~nder te die B le iphospha tb i ldung und -ab lagerung nicht . Es t r a t keine w a h r n e h m b a r e Versti~rkung der R e a k t i o n ein, wie sie den Reagenz- g lasversuchen von HASSELBACtt und MAXINOSE (1961) an Mikrosomenf rak t ionen zufolge zu e rwar ten gewesen ware. Ersa tz von Mg ++ durch Ca ++ konn te keine reproduz ie rbare Ble iphospha tb f ldung hervorrufen.

Wirkung yon PCMB, NEM u n d g-Strophanthin Die als I nh ib i t o r en der Sul~hydrylgruppen von Enzymproteh~en b e k a n n t e n

Subs tanzen PCMB und N E M ve rh inde r t en in den l i ch tmikroskopisch ausgewer- te ten P r g p a r a t e n in den ve rwende ten K o n z e n t r a t i o n e n jede E n z y m a k t i v i t g t . Die

148 W. SCHULZE und A. WOLLENBERGER:

e lek t ronenmikroskopischen Bilder zeigen eine s ta rk verminder te , aber n icht vSllig un te rdr f ick te Bleipr/s g -S t rophan th in , das die durch Na + und K + akt i - vier te T r a n s p o r t - A T P a s e der Ze l lmembran selekt iv blockier t (GLY~N, 1964), ha t in den angegebenen Konzen t r a t i onen auf die Ble iablagerung in den la tera len Vesikeln de r Tr iaden, die ohne zugesetztes Na + und K + vor sich gehen kann, keinen EinfluB (Abb. 6 b und 7 b). Daffir ist, wie besonders durch den Vergleich der Abb. 6b und 7b mi t den Abb. 6a und 7a deut l ich wird, die Ble iphosphatkr i s ta l l i -

Abb. 7b. Mit 10 -3 M g-Strophanthin vorbehandeltes und inkubiertes Gewebe aus dem Dia- phragmamuskel der Maus. T-System und Plasmamembran der Muskelzelle ohne Reaktion. Die Bleiphosphatkristallite bedecken fast ausschliel~lich die lateralen Vesikel. OsO 4 vor-

fixiertes B16ckchen. Standard-ATP-Medium und 10 3 M g-Strophanthin. Vergr6Berung: 37500:1

sa t ion an der P l a s m a m e m b r a n des Sarko lemms nach Vorbehandlung und In- kuba t ion mi t 10 -~ M S t rophan th inkonzen t r a t i onen fast vollst/~ndig verschwunden.

Substratspezi/itdt Alle an Stelle von A T P eingesetzten Nukleo t ide ergaben eine Reak t ion in den

la te ra len Vesikeln. Aber schon an den l ichtmikroskopischen Pr / ipa ra ten liel3en sich gewisse Abs tu fungen in der Ak t iv i t~ t erkennen, die auch in den elektronenmikroskopischen Bi ldern augenscheinl ich wurden. So hinterliel3en ITP , CTP und U T P ebenfal ls Ble iablagerungen in den Seitenbl/ ischen der Tr iaden, die in ihrer St/~rke denen bei I n k u b a t i o n mi t A T P glichen. Die Bleikr is ta l l i sa t ion erschien aber nach U T P - E i n s a t z grSber zu sein und st / irker fiber andere Anschni t t e des

Fermente im sarkotubul/~ren System 149

SR-Systems zu streuen. Eine wesentlich geringere, allerdings qualitativ von den Resultaten bei ATP-Inkubation nicht abweichende Ablagerung ergab sich nach Zus/itzen von GTP, ADP und IDP. Inkubationen ohne Substrat waren immer negativ. Eine auffallende l~eaktion bewirkte das Angebot yon P N P P als Substrat. Nach 40 min Inkubation mit P N P P konnte, im Gegensatz zu den Befunden mit Nukleosidphosphaten, eine Bleiablagerung im T-System gesehen werden (Abb. 8). DiG lateralen Vesikel waren hier ohne Bleiphosphatniederschlgge.

Abb. 8. L~ngsschnitt dureh den Rumpfmuskel yon Mollienesia nach Inkubation mit p-Nitro- phenylphosphat als Substrat. Die Reaktion ist auf das T-System lok~lisiert. In den lateralen Vesikeln sind nur sehr vereinzelte Bleipartikel. Vorfixierung: OsO 4. 120 ~z-Gefrierschnitt.

