Zytochemische Lokalisation und Differenzierung von Na+-K+- und anderer membranständiger ATPase-Aktivität im Herzmuskel

Histochemie 19, 302--318 (t969)

Zytochemische Lokalisation und Differenzierung von Na§ +- und anderer membranst/indiger ATPase-Aktivit~it

im Herzmuskel*

W . SCHULZE ~lnd A. WOLLENBERCER

Abteilung fSr Zellbioiogie des [ns t i tu l s fiir Kreislaufforschung der I)euSschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Berlin-Buch

Eingegangen am 23. Mai 1969

Cytochemical Localization and Di//erentiation o/ Na +, K + Dependent and other Membrane-Bound A TPase Activity in the Myocardium

Summary. Assuming tha t the lead precipitation method used in the present s tudy for the cytochemical demonstrat ion of ATPase act ivi ty does not yield artificial results one can demonstra te a t least two enzymes or enzyme systems ATP hydrolyzing a t the different parts of the cell membrane of the myocardial cell. First, a Mg, Na, K act ivated ATPase subject to inhibi t ion by ouabain. This enzyme system is presumably identical with the Na, K transport ATPase. I t is inact ivated by Ca ++ and by SH groups inhibitors and preferably splits ATP, to some ex ten t also ITP. The enzyme act ivi ty is localized a t the plasma membrane of the sarcolemma and not at the basal membrane. Second, an enzyme system which can be demonstra ted in the presence of Mg ++ and also of Ca+% I t is not inhibited by ouabain and does not require Na- and K ions. I t s activity is lowered, though not abolished by sulfhydryl group inhihitors. This enzyme activity is localized at the membranes of the intercalated disks and is particularly active a t the nexus (Fascia and macula occludens). I t may be identical with the Mg stimulated, Na, K independent basal ATPase activity which usually is observed in studies on isolated cell membrane preparations simultaneously with the Na, K t ranspor t ATPase.

Zuzammen/assung. Unter Annahme, dab die hier benutzte Bleipr~cipitationsmethode b e i d e m Nachweis membranengebundener ATPase-Aktivit~ten keine artifiziellen Ergebnis~ce liefert, lassen sich an den verschiedenen Teilen der Zellmembran der Herzmuskelzelle mindestens zwei unterschiedliche ATP spaltende Ferments oder Fermentsysteme darstellen. Erstens sine Mg-, Na- und K-Ionen ben6tigende, dutch g-Strophanthin hemmbare ATPase, die vermutlich identisch mi t tier Na, K-Transport-ATPase ist. Sie wird durch Ca ++ und dutch SH-Gruppen-Inhibi toren unterdrfickt und spaltet vorzugsweise ATP, weniger intensiv ITP. Das Ferment ha t seinen Sitz an der Plasmamembran des Sarkolemms, nicht an der Basal- membran. Zweitens sin durch Mg ++ und auch durch Ca *+ darstelIbares Fermentsystem, das nicht durch Strophanthin zu beeinf]ussen ist und keine Na- und K-Ionen benStigt. SH- Gruppen-Inhibi toren vermindern diese Fermentaktiviti~t, unterdrficken sie abet n icht vSllig. Diese Fermentak t iv i t~ t ist an den Membranen des Glanzstreifens lokalisiert und besonders akt iv am Nexus (Fascia und Macula occludens). Sie k6nnte identisch sein mit der in Unter- suchungen an isolierten Zelhnembranpri~paraten gleichzeitig mit der Na-, K-Transport- ATPase gew6hnlich vorgefundenen, durch Mg ohne :Na und K stimulierten Grund-ATPase- Aktivitgt .

* Abk~rzungen: ATP=Adenos in t r i phospha t , I T P = I n o s i n t r i p h o s p h a t . U T P - - U r i d i n - t r iphosphat , GTP - Guanosintriphosphat, ADP = Adenosindiphosphat, IDP = Inosindi- phosphat , PCMP=p-Chloromereur ibenzoat , NEM=N--~_thylmaleinimid, T r i s=2-Amino- 2-oxymethylpropan-l,3-dio].

ATPase-Aktivit~t im Herzmuskel 303

Einleitung

Nur wenige Gewebe besitzen eiue so vielf~ltige Zellumgrenzung wie die Herz- muskelzelle. Dadurch, dab die Zellmembran die Myofibrillen in der Ls durchtrennt, an anderer Stelle aber nichtfibrill~re Sarkoplasmabereiche durch- zieht und schlieBlieh gegen extrazelluls l ~ u m e Abgrenzungen bildet, sind diese verschiedenen Diiferenzierungen erkl~rbar. Abb. 1 a und b demonstrieren die einzelnen Abschnitte und die yon uns verwendete Nomenklatur. In Anlehnung an KARR~R und Cox (1960) werden nur die zum Interzellularraum liegenden Mem- branen, bestehend aus Plasmamembran und Basalmembran als Sarkolemm be- zeichnet. Der eigentliche Discus intercalaris (intercalated disc, Glanzstreifen) ist der Abschnitt der Zellumgrenzung, der unmittelbar ohne Extrazellularraum und deshalb ohne Basalmembran die Zellc zur benachbarten Muskelzelle abgrenzt. Er besteht aus dem Teil, an dem die Myofibrillen angehcftet sind, den Fascia adherens (,,Intermediate junction, interfibrillar region of attachment of myofibrils", nur dieser wurde yon der klassischen Histologie als Glanzstreifen gesehen), den Desmosomen (Macula adherens) und den zwischen den Fibrillen liegenden Mem- brandifferenzierungen, den ,,tight junction", Nexus oder ,,longitudinal connecting surface" (Macula und Fascia occludens). Hier ist die von FAWCETT (1966) ffir iihn- liche Membranenbildungen in verschiedenen Epithelien gebrauehte Nomenklatur verwendet worden.

Da die verschiedcnen Teile der Zellmembran des tterzens sich sowohl hinsicht- lich ihrer physiologischen Eigenschaften als auch ultrastrukturell unterscheiden, interessierte uns das biochemische Verhalten dieser Abschnitte, vor allem aber die Verteilung der verschiedenen A T Pasen an der Zellmembran. Versuche an isolierten Zellmembranen des Herzmuskels weisen auf die mSgliche Existenz yon mindestens zwei ATPase-Systemen hin, eines, das yon Mg++ und das andere, das yon Mg++, Na + plus K + abhiingig ist (MATsUI U. SCHWARZ, 1966 ; PORTIUS u. REPKE, 1967 a, b). Das letztere System ist durch Herzglykoside hemmbar und ist vermutlieh identisch mit der yon SKOC (1957) zuerst am Nervengewebe entdeckten und sp~ter yon ihm und den oben genannten Autoren am Herzmuskel beschriebenen Na-K- Transport-ATPase. Durch dig Modifikationen der Bleipr~cipitationsmethode yon WAC~IST~ und M~IS~L (1957) gelang es in der vorliegenden Untersuchung, eine spezifische Verteilung und Lokalisation dieses und anderer ATPase-Systeme an den verschiedenen Ahschnitten der Zellmemhran der Herzmuskelzelle nachzu- weisen.

Material und Methodik

Die Versuche wurden in der Regel am linken Ventrikel yon Bastardhunden, Meerschwein- chen, Kaninchen, Wistarratten und Laborm~iusen durchgefiihrt. Mit Ausnahme yore Hund wurden die Tiere mit Nackenschlag bet~ubt, und es wurde ihnen nach Dekapitierung das Herz entnommen. Bei Hunden erfolgte die Herausnahme des Gewebes unter Pentobarbital- narkose bei kiinstlicher Beatmung. Das tterzgewebe wurde sofort in eisgekiihlter, 0,25 m, gepufferter Saecharosel6sung kurz gewaschen, mit CO2-Schnee eingefroren und in 40, 60 oder 120 t~ dicke SchniSte zerlegt. Die Schnitte wurden wie folgt vorfixiert: a) 3 min in 1%iger gepufferter OsO4-L6sung (CAuL]~IELD, 1959) oder b) 5 min in 2,5%igem Glu~araldehyd, gepuffert mit 0,1 m Phosphatpuffer, pH 7,2 (SABATI~I, BE~SeR u. BA~a~ETT, 1963) oder c) 5 min in Formalin nach HOLT und HIcKs (1961). Die letztgenannte Fixierung wurde nicht in allen Priiparationen durehgefiihrt. Die Temperatur der LSsungen war 0 ~ C. Nach der

304 W. SCHULZE und A. WOLLENBERGER:

Abb. 1. a Verlauf der Zellmembran der Herzmuskelzelle mit der Bezeichnung der einzelnen Abschnitte des Glanz- streifens. Ver/4ndertes Schema nach SJ(~STRAND, ANDERSSON tl. DEWEY (1958). Sarkolemm (S) bestehend aus Basalmembran (B) und Plasmamem- bran (P). Der eigentliche Glanzstreifen bildet sich aus den Fascia adherens (Fa), den Macula und Fascia occludens (Nexus, N) und den Macula adherens (Desmosomen, D). b Der Verlauf der Zel]membran in einem normalen Diinn- schnitt aus dem linken Ventrikel eines

Kaninchenherzmuskels. Nexus (N); Fascia adherens (Fa), 18000:1

Abb. 1 a

Abb. 1 b

ATPase-Aktivit~tt im Herzmuskel 305

Fixierung wurden die Sehnitte 20 min in einer mit 0,1 m Phosphatpuffer auf pH 7,2 einge- stellte SaceharoselSsung grfindlich gewaschen und anschliel3end inkubiert. Das Inkubations- medium enthielt, wenn nicht anders angegeben, 12,5 mM Tris, 35 mM Kaliumnatriumtartrat (Seignettesalz), 2,5 mM Magnesiumsulfat, 2,5 mM Bleiacetat, 30 mM Tiron (Natrium 3,5- Brenzkatechinsulfonat) (vgh v. DEI~ILING, 1964) und 2,5 mM ATP-Natrium 1. Der pH der LSsung betrug 7,2--7,4. Von groBer Bedeutung fiir das Gelingen der Reaktion ist die Reinheit der Trissubstanz und des eingesetzten ATP.

Aul3er ATP wurde ITP, UTP, GTP, CTP, ADP und IDP in /~quimolaren Mengen eingesetzt 1.

Um den EinfluB verschiedener Ionen, Aktivatoren und Inhibitoren zu ermitteln, wurde MgSO 4 durch 2 mM CaC12 ersetzt und Na- und K-Ionen in unterschiedlichen Relationen eingesetzt. Die hSchste Natriumkonzentration betrug 150 raM, die vom Kalium 70 mM. In den Experimenten ohne Na und K wurden die im Standardmedium vorhandenen Ionen ausgeschlossen und durch entsprechende natrium- und kaliumfreie Substanzen ersetzt.

Ferner wurde die Wirkung von 2,5 mM PCMB und 1 mM NEM, sowie der Einflu~ yon 1, 0,5, 0,1 und 0,01 mM g-Strophanthin (Ouabain) gepriift. Zu diesem Zweck wurden die Schnitte mit den genannten Reagentien vorbehandelt oder/und gemeinsam mit dem ATPase- Medium inkubiert. Die Vorbehandlungszeiten betrugen im allgemeinen 10 min bei Raum- temperatur, die Inkubationszeiten 2 0 4 0 min bei Raumtemperatur oder 37 ~ C. In einigen F/illen erfolgte eine Vorinkubation mit vollem Medium [fir l0 min bei 0 ~ C.

Naeh der Inkubation wurde grfind]ich in 0,25 m SaceharoselSsung gew~schen und fiir die elektronenmikroskopische Weiterbearbeitung bis 21/2 Std in 1%iger OsOt-LSsung Iixiert. Eingebettet wurde in der Regel in Vestopal W (Firma Jaeger, Geneve), seltener in Araldit (Durcupan ACM yon Fluka, Buehs AG) oder Epon 810 (Serva, Heidelberg). Ultradiinn- sehnitte wurden mit dem Ultrotome 4400 A (LKB) mit Glasmessern angefertigt und die Schnitte ohne Kontrastierung in einem SEM 3 (Standardelektronenmikroskop des VEB- Werk fiir Fernsehelektronik, Berlin-SchSneweide) betrachtet. Die Prim~rvergrSBerung der meisten Aufnahmen betrug 6000-, 10000- und 15000faeh.

Zur Bestimmung des Na- und K-Gehaltes wurden die 60 und 90 tz dieken Schnitte in 25 ml kalter gepufferter SaccharoselSsung ffir 30 120 min gewaschen und in 65%iger Sal- peters~ure unter Erhitzung im Sandbad verascht. Die Messungen der Ionen erfolgten mit dem Flammenphotometer, Modell III, des VEB Carl Zeiss Jena, unter Benutzung yon internen Standards 2.

Ergebnisse Lokalisation der A T Pase. Aktiviti i t

Mit der benutz ten Inkuba t ionsmethode lassen sich ATPase-Akt iv i t / i t en regel-

m/il]ig in den Ze l lmembranen nachweisen. J e nach Inkuba t ionsdauer sind die Bleiphosphatniederschli~ge in diehter Lagerung oder als Einzelpar t ikel an der P l a s m a m e m b r a n gebunden. Die GrSfie der Par t ikel liegt zwischen 50 und 120 A

und ges ta t t e t eine reeht genaue Aussage. Danach ist allein die P lasmamembran , nicht die Basa lmembran , Tr/iger der ATPase-Aktivi t /~t (Abb. 2, 3). Die Blei- phosphatniedersehl/~ge lassen sich in Bezirken mi t geringerer Ablagerung st/~rker

der Innensei te der P l a smamembran zuordnen, wie besonders gut an dem Uber- gang vom extra- zum intrazellul/s Membranenver lauf s iehtbar wird (Abb. 3).

Auch in den selten angeschni t tenen T-Tubul i l~ftt sich die Fermentakt iv i t i~ t der P l a smamembran verfolgen (Abb. 4; T). Wie am Sarko lemm ist die B a s a l

membran ohne Reakt ion.

1. ATP, ADP und ITP wurden yon der Firma Boehringer und Soehne, Mannheim, ITP, UTP, GTP, CTP, ADP und IDP yon Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., bezogen.

2. Herrn Doz. Dr. R. GLASER danken wir fiir die flammenphotometrisehen Na- und K-Bestimmungen der Muskelschnitte.


Abb. 2 ~


Die verschiedenen Teile des Glanzstreifens zeigen mit unterschiedlicher Ver- teilung ebenfalls Bleiphosphatniedersehl~ge. Intensive Bleiablagerungen linden sich unabh~ngig v o n d e r Tierart vor allem in den Nexusabschnitten (Abb. 5, 6). Aber auch die myofibrill~ren Bezirke (Fascia adherens) tragen verstreut und weniger exakt zugeordnet Bleipartikel. In Ultradfinnschnitten, die mittels Ziel- preparation aus Zonen mit geringer Fermentaktivit~t herausgesucht sind, reagieren nur noch die Nexusbereiehe positiv (Abb. 6, N). Alle anderen intramusku- l~tren Membranbezirke sind ohne Zeiehen einer Fermentaktivitiit.

Substratspezi/itiit Im Gegensatz zum Verhalten der Endothelzellmembranen reagiert die Plasma-

membran des Sarkolemms sehr spezifisch nur nach Zugabe yon ATP als Substrat. Vereinzelt wurde eine Reaktion mit ITP gesehen, nie mit ADP (Abb. 7). Aueh ATP, das lange gelagert war und durch spontane Hydrolyse schon erhebliche Mengen ADP enthielt, ffihrte hier zu keiner Bleiablagerung. Der Nexus reagiert jedoch, wenn auch in geringerem Mai~e mit ITP und CTP.

Einflufl yon Ca, Mg, Na, K Die bisher beschriebenen ATPase-Aktiviti~ten der Zellmembran werden unter

Bedingungen sichtbar, in denen Mg-, Na- und K-Ionen vorhanden sind. Die Naehweisreaktion ver~ndert sich jedoeh bei Variation des Ionenangebots.

Nach Inkubation in einem Medium, das Na + und K +, aber kein Mg ++ enth~lt, konnten keinerlei Zeiehen einer ATP-Spaltung an der Plasmamembran des Sarkolemms gesehen werden. Die Reaktion der Endothelzellmembran bleibt aber im allgemeinen zumindest in den Pinozytosevesikel nachweisbar (Abb. 8). Ca ++ kann Mg ++ nicht voll ersetzen. Die Plasmamembran des Sarkolemms zeigt in Ca++-haltigem Medium keine Fermentaktivit~it, jedoch im Glanzstreifen, insbesondere im Nexus, sind ebenso wie an den Membranen der Kapillarendothelzellen Bleiphosphatpartikel vorhanden.

Wenn Mg-Ionen ohne Na + und K +im Inkubationsansatz anwesend sind, kann in keinem der Versuche eine der normalen Inkubation entsprechende Reaktion gefunden werden. An der Plasmamembran sind unter diesen Bedingungen keine, an den intramuskul~ren Zellmembranen wenige Bleiniederschl~ge sichtbar. Dieser Befund ist allerdings nur an Gewebeschnitte gefunden worden, die mindestens

Abb. 2. Sarkolemm mit Basal- und Plasmamembran. Bleiphosphatpartikel sind auf der Plasmamembran lokalisiert. Linker Ventrikel (LV), Hund. 80000:1

Abb. 3. ]:)as Sarkolemm mit der ATPase-Aktivit~t an der Plasmamembran geht in einen intramuskuliiren Membranenabschnitt fiber. Die Fermentreaktion bleibt erhalten. Die Blei- partikel scheinen starker der zellulgren Seite zugewandt zu liegen. Inkubation ohne Tiron.

LV, Maus, 45000:1

Abb. 4. Das Sarkolemm zweier Muskelzellen mit starker Fermentaktivit~t der Plasmamem- bran. Pinozytosevesikel, die aus der Plasmamembran hervorgehen ebenfalls mit Bleiphos- phatpartikeln bedeckt. Die das T-System (T) bildenden Anteile der Plasmamembran besitzen

ebenfalls ATPase-Aktivitiit. LV, Hund. 40000:1

308 W. SCHULZE und A. WoLLENBERGER:

Abb. 5. An den intramuskul/iren Membranen sind vor allem die longitudinal zu den Fibrillen verlaufenden Teile des Glanzstreifens (Nexus) Tr/tger der Bleiphosphatablagerungen. LV,

Ratte. 30000:1

Abb. 6. Auf Schnitten, die aus Gewebsregionen mit geringer Fermentaktivit~t herausgesucht worden sind, ist nur noch am Nexus eine deutliche Fermentreaktion vorhanden. Inkubation

ohne Tiron. LV, Maus. 30000:1


Abb. 7. Inkubation mit ADP als Substrat. Keine Fermentaktivit~t am Sarkolemm. Die Pinozytosevesikel der Endothelzellen reagieren positiv. LV, Maus. 40000:1

Abb. 8. Nur eine schwache Reaktion der Endothelzellmembranen ist nach Inkubation ohne Mg ++ nachweisbar. Die Plasmamembran des Sarkolemms ist negativ. LV, Maus. 20000:1

20 rain in kalter gepufferter SaccharoselSsung gewaschen wurden. Nach dieser Zeit ist der Natriumgehalt des Gewebes flammenphotometrisch nicht mehr nachweisbar und die Kaliummenge unter einen meBbaren Wert yon 3,5 ~M/g Gewebe abgesunken. Die ohne den Waschprozel~ vorhandenen Ionen genfigten, um eine Reaktion zu erhalten. Das Verh/iltnis von Na + und K +, alas bei den quantitativen Versuchen an isolierten Membranfraktionen yon grol~er Bedeutung ist, konnte in den vorliegenden Experimenten innerhalb der in der Methodik angegebenen Grenzen (10--150 mM Na und 5--70 mM K) ohne groSen Einflu$ auf die Blei- phosphatablagerung variiert werden.

EHekt yon Strophanthin

Von grol~er Bedeutung fiir die Differenzierung und Identifizierung der Mem- branen-ATPasen ist die Wirkung yon Strophanthin. Deshalb haben wir in einer grSBeren Zahl yon Experimenten an verschiedenen Tierarten den Einflul~ unterschiedlicher Konzentrationen und Einwirkungszeiten des Strophanthins auf die zytochemisch nachweisbare ATPase-Aktivit/~t im Herzmuskel untersucht.

310 W. SCHVLZE und A. WOLLENBERGER: ATPase-Aktivit/it im Herzmuskel

Abb. 9. ATPase-Reaktion nach 40 rain Vorbehandlung des Gewebes mit l0 -'z m g-Strophanthinl6sung. An der Plasmamembran der Muskelzelle ist keine ATPase-Reaktion mehr nachweisbar. Die Aktivit/~t der Endothel- zellmembranen ver/indert sich dagegen

kaum. LV, Maus. 30000:1

Allgemein kann gesagt werden, dab die gesamte ATPase-Aktivit/~t der Herzmuskel- ze l lmembranen der Maus naeh einer 40minii- t igen Behandlung mit 10 2m g-St rophanth in verschwunden ist. Weder in der Plasma- membran des Sarkolemms, noch in den intramuskul/tren Zel lmembranen, ist danach eine Bleiphosphatablagerung vorhanden (Abb. 9). Eine geringere Glykosidkonzentrat ion ( 10 -4 m) verminder t den Bleiniedersehlag an der P lasmamembran , hat aber keine Wirkung auf die Fermentakt iv i t / i t der interfibrill/s Membranabschni t te , insbesondere des Nexus (Abb. 10a und b). Sic liiBt sieh meistens auch noeh naeh einer Vorbehandlung von l0 3m St rophanth in naehweisen; dann ist aber die P l a smamembran des Sarkolemms vbllig negativ. Eine /~hnliche Glykosidwirkung wie im Herzen der Maus ist aueh an den Membranen der Rattenherzmuskelzel le zu finden. Jedoch ist hier die Reakt ion der P l a smamembran auch mit hohen S t rophan th inkonzen t ra t ionen (10 -2 m) nieht immer vollst/~ndig zu unter- drfieken. Die Nexusregionen verlieren niemals ihre ATP-spal tende Aktivit/~t.

I m Meersehweinchenherzen ist nach einer Vorbehandlung yon 10 -2 m St rophanth in kein Bleiphosphatniederschlag mehr an der P l a smame mbr a n zu beobachten. Wiederum sind die Nexusbezirke der Glanzstreifen davon nicht betroffen (Abb. 11). Am deut- liehsten ist die S t rophanth inwirkung aber am Hundeherzen zu erhalten. Naeh kurzer Vorbehandlung der 60 ~ dieken Gefrier- sehnit te mi t 1 0 - 3 m gepufferter Strophan- thinlSsung und ansehlieSender I n k u b a t i o n im ATPase-Medium, das ebenfalls S t rophanth in enth/~lt, ist die Bleiablagerung fast in allen PrKparaten nur noeh am Nexus zu sehen.

I n allen un te rsuch ten Tieren is~ die Bleiablagerung an den Membranen der Kapi l larendothelzel len dureh die S t rophan th inbehandlung nicht verSndert. Aueh hohe Dosen (10 -2 m) bleiben hierauf ohne Einflul3.

Abb. 10. a Vorbehandlung und Inkubation mit 10 -4 m g-Strophanthin. An der zum extrazellul~ren Raum (ex) liegenden Plasmamembran ist die ATPase-Aktivit/~t vollst/~ndig verschwunden. Die Plasmamembran zwischen den engbenachbarten Muskelzellen zeigt dagegen die normale Aktivit/it. LV, Maus. 30000:1. b Intramuskul~re Membranenabschnitte (Nexus) zeigen intensive Bleiphosphatablagerung, obwoh] mit l0 -4 m g-Strophanthin inkubiert wurde.

LV, Maus. 40000:1

Abb. lOa u. b


Abb. 11. Vorbehandlung und Inkubation mit 10 .3 m g-Strophanthin hat auf die ATPase dcr intrazellul~rcn Membranenregionen, insbesondcrc des Nexus (N) keine Wirkung. Die Bleiphosphatablagerung an der Plasm~membran, die die Zelle zum Extrazellul~iwaum (ex)

begrenzt, ist jedoch verschwunden. LV, Meerschweinchen. 30000:1

El[e/or von SH-Gruppen-Inhibitoren

PCMB und NEM haben auf die ATPase-Darstellung der Herzzellmembranen, /~hnlich wie Strophanthin, eine deutlich hemmende Wirkung. Sie reduzieren sowohl die Bleiablagerungen der Plasmamembran des Sarkolemms als auch die der intermuskul/iren Membranen. Vorbehandlung mit 0,025 m PCMB wirkt dabei ebenso stark hemmend wie Anwesenheit dieser Konzentration im Standard- inkubationsmedium. Der Effekt von NEM ist dagegen weniger deutlich darzu- stellen. Neben Abschnitten mit totaler Hemmung linden sich andere, die eine anns normale Reaktion zeigen.

Diskussion

Zur Kritik der Bleiprdcipitationsmethode des histochemischen A TPase-Nachweises

Die beschriebenen Ergebnisse sind mit der Bleipr~cipitationsmethode erhalten worden. Die eingesetzten Substratkonzentrationen, Aktivatoren und Effektoren sind den aus der biochemischen Literatur bekannten Inkubationsmedien ffir den Nachweis der Aktivit/it membranengebundener ATPasen angeglichen worden. Wie aus der umfangreichen Diskussion der Ietzten Jahre hervorgeht, ist die M6g- lichkeit der topochemischen Darstellung und vor allem der Differenzierung dieset Enzymaktivit/~ten mit der Bleisalzmethodik noch immer umstritten (MosEs u. ROSEI~THAL, 1967, 1968; NOVIKOFF, 1967; BOSe11, SALI~IAN U. ROMnU, 1967; McCLuRKIN, 1967; TORMEY, 1966). Neben der Vorfixierung ist besonders das F~llungsreagenz, das Bleisalz, der begrenzende Faktor der Nachweismethode (NovIKOFF, HAUSMAN• U. POD]3ER, 1958). Wie aus quantitativen Untersuchungen isolierter Membranfraktionen hervorgeht, reagieren die verschiedenen ATP- spaltenden Fermentsysteme unterschiedlich auf Bleiionen. So wird vor allem die yon Mg-, Na- und K-abh~ngige strophanthinempfindliche Transport-ATPase


inaktiviert, die Mg-abhi~ngige Grundaktivit~t dagegen wenig beeinfluBt. Schon 0,01 M Pb ++ sollen die Transport-ATPase vollst~ndig inhibieren (BONTING, CARA- VAGGIO u. HAWKINS, 1962). JACOBSON und JORGENSEN (1968) fanden in Mikro- somenfraktionen der Niere in Gegenwart yon 0,5 mM oder h6herer Bleikonzen- trationen eine totale Hemmung der Na-K-Transport-ATPase, jedoch noch 64% der Mg-ATPase-Aktivit~t.

Nach der Entdeckung, dab Nukleosidphosphate durch Blei zu einer spontanen, nicht-enzymatisch bedingten Hydrolyse angeregt werden (RoSENTHAL, MOSES, B~AVER U. SCHUFFMAN, 1966; MOSES u. Mitarb., 1966) erschien die Bleisalz- methode zeitweilig ungeeignet ftir den ATPase-Nachweis. Inzwischen konnte aber gezeigt werden, dal~ die durch Blei angeregte ATP-Hydrolyse nur unter den unver~nderten Wachstein-Meiselschen Bedingungen (Inkubationen bei 37~ und |angen Zeiten) eine Rolle spielt (NovIKOFF, 1967; JACOBSON U. JO~GENSEN, 1968). Unter unseren Bedingungen (2,5 mM Pb ++, Gegenwart yon Komplexbildern) ist der nichtenzymatische ATP-Zerfall v611ig unbedeutend. Erst bei einer Bleiazetat- konzentration yon 5 mM konnten wir nach 70 rain Inkubat ion eine ca. 7%ige Phosphatfreisetzung aus dem ATP messen. Der Hemmeffekt der Bleiionen ist auch unter unseren Bedingungen mit isolierten Membranfraktionen des t terzens quant i ta t iv best immt worden (PORTIUS U. 10vEPKE, 1967; PORTIUS u. SCttULZE, unver6ff.). Ebenso wie die fibrigen Untersucher sehen wir eine sehr unterschiedliche Beeinflussung der beiden Membran-ATPasen. 0,5 mM Bleiacetat hemmte die Mg, Na, K-ATPase zu 94 % und die Mg-ATPase zu 17 %. In Gegenwart yon Tiron (Brenzkatechinsulfonat), einer Substanz, die mit Blefionen einen Komplex im neutralen pIt-Bereich eingeht und daher die Konzentrat ion der ffeien Blei- ionen herabsetzt (v. DEIMLING, 1964), ist der I temmeffekt wesentlich geringer. Mit 2,5 mM Bleiacetat konnte unter Inkubationsbedingungen mit Tiron nur noch eine 15%ige t t emmung der Mg, Na, K-ATPase und eine 30%ige Inakt i - vierung der Mg-ATPase nach 1 Std Inkubat ion gemessen werden. Auch unter Annahme einer zusi~tzlichen tIerabsetzung der Fermentakt ivi t~t durch die kurze Vorfixierung (GOLDFISCHER, ESSNER U. NOWKOFF, 1964; SCHULZE U. WOLLEN- BERGER, 1965) sollte t rotzdem noch mit einer ausreichenden und darstellbaren Aktivit~t der Membranen-ATPasen zu rechnen sein. Beispiele daffir sind durch Untersuchungen an verschiedenen Geweben geliefert worden (BARTOSZEWICZ u. BARRNETT, 1964; COLE, 1964; McCLuRKIN, 1964; NOVIKOFF, 1964; FARQVHAa~ U. PALADE, 1966; KAYE U. TICE, 1966; MARCHES~ U. PALADE, 1967; SABATINI, DIPOLO U. VILLEGAS, 1968; TORACK U. BARRNETT, 1963; NOVIKOFF, ESSNER, GOLDFISCHER U. HEUS, 1962).

Zur Lokalisation der A T Pasen

Tritger der Fermentaktivit/~t der Zellmembran der Herzmuskelzelle ist immer die P lasmamembran und nie die Basalmembran. Die Gr61~e der Bleipartikel (50--100 A) gestattet eine exakte feinstrukturelle Zuordnung. Danach ist die ATPase-Aktivit~t gleichmi~l~ig fiber die Membran verteilt. Auf einigen Bildern, insbesondere an Stellen, an denen zwei Plasmamembranen ohne Basalmembran zusammenliegen, scheint, wie nach biochemischen Vorstellungen zu fordern w/~re (WHITTAM, 1962; OHT U. CHARLOCK, 1965; ALBERS, 1967), eine st~rkere Ab- lagerung an der Innenseite der Membran vorzuliegen.

23 Histochemie, Bd. 19


Zur Di//erenzierung der A T Pasen

Unsere ATPase-Aktiviti~tsnachweis ist teilweise nur m6glich in Gegenwart yon Mg++-Ionen. Bei Ersatz durch Ca ++ ist die sarkolemmale ATPase nicht darstellbar und die Reaktion in den interfibrill~ren Membranen auf den Nexus beschri~nkt. Au~erdem reagieren die Membranen der Pinozytosevesikel der Endothelzellen (ScttULZE u. WOLLENBERGER, 1969).

Der Glanzstreifen und seine verschiedenen Teile verhalten sich auch auf den Einsatz yon Na- und K-Ionen und die Zugabe yon Strophanthin andcrs als das Sarkolemm. Die Bleiablagerung an der Plasmamembran ist nur zu beobachten, wenn neben Mg ++, Na + und K + vorhanden sind. Im Gegensatz zu quantitativen Untersuchungen an isolierten Mikrosomen- und Zellmembranpr~paraten, konntc zytochemisch kein optimales Verhi~ltnis yon Na- zu K-Ionen ermittelt werdcn (vgl. SKOU, 1965; REPKE, 1965).

Seit der Entdeckung der Hcmmbarkeit des aktiven Natrium- und Kalium- transportes dutch Herzglykoside (ScHATZMANN, 1953), die wic SKOU gezeigt hat, der Na-K-Transport-ATPasc zugeschrieben werden kann, ist der Mechanismus dieser Hemmung eingehend untersucht worden (GLYNN, 1964). R]~rKE (1964) und R]~]'KE und PORTIUS (1963) sehen die Transport-ATPase als den spezifischen Digitalisrezeptor an (vgl. WOLLENBERGER, 1967). Nach unseren zytochemischen Untersuchungen l~Bt sich eine Strophanthinhemmung nur eindeutig an der durch Mg-, Na- und K-aktivierten ATPase-Aktivit/it der Plasmamembran des Sarko- lemms nachwcisen. Allerdings gelingt die Hemmung nur nach entsprechender Vorbchandlung des Gewebes mit relativ hohen Glykosiddosen (10 -a m), die in quantitativen Untersuchnngcn der Glykosidwirkung als unphysiologisch anzu- sehen wi~ren (WOLLENBERGER U. SCHULZE, 1966). M6glicherweise ist unter unseren Versuchsbedingungen eine nahezu 100%ige Hemmung der ATP-Spaltung er- forderlich, damit das Auftreten yon Schwiirzungen ausbleibt. Es ist interessant, dab der Herzmuskel des tIundes zytochemisch besser auf Strophanthin anspricht als der Herzmuskel der Ratte. Diese Bcobachtung kSnnte als Ausdruck der Speziesabh~ngigkeit der Digitalisempfindlichkeit gewertet werden, die auf Unter- schiede der Na-K-Transport-ATPase beruhen soll (REPKE, EST U. PORTIUS, 1965). Trotz hoher Strophanthinkonzentrationen wurde yon uns hie ein vollst/~ndiges Verschwinden der Bleiphosphatablagerungen an den Nexusbereichen (Fascia occludens, tight junction) gefunden. Auf Grund dieses Verhaltcns sowie dcr beob- achtcten Reaktionen auf das Angebot anderer Nukleosidtriphosphate als Sub- strate und auf Zugabe von Calciumionen und SH-Gruppen-Inhibitoren kaml angcnommen werden, dal~ an diesen Zellmembranabschnitten mindestens zwei ATPasen lokalisiert sein mtissen: a) Ein durch Zugabe yon Mg- und von Ca- Ionen darstellbares Ferment und b) die Mg-, Na- und K-ATPase, deren Aktivitiit aber vSllig maskiert wird durch die wesentlich aktivere und gegenfiber Vorbe- handlungen unempfindlichere Mg-ATPase. Es ist aber durchaus wahrscheinlich, da~ die Mg-, Na- und K-ATPase an den intrafibrilli~ren Membranen der Glanz- streifen fehlt. Denn in Kaliumdiffusionsversuchen konnte WEIDMANN (1961, 1966) am Glanzstreifen eine 5000mal schnellere Permeation des K + feststellen als es ftir den Austritt yon markicrtem Kalium durch die fibrige Zelloberfl/~che der Fall war.

ATPase-Aktivit~it im Herzmuskel 315

Die Glanzstreifen wfirden demnach kein Hindernis ffir die Ausbreitung der Er- regung yon Zelle zu Zelle darstellen (WooDsu~Y, 1962 ; WEIDMA~N, 1967). Beson- ders bevorzugte Bindeglieder zwischen benaehbarten Herzzellen sind die Nexus- abschnitte. Bei partieller Zerst6rung des Glanzstreifens mittels hypotoner Sac- charosel5sung (BARR, B~RO~.~ u. DEWEY, 1964, 1965; DEWEY u. BAI~, 1964; DI~EIFUSS, GIRAXtDIEt~ U. FORSSMANN, 1966) oder Behandlung mit EDTA (KAwA- MURA U. KONISHI, 1967) wird die Erregungsausbreitung nur dann verhindert, wenn der Nexus zerstSrt ist. Aus diesen Untersuchungen kann geschlossen werden, dos der Nexus a]s Ort der Kaliumdiffusion von einer Zelle in die andere in Frage kommt. Versuchen an Erythrozyten zufolge besteht ein aktiver, energieverbrau- chender Transport von Na + und K+ nur bei grol~en Kaliumkonzentrations- differenzen (TosTESON, 1963; G~EFF u. Mitarb., 1964). Demnaeh w/ire ein voll- sts Fehlen der No-, K-Transport-ATPase in den Glanzstreifen kein iiber- raschender Befund.

I m Gegensatz zu unseren Befunden am Skelettmuskel (ScHuLZE U. WOLLV, N- ]3~I~OER, 1967) fanden wir in den vorliegenden Experimenten auch eine intensive Fermentaktivi t / i t an den Membranen des T-Systems. Allerdings kann die Frage nach dem Vorhandensein der Transport-ATPase an diesen Membranen im Augen- blick noch nicht beantwortet werden. Aus unseren eytoehemischen Ergebnissen und den vorhandenen physiologischen Untersuchungen m6chten wir schllel3en, dal] die Na-K-Transport-ATPase an der Plasmamembran des Sarkolemms lokalisiert und dab eine zweite ATPase, deutlieh zu unterseheiden yon der ersteren, an den Glanzstreifen, insbesondere am Nexus gebunden vorliegt.

Fiir die sorgfitltige und aufmerksame Hilfe bei der Durchffihrung der Arbeit danken wit Frl. EVELYN BOLICK und Frl. I-IEIKE SOMMERFELD.

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Zytochemische Lokalisation und Differenzierung von Na+-K+- und anderer membranständiger ATPase-Aktivität im Herzmuskel