Bernhard-Strigel-Gymnasium Kollgestufe Jahrgang:......2007/2009Memmingen Leistungskurs:.....................Biologie Kollegiatin:..................Nadja Kühne
Facharbeit
Blau-Weiß-Selektion
Abgegeben am: 30.01.2009
Bewertung:
Facharbeit: Note: __________ Punkte: __________
Mündliche Prüfung: Note: __________ Punkte: __________
Datum und Unterschrift des Kursleiters: ____________________________________
Eingetragen in das Kursblatt: _____________________________________________
INHALTSVERZEICHNIS
1. Einleitung ............................................................................................................................... . 3
2. Material
2.1 Verwendete Chemikalien ................................................................................................ . 5
2.2 Verwendete Gerätschaften ............................................................................................... . 5
3. Methoden
3.1 Herstellen von LB-Agarplatten ........................................................................................ . 6
3.2 Anlegen einer Übernachtkultur ........................................................................................ . 6
3.3 Plasmidpräparation
3.3.1 Einführung ................................................................................................................ . 6
3.3.2 Durchführung ............................................................................................................ . 7
3.4 Nachweis durch die Agarosegelelektrophorese
3.4.1 Einführung ................................................................................................................ . 8
3.4.2 Durchführung ............................................................................................................ . 9
3.5 Blau-Weiß-Selektion
3.5.1 Herstellen der Chemikalien ...................................................................................... 10
3.5.2 Durchführung ............................................................................................................ 10
4. Auswertung
4.1 Plasmidpräparation ........................................................................................................... 11
4.2 Blau-Weiß-Selektion ........................................................................................................ 12
4.3 Anwendung der Cracking-Methode .................................................................................. 12
4.4 Durchführung der Plasmidpräparation .............................................................................. 13
5. Nachwort ................................................................................................................................ 14
6. Literaturverzechnis................................................................................................................ 15
6.1 Literaturquellen ................................................................................................................. 15
6.2 Internetquellen ................................................................................................................... 15
7. Abbildungsverzeichnis ........................................................................................................... 16
8. Erklärung des Kollegiaten..................................................................................................... 17
3
1. Einleitung
Thema meiner Facharbeit ist die Blau-Weiß-Selektion, die auch unter dem Namen
„Alpha-Komplementations-Test“ bekannt ist. Das Prinzip der Blau-Weiß-Selektion beruht
auf der „einfachere[n] Selektion der gewünschten Klone nach einer Klonierung.“
(MÜHLHARDT, 2003: S. 130)
Plasmide besitzen eine so genannte Klonierungsstelle, die zur Aufnahme von
Fremd-Desoxyribonucleinsäure (Fremd-DNA) mehrere Schnittstellen enthält, weshalb man
von einer „multiple cloning site“ (MCS) spricht. Durch die Klonierung eines DNA-Fragments
kann ein Gen über diese Klonierungsstelle deaktiviert werden. Genau dies geschieht bei der
Blau-Weiß-Selektion, bei der das lacZ-Gen, ein Gen der β-Galactosidase, durch die Insertion
von Fremd-DNA unterbrochen wird. Das Markergen lac-Z enthält die kodierende Sequenz
für das N-terminale α-Fragment der β-Galactosidase, welches aber „alleine keine
β-Galactosidase-Aktivität besitzt“ (MÜHLHARDT, 2003: S. 130) Um diese Aktivität
herzustellen, müssen Komplementäre verwendet werden, die im Genom die kodierende
Sequenz für das C-terminale Fragment der β-Galactosidase enthalten. Dies wird als
„α-Komplementation“ bezeichnet. Die Zugabe des Induktors Isopropyl-1-thio-β-D-Galaktose
(IPTG), der am Repressor bindet, führt dazu, dass die Transkription des lacZ-Gens
freigegeben wird und das Enzym β-Galactosidase produziert werden kann. Der Indikator
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-Galaktosid (X-Gal), ebenfalls auf den Agarplatten
ausgestrichen, wird durch dieses Enzym „unter Freisetzung eines blauen Farbstoffes
gespalten“ (www2.vetmed.uni-muenchen.de, 2007 a: S.11).
Bakterien, die pUC18 enthalten, „sind ampicillinresistent und besitzen überdies eine
funktionsfähige β-Galactosidase“ (KNIPPERS, 2001: S. 291), weshalb sie auf den Agarplatten
blaue Kolonien bilden.
Abbildung 1: pUC-Plasmid
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Durch die Insertion von Fremd-DNA wird jedoch die Transkription des lacZ-Gens
unterbrochen, es kann keine β-Galactosidase mehr gebildet werden, es führt zur Bildung von
weißen Kolonien auf den LB–Agar–IPTG–X-Gal–Platten.
Abbildung 2: Vorgang der Blau-Weiß-Selektion
Abbildung 3: Kolonienbildung der Blau-Weiß-Selektion
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2. Material
2.1 Verwendete Chemikalien
• LB–Zubereitung (Firma Merck)
• Agar-Agar
• destilliertes Wasser
• Bakterien „Escherichia coli“
• Kulturmedium
• TAE-Puffer
• Gelladungspuffer
• QIAamp DNA Mini Kit (Quiagen AG)
• DNA Längenstandard "Gene Ruler™ 1kb DNA Ladder" (Fermentas)
• Ethidiumbromidlösung
• Agarose
• IPTG
• Ethanol (100 %)
• X–Gal
• Dimethylformamid
2.2 Verwendete Gerätschaften
• Laborwaage
• Pipette mit sterilen Spitzen
• Mikrowelle
• Magnetrührer
• Schüttler
• Zentrifuge
• Vortexer
• Agarosegelkammer mit passendem „Kamm“
• Spannungsquelle
• UV-Leuchttisch
• Autoklav
• Bunsenbrenner
• Drigalski–Spatel
• Impföse aus Platin
• Kühlschrank
6
• Heizblock
• Autoklav
3. Methoden
3.1 Herstellen von LB–Agarplatten
Zur Herstellung der Agarplatten wird die von der Firma Merck vorgegebene Menge der
LB-Zubereitung für 500 ml Fertigmedium abgewogen und anschließend 7,5 g Agar-Agar und
500 ml Wasser, gemäß dem Labor-Protokoll von Herrn Schmitt, hinzugefügt. Diese
Mischung wird nun in der Mikrowelle zum Kochen gebracht und mit dem Magnetrührer
gerührt, bis eine klare Lösung entsteht. Danach wird bei 121 °C autoklaviert und auf ca. 60 °C
abgekühlt; das nun noch flüssige Medium wird vorsichtig in sterile Petrischalen gegossen, die
Schalen mit einem Deckel verschlossen und auf Raumtemperatur abgekühlt. Anschließend
können die Agarplatten in einer Plastiktüte im Kühlschrank aufbewahrt werden. (Vgl.:
SCHMITT, 2005: S. 13)
3.2 Anlegen einer Übernacht–Kultur
Hierzu werden die Bakterien E.coli mit Hilfe einer sterilen Pipettenspitze in ein mit 3 ml
Kulturmedium gefülltes Reagenzglas gegeben. Zunächst pipettiert man ca. 5 µl Ampicillin in
das Kulturmedium, damit nur Bakterien mit funktionsfähiger Ampicillin-Resistenz überleben.
Eine neue sterile Pipettenspitze wird anschließend kurz in die Stammkultur eingetaucht und
ohne Berührung des Reagenzglases und des Eppendorfcaps, in dem sich die Bakterien
befinden, abgeworfen; danach wird das Reagenzglas mit einer Aluminium–Kappe
verschlossen und bei ca. 37 °C über Nacht und unter Schütteln inkubiert. (Vgl.: SCHMITT,
2005: S. 13)
3.3 Plasmidpräparation
3.3.1 Einführung
„Plasmide sind zirkuläre, doppelsträngige DNA–Moleküle, die sich unabhängig vom
bakteriellen Genom in Bakterien vermehren können.“ (MÜHLHARDT, 2003: S.129) Sie
bestehen aus einem Replikationsstart (origin of replication), einem Selektionsgen und einer
Klonierungsstelle. Da sich Plasmide sehr leicht isolieren und einschleusen lassen, haben sie
sich zu einem bedeutenden Hilfsmittel in der Molekularbiologie entwickelt.
Ziel der Plasmidpräparation ist die reine Isolation eines Plasmides aus einem Bakterium, um
„sie außerhalb der Zelle (in vitro) und in gereinigter Form, d.h. frei von anderen
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Zellbestandteilen wie Proteinen, Enzymen und Lipiden, vorliegen zu haben.“
(www.genetik.uni-koeln.de, 1996 a)
Hierzu wird zunächst die Zellmembran der Bakterien durch das Detergens
Natriumdodecylsulfat (SDS) zerstört, weshalb man von einer alkalischen Lyse spricht. Zur
Abtrennung unbrauchbarer, großer Substanzen, wie z.B. chromosomale DNA und
Zelltrümmer, sowie durch Zentrifugation und Zugabe von Hochsalz, erhält man eine
verunreinigte Plasmidlösung. Diese wird schließlich durch die Reinigungssäule des
Quiaprep–Kits und der Bearbeitung mit ausgewählten Puffern von Proteinen und Puffersalzen
gelöst, bis man eine gereinigte Plasmidlösung erhält. (Vgl. Abbildung: www.nugi-zentrum.de,
2006 a)
3.3.2 Durchführung
Die Durchführung der Plasmidpräparation erfolgt nach dem Handbuch des Quiaprep–Kits,
das bereits im Vorjahr von der Kollegiatin Martha Dziuk zur einfacheren Durchführung
übersetzt wurde. (Vgl.: QUIAGEN, 2003: S.22 ff)
Dazu werden 1,5 ml der am Vortag angesetzten Übernacht–Kultur mit Escherichia coli
(E.coli), die das pUC18–Plasmid enthält, mit Hilfe einer Pipette in ein steriles Eppendorfcap
überführt. Die Bakterienlösung wird 5 Minuten zentrifugiert (13000 rpm) und der Überstand
anschließend verworfen. Das entstandene Pellet wird nun mit 250 µl des Puffers P1 so lang
resuspendiert, bis keine Zellklumpen mehr sichtbar sind. Nun werden 250 µl des Puffers P2
hinzugefügt und die Bakterienlösung 4–6 mal zum Mischen gedreht. Dieser Schritt muss
zügig, aber vorsichtig durchgeführt werden, damit die DNA nicht zerrissen wird. Es entsteht
eine dickflüssige, leicht durchsichtige Lösung. Bei Bedarf muss das Eppendorfcap öfter
gedreht werden, die Lyse darf jedoch nicht länger als 5 Minuten dauern. Anschließend werden
noch 350 µl des Puffers N3 hinzugefügt und die Lösung wieder 4–6 mal gedreht, es sollte
eine trübe Lösung entstehen. Diese Lösung wird 10 Minuten zentrifugiert; es entsteht ein
festes, weißes Pellet. Der Überstand, der das Plasmid enthält, muss nun mit Hilfe einer
sterilen Pipettenspitze in eine QIAprep-Säule überführt werden, die in einem neuen sterilen
Eppendorfcap steckt. Daraufhin wird 30–60 Sekunden zentrifugiert und der Durchlauf, der
Proteine und Puffersalze enthält, verworfen. Nun muss die Reinigungssäule mit 0,5 ml des
Puffers PB gewaschen und 30–60 Sekunden zentrifugiert werden. Dieser Schritt wird
nochmals mit 0,75 ml des Puffers PE durchgeführt. Der Durchlauf wird entfernt und die
Reinigungssäule nochmals 1 Minute zentrifugiert, um den Puffer PE vollständig zu entfernen.
Die QIAprep-Säule wird nun in ein neues steriles 1,5 ml Eppendorfcap gesteckt und
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anschließend 50µl Wasser hinzugefügt, um einen Durchlauf mit Plasmid–DNA zu erhalten.
Dieser Schritt kann alternativ auch mit 50 µl des Puffers EB durchgeführt werden; wir
verwendeten jedoch Wasser, um bei der Gelelektrophorese ein besseres Ergebnis zu erzielen.
Die Lösung wird 1 Minute stehen gelassen und anschließend 1 Minute zentrifugiert. Der nun
entstandene Rest, der sich im Eppendorfcap befindet, ist die Plasmid–Lösung.
Abbildung 4: Durchführung der Plasmidpräparation mit Hilfe eines Kits
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3.4 Nachweis durch die Agarosegelelektrophorese
3.4.1 Einführung
„Die Agarose–Gelelektrophorese ist die einfachste und effektivste Methode, mit der
DNA-Fragmente zwischen 0,5 und 25 kB Länge voneinander getrennt und identifiziert
werden können.“ (SCHMITT, 2005: S. 20)
Durch das Anlegen eines elektrischen Feldes wandern die negativ geladenen DNA-Fragmente
durch das Agarosegel, das aus Agarose und Elektrophoresepuffer besteht, zur positiv
geladenen Anode. Die Geschwindigkeit der Fragmentwanderung durch das Gel ist abhängig
von deren Ladung und Größe. Je kleiner das DNA-Fragment ist, umso schneller kann es sich
durch die Poren des Gels bewegen.
3.4.2 Durchführung
Die Durchführung der Agarosegelelelektrophorese erfolgt nach dem Labor-Protokoll von
SCHMITT (2005: S.20 ff)
Zur Herstellung eines 1%-igem Agarosegels werden 0,2 g Agarose abgewogen und mit dem
TAE-Puffer auf 20 ml in einer Glasflasche mit Schraubdeckel aufgegossen. Um einen
Siedeverzug zu vermeiden, gibt man einen Rührfisch in die Flasche und kocht das Gel unter
Beobachtung in der Mikrowelle auf; hierbei sollten Handschuhe getragen werden. Das heiße
Gel wird nun vorsichtig in die Gelkammer gegossen und der Kamm eingesetzt, anschließend
lässt man es abkühlen, bis es leicht trüb wird. Der Kamm kann nun entfernt und das Gel mit
TAE-Puffer bedeckt werden, bis die Taschen gefüllt und das Gel leicht bedeckt ist.
Nun werden 5 µl der Plasmid-Lösung mit 2µl Gelladungspuffer in einem sterilen
Eppendorfcap gemischt, einige Sekunden zentrifugiert und in die Taschen des Gels pipettiert.
Hierbei sollte beachtet werden, dass das Gel nicht durchstochen wird. Links und rechts der
Plasmidlösungen werden zur Identifizierung der Fragmente jeweils 5 µl des Längenstandars
„1kb DNA Ladder" (Fermentas) in eine Tasche pipettiert. Nun wird eine Spannungsquelle
angeschlossen; dabei ist die Polung zu beachten und auf maximal 7 Volt Spannung je
Zentimeter Elektrodenabstand anzulegen. Die Elektrophorese ist beendet, wenn die blauen
Banden fast das Ende des Gels erreicht haben. Die anschließende zehnminütige Färbung des
Gels in der krebserregenden Ethidiumbromidlösung und das Übertragen auf den
UV-Leuchttisch wird durch den Versuchsleiter durchgeführt.
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3.5 Blau – Weiß – Selektion
3.5.1 Herstellen der Chemikalien
IPTG Konzentrierung 1-fach, gebrauchsfertig
Volumen 1 ml
Zusammensetzung: Subatanz Menge Molarität Molekulargewicht Lieferfirma, Bestellnummer
IPTG 30 mg/ml 126 mM 238,3 g/mol Fluka, 59740
Ethanol 100% 1 ml -- 46,07 g/mol Fluka, 02855
Herstellung: Bei -20°C aufbewahren. Für Blau-Weiß-Screening je 40 µl auf den Agarplatten ausplattieren.
Sicherheitsdatenblatt IPTG, Ethanol
Abbildung 5: Herstellung von IPTG
X-Gal
Konzentrierung 1-fach, gebrauchsfertig
Volumen 1 ml
Zusammensetzung: Subatanz Menge Molarität Molekulargewicht Lieferfirma, Bestellnummer
X-Gal 20 mg/ml 49 mM 408,6 g/mol Fluka, 16665
Dimethyformamid 1 ml -- 73,1 g/mol Merck, 02855
Herstellung: Substanz lösen und bei -20°C lichtgeschützt aufbewahren.
Anwendung: Für Blau-Weiß-Screening je 40 µl auf einer Agarplatten mit einem Drigalskispatel ausplattieren.
Sicherheitsdatenblatt X-Gal, Dimethylformamid Abbildung 6: Herstellung von X-Gal
3.5.2 Durchführung
Zur Durchführung der Blau–Weiß–Selektion werden die unter Punkt 3.4.1 in der Tabelle 1
und 2 angegeben Substanzen in einem sterilen Eppendorfcap gemischt und mittels einem
ebenfalls sterilen Drigalski-Spatel zu jeweils 40 µl auf den schon hergestellten
LB-Agarplatten (ohne Ampicillin) ausplattiert; die Agarplatten werden anschließend 30
Minuten stehen gelassen.
Beim nächsten Arbeitsschritt werden die E.coli-Bakterien aus der am Vortag angesetzten
Übernachtkultur mit Hilfe einer Impföse aus Platin auf den LB–Agar–IPTG–X-Gal–Platten
ausgestrichen. Um die Impföse zu sterilisieren, taucht man sie zunächst in Ethanol, glüht sie
im Bunsenbrenner aus und lässt sie abkühlen. Anschließend wird die sterile Impföse in die
Bakterienkultur eingetaucht und gemäß dem Muster in Abbildung 4 auf der Platte
ausgestrichen. Die Öse sollte zwischen den 5 Schritten immer wieder ausgeglüht und
anschließend abgekühlt werden. Danach sind die Platten mit Parafilm zu verschließen und bei
37 °C im Brutschrank zu inkubieren. Am nächsten Tag kann das Ergebnis abgelesen werden.
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Abbildung 7: Ausstreichschema
4. Ergebnisse und Fehleranalyse
4.1. Plasmidpräparation
Die Plasmidpräparation, die S. Funk, N. Makowski und die Autorin am 23.10.2008 im Labor
des Bernhard-Strigel-Gymnsiums durchführten, ergab ein zwiespältiges Ergebnis, da die
Banden der Plasmid-Lösungen beim Nachweis durch die Agargelelektrophorese nicht
ansatzweise die durch den Marker „1kb DNA Ladder" im Gel vorgegebene Länge des
pUC18-Plasmids erreichten. Das Plasmid pUC18 besitzt 2686 Basenpaare (bp). Das bedeutet,
dass unsere Proben in der Reihe des Markers, ausgewertet durch die dazugehörige Legende,
zwischen dem 7. und 8. „Strich“ der Bande liegen müssten. Wie STUPPERICH
(www.nugi-zentrum.de, 2006 b) eingehend erläutert, findet man häufig „auch einen diffusen
Schmier, der bei kleinen Fragmentlängen auftritt“. Dieser „Schmier“ ist auch in unserem
Ergebnis deutlich sichtbar und könnte darauf zurückzuführen sein, dass unsere verwendeten
Bakterien zu wenig Plasmid enthielten.
Überlegung: Unterlief uns als Laborneulingen ein Fehler bei der Durchführung der
Plasmidpräparation, oder waren die Bakterienstämme und der Quiaprep-Kit fehlerhaft?
Ein kleiner Fehler unterlief uns auch bei der Reinigung der Plasmidlösung mit den
ausgewählten Puffern, da wir anstatt wie oben geschrieben, zunächst den Puffer PE und
anschließend den Puffer PB der Plasmidlösung hinzufügten.
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Eine weitere Fehlerquelle könnte gewesen sein, dass das Wasser unseres Labors, welches wir
bei den gesamten Experimenten verwendeten, zu sauer war.
Abbildung 8: Ergebnis der Gelelektrophorese vom 23.10.2008
4.2 Blau-Weiß-Selektion
Die Blau-Weiß-Selektion, die ich am 13.11.2008 im Labor des Bernhard-Strigel-Gymnasiums
durchführte, erbrachte leider keine Ergebnisse. Nachdem ich, wie vorgeschrieben, 40 µl des
Induktors IPTG und 40 µl des Indikators X-Gal auf meinen LB-Agarplatten ausgestrichen
hatte, stellte ich die Platten bei ca. 37 °C in den Inkubator und wartete bis zum nächsten Tag
auf das Ergebnis, doch bereits wie im Vorjahr waren nur weiße Kolonien sichtbar. Da X-Gal
lichtempfindlich ist, bewahrte ich meine Platten noch einige Tage abgedunkelt auf, doch auch
die veränderte Lagerung führte nicht zu dem erwarteten Ergebnis. Es stellte sich erneut die
Frage, wo die Ursache des Fehlversuchs liegen könnte. Da die Chemikalien IPTG und X-Gal
vom Labor erst neu gekauft wurden, schieden diese Chemikalien als Fehlerquelle aus.
4.3 Anwendung der Cracking-Methode
Um den Problemen auf den Grund zu gehen, führten wir am 4.12.2008 eine von Herr
SCHMITT verkürzte Form der Cracking-Methode durch. (Vgl.: www.nugi-zentrum.de, 2006
c)
„Im cracking-Verfahren werden Bakterien aus Kolonien oder aus Flüssigkulturen im
cracking-Puffer aufgeschlossen. Dieser Zellaufschluss wird in der Agarosegelelektrophorese
analysiert. Nach Anfärben des Agarosegels mit Ethidiumbromid erkennt der Experimentator,
ob Plasmide in den Klonen vorhanden sind oder nicht.“ (www.nugi-zentrum.de, 2006 d)
Wir verwenden also das Verfahren, um festzustellen, ob in den Bakterien unseres Labors
überhaupt oder genügend pUC18-Plasmid vorhanden ist.
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Zunächst wird 2 Minuten 50 µl einer am Vortag angesetzten Übernachtkultur in einem
Eppendorfcap abzentrifugiert, der Überstand verworfen.
Anschließend fügen wir, im Gegensatz zum Autor der Nugi-Homepage, statt den
vorgeschriebenen 50 µl, 75 µl Aufschlusspuffer hinzu, und verwenden den TE-Puffer nicht.
Dieser Ansatz wird nun 5 Minuten lang bei 70 °C auf dem Heizblock gekocht, sodass sich die
Zellklumpen auflösten. Zur Abkühlung werden die Eppendorfcaps mit der Lösung 5 Minuten
in ein Eisbad gelegt. Danach zentrifugiert man 5 Minuten, pipettiert den Überstand, der die
Plasmide enthält und 2 µl des Gelladungspuffers in ein neues steriles Eppendorfcap.
Mit Hilfe unserer Plasmid-Lösung und einem Marker führten wir dann nochmals eine
Agargelelektrophorese durch.
Abbildung 9: Ergebnis der Gelelektrophorese vom 4.12.2008
Wie die Abbildung 9 deutlich macht, war das Ergebnis der 2. Gelelektrophorese noch
schlechter. Von unseren Plasmid-Proben war nur der Ansatz im Gel leicht zu erkennen, eine
Wanderung durch das Gel zur positiven Anode hat jedoch nicht stattgefunden. Auch die
Banden des Markers waren nur sehr schwammig zu erkennen.
Beide Ergebnisse zeigten aber, dass der Fehler bei den Bakterien unseres Labors liegen
müsste. Nach weiteren Überlegungen entschlossen wir uns, mit neu bestellten Bakterien und
einem neuen Kit erneut eine Plasmidpräparation durchzuführen.
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4.4 Durchführung der Plasmidpräparation
Die Plasmidpräparation, die wir am 17.12.2008 vornahmen, führte dann schlussendlich am
8.01.2009 durch die Agarosegeleleklektrophorese zum optimalen Ergebnis, wie die
Abbildung 10 zeigt. Somit waren wir uns sicher, dass der Fehler bei den Bakterien unseres
Labors liegen müsste.
Abbildung 10: Ergebnis der Gelelektrophorese vom 8.01.2009
Die Bakterien, die ich bei der Durchführung meiner Blau-Weiß-Selektion verwendete, waren
defekt oder enthielten zu wenig Plasmid, das sowohl zu den weißen Kolonien der
Blau-Weiß-Selektion als auch zum Ergebnis der Plasmidpräparationen führte. Um mit den
neuen Bakterien nochmals eine Blau-Weiß-Test durchzuführen, fehlte im Anschluss leider die
Zeit für weiterführende Laborversuche.
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5. Nachwort
Da ich aufgrund meines Stundenplans am Labor-Praktikum bei Herrn Schmitt in der 12.
Jahrgangsstufe nicht teilnehmen konnte, war für mich der Einstieg in die Labormethoden
etwas erschwert. Die Laborleiter, Herr Schmitt und Herr Weber, waren jedoch stets bereit,
mich nach intensiven, vorangegangenen Studien im Internet und des Labor-Protokolls zu
unterstützen. Nach einigen Anfangs- und Verständigungsschwierigkeiten mit der
Labormethode gelang es uns mit oben genannter Unterstützung, die Fehlerquellen dennoch zu
erkennen und die Grundlagen für das Verständnis mikro- und molekularbiologischer
Denkweisen zu legen.
Die Facharbeit hat dazu beigetragen, meine Erkenntnisse zur theoretischen und praktischen
Vorgehensweise in der Gentechnik deutlich zu erweitern; trotz Fehlversuchen hat mir die
Beschäftigung mit diesen Themen viel Freude bereitet.
Meinen Lehrkräften danke ich für die wertvolle Unterstützung.
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6. Literaturverzeichnis
6.1 Literaturquellen
1) Facharbeit: DZIUK Martha, 2008: Herstellung kompetenter Zellen und Nachweis
durch Blau-Weiß-Selektion
2) KNIPPERS, Rolf, 2001: Molekulare Genetik. 8. Auflage. Stuttgart: Thieme Verlag.
ISBN-10: 3134770083
3) MÜHLHARDT, Cornel, 2003: Der Experimentator. Molekularbiologie/Genomics. 4.
Auflage. München: Spektrum Akademischer Verlag. ISBN 3-8274-1460-1
4) SCHMITT Patrick, 2005: Einführung in die Grundarbeitstechnicken der
Molekularbiologie
5) QUIAGEN, 2003: „QIAprep® Miniprep Handbook“ Cat.No.27990.
6.2 Internetquellen
1) www.genetik.uni-koeln.de, 1996 a: MENZ, Volkmar: Plasmidpräparation mittels
Kochlyse (Nährbodenplatte). [Stand: 28.01.2009]
http://www.genetik.uni-koeln.de/teaching/lehramt/material/menz/kap52.html
2) www.nugi-zentrum.de, 2006 a: STUPPERICH, Erhard: Netzwerk Universität
Gymnasium Industrie, Ulm. [Stand: 28.01.2009]
http://www.nugi-zentrum.de/pdf_Dateien/Plasmid/Plasmidisolierung_erklaerg
3) www.nugi-zentrum.de, 2006 b: STUPPERICH, Erhard: Netzwerk Universität
Gymnasium Industrie, Ulm. [Stand: 28.01.2009]
http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Molekularbiologie/Agarosegel/
Diskussion.html
4) www.nugi-zentrum.de, 2006 c: Stupperich, Erhard: Netwerk Universität Gymnasium
Industrie, Ulm. [Stand: 28.01.2009]
http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Molekularbiologie/cracking/Methode.html
5) www.nugi-zentrum.de, 2006 d: Stupperich, Erhard: Netzwerk Universität Gymnasium
Industrie, Ulm. [Stand: 28.01.2009]
http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Molekularbiologie/cracking.html
6) www2.vetmed.uni-muenchen.de, 2007 a: S.11. [Stand: 28.01.2009]
http://www2.vetmed.uni-muenchen.de/tiph_c//Vorlesungen/chNukl.pdf
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7. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: bearbeitet: OSPRIAN, Ingrid: Labordiagnostik in der Molekularbiologie.
[Stand: 27.01.2009]
http://biomed.umit.at/upload/methoden_ss06_part10.pdf
Abbildung 2: bearbeitet: http://www.bioworkx.de: Klonieren Teil A. [Stand: 27.01.2009]
http://www.bioworkx.de/PDF/02%20Klonieren%20A.pdf
Abbildung 3: BITTNER, Diana, FLEMMING, Katrin und RAFF,
Johannes Dr.: Forschungszentrum Dresden Rossendorf. [Stand: 27.01.2009]
http://www.fzd.de/db/Pic?pOid=23357
Abbildung 4: Plasmidisolation mit Hilfe eines Kits, von Autorin erstellt
Abbildung 5: STUPPERICH, Erhard: Netzwerk Universität Gymnasium Industrie, Ulm. [Stand:
27.01.2009]
http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Allgemeines/Rezepte_Medien.html#IPTG
Abbildung 6: STUPPERICH, Erhard: Netzwerk Universität Gymnasium Industrie, Ulm. [Stand:
27.01.2009]
http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Allgemeines/Rezepte_Medien.html#X_Gal
Abbildung 7: bearbeitet: SCHMITT, Patrick: Einführung in die Grundarbeitstechniken der
Molekularbiologie. [Stand: 27.01.2009]
http://www.strigel.de/biotech/download/kursskript.pdf
Abbildung 8: Ergebnis der Gelelektrophorese im Labor des Bernhard-Strigel-Gymnasiums
vom 23.10.2008
Abbildung 9: Ergebnis der durchgeführten Cracking-Methode im Labor des Bernhard-Strigel-
Gymnasiums vom 4.12.2008
Abbildung 10: Ergebnis der durchgeführten Plasmidpräparation im Labor des Bernhard
Strigel Gymnasiums vom 8.01.2009
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8. Erklärung des Kollegiaten
Ich erkläre, dass ich die Facharbeit ohne fremde Hilfe angefertigt und nur die im
Literaturverzeichnis angeführten Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Bad Grönenbach, den 30.01.2009 ……………………………………………… (Unterschrift des Kollegiaten)