Inkubationszeit: 40 min. pH: 7,4. VergrSBerung: 25000:1

Diskussion

Die histochemische Lokalisation yon Fermentwirkungen, ob im licht- oder elektronenmikroskopischen Bereich, wird durch eine vorausgehende Fixierung der Gewebe erschwert. Es ist bekannt, dab ein erheblicher Anteil der vorhandenen Aktivit/~ten bei der Vorbehandlung verschwindet (GoLD~ISCHER, ESSNE~ und NOVIKOFF, 1964; S]~LIGMAN, 1964). Auch die ATP-spaltenden Reaktionen in den verschiedenen Strukturen der Muskelzelle werden davon betroffen. Doch scheinen die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Nukleosidphosphatasen des sarkotubul/iren Systems besonders widerstandsfi~hig zu sein. In isolierten Mikrosomen- fraktionen aus dem Skeletmuskel nach Vorbehandlung sowohl mit Glutaraldehyd als auch mit OsO a fanden sich noch betr/ichtliche Fermentaktiviti~ten (ScHuLZI~

150 W. SCHULZE und A. WOLLENBERGER:

und WOLLENBERGER, 1963; 1965 a). Die Mikrosomenfraktion setzt sich freilich aus den verschiedensten membran6sen Elementen des Muskels zusammen; deshalb kann die dort gefundene Enzymaktivit~t durchaus von einem in hestimmten Abschnitten des sarkoplasmatischen Systems lokalisierten, stabilen Ferment- komplex herrfihren. In dem yon uns untersuchten Material fanden sich mit der beschriebenen Methode, im Gegensatz zu unfixierten lichtmikroskopischen Pr~- paraten (ENGEL, 1963; GAUTHIER und PADYKULA, 1965) und elektronenmikroskopischen Aufnahmen (ZEBE, 1965), nur in den lateralen Zisternen der Triaden Zeichen einer Nukleosidphosphatase-Aktivititt. Die anderen Anschnitte des SR- Systems, ebenso wie die T-Memhranen, wiesen keinc Bleiphosphatablagerung auf. Es hat den Anschein, dab die hier untersuchten Muskelgewebe empfindlicher sind als der unter iihnlichen Bedingungen yon Z]~BE (1965) untersuchte Froschmuskel. Eine gute l~bereinstimmung unserer Ergebnisse ergibt sich mit den elektronenmikroskopischen Resultaten von GAUTHIER und PADYKULA (1965), ESS~ER, No- VIKOFF und QUINTANA (1965), ROSTGAARD und BERNKE (1965). GAUTHIER und PAKYKULA finden nach Vorfixicrung in Glutaraldehyd im Schwimmblasenmuskel von Opsanus tau nur Bleiablagerungen in den lateralen Vesikeln der Triaden, niemals im T-System (Abb. 16 der erw~hnten Arbeit).

In allen unseren Abbildungen von Dfinnschnitten aus dem Muskel von black Mollie ist nach Inkubation im ATPase-Medium eine Bleiakkumulation unmittelbar unter der dem T-System zugekehrten Wandung der terminalcn Endzisterne zu beobachten. Dieser Lokalisationsort ist identisch mit demjenigen des feingranu- 1/~ren bis amorphen Pritzipitats, welches von FRANZINI-ARMSTRONG und PORTER (1964) und REVEL (1962) in diesen Vesikeln beschrieben wurde. Wie schon erwhhnt, sind die lateralen Vcsikel der Bindungsort der fiir den Kontraktionsprozel3 un- entbehrlichen Ca-Ionen. Deshalb wurde die aus isolierten Fraktionen des Skelet- muskels bekannte ,,Calciumpumpen-ATPase" hier vermutet (EBAsItI, 1956; HAS- SELBACH, 1964; HASSELBACH und MAKINOSE, 1961). MAKINOSE und THE (1965) beschrieben kiirzlich zwei verschiedene NTP spaltende Fermentsysteme in isolierten, vesikuli~ren Membranen des sarkoplasmatischen l%etikulums. Diese Fer- mente sind unter anderem durch ihr Verhalten gegen/iber SH-Inhibitoren charak- terisiert. Die ffir den Ca++-Transport verantwortliche Fermentaktivit~t wird durch SH-Blocker unterdrtickt, die basale NTPase-Aktiviti~t bleibt dagegen un- beeinflul3t (s. auch HASSELBACH und SERAYDARIA~ 1966). In der vorliegenden Arbeit wird eine Verminderung, jedoch keine vollsti~ndige Hemmung der ATPase- Aktivit~t nach Zusatz von PCMB und NEM gesehen. Aus diesem Verhalten und aus der lZeaktion gegentiber den angebotenen Nukleosidphosphaten m/il3ten demnaeh beide von MAKINOSE und TItE beschriebenen Fermentsysteme dargestellt worden sein.

Obwohl in der Plasmamembran der untersuchten Muskelzellen eine mehr oder weniger starke Bleiprgzipitation deutlieh zu beobaehten war, blieben die Blei- ablagerungen selbst in den unmittelbar in Naehbarschaft zum Sarkolemm liegenden Teilen der transversalen Tubuli aus. Die der Zellmembran zuzuordnende ,,Trans- port-ATPase" (vgl. SKOU, 1964) wird durch Na + und K+ aktiviert und durch g-Strophanthin gehemmt. Die Plasmamembran der Diaphragmamuskelzelle zeigt, ebenso wie die des Herzmuskels (WOLLENBERGER und SCHULZE, 1966), histochemisch das gleiche Verhalten. Dagegen haben weder Na + und K + noch

Fermente im sarkoSubul/~ren System 151

g-Strophanthin irgendeinen Einflul3 auf die Bleiphosphatbildung innerhalb der Triaden. Demnaeh unterscheiden sich die Membranen des T.Systems histoehe- misch vom Sarkolemm, mit dem sie kontinuierlich verbunden sind. Von einigen Autoren wurde sehon auf unterschiedliche Eigenschaften des Sarkolemms und des T-Systems im Hinblick auf Ionenaustauschvorg~nge hingewiesen (FREYG~_NG, 1965; GIRARDI~,~, R~UB~,N, BRANDT und GRVNDF~ST, 1964; PODOLSKY, 1965). Aus Modellvorstellungen sehloB BVBWNZER (1966) ebenfalls auf physiko-chemische Unterschiede der beiden Membransysteme. Schlief~lich sind Untersehiede hin- sichtlich der ATPase-Aktivit~ten der Zellmembranpr~parate und der im wesentlichen aus Membranteilen des sarkotubul~ren Systems zusammengesetzten Mikro- somen (PonTIUS und Rv, Px~,, 1963; REPXV,, 1965) gefunden worden.

Die in Abb. 8 dargestellte Reaktion naeh Inkubation mit P~qPP kSnnte ebenfalls als Bests untersehiedlieher physiologiseher Eigenschaften der Zell- membran und des T-Systems gewertet werden. JVDAH, AHMED und MCLEAN (1962) fanden in der Membran der roten Blutzelle, EMMELOT und Bos (1966) in der Plasmamembran der Leberzellen eine yon K + abh~ngige, strophanthinempfindliehe Hydrolyse des PNPP. FRV, YGANG (1965) schloi~ aus elektrophysiologischen Experimenten auf eine Kalium-Bewegung innerhalb der Triaden zwischen T-System und lateralen Vesikeh Vielleicht steht die Bleiablagerung im T-System nach Angebot yon P N P P mit dieser Kalinmtransporteigenschaft in Beziehung. Bisher haben wir allerdings keine reproduzierbare Aktivierung der PNPP-Spal tung dureh Kaliumionen oder eine Hemmung derselben durch g-Strophanthin beob- achtet, beides Eigenschaften, welehe ffir die PNPP-Dephosphorylienmg, sofern diese eine Komponente der Aktivit~t des durch Na + und K + aktivierten ATPase- Systems darstellt, charakteristisch sind (vgl. EMMELOT und Bos, 1966). MSglicher- weise wird die dutch Mg++ und K + aktivierte Hydrolyse yon P N P P durch ein Ferment katalysiert, welches mit keinem der Enzyme des dutch Mg ++, Na + und K + aktivierten ATPase-Systems identisch ist (ALBE~S und KOVAL, 1966). DaB in den vorliegenden Versuehen eine Aktivierung der PNPP-Spaltung dutch zu- gesetzte Kaliumionen nicht eindeutig zu beobachten war, mag vielleicht daran liegen, da~ die inkubierten Gewebe noch ausreichende Mengen yon endogenem Kalium enthielten.

Danksaqung. Fiir die sorgf/~l~ige und aufmerksame technische Hilfe bei der Durehfiihrung der Arbeit danken wir Frl. EV~LY~W BO~CK und Frl. H~.IKE SOMMERFELD.

Anmerkung bei der Korrektur. W~hrend der Drucklegung der vorliegenden Arbeit erschien ein Bericht yon GIACOMELLI, BIBB~r BERGA~fr~I und PELr~GRI~I, Nature 218, 679--682 (1967), demzufolge sich in den lateralen Vesikeln des sarkoplasmatisehen Retikulums des Sartoriusmuskels des Frosches neben einer durch Mg ++ aktivierten ATPase eine zusi~tzlieh durch Na + und K + stimulierte, strophanthinempfindliehe ATPase darstellen l~13t. Uns ist es trotz Verkfirzung der Inkubationszeiten und Variierung der Bedingungen der Glutaraldehyd- fixierung nicht gelungen, an den lateralen Vesikeln des sarkoplasmatischen Retikulums des Muskels von Black Mollie eine Na+-K+-abh~ngige, strophanthinempfindliche ATPase-Aktivit~t darzustellen. Wie wir bereits betont haben, kSnnen unsere Ergebnisse keineswegs als Beweis daffir dienen, dall die Na+-K+-aktivierte, durch Strophanthin hemmbare ATPase-Aktivitiit im Muskel ansschlieBlieh an der Plasmamembran des Sarkolemms lokalisiert is$. Nur glauben wir, dab es sehwierig ist, im sarkoplasmatischen Retikulum oder an anderen Stellen im Innern der Zelle neben der relativ stabflen Mg++-ATPase-Aktivit~it die gegenfiber Fixantien und Blei- ionen sehr sensible Na+-K+-ATPase dffferenziell darzustellen.

152 W. SCHtrLZ:E und A. WOLLENRERG:ER:

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Zytochemische lokalisation und charakterisierung von phosphatabspaltenden fermenten im sarkotubulären system quergestreifter muskeln