Download pdf - Der Stoffwechsel der Folsäure und der Einkohlenstoffeinheiten

KLINISCHE WOCHENSCHRIFT 41. JAHRGANG, HEFT 21 1. NOVEMBER 1963

U B E R S I C H T E N

Der Stoffwechsel der Fols~iure und der Einkohlenstoileinheiten Von

L. J A ] ~ c x E und W. W~L~A~SS

Aus dem Physiologisch-Chemischeu Institut der Universitgt KOln, Abteilung ffir Enzymcheraie (Leiter: Prof. Dr. L. JA]~CKE) un4 der Medizinischen Klinik der Universitiit Tfibingen (Dh'ektor: Prof. Dr. tL BOOK)

Die Aufklgrung des Wirknngsmeohanismus eines Vitamins erregt die 0ffen~lichkeit zwar welt weniger als seine Entdeckung oder Synthese; trotzdem ist es ffir die medizinische Wissen- schaf~ ebenso wichtig, zu wissen, wie und weshalb diese Ver- bindungen ihre Funktion erffillen, wie ihre ehemische Kon- stitution zu erkennen. Erst wenn alle drei Fragen gekl~rt sind, ist unser Wissen um das Vitamin vollst~ndig und kann in der Praxis Nutzen tragen. Unter den Avitaminosen nehmen die makrocytgren Angmien ~ eine Sonderstellung ein, denn sie sind symptomatiseh und gtiologisch fiberaus komplexer Natur. Mehrere der wasserl6sliohen Vitamine der B-Gruppe sind an der Blutbildung synergistisch beteiligt: Folsgure, Vitamin BI~, Pyridoxal und Thiamin.

Folsgure und Folsdgure.Mangel-Erseheinungen Die Fols~ure ist den Egmatologen indirekt seit den Beob-

achtungen von W~ns °~ fiber die ~herapeutische Wirkung der Leberdigt bei Angmien bekannt. Im Anf~ng der vierziger Jahre haben dann unabhgngige Arbeitsgruppen den Wirkstoff aus versehiedenen Quellen isoliert, naehdem ein~aehe mikrobiologische Analysenverfahren gefunden waren, um die An- reieherung aus dem n~tfirlichen Muterial zu verfolgen ~9, s~, ss, ~s,s~,sa. Die folsgurereiehs~en Gewebe sind Leber, Here und einige Pflanzen. Knrz darauf warde die KonstiSu$ion der Sub- s~anz aufgeklgrt had fast gleichzeitig auch ihre chemische Synthese mi~geteilt% Folsgure* is~ 2-Amino-4&ydroxy-6- pteridylmethyl-p-aminobenzoyl-L-glutamins~ure (~ormel I);

OH I ~ COOH

u ~ " - , , , / 5 ~ . . . - - C Ha~ N H-~< >z--CO ---i-, N H - C H DI 6" I ,~ II 81 9 , ~o ' , ~ - - ~ , .-..

H P'N~I~/%"N~ ~OH ,~,--D-/m/~D- I

aezzoesaa:e-~, , v . , - - p - A m l n o - b e i s z o g l - .. ,, i ~IE/am, insdms . !

,i " P/e:a/'~sdum -- i ! l i

I

I.. Ple/'ogl~/ulam/xxs~hx,e -- i //Folsd'ure #

¢1)

das Molekfil ist also aus einem Pterin- und einem p-Amino: benzoyl-peptid zusammengese~zt, die fiber eine Kohlenstoff- brficke verknfipft sind. p-Aminobenzoesgure bildet somit den zentralen Tell der Molekel, und ihre bekarm~e Vitaminfunktion ffir vide pathogene Mikroorganismen miindet damit in die- jenige der ~olsgure ein.

Man glaubte zun~chst, in der Folsgure das l~nge gesuchte wirksame Prinzip der Leberextrakt-Therapie bei verschiedenen Formen schwerer An~mien entdeckt zu haben, mul~te aber bald seine ttoffnungen zurfickstecken: Die Folsgure hat nur einen begrenzfmn praktisehen Anwendungsbereieh, und die eigentlieh wirksame Substanz bei perniziSser Angmie ist das

* Dieser Name, der ursprfinglieh ein nieh~kristallines, wirksames Konzentrat aus Spinatblgttern bezeichmete, wird jetzt allgemein auf die Pteroyl-glutaminsiiure ~ngew~ndt. Er sollte aber im Pr'mzip als generischer Name der g~nzen Klasse yon der Pteroyl-glutaminsgure abgeleiteter Cofgktoren vor- behalten bleiben.

Xlin. Wschr., 41. Jahrg .

Vitamin BI~ , das in uns noeh nieht zu fiberblickender Weise in den Stoffwechsd eingreift und zusammen mit der Folsgure bestimmte Vorggnge der zellnotwendigen Biosynthesen kata- lysier~ 2~.

Nach ern~hrungsphysiologisehen Beobaehtungen an hShe- ten Organismen ist Fols~ure an zahlreiehen Stoffwechsdvor- ggngen mittelbar beteiligt. Wenn nieht besondere t~esorptions- stSrungen auftreten, genfigt die mit der Nahrung aufgenom- mene Vitaminmenge ffir den ~ggliehen Bedarf. Aueh sind manche Darmbakterien zur Bildung der Folsgure fghig.

Indirekte sehwere Symp~ome eines Folsgnremangels - - fiber den geschgdigten Nucleins~ure-Stoffweehsel - - sind im blutbfldenden Knochenmark StSrungen der Leuko-, Erythro- nnd Thrombocytopoese, in den grol3en KSrperdriisen die Be- eintrgehtigung der Bfldung yon Antik5rpern, also der allgemeinen t~esistenz, schlieBlich sogar kongenitale Mil3bfldungen.

Alle diese Symptome eines ph~notypiseh manifest ge- wordenen Folsguremangels habea ihre molekulare Grundlage im Versagen bestimmter enzymatischer Vorg~nge.

Die Beziehungen zwischen Vitaminen und dem Stoff- wechsel lassen sich besonders klar bei Mikroorganismen un~er- suchen. Bei ihnen mit~elt man einmal fiber ungeheure Popula- tionen, zum anderen lassen sieh die Waehstumsbedingungen ldar definieren und reproduzieren ~.

WooDs 90 postulierte bereits 1940, dab p-Aminobenzoesgure ein essentieller Wnchsstoff ffir Bakterien is~ und dal~ die Sul- fonamide als Struk~uranaloge aufgefaBt werden mfiB~en, die das Wachs~um der Bakterien dadurch hemmen, dab sie mit p-Aminobenzoesgure um ein Enzym konkurrieren, das im Normalfall p-Aminobenzoesgure im Stoffweehsel handhabt. Diese Auffassung is~ gl~nzend bes~tig~ worden. Fols~ure- auto~rophe Bakterien, Helen und Pilze brauehen p-Amino- benzoesi~ure und ffigen sie in das Molekfil der Folsi~ure ein. Die 8ulfonamide unterbinden die Biosynthese des Vitamins; ~'ols~uregaben fiberwinden die Sulfonamidhemmnng nicht- kompe~itiv. Folsiinreanaloge dagegen greifen in die Nu~zung der biologisch aktiven Formen der Folsi~ure ein. Die Angriffs- orte dieser beiden Antime~aboli~en sind also versehieden, die Wirknng kann aber in vielen F~llen gleieh sein.

Den anfgngliehen Befunden folgte eine solche Answeitung und Vertiefung unseres Wissens auf diesem Gebiet, da$ die Sulfonamide und die Folsiiure-Antagonisten heute zu den Paradebeispielen der S$offweehselinhibi~orea und ihrer Wir- kung gehSren. Diese Ergebnisse sind eines der brillantes~en Kapitel der Chemotherapie und in der klinisehen Li~eratur auf das eindrfictdiehste kommen~iert.

Fols6ure als Co/aktor der Einkohlen~to//-Ubertragungen Die ttemmung des Wachstums durch Chemotherapeutiea

nnd seine Wiederaufnahme dureh essentielle Nghrstoffe gibt in vielen Fgllen eine indirekte, abe r tdare Antwort fiber die Zusammenh~nge zwischen Vitaminen nnd enzyma$isehen Reaktionen. Mit der darauf beruhenden Methode der ttem- mungsanalyse ~and W. Sm-v:~ ~, dab sulfonamidhemmbare, d. h. p-Aminobenzoes~ure- bzw. Fols~ure- abhgngige Reaktionen nacheinander zu Methionin, Purinen, Serin und Thymin ffihren. In allen diesen l~eaktionen greifb p-Aminobenzoe- s~ure oder Fols~ure durch Einffigen eines einzigen Kohlenstoff- atoms in einen Vorli~ufer ein.

Diese l~eaktionen werden durch Enzyme katalysiert, die sich weitverbreitet im Gewebe in weehselnden Konzen~r~tionen linden. Die meisten unserer Untersuehungen wurden mit Enzymen ~us Mikroorganismen oder Tieren ~usgeffihrt. Doch spgtere Versuehe zeigten, dab sieh die Ergebnisse auf den

72

1030 L. g~n~io~:n und W. WIL~IA~CS : Der Stoffwechsel der Fols~ure und der EinkohlenstoffeinheRen Klinische Woehenschrift

mensehlichen Organismus fibertragen lassen und dab Aktivi- taten und Meehanismen in allen Fallen identisch sind.

Die KSrpersubstanz is~ nich% statisch, sondern erhalt sich dutch s~etes Auswechseln yon Molekiilen oder Molektil- gruppen 7°. Die Stoffwechselbausteine werden an Co[aktoren zu den Orten der enzymatischen Umsetzungen transportiert. Diese Cofaktoren oder Transportmetabolite haben als in~e- grierenden Bes~andteil ein Vi%amin, dessert biologische Wirk- samkei~ hier ihre Grundlage ha~. Die hier spezie11 behandelten Folat-Coenzyme sind also die enzymatische Wirldorm der Fo~s~iure. Folsaure selbst ist aber nieht der biologische Co- ~aktor tier Einkohlenstoffreaktionen 2s. Wie auch bei anderen Vi~aminen muB deren Molekiilerst zum Coenzym umgewandelt werden. Die haufig Ms Coenzym F bezeichnete~ Molekel ist die 5,6,7,8-Tetrahydrofolsaure (Formel III) oder tin davon ab-

OH O,H H H~R

Ft~N'~.N/\N/~" H H H

7, 3 - #ikEdro- 5, 8, 7, # - Telr~ihEdi,o-

fols#'um fols#om (g) (~)

(bemerke." Asymmetfl'~- xen/num ~n C-~/)

R =-~CO-NH.CH (CO0 H}-(CH2)2.C00H

geleite~es Glu~amyl-peptid, ein sog. Konjuga%. Diese Konjugate, die drei mid sogar seehs Glutamylreste tragen, kommen welt verbrei~eb in der Na%ur vor. Das Triglutamat [Teropterin (V/)] s~ellt den Hauptanteil der mikrobiellen Fo]a%verbindungen ~-°, und seine Cofaktor-Derivate besitzen of~ eine signifikant hShere Ak~ivit£%. Im Gewebe des Menschen jedoch fiberwiegt das Monoglutama$, die Fols~ure, und has dort auch die volle Wirksamkeit. Vermutlieh werden die Konjugate zur Resorp- tion ohnedies ers$ durch spezifische Konjugasen zu Fols£ure gespalten und in dieser Form fiber das Blur in Leber und Knochenmark ~ransportier%.

Biogenese der Folsiiure Die Bfldung des Vitamins aus den l~onstituierenden

lYIolekiilhalften konnte in Coli-Bakterien verfolgt werden ~, flit die Folsaure nieh~ essen~iell is~, wohl aber p-Aminobenzoe- saure (Formel III). Ein dihydrierter PterinMkohol (IV) wird

OH OH . CH2OP~OFH3. N ~fl'-~'N:~/CH~ OH . ~ N ~

Z-Am/zo-#-hydfox#-d/h#dro- Z-Aml'/7o-#-h]dCoxff-d/'/z~/dfo- p t e~/ ~}y - G- c d r b />/ o 7 f l ter/ ~z - G- c ~rh / ~ o / -~y ~ph m~hat

2~I/oz- + HgN-CsH~-CO'R #m/de

N CHa

(.~r) [HI H~N N H H ~,8-#z'k#_droio/~#ure

~ )

mit ATP in das Pyrophosphat (V) umgewandelt. Dies konnf0e isoliert und mi~ synthe~ischem Material ~4 vergliehen werden. Die Syn~hese des Pyrophosphats erfolgt durch direk~e Pyro- phosphorylierung des PterinMkohols und anschliel~ende Re- duk~ion mittels Dithionit. In einem weiteren enzymatischen Sehritt wird das sehr reaktionsf£hige DihydropteridyLpyro- phosphat mit p-Aminobenzoyl-r,-glutamins~ure zu Dihydro- fols£ure (IIa) konder~sier~. Diese wurde isoliert und ihre co- enzymatische Wirksamkeit nach weiterer Reduktion zu Tetra- hydrofols£ure (III) nachgewiesen. Tabelle 1 fa$t einige der Versuche zusammen. Auch andere AnMoge der p-Amino- benzoes/iure, wie p-Aminosalizyls£ure, kSnnen durch dieses Enzymsys%em in fols~ureartige Molekfile eingebaut werden 2% st

Tabelle 1. Biosynthese von ,,Folat"- Verbindungen

:~olsiiure- Ansatz Xquivalent

nMol

Komplet~ . . . . . . . . , . . . Ohne ATP . . . . . . . . . . . Dihydropterinpyrophosphat

start Dihydropt~erin, ohne ATP Dihydrop~erinmonophospha%

start Dihydropterin . . . . . . Dihydrop~erinmonophospha%

s~att Dihydropterin, ohne ATP Zusa%z yon 10 -4 M Sulfonamid .

10,0 0

8,5

7,0

Der Ansa~z (pH = 7,8) enthalt 20 #Mol Tris-HC1, 5 #Mol MgCI~, 2 #Mol ATP, 0,08 #Mol Dihydropterin, 1 #Mol p-Amino- benzoylglutamins~ure, 10 #~oI Mercaptoathanol, 0,55 mg Enzym (12faeh angereiehert), Gesamtvolumen 0,5 ml. Inku- bation 60 rain bei 37 °. Mikrobiologische Bestimmung mit Streptococcus faecMis 1%. (Pterin = 2-Amino-4-hydroxypteri- din-6-earbinol).

In analogen Versuchen hat SHIOTA 72 diese Ergebnisse ~iir Lactobaeillus plantarum bes~itig~. Nach Untersuchungen yon BRow~ ~ ist der Kondensa%ionsschri~t mit p-Aminobenzoesaure oder p-Aminobenzoyl-L-glutaminsaure die S%ufe, bei der die Sulfonamide eingreffen. Damit wird eine zuerst yon TscH~.- scH]~ ss. aufgestellte Hypothese der Sulfonamldhemmung be- s~a~igL

Auch die Bfldung der Konjuga~e der Fols~ure (VI) wurde in zellfreien Bak~erienextrakten verfolgt ~. Ver-

OH N.-~/N~CH2 -- .sO 'r ]l F'-, H, \NH-~" ~r-C~/+NH-OH-COOH

H " ' ~ N J ~ ' N "~n ~ ~ '

,CH~

CH~- CH~-CH-NH+C~BH~-OH~- OH -NH OOOH COOH ~OOH

# Po/sdu/;e -/fon,/'#,~c#"

f(onj'u#as~ )

wendet wurden hierzu Extrakte des Anaerobiers Clostridium eylindrosporum, bei dem der Cofaktor nach Arbeiten yon HI~]~s u. R~]~INOWITZ 62 ausschlieBlich als Triglu%amat vor- lieg%. Die VerlEngerung der Seitenkette erfordert~ auBer Glut- aminsaure und Folsi~ure ATP Ms Energiedonator. Es entsteh% ein Gemisch versehiedener Konjugate, under denen aber das Triglutama~ (VI) weitaus dominier%. Der Nachweis erfolgte dureh mikrobiologisehe Analyse naeh Chromatographic an Austauschercellulose~, ~5. Neben diesen Konjugaten sollen auch solche natfirlich vorkommen, die andere Aminos~iuren tragen100,1%

Die biosynthetisch en~s~andene Dihydrofolsaure, aber auch die aus natfirlichem Material isolierte oder ehemisch synthetisierte Folsaure, mu~ reduzier~ werden, bevor sic biologisch aktiv wird. Es gib~ zwei Euzym-Schri~%e, die die n6tigen Hydrogenierungsstufen ausffihren: Fols~ure-Reduk~ase [1] und Dihydrofolsaure-Reduktase [21%15,1°2.

F 4- TFNH + H+ ~ " FH2 + TPN + [i]

FI t 2 + TPNH + H + . " F H 4 + TFN + [2]

Das erste System addiert~ zwei Wasserstoffatome an den Pteridinring, im zweiten wird die Reduk~ion des Pyrazinrings vollstandig, so dab 5,6,7,8-Tetrahydrofolsaure entsteh~. Dabei entsteh~ ein Asymmetriezen~rum an C-6; wenn die Reak~ion ehemisch ausgefiihrt wird, wird ein Gemiseh der beiden 6-Diastereomeren der Te%rahydrofols~ure gebflde~. Nur eins yon ihnen ist biologisch aktiv, l~euerdings haben ZA~nZ~WSKI und NICHOL 10~ gezeig~, dM~ die beiden Reduktase-l~eaktionen in Rat~enleber durch das gleiche Enzymsystem ausgefiihr~ werden, da die Aktivitaten fiir Folsaure und Dihydrofols£ure sieh dutch enzymchemische Verfahren nich% trennen lie2en.

gg. 41,/{eft 21 L. JAv.~ZOKV. und W.Wzr.~ax~c~S: Der Stoffwechsel der Falsi~ure und der Einkohlenstoffeinheiten 1031 1. November 1963

Allgemein ist das Reduktionsmittel TPNtI, das Substrat der Reduktasa 7,8-Dihydro.fols/~ure. Folatreduktase wurde aus Sgugetierleber auf das 15- bis 20faehe angereiahart. Es sei jedoch hier darauf hingewiesen, dab in unreifen Leukoeytenvor- stufen nur eine Dihydrofolatreduktase [2] gefunden wurde~S% Alle diesa Enzyme sind fiberaus empfindlieh gegan Folsgure- Antagonisten, wie wai~er unten n~her ausgeffihrt wird.

Der Einkohlensto//-,,pool" Das Substrat der Folatanzyme sind die Einkohlenstoff-

einheiten, die kleinsten Bausteine der Zelle. Wir rectmen zu ihnan alle Molekiile mit einem einzigen Kohlenstoffatom auf den Oxydationsstufan der Ameisens~ure, des Formaldahyds und des Methanols.

Es erhebt sich zung-chst die Frage, weber komman die Einkohlanstoff-Fragmante, was tun sie im Stoffwaehsal, und wie warden die katalytisahen Prozesse in StSchiometrie und im Maahanismus volbracht ? Dureh Isotopanv, arsuehe naeh dam Vorbild S c ~ 6 ~ r ~ s ~s, 70. ~0 ist bekarmt, dag die beiden star- ken Zellgifte ~ormiat und ~ormaldehyd frei in dar Zelle nJcht vorkommen, dab aber die fl-Hydroxymethylgruppe des Serins sich in airier ganzett Anzahl yon KSrperbausteinan nach Gabe der markiertea Verbindung wiederfindet. Serin stellt also einen gebundenen, entgifteten, abar leicht varf/igbaran Fomaldehyd dar nnd kann allgamein Ms das Stoffweehselreservoir dar Kohlenstoff-Fragmente betraehtet warden. Diese werdan um- gewandalt, fibertragan und ffir die -zersehiedenen Synthese- prozesse der Zelle verwendet. Schema 1 varanschauliehg, dab die 3/[ethylgruppe des Mathionins, Cholins und Thymins, die

@ (CH3)3N-OH2.CH~OH /'h o//#

/ ° OH3 HN)L~'CH3 S(CH~)~'CHNH~.COOH 0~"~ ~ lqethionin Thy~/n

CHgOH /~H20H CHNH~' o . / . . ,¢ (~HNH~.COOH. I ~ , / / I #'er]n o?o, I 1 / l) ePI,,7 , # ~ '~E~, / , /~ /~ .~Z: . .o~,o / '~ r " "~ .. NH~

Amgsens6u_~-~ i " ~ N % HCOOH 8CH

H2CO Aden/z ~zmaldeh~vd

Z u - u n d AMIUsse des g~kohlensfotf-

/@serP'o/'Ps

HN.~CH20H OJ-.U2

H ~-t/b' ~xymeth#lcylos/n

OH N~J-~..N~

H2NAJ~N.JL.N~CH H

Guan/n

Schema 1

H~NHO-O~H~..N~ ooHq.. :H

H His//#l~

TPNH TPN ~

COOH " ~OOH ~ C O O H Oxals#ure Oxa~/-CoA COa G/g~/z(/s#u~e

~ H20H ,,. CHzOH CHO c.=o !H OH

COOH COOH COOH Hudfox U- Y##zon-

Zerin bren~lra#beo- ~/@.hyd- S~Lil~ SC/Upe

~#dun~ von Serl'Z ~us Oxu/~t /b Pseudomonas sp.

Schema 2

mug; dashalb ist diese Methode, 1/~ngerkettige Kohlenstoffvar- bindungen zu bilden, ein enargetisch nngfinstigar Vorgang.

Es scheint jadoeh m6glieh, dab ein ~hnlicher Reaktions- ablauf, der dann abar aus der allgemeinan Stoffwechselenargie erhalten wird, auch im h6heren Organismus ffir die Bildung des Serins und damit dar Einkohlenstoffeinheiten, Bedeutung hut.

Die ,,aktivierte" Einkohlensto]]einhdt Bei Inkubation yon Leberhomogena~en mit Tetrahydrofol-

s~ure, einem energialiefernden System und eiaem dar oben Ms Donatoren der Einkohlenstoffeinheitan bezeichneten Zellbausteine baobachCeten wit ~ , 66 das Auftreten fluoreseierendar 10-Formylfols/iure als Indiz der Einkohlenstoff-tTbartragung (Tabelle 2A). Setzt man den Homogenaten 10-Formylfols~ure und einen geeigneten Accepter zu, wird die Formylgruppe an diesen zu einam neuen Stoffwechselbaustein ge- btmden, und der Cofaktor wird frei (Tabe]le 2 B). Die Leberhomogenate enthalten also in 16slicher Form die ffir die verschiedenen Umwaiadlungen er- forderliehen Enzyme. Sic kOnnen daraus angerei- chart nnd nntersuch$ werden, so dab man heute die meisten yon' ihnen recht gut kennt.

Die Bindung des Einkohlenstoffrestes an die Fols~ure ben6tigt ATP-Energie. Wir bezeichnaten daher das bei diesen Reaktionen gebfldete gemeinsame Einkolflenstoffzwisehenprodukt - - zungehst olme :Kenntnis seiner chemisehan K o n s t i t u t i o n - als ,,aktivierte Ameisens/~ure" trod den Cofaktor, in Analogie zum acetatiibertragendan Coenzym A, als ,,Coenzym ~F ~' 6~.

Als zentrMes Problem ergab sich natfirlich die Frage nach der molekularen Konstitntion und der bioehemisehen Bfldung dar ,,aktiviarten Ameisen- s~ttre". Es wurde sehr bald klar, dab es eine ganze Anzahl ,,aktivierter" KoMenstoff-Fragmanta

3/Iethingruppe der Purine und einige andere Substanzen die aus dem #-Kohlenstoff stammende Narkierung an den bezeichneten I Stellen tragen. Aus diesen in vivo-Versuehen war bereits er- kannt worden, dub die fl-I-Iydroxymethylgruppe bei diesen t)bertragungsvorggngen nicht frei wird, und man sehlo8 daher auf einen Trggermeehanismus.

Die angedeuteten Beakgionert sind in tier Zella der hSheren Organismen umkehrbar. Zucker, Fetts~uren und Nuclein- ] I s/iuren kSnnen alle mittelbar fiber Serin fin odar mehrera Kohlenstoffatome zum Einkohlenstoff-,,pool ''ga beisteuern, aus dam die Einkohlenstoffreaktionen gespeist warden. Die Bildung des Serins selbst ist ein noah nicht yell geldgrter Vor- gang, der vermutlieh fiber phosphoryliertes Pyruvat und Glycerat l~uftlL Bei Mikroorganismen dagegen gibt as klarere Varh~ltnisse, da sieh manche yon ihnen durch ihren hoeh- speziMisierten Stoffweehsel, der ilmen das ~berleben unter sehr einseitigen Verhgltnissan ermSglicht, auf wenige, gut zu fibersehande Beaktionen beschr~nkt haben.

Eine solche Reaktionskette bei einem Oxalsgure als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle banntzendan Mikroorganismus der Species Pseudomonas s~ zeigt das Schema 2. Sin ffihrt fiber Oxalyl-CoA44,~9, s° und Glyoxyls~ure zn Tartronsemialdehyd, der mit ttydroxypyruvat im Gleichgewicht steh$. Die Sehritte ban6tigen Energie, die hier aus der Spaltung und Oxydation des grSBtan Tells der Oxalsiiure zur Verffigung gestellt warden

Tabelle 2. Bilanz der aeroben Einkohlensto//- t)bertragungen 26

Serin Zeit

rain ~Mol

30 0,26 Spur 0,21 0,04

60 0,12 0,06

600 0,10 5,0 0,18

120 0,23

Glycia

~1~ol

10-Formyl-fols~ure % Standard-Fluorescenz

ohne ] mit

Y~'idoxalphosphat

20 45 80 200 90 420

380 230 120

Ansatz A enthiilt in 1,0 mh 0,26#Mol L-Serin, 0,5/~Mol Fols/iura, 1 #Mol ATP, 5 #Mol Pyruvat, 5 #Mol Citrat, 66 #Mal K-phosphat-Puffer p~I 7,6, 50 #Mol Thioglykolat, 0,3 mg TPN +, 10 #?¢Iol MnSO4, 0,15 ml Schweineleberextrakt (35000 g-t3berstand diMysiert). Inkubation aerob, 36 °.

Am Ende des Versuehes wurdan 5,0 #Mol Glycin zugegeben (Ansatz B) und waiter inkubiert.

Sarin wurde dutch Perjodatoxydation, Glycin dureh Ninhydrinoxydation, 10-Yormyl-fols~ure fluorometriseh gegen Chininsulfat als Standard bestimmt.

72*

1032 L. JA:~mKE und W . W ~ N ~ s : Der Stoffwechsel der Fols~ure und der Einkohlenstoffeinheiten Klinische Wochenschrilt

gibt. Die Bearbeitung dieses Komplexes hut zu den folgenden Ergebnisse gefiihrt: Vier direkte Wege sind bekannt ~, es,~l, dutch die ein biogenes KohlenstoHatom enzymatisch mit der TetrahydrofolsEure verkniipft werden kann. Sic sind in Sche- ma 3 zusammengestellt, n~mlich: 1. die Reaktion mit pc-

OH I H /NI~,CsH~_CO_5IzI~m~71 ~z~QT__h:__c£_- ~ -

/ ®i;ao,,\ ~2C0/fir'S_. cH(N- ~ , +HCOOH

/ "~'- £-fofmlm/no-PH~

iCHzx ~CH\ H I -N /N-221:H]/N$ ,,N- -+. HeO

rc~ - "r -c~ -/"'r-c~ N - - "

Jl (Y"zO /'/etke"zyI-FHn)

~/±~zo /OH 3 H /.CHO H

/N'.[_cH(N- /N-,,r_CHg/N-

a"-/Ve//~#/- F H ~ 5-Fo/,mg/- F H ~ ( ~ ) ( ~//foYoru~fcE@p)

(£r-)

iVa/Z/fll~ vofkommecde Te/f~/iEdmPokzt- i2eflk~/e

Schema 3

lo-~/'myI- FH~

tentiellem l%rmaldehyd zu Methylen-tetrahydro~o]sEure (VIII) und daraus zu Methyl Joint (XI); 2. die energiebenStigende ]~ormylicrung zu Formyl-tetrahydrofols~ure (X) und welter zu Methenyldetrahydrofolsaure (VIII) und Citrovorumfaktor (IX); 3. die Kondensation mit pr~formierten Formamid- gruppen zu 5-Formimino-tetrahydrofols~ure (XII); 4. die unmittelbare Anlagerung gebundener N-Formylgruppen zu 5-Formyl-tetrahydrofolsgure (IX).

Die dabei entstehenden, ,aktivierten" Kohlens~off-Einhei- ten tragen das Kohlenstoff-Fragment an ~T-5, N-10 oder als Brficke zwischen den beiden N-Atomen der Tetrahydrofol- sEure und kSnnen zu einer gemeiasamen Form, der Anhydro- formyl-tetrahydrofols~ure, umgewandelt werden, die sich dutch eine sehr spezifisehe Absorptionskurve mit einem Absorptionsmaximum bei 355 m/~ auszeiehnet.

Die Bindung tines Kohlenstoffatoms an N-5 stabflisiert die hydrogenierten Pteridinringe gegen Luftoxydation, durch die sonst TetrahydrofolsEure und seine 10-substituierten Derivate raseh zerse~zt werden. Reduzierende Agentien, wie Ascorbat oder Herc&ptoathanol, werden zugcsetzt, um die labflen Verbindungen zu stabflisieren. Die Schutzwirkung der 5-Substitution ist so groB, dub 5-Formyldetr~hydrofols~ure (Citrovorumfaktor) bei pH 6 autoklaviert werden kanm

Enzymatische Ein~ohlensto/]rea~tionen

der Zelle ge..hen die enzymatisehen Aktivierungen, Umwandlungenund Ubertragungen durch spezifisehe Fermente vonstatten. Dadureh wird der Weg zu einer Anzahl zellwich- tiger Bausteine geSffnet. Dutch Kombination solcher Enzyme k6nnen die versehiedenen Reaktionsketten katalysiert werden, dureh die die Einkohlenstoffeinheiten im Stoffweehsel nutz- bur gemacht werden.

a) Serinaldolase. Wie oben gezeigt, ist der biologische Do- nator der Kohlenstoffeinheiten ganz allgemein die fl-gydroxy- methylgruppe des Serins. In einer pyridox~labh~ngigen Spaltungsreaktion wird diese durch das Enzym Serinhydroxy- methylase ~, ~s, ~a auf TetrahydrofolsEure iibertragen (Tabelle 3). Die Reaktionsprodukte sind Glycin und aktiver Formaldehyd nach der Gleichung [3].

Serin ~ FHa Pyridoxalphosphat,, Glycin q- MethylemFH~ [3]

Tabelle 3. Bilanz der Serinspaltung

ohne J mit

0,1 yYol TPH +

I Glyein . . . 0,22 #Mol 0,34 #Mo] ~[ethenyl-FHa 0,19 #Mol 0 #Mol Methylen-FH~ 0 yMol 0,30 #Mol

Der Ansatz (1,0ml) enth~lt: 2,0#Mol Serin, 0,6#Mol Tetrahydrofolsi~ure, 1,8 #Mol MnSO~, 10 #Mol ~-Ketoglutara~, 10 #Mol ~IH~C1, 50 #Mol K-phosphat-Puffer PH 7,8, 0,1 ml Taubenleber-Acetonpulvercxtrakt, 20/50% Ammonsul~at- ffaktion, 50 #Mol Thioglykolat, 20 #Mol Mg-komplexonat. Inkubation: 45 rain, 35% anaerob.

(Beachte die Bildung von Methylen-FH~ bei Anwesenheit Yon TPN +, katalysiert durch Methylen-FHa-Dehydrogenase).

Dieser konnte aus enzymatisehen Ans~tzen isoliert und als cyclische 5,10-Methylen-Tetrahydrofols~ure (VII) identffiziert werden17 2s, a Die Verbindung kann in einfacher Synthese durch Kondensation yon Formaldehyd mit Tetrahydrofols~ure dargestellt werden. Die chemisch synthetisierte Verbindung ist enzymatisch nur halb so aktiv wie das biosynthetische Ma- terial, da dieses nur dasjenige Isomere darstellt - - Tetra- hydrofols~ure hat ein Asymmetriezentrum an C-6 (s. oben) - - , das yon den verschiedenen Enzymen als Produkt gebildet oder als Substrat verwendet werden kann. Der Antipode ist inaktiv (Schema 4).

HCHO~.x /~-FH4~. /¢HOCHz-CH-COOH ~ / \/ NH~ t I Sml~oldolase oH C H2-NR A <~,,J,~.<ipho~p~i~

~fl"I(N'y'CHz / x'~CH~-COOH R N'~N"~'N "> - - I 2, H NHZ

TPN %~ethtilen-PH~ (Vff) ,~ ~,~ Dekgo'rogenasc

TPNH +H ~'"~I CH-NR 014 I1~, I

H /'Setken#l- PHq (~J

EnzUm ~tl'sCke Reo/c/l'onen dep Helk~llen/etr~ky dro/'olmfibre

Schema 4

b) Transhydroxymethylierung. Der aktive 1%rmaldehyd iibertr~igt in weiteren Reaktionen die Einkohlenstoffeinheit auf Glycin zu Serin (Umkehr dcr Serinaldolasereaktion) oder auf Cy&osin zu 5-Hydroxymethyl-Cytosin. Dieses spielt in den Desoxyribonucleins~uren bestimmter Vircn eine wichtige Rolle. Das synthetisierende Enzymsystem wird erst nach der Virusinfcktion yon der Wirtszelle auf Kosten der eigenen Stoif- wechselreaktionen gcbildetl~;

c) Methyten-tetrahydro/olat-Dehydrogenase. Dcr Hydroxy- methyl-Kohlenstoff des Serins finder sich aber aueh in solchen Positionen, in denen er auf die Oxydationsstufe der Ameisen- sgure gehoben worden ist, z.B. in den Kohlens~offatomen 2 und 8 dcr Purine. Die Umwandlung des fl-Kohlcnstoffs des Serins in diese iY[ethingruppen der Heterocyclen stellt zwei Fragen, die ebenialls mit Enzymen aus tierischer Leber und anderen Organen beantwortet werden konnten, n~mlich: 1. ist auch bei diesen Ubertragungen Tetrahydrofols~ure beteiligt und 2. wie wird dieser maskierte l%rmaldehyd zur Stufe der Ameisens/£ure oxydiert ?

In Extrakten yon Taubenleber wurde erstmals ein En- zym nachgewiesenn, 2s, das Methylen-tetrahydroiols~ure mit Hflfe. yon Pyridin-Nueleotid zu Formyltetrahydrofols~ure oxydier~.

~ethylen-FK~ -F TPN + - "- 10-~ormyl-~FH4 -[- + TPNH + H+ [4]

I)iese Methylen-tetrahydrofolat-Dehydrogenase aus Leber und aus Leukoeyten ist TPN+-spezlfisch. Die Reaktion l£Bt sieh spektrophotometrisch leicht veffolgem Sie ftihrt zu einem

Jg. 41, IIef~ 21 L. JA.ENICKE und W. W~LM~S: Der Stoffwechsel der Folsauro und der Einkoblenstoffeinhei~en 1033 1. November 1963

Gleiehgewich~, d~ das primare 0xydationsproduk~ vermutlieh Anhydroformy14e~rahydrofolaC (VIII) ist~5, ~¢,~,% Dutch enzymaCisehe Offnung des Imidazoliniumrings zu 10-Formyl- tetrahydrofolsauro in den CyclohydroIase en~alCenden En- zymprapara~en s~ wird alas Gleichgewicht abet wei$ in l~ichtung der 10-Formy14etrahydrofolsaure versehoben, so dab die Oxyda~ion quaa~itat-iv verI~uft. Die isolierte aktive FormyI- tetrahydrofolsaure wurde eindeutig aIs die N-10-Verbindung identffizie~%~% ~s, ~.

Interessaat is$, da$ die Oniumenergie des oxydierten Pyrid-h~-Nucleo$ids auf diese Weise im Oxydationsproduk~ Anhydroformyl4e~r~hydrofola$ bewahrt wird, das dadurch eine spezffische energiereiehe Bindung erh£1t und den Proto~yp einer neuen Klasse energiereicher Verbindungen dars~ellt. Wie Tabelle ~ zeig~, kann sic ~a~s£chlich verwendet werden,

Tabelle4. ATP-Bi ldung aus lO-Form

Zusatz 1 I 2 I

10-F°rmyl-YHa • • -- I -- tIexokinasesystem* A T P gebfldet (#~ol) 0,001 0,0-03 ItC-Formiat frei-

gesetzt (#Mol) . . 0 0

71-tetrah ydro/olsSure

3 4

; ÷ +

0,001"* 0,037"*

0 0,05

Das System enth£1t in 0,4 mh 0,65 #Mol 10-1aCHO-FHt (7800 Ipm/#Mol), 10#iVfol z~PO~- (1,12 × i0 ~ Imp/#Mol), 0,28 #Mol ADP, 6 ttYC[ol MgCI~, 0,54 mg Formylase aus Tauben- leber, 120Inch angereiehert. Inkubation 30 rain bei 36 °.

* Hexokinasesystem: 40#Mol Glucose, 1 mg Hexokinaso (Sigma).

** Gemessen als Gluoose-6-phosphat naeh Papierelektro- phorese.

um ADP mit Phosphat zu ATP zu phosphorylieren, voraus- gcse~zt, da$ man dafiir sorgt, dab diese sofor~ aus dem l~eak- tionsgemiseh enffern~ wird~L Von dieser Bildung eines energie- reiehen Pyrophospha~s

~:g++ FormyI-FH~ -5 ADP -~ HsPO 4 ~ FH~ +

+ HC00H + ATP [5]

wird jedoch, eben wegen der rela~iv ungiinstigen Gleich- gewichtslage, in der Natur nur unter bes~imm$en Ums~iinden yon purinabbauenden Bakterien Gebrauch gemacht%

d) Tetrahydro/olat-Formylase. 10-Formyl4e~rahydrofol- saute (X), die fiir die biologisehen Formylierungsreak$ionen ben5~igt wird, entsteht aber nicht nur bo ide r besprochenen Oxydationsreaktion, sondern kann aueh, in Umkehr dor er- wahn~en ATP-Bfldungsreaktion, aus freiem Formiat und Tetra- hydrofolsaure unter Spal~ung yon ATP zu ADP und Ortho- phospha~ kondensier~ werden. Diese Reaktion [6]

~g++ FH~ + HCOOH + A T P ........ 10-Formyl-FH 4 ~-

-~ ADP + H~PO~ [6]

wird dureh die Fola~-Formylase ka~alysier~, die aus verschiedenen biologisehen Quellen dargestell~ und angereichert werden konn~e. In Bilanz (TabelleS) und ~Ieehanismus

Tabe]ie 5. Bilanz der Tetrahydro/olat/ormytase

iYIg ++ 10-Forrayl- FH~ + IICOOH + ATP ~ F~[~ + ADP + tt~PO~

An fang 7 (/~Mol) 1,5

Ende (ttMol) 1,1

Differenz (#lgol)

Im Ansatz (/~Mol)

0,9 ~ ~

0,4..~_

0,5

30 [Ik'is-HC1 pK7,8;

0,1

0,5

0,4 1,0 d , l -F t t , ;

1,5 I-ICOOK (6700 IpNf//AV[ol) ; 1,0 ATP-K+; 10 ~VfgCI~; 10Thio- glykol; 46 ~ Enzym [aus Taubenleber, 180Inch angereicher~ (vgl. ~)]. Vol. 0,3 ml, 20 rain 370 unter Ligroin; EnteiweiBung mit 5 % Perehlors~iure. ATP, ADP und Formia~ wurden enzy- matiseh, Phosphat colorimetriseh und FH~ sowie 10-Formyl- F]=[a (als Anhydroformyl-FHa bei 360m#) spekSrophoto- me~risch besbimmt.

diirften alle diese Enzyme fibereins~immen. Dieser ist eine sog. ,,push-pull"-Reak~ion~, ~, s~, % bei der die terminale Pyro- phospha~bindung der ATP die Reaktionspartner am Enzym so polarisiert, alas die Kondensation zum S~nreamid eintritt, was sieh dutch Gleichungen [73 bis [10] ausdriicken l~Bt, deren Summe [6] is~.

E + .ATP ~ ":. [E ~ P.ADP] [7] [E ,-~ P.ADP] + FHa ~ []7] ,-.~ Phosphoryl ~-~ FHa] +

+ ADP [8] [E ~ Phosphoryl -~ FH~] + HCOOH ~ "

[E" 10-Fomyl N FHt] -~ H~PO~ [9]

[E- 10-Fonnyl ~-~ FH,] ~ 10-Formyl-Ftt~ + E [10]

Solche Meehanismen sind yon a]Igemeinem In%eresse, da eine ganze l%eihe yon gleiehar~igen l%eak~ionen zu Biosynthesen yon Amiden dienen, die wiederum Zwisehens~u~en bei weiteren Biosynthesen sind.

e) Transformylierungen. Reak%ionen aus der Biogenese der Purine% ~6 geben die bekanntes~en Beispiele soleher Pro- zesse, in denen an Folat-Cofaktoren aktivierte Formylgrup- pen auf Acceptoren iibertr~gen werden. Sie sind in Schema 5 zusammengestellt. Anhydroformyl-tetrahydrofols£ure is~ d~s

PH~ ~ l¢~-Forina~/do-5-/in/dazo/- V Fal'~O.F~/iYlY-iP/~offd _ 1 T~ansio~ulase

HCO A< - ~ ~"

HCOOH +FH ~ ix!--~t--.N..~H~ cafboxa177/d-~l'~oi/d

xo-ro~}J-r.~(×) H llCYcfohyd~olase O, H~-NR l +i I1@ 1

N~.-N..cCH$ \ f Glyc/nam/d-Pi~ot/d

Enzym~t ikcke Reccletionen dep Por rlT~l I - Te lrah~i droPols ~'~ire n

Schema 5

Coenzym der Ubertragung der Einkohleastoffmolekel in die Stellung 8 der PurinringeT; 10-Formyl-te~rahydrofolat fiber- tri~gt in die Stellung 2 7, wodurch der Purinring vollendet wird. In beiden Reaktionen en~steht Te~rahydrofols~ure.

f) Methylgruppenbildung. Bei der Biosynthese der Methyl- gruppe yon Thymin oder yon Methionin und Cholin is~ die mittelbar wirksame Verbindung in allen Fallen tier ,,ak~ive" Formaldehyd: Methylen-~e~rahydrofots~ure (VII). Naeh unse- rein heutigen Wissen li~uft die Biogenese der Methylgruppe yon Thymin und yon Me~hionin aber naeh versehiedenen Mechanismen ab.

Im ersSen Fail, der vornehmlich yon ~'hR.IEDKINI8~, 90 und yon BI_~F_~E¥ ~ untersueht wurde, handelt es sich um eine dlrekf~ Kondensation yon Me~hylen4etrahydrofolsaure aIs Subs~rat mi~ dem Accepter und eine ansehIieBende oder gleiehzeitige reduktive SpaI~ung, mi~els der labflen Wasser- stoffa~ome der Te~rahydrofolsi~ure, so dab Thymidylsaure and Dihydrofolat entstehen, abet ein Folatzwisehenproduk$ nieh~ auftritt. Dutch die Regenerierung yon Te~rahydrofol- saute kann bier Dihydrofolat-Reduktase regulierend in den S~offweehsel (der DesoxyribonueleJnsaurebildung) eingreifen (Schema 6).

Interessan~ is~ die Angabe yon G~EENBERG ~°, dab die aus der Thymidinsynthese ents~ehende DJhydrofolsaure (II) nieh~ dutch die gewShnliche Leberreduktase zu Tetrahydrofola~ reduzier~ werdea kSnne. Es sell sich dabei um ein anderes Isomeres der Dihydrofols£ure, vermuflich die 5,8-Form (IIa), handela. Ein Dihydropteridia-Isomeres (wabrscheinlich die 5,6-Dihydroverbindung) wird aueh bei der Hydroxylierung des Phenylalanins zu Tyrosin als wirksamer Cofaktor an- genommenST, 9% $9.

Die Biogenese der Me~hylgruppe yon Methionin kanu wiederum auf verschiedenen Wegen ablaufen. Der eine is~ Vit- amin B12-abh/~ngig und wurde bei bes~immten Mutanten yon

1034 L. JAE?ClCKE and W.W~L~?c~s: Der Stoffwechsel der FolsBure und der Einkohlenstoffeinheiten Klinische Wochcnschrif$

Oe~oxy- Y/O-i'letkylen-

TbyT/~iy/~/- x

FHg FHI~

Hernmunj der Tkyrrz'dylat-~flHntkese dutch folyh'zlre-Anta~zom'yten ( A )

Schema 6

Escherichia eoli aufgeklBrt ~0. Hierbei scheint ein Methyl-Co- balamin (Co++-B~-Coenzym) die aktive IntermediBrform zu sein ~9. Aadererseits gibt es aueh einen allgemeinen Weg, bei dem ]~2-Cofaktoren nieht mit Sicherheit nachgewiesen

1,5

6' ~ S0 SF S¢ 1o" /8 20 Pfu2//~n~-Nz.

Abb. 1. DEAE-Zellulose-Chromatogramm der Fola~-aktiven Substanzen aus dem Serum eines Peunieiosa-Krankcn. Die L. easei-aktive Folat-Ver-

bindung is~ idcn&isch mit 5-Mc~hyl4etrahydrofolsgu~e (Fak~ion 12). Das Serum sCellte Dr. A. H. WATERS (London) zur Vefftigung

wurden, dafiir aber die Methylgruppe am Folat-Cofaktor ent- steht21,~,s6, os. Zu dieser Synthese sind erforderlich: Methylen- tetrahydrofolsBure (VII) als Donator und Homocystein als Aeeeptor der Einkohlenstoffgruppe. Weiter erfordert die Synthese ATP, TPNH and, vermutlich, ein Flavin. In- kubiert man mit dem angereieherten Enzym and dem reduzierenden System Methylen-tetrahydrofols~ure, entsteht ein neues Folatderivat, das sieh durch Chromatographie an DEAE-Cellulose abtrennen l~St a°, a~, ~7, % Es nnterscheidet ich yore aktiven Formaldehyd sehr charakteristiseh. Es ist ein ausgesprochener Wuchsstoff ffir Laetobaeillus casei, aber nieht fiir Streptococcus faecalis 1~. Die Reaktionen auf Formaldehyd sind negativ. Bei der Spaltung mit JodwasserstoffsBure entsteht Methyljodid, das unmittelbar aus der urspriinglichen ~ethylengruppe stammt.

Setz$ man die neue Verbindung einem Inkubationsansatz zu, der Homocystein und ATP enthBlt, wird raseh Methionin gebfldet (Tabelle 6). Wir haben in der neuen Folatverbindung zun/~chst ein Methyl-Dihydrofolat vermutet, das ehemiseh sehr wohl zur direk~en ~t~bertragung der Kohlenstoffeinheit auf ~ethylaceeptoren bef/~higt w~re. Da man die gleiehe Methyl- verbindung aber durch einfaehe ehemisehe Reduktion yon ~ethylen-tetrahydrofols~ure mit ~qatriumborana~ erhalten

Tabelle 6. Bildung .von Methionin aus Methyl- Tetrahydro]olat

System

Komplett . . . . . . . . . - - TPNtt . . . . . . . .

Methyl-FH 4 start FHa A- CH~O - - TPNH . . . . . . . .

~ethionin (mgMol/ml)

90 26

116 104

Ira Ansatz (#Mol) : 0,2 FH4; 2,0 CH20; 1,0 ATP; 5,0 MgCI~; 2,0 d,l-Homoeystein; 0,2 TPNH; 8 mg Protein (aus Sehweine- leber). Vol. 0,6 ml, 60 rain, 37 °, anaerob. Mikrobiologiseher Test mit Diploeoeeus mesenteroides.

5-Methyl-FH~ dureh enzymatische Inkubation yon Me- thylen-FH4mit Schweineleberenzym, TPNI-[ und FAD 72 and ehromatographische Isolierung an DEAE ira Ammoncarbonat- Mereapto~thanolgradienten.

kann, ist ftir die isolierte Verbindung die Struktur einer Tetra- hydroverbindung (XI) wahrscheinlieher. Sie muB dann wi~hrend der l~eaktion auf noch unbekannte Weise quaternisiert werden30, 69

Identitdit von Methyl-tetrahydro/olat mit ,,Prii]olsdiure A" und Serum-L. casei-Faktor

Von besonderem Interesse, aueh ffir die Diagnose und Therapie yon Fols~uremangelerscheiaungen ist, dab sich die isolierte Methylfolat-Verbindung a]s identisch erwiesen hat mit einer yon MoLLI~¢ und WATerS '~ beobachteten L. casei- aktiven Substanz im Serum, die bei perniziSser An~mie aber auch in der Schwangersehaft vermehrt auftritt and daher dia- gnostiseh yon Bedeutung ist 92. Abb. 1 zeigt, daS dieser L.easei- Faktor and die Methyl-folat-Verbindung der Methionin- synthese oder der chemisehen I~eduktion yon 3~ethylen- tetrahydrofols~ure3°,87, 69 miteinander identisch sind 91. Neuer- dings hat es sich auch herausgestellt, dab die Pr~folsBure A ebenfalls die 5-Methyl-tetrahydrofols~ure darstellt %a0.

Zusammenwirken ]ols~iurekatalysTerter Enzymreaktionen Es gibt noch einige weitere - - hier nieht einzeln bespro-

ehene - - Enzyme, die einen Folat-Cofaktor benOtigen. Die in TabeUe 7 angeffihrte Reihe yon l~eaktionen zeigt die Wich- tigkeit der FolsBure-Enzymsysteme bei der Bildung der Purine and des Thymins. Da Adenin, Guanin und Thymin drei der vier Basen der DesoxyribonucleinsBure sind, ist die zentrate Stellung der FolsBure bei der Bildung neuer Zellen evident. Welter entstehen auch einige essentielle Amiaos~uren dutch folatabhBngige Reaktionen. Zum Beispiel wird das C-2 des Imidazolrings im Histidin indirekt aus einer folsBureab- hBngigen Reaktion gebildet, and der biologische Abbau dieser AminosBure fiihrt zu Formylglutarnat, das zur Formylgruppe in 5-Formyl-tetrahydrofolsBure beisteuert und bei St6rungen im Fols~ure-(oder Bl~-)Stoffweehsel vermehrt ausgeschieden wird.

FaSt man die besprochenen Reaktionen der Einkohlen- stoffkSrper, die dutch Folat-Coenzyme katalysiert werden (Tabelle 7), zusammen, erhBlt man das in Schema 7 dar- gestellte System eyclischer Prozesse. Auf diese Weise wird in den verschiedenen Umsetzungen der Cofaktor regeneriert und kann tats~chlich als Katalysator wirken. Die Einkohlen- stoff-Fragmente erhalten an diesem Folat-Cofaktor die gehSrige Aktivierung, sei es direkt oder dutch Umwandlungsreaktionen, die unmittelbar am Coenzym stattfinden, ttierzu mtissen weitere Cofaktoren beistehen, sodas in l~ngeren oder kfirzeren Reaktionsketten die primer gebfldete Einkohlenstoffeinheit aus Serin yon Cofaktor zu Cofaktor und yon Donator zu Aeceptor gereieh~ wird. An den Verzweigungsstellen dieser Reaktior/sketten stehen jeweils die Fola~-Cofaktoren, an denen die Oxyda~ionen und Reduktionen, aber auch die Aktivierun- gen and Ubertragungen der Einkohlenstoffbausteine, sei es auf der Stufe des Methyls, des Hydroxymethyls oder des For- myls erfolgen kSnnen. An diesen Stellen kann aber auch die therapeutisehe Beeinflussung yon Einkohlenstoffreaktionen z.B. dureh FolsBure-Antagonisten ansetzen.

J~ols~iuremangelzustiinde Fols~uremangelzust~nde, wie wir sie am h~ufigsten bei

Resorp~ionsstSrungen im Darm, wBhrend der Schwangerschaft, bei ehronischem Leberparenchymsehuden und unter der Leuk~mieb6handlung mit FolsBureantagonisten linden, ~iihren zu StSrungen der ZeLlrelfung. I~liniseh sehen wit makroplane

Jg. ~1, Heft 21 L. JAENICKE und W. W ~ L 3 ~ S : Der Stoffweehsel der Folsi~ure und der Einkohlenstoffeinheiten 1035 1. :November 1963

An£mie, Leuko- und Thrombocytopenie. Die durch die genannten Ursaehen beding~e 1Viegaloblasten- an£mie ist yon der eehten Pernieiosa, die Folge des Fehlens yon Vitamin B~, ist, abzugrenzen. Ursuche der synergistischen Wirknng yon FoMiure und Vitamin Bl~ bei der Behandlung megalQblas~rer An~mien ist wahrscheinlich die gemeinsame Be- teiligung bei der Synshese yon Desoxyribonuclein- s~iure-Bausteinen. Im einzelnen ist der Wirkungs- mehanismus im Zusammenspiel dieser beiden Vit- amine jedoch noch nieh~ geklgrt. Insbesondere besteht absolute Unklarheit, warum, trotz des biochemisehen Wirkungssynergismus, die als Kom- plika~ion einer echten Perniciosa en~stehende funi- kul£re Myelose dutch FolsEuregaben noeh ver- schlechtert wird. Bocx ~ warnt daher, bei nieh~ absolut gekl~rter f4tiologie einer megaloblast~tren /b~£mie vor einer alleinigen Behandlung mit Fol- s£urepr~paraten. Besser is~ im Zweifelsfalle s~e~s die Kombinationsbehandlung mi~ Vitamin BI~.

Zur Abgrenzung yon Fols~ure- und B12-Mangel- an/~mien wird yon TABO~ und Wr~GXgDE~ ss sowie yon LUHB¥~ COOP:ERIVfAN and TELLER 46 die Bestimmung yon Formiminoglutamins£ure im Urin nach Histidinbelastung emp~ohlen. Bei Folsi~uremangelzust~nden wird n£mlich Formiminoglutamin- s£ure, die beim Abbau des Histidins entsteht, vermehrt ausgeschieden, da die Ubertragung der Formiminogruppe auf Tetrahydrofols~ure unter Bildung yon N~-Formimino-FH t gest6rt ist (Tabelle 7, 1. G1. [11]) ~7,s~.

NHCII=NH

HO OC--CH2--CII2--CH--CO OH + FH ~ > Formiminoglutamins/~ur e (IIl)

5-CI-II~H" FI-I~q-HOOC---CH~--CI-I2--CHNH2--COOH [ii] (xII) Glutamins~ure

Allerdings fanden S~LVER~N und P~T:~EY 7~ beiVitamin B n mangelern£hrten Ratten ebenfalls eine vermehrte Formimino- glutamins~ureausscheidung naeh I-Iistidinbelastung im Urin. Eine Normalisierung dieses Befundes konnte erreioht werden dutch Vitamin B~2 oder Methioningaben. In diesem Zusammen- hang ist die auf S. 1034 erw£hnte Identit£t zwisehen der bei der ige~hionin-Biosynthese gefundenen Methyl-Flit und der Fr£fols~iureA interessant. DONALDSON und KE~SZT~Sr n fanden, dab in Pferdeleber die gr5Bte Menge der Folsgure in Form der ,,Pr~ifo]s~iure A", bei der es sich chemisch um N~- Methyl~etrahydrofols~iure handelt, vorliegt. Fiir das Zusam- mensl0iel zwisohen Folsaureverbindungen, Vitamin B~ und Methionin postu]iere~ N O R O ~ und S ~ v E ~ N folgenden Mechanismus 5e: a) iKethionin-~ATP---, S-Adenosylmethionin+PF+P [12] b) S-Adenosylmethionin+Acceptor----> Methyl-Accepter +

+ S -Adenosylhomoeystein [13] c) S-Adenosylhomocystein+Methyl-FH4 B----~ FH~+

+ S-Adenosylme%hion~n [ 14] Auf die besehriebenen Un~ersuehnngen angewendet, wiirde dies bedeuten, dab durch Methionin- und Vitamin Bn-Gaben dem Organismus notwendige Tetrahydrofolsaure aus Pr£fol- s£ure A, die anders im Stoffweehsel nieht verwendet werden kann, znr Verfiigung gestellt wird. Diese Theorie ist jedoch noch nicht bewiesen.

~ ols~ ure- A ntagon isten Die Wirkung einer Fols~urede~izienz bei der En~s~ehung

yon AnEmie und Leukopenie lieBen den Gedanken w~ch werden, dab es mSglieh sein sollte, FolsEure-Antagonisten zu syntheti- sieren, die die Bfldung yon Bintzellen bloekieren, um sie b~i der Behandinng yon LeukEmien einzuse%zen. Tats/~chlieh zeigten bereits die ersten derartigen Verbindungen die er- w&rteten Eigenseha~ten, lieBen sieh aber wegen der sehweren klinisehen Nebenwirkungen therapeu~isch nicht anwenden. Ers% die Synthese der Aminop~erin-Serie ~iihr~e zu brauehbaren Verbindungen 71. Ihre ttemmwirkung kann nieht dureh Fols~u~e kompensier~ werden. Aueh manehe Antimalariatherapeutiea, wie Pyrimethamin, haben als struktur~hnliehe 2,4-Diamino- pyrimidine eine antagomstisehe Wirkung ~, es. Die Aktivit£t dieser S~offe beruht auf der Hemmung der Bildnng einer ak~i- vier~en Form der FolsEure, yon der wir jetz% wissen, dab es sich um Tetrahydrofols~ure handelt.

\ ~ / TPNH,H TPN e

/ k i p TPNH, He N'O~Teze~e I

ATezRtibnsu/fUen der folcltcoenzzlme Schema 7

Tabelle 7. FolatabMinglge Enzymreaktionen

1. Formimino- Transferase st, ss F H t + F~--N~ • C~ ( = ~ H ) ~- 5 - C H N ~ - - F H t + l%-NH2; R = Glutaryl oder Acetyl

2. Cyclodesaminase st 5-CB_NIi--FH~+ H+ ~ 5,10-CH = F H +

3. Glyeinamid-Ribotid-(GAR-)Transformylase :,16 5,10-CH = FH + + GAg ~- H20 ~ CRO- GAR -k FHt -k H +

4. Cyclohydrolase a 5,10-CK = FH + -}- It20 @ 10-CHO--FHt-~ I-I+

5. Tetrahydrofolat-Formylase 17 10-CHO--FHt q- ADP + II~PO~FH t-~ HCOOK + ATP

6. Aminoimidazolcarboxamid-gibo~id- (AICAR-) Transformylase 7 10-CItO--FHt -~ AICAR @ CKO--AICAR + FH 4

7. Formylfolat-l%eduktase 2s, 6~ 10-CHO--FH({- TP1NK -k H + ~ 5,10-CH~--FH~-~ TPN + + H~O

8. Thymidylat- Syn%hetase 4,9° 5,10-CH2--FH~+ Desoxy-U1ViP @ Thymidylat 4- FH 2

9. Dihydrofolat-Reduktase % 15,1°2 FI-I~ q- TPNH ~ I4+ ~ FI-I~ -}- T PIll÷

10. Desoxycyiidylat-Transhydroxymethylase I~ 5,10-CH2--FH4 q- Desoxy-CMP~ 5-CH~OH-desoxy-

CMP + FH~

ll.- Serin-aldolase I, 2s, 43 Pyridoxal-

5,10-CH~--FI-I~+ Glycin-~ I-I~O. " Serin-~ FI-I a phosphat

12. l~ethylenfolat-Reduktase 11, as 5,10-CK2--FHt+ FADK 2 (?) ~ 5-Me%hyl-FK4+ FAD

13. ~ethylfolat-Oxydase lo Menadion

5-Methyl-Flit+ DP1N + F l i t + Clq20 (?) ~- + DPNH-? H +

14. Methionin-Synthetase ~l,so,0s ATP

5-1Y[e%hyl-FHt + Homocys~eln. ~ Met~hionin + FH t Vitamin B~

15. Formyl-Transferase ~s, ~t FH~-k Formyl-glutamat @ 5-CtIO--FH~- Glutamat

16. Cyclodehydrase ~ 5-CHO---Ftt~-~ H + @- 5,10-CH + = FH~+ H~O

17. Folins£ure-Isomerase 17 5-CItO--FI-I~- ATP ~- 10-CHO-FH~+ ADF -~ H~PO 4

1036 L. JAE~mK]~ und W.WILMANSIS" Der Stoffwechsel der Folsgure und der Einkohlenstoffeinheiten Klinische Wochenschrift

a) Chemie der Folsgure-Antagonisten. Von den Fols~ure- Aatagonisten haben nur diejenigen klinisches Interesse, die Vcrbindungen mit 2,4-Diaminopyrimidin- oder 2,4-Diamino- triazingruppierung, also mit abgewandelten Pterinsystemen, sind. Prototypen sind Aminopterin (2,4-Diamino-pteroyl- glutamins~ure) und Amethopterin (2,4-Diamino-10-mcthyl- pteroylglu~amins~ure). Sie hemmen das Wachstum yon

COOH )~ R-~-~CONH-iH N~N~F.CH~ CHz

~'~ ~ '~ COOH

7O-Nelh#/fo/sEure: X = OH, ~ - ~H 3 Am/#op/ef/z X = NH~, .,<lme//zop/ez/2z : X= NH 2 , R = CH 3

Fo/~E~re -,4ntaqon/~ten

Streptococcus faecalis R. Es kann nur durch groBe Mengen Fols~ure restituiert werden, vollst~ndig aber durch Citro- vorumfaktor und andere tetrahydrierte l~ols~urederivate. Der Mechanismus erseheiat als pseudo-irreversible Kombina- tion der 4-Amiaogruppe mit dcm Enzymprotein der Folab reduktase. Tetrahydrofols~urederivate schlieBen diese Hem- mung durch Zugabe des Endprodukts der Reduktion kurz: die Enthemmung ist daher nicht-kompetitiv. In manchen F~llen haben die Antagonistcn aber auch eine kompetitive Wirkung, dort n~mlich, wo sie direkt mit einer aktiven Kohlenstoffeinheit konkurricren a~. Eiae Ausnahme yon der Regel, dal~ diese Antagonisten die Folatreduktase blockieren, scheint bei den reduzierten Antagonisten -¢orzuliegcnax, a~.TL Vermutlich ist die Hydrogenierung des Dihydropyrazinrings der Schritt, der die Dissoziation des Substrats yon tier Reduk- tase in der ~eaktion Dihydrofolsaure-÷Tetrahydrofolsgure bewirkt, und Tetrahydropteridine kSnnen sich nicht mit dem Enzym verbinden. Dagegen sind die Tetrahydro-Antagonistcn ira allgemeinen in den kompetitiven Hdmmungen wirksamer.

b) Wirkung au~ Enzymsysteme. Das Interesse am enzymatischen Wirkort der Fols~ure-Antagonisten wurde durch ihre ticfgreifenden Effekte in zahlrcichen biologischcn Systemen erwcckt. Um Schlfisse auf die spezifisehen Wirkungen eines Antagoniste~i ziehen zu k6nnen, ist es n6tig, das Enzymsystem in Abwesenhcit anderer Enzyme zu untersuchen, denn im lebenden Organkmus oder in rohen Gewebspr~paraten kann der Antagonist indirekte Wirkungen zeigen. Zum Beispiel bewirkt die Zugabe yon Sulfonamiden zu einer Kultur von E. coli das Anh~ufen yon Aminoimidazolcarboxamid ~. Diese Sub- stanz wird normalerweise mit 10-Formyl-tetrahydrofols~ure reagieren und in der AICAR-Transformylase-Reaktion Inosin- s~ure geben. Man k6nnte daraus schlieBen, dab die Sulfon- amide dicse Reaktion blockicrcn. Tats~ahlich jedoch inter- ferieren die Sulfonamide nicht mit diesem Vorgang, sondern mit der Biogenese eines Vorl~ufers des aktiven Formiats, ngm- lich der Dihydrofols~ure. Nur durch eine Untcrsuchung aller Schritte eines biosynthetischen Vorgangs kann also der spezifische Angrfffspunkt eines Antagonisten ermittelt werden. Aminoimidazoloarboxamid h/ruff sich n~mlich auch an, wenn an Stelle der Sulfonamide Amethopterin zum Medium der Coli-Bakterien gegebcn wird ~ ~,sT, also die Umwandlung der Dihydrofolsgure iu den aktiven Cofaktor unterbunden wird; ein schlagender Beweis der Analogie zwischen Sulfonamiden und Folsgure-Antagonis~en in ihrer Wirkung auf e~uen Stoff- wechselweg: das gleiehe Endprodukt entstcht durch Blockie- rung zweier verschiedener Stoffwechselschritte.

Im Fall der Fols~ure-Antagordsten sind die ausgepr~gtesten biochemischen Effekte, die in einigen Zellsystemen beobachtet werden, eine Verminderung der Thymidin-Synthese~L Das berub.t auf einer ttemmung der Folatreduktase, die ihrerseits notwcndig ist, um die zur Reduktion der Methylengruppc zur Methylgruppe dcr Thymidyls[iure notwcndige Konzentration an Tetrahydrofols/~ure in der Zelle aufrechtzuerhalten. Es ist aber zu diskutieren, da$ ldeine Mengen dieser Antagonisten biologisch zu den entsprechcnden Tetrahydro-Derivaten redu- ziert werden, die dann im Gegensatz zu den Stammverbindun- gen die Thymidylatsynthese direkt hemmen ~°.

Die ~otwendigkeit, dab efue Reduktion der Fols/fure ihrem biologischen Wirksamwerden vorausgehen muB, wurde aus

den Untersuchungen mit dem Citrovorum~aktor Mar. Auf die starke Affinit~t des Amethopterias zum Citrovorumfaktor- bildenden Enzymsystem wurde zuerst yon Nic~on und W~Lc~ 51 hingewiesen. Das wurde dann dureh viele andere Untersuchungen best~tigt. Die Beobachtung, dab Tetra- hydrofols~ure, aber nicht Fols~ure oder 10-Formyl-Fols~ure, die toxische Wirkung des Aminopterins bei M~usen umkehrt 5 ~, ~G~, al zeig~e, dab diese Reduktion durch die Pterin-Antago- nisten gehemmt wird. An der TPNK-spezffischen Dihydrofolat- reduktase aus Kfihnerleber wurde gefunden, da$ das Enzym nicht-kompetitiv dureh die Antagonisten gehemmt wird 5a. Ihre Affinit~t zum Enzymprotein ist etwa I0000mal grSSer " als die yon Dihydrofols~ure ~ und daher pseudoirreversibel. Die Reaktion, die regelreeht st6chiometrisch verl~uft, so dab man damit die Enzymmenge bestimmen kann, wird m6glicherweise durch die st~rkere Basizit~t des Pyrimidinrings im Antagonisten bewirkt.

Tabelle 8 gibt eiue Zusammenstellung der dureh Folsgure- Antagonisten mit gereinig~en Enzymen erhaltenen Hemm- effekte. Unter ihnen gibt as aber offensichtlich nur eines, das durch so geringe Konzentrationen des Antagon~sten blockiert wird, dab eine darauf aufgebaute Therapie sirmvoll ist, n~m- lich die Dihydrofolatreduktase. Mittelbar kSnnen dadurch aber die Bildung der Methylgruppe und alle anderen Vorg~nge beeinfluBt werden, wie aus dem Gesamtschema (7) Mar hervorgeht.

Tabelle 8. Hemmung yon Fola#Enzyman dutch Fols~iure-Antagonisten

Inhibitor- Enzym konzentration* * Hemmung

]Kol[1

Dihydrofolat- Reduktase . . . .

Tetrahydrofolat- Formylase . . . .

10 -s (I)

10 -t (I) 10 -4 (I-It4)

5 X 10 - ' (II-H~)

50 %, pseudoirre- versibeP 5

60%, kompetitiv 90 %, kompetitiv 65 %, kompetitiv

Cyclodesaminase . . .

Cyclohydrolase . . . .

Yorminotransferase

Serin-Aldolase . . . .

Thymidylat-Synthe- tase . . . . . . .

5 × 10 -~ (I) 10 -~ (II)

5 x 10 -4 (I)

5 X 10 -~ (I) 5 x 10 -~ (II)

lo-~ (I)

10 -~ (I)

15%s6 49%s a

43%s ~

69% s~ 83%s ~

nicht gehemmt

nicht gehemmt*

Methionin-Synthetase 10 -~ (I-H4) nieht gehemmt

* Hemmung nur mittelbar fiber Folat-Reduktase bei Ver- wendung katalytiseher Konzentrationen des Cofaktors.

** I=Aminopterin, I I = Amethopterin.

Vitamin/u@tion und Chemotherapie in der H~matotogie Was der Kliniker als Mangelerschemungen und als Krank-

heitssymptom diagnostiziert, sind nur selten Ausfglle bestimm- ~er isolierter Einzelvorggnge, sondern sie sind das Integral fiber eine Vielzahl yon enzymatisehen Emzelschritten, die als l~eaktionsketten miteinander, nebeneinander und hinter- einander ablaufen. In einem solchen Multienzym-System stellen sich komplizierte FlieBgleichgewichte s° era, durch die auf der einen Seite der Stoffwechsel reguliert werden k~nn, z.B. durch eirffache kompetitive Steuerungsmeehanismen oder durch l~fickkopplung zwischen Substraten, Produkten und .E. nzymen. Auf der anderen Seite kann aber durch minimale Anderung der Konzentration eines Reaktionspartners die gesamte Stoffwechselgeschwindigkeit tiefgreffend gestSrt werden. Besonders wirksam wDd sich das dann zeigen, wenn die Bloekierung nieht im glatten Kettenablauf, sondern an einer Kreuzungsstelle mehrerer Reaktionsketten, also an einem Transportmetaboliten, angreift.

Was man schlieBlich registriert, kann eiue Mangelerschei- hung sein, abet auch durch den uabalancierten Stoffwechsel zum unkontrollierten Waehstum eines Tumors ausarten.

Andererseits kann abet mit ttflfe der Ke~mtnis der Enzym- systeme und der Wirkung spezffischer Hemmstoffe eine ratio- nelle Therapie au~gebaut werden. Die chemisch-therapeutische Behandlung der Leuk~mien 2a ist nut eines der angestrebten Ziele der selektiven Toxikologie.

;ft. 41, t~eit 21 L. J~E~ICK~ und W. WIL3~AX~S: Der StoffwechseI der Folsgure und der Einkohlenstoffeinheiten 1037 I , November 1963

Literatur. ~AL]~XA~nE~, N., and D.M. G ~ ] ~ ] ~ : Studies on the purification and properties of the serine- forming enzyme system. J. biol. Chem. 220, 775 (1956). - -

B ~ r ~ I ~ , F. H. : in Sebrelt-Harris The vitamins, Band I I I , p. 202. New York: Academic Press 1954. - - a BLXKI~E:r, R . L . , and B.M. McDovaa~I~: Dihydrofolie acid reductase from streptococcus faecalis R. J . biol. Chem. 286, 1163 (1961).

BL~KL~¥, R . L . , and B. M. MoDolrcALL: The biosynthesis of thymidylic acid. I I I . Purification of thymidylate synthetase and its spectrophotometric assay. J . biol. Chem. 287, 812 (1962). ~ ~ BooK, H. E. : Eortschritte in der Erkennung and Behandlung megalozyti~rer An~mien. Regensburg. Jb. i~rztl. Fortbild. 8, (1959/60) 1. ~ ~ B~OqVlS~, H. P., M. J . F ~ - nKcI~, & A. BROCK~'¢ jr., E. L. R. STOKS~tD and T. It. JVKES: Citrovorum factor activity of tetrahydropteroylglutamic acid. J . Am. Chem. Soe. 78, 3535 (1951). - - ~ Bt~ow~, G.M., R. A. W E I S ~ ¢ and D. A. ~OL~Xl~: The biosynthesis of folio acid. I. Substrate and cofactor requirements for enzymatic synthesis by ceil-free extracts of Escheriehia coll. J . biol. Chem. 236, 2534 (1961). __7 BtlOI~A~Ia~r, J .M. , and S. C. t L A R ~ : Enzymic reactions in the synthesis of the purines. Advanc. Enzymol. 21, 199 (I959). - - s D~xox, M. : ~ult i -enzyme systems. C~mbridge: Cambridge University Press 1950. - - ~ DO~ALDSOI% K. 0. , and J . C. K~I~ESz~EsY: Further evidence on the nature of prefolie A. Bioehem. biophys. Res. Commun. 5, 289 (1961). - - 10 Dox~!~Dsox, K .O. , and J . C. KEaESZTESr: Naturally occurring forms of folio acid. I. "Prefolic A" : Preparation of concentrate and enzymatic conversion t~) eitrovorum factor. J. bioI. Chem. 284, 3235 (1959). - -11 DOnALDSOn, K. 0., and J . C. K~I~SZTES~: Naturally occurring forms of folio acid. I I . Enzymic conversion of methylenetetrahydrofolie acid to prefolic A-methyl-tetrahydrofolate. J . biol. Chem. 287, 1298 (1962). - - ~ FL~KS, J . G . , and S. 8. CoI~r~: Virus-induced acquisition of metabolic function. I . Enzymatic formation of 5-Itydroxymethyl-deoxyeytidytate. J . biol. Chem. 234, 1501 (1959). ~ 1~ F~i~Knn~, A .L . , E. L. R. STOKSTXD, IV[. BELT and J . t~. JvK~s: Biochemical experiments with a s~uathetie preparation having an action antagonistic to that of pteroyl- glutamie acid. J . biol, Chem. 169, 427 (1947). - - ~3~ Fu~Ei)- K~¢, i t . : The transfer of I~ a from tritiated tetrahydrofolic acidto thymidylic acid. Fed. Proe. 18, 1031 (9157). - - x~ F~w- ToI~, J . S., and S, S ~ O N D S : Metabolism of serine, in: General biochemistry, 8.789ff. New York: John Wiley & Sons 1958. - - ~ F ~ T ~ r ~ , S. : Enzymatic reduction of folio acid and dihydrofolic acid to tetrahydrofolie acid. J . biol. Chem. 228, 1031 (1957). --~a GOLDTt[WAIT, ]). A., and G. R. G ~ E ~ - ~E~¢: Some methods for the study of the de novo synthesis of purine nucleotides. In: 8. P. COLOW~OK and N. 0. KArLA~, Methods in enzymology, vol. I I , p. 504. New York: Academic Press 1955. - - x7 GR~E~ERG, G .R . , and L. JXE~r~CK~: On the activation of the one-carbon unit for the biosynthesis of purine nucleotides. In: G. E. W. W O ~ S ~ O L ~ and C. ~ .

CondoR, The chemistry and bmlogy of purines, p. 204. London: Churchill 1957. ~ ~s GREE~B~E~¢, G. t~., L. JAEI~OKE and M. S~Lv~m~¢: On the occurrence of N~0-formyl tetrahydrofolic acid by enzymic formylation of tetrahydrofolic acid and on the mechanism of this reaction. Biochim. biophys. Acta (A3nst.) 17, 589 (1955). - - 1 ~ GvEsT, J . R . , S. ~ ) - ~ , D. D. WooDs and E. L. S - ~ : A methyl analogue of eobamide coenzyme in relation to methionine synthesis by bacteria. Nature (Lond.) 195, 340 (1962). - - =0 GVEST, J . R., and D. D. WooDs: Metabolic interrelationships between cobal- amine and folio acid in the synthesis of methionine by Esche- riehia coll. In: tI . C. ttEI~R~O~, Vitamin BI~ und Intrinsic Factor, S. 686. S~uttgart: Ferdinand Enke 1962. - - ~1 ttATC~, F. T., A. L. LAI~I~A]~EE, R. E. CATItOU and J . iV[. B ~ o ~ x A ~ : Enzymatic synthesis of the methyl group of methionine. I. Identification of the enz~u~aes and eofaetors involed in the system isolated from Escherichia coll. J . biol. Chem. 286, 1095 (1961). - - 22 H E I ~ o ~ r , I-L C.: Vitamin B13 und Intrinsic Factor, Stut tgart : Ferdinand Enke 1 9 6 2 . - ~aI~Tcmug(~s, G. H. : Symposium on the clinical pharmacoIogy and thera- peutic use of antimetabolites. II . Pyrimethamine. Clin. Pharmaeol. Ther. 1, 570--589 (1960). - - 2~ HOL~WD, J . E.: Folic acid antagonists. Clin. PharmacoI. Thor. 2,374 (1961). - - e ~ H u ~ , E K ~ s , F.M., and 3{. J. Os~o~sr: Folio acid coenzymes and one-carbon metabolism. Advanc. Enzymol. 21, 369 (1959). - - ~ J~c~w~oK~, L, : Eolsgure als Cofaktor biologi- scher Rcaktionen. Experientia (Basel) 17, 481 (1961). - - Die Fols~ure im Stoffwechsel der Einkoidenstoff-Einheiten. Angew. Chem. 78, 449 (1961); - - Wirkformen der Eots~ure, ihre 8truktur und Funktion. In: H. C. t{EIg~o~, Vitamin Ble

Klin. Wschr., 41. Jahrg.

and Intrinsic Factor, p. 701. Stut tgart : Ferdinand Enke 1962. - - 2a~ JA~IGKE, L.: Die Fols~iuregruppe als Cofaktor im Stoffwechsel der Einkohlenstoff-Einheiten. tIabil.-Sehrift, Narburg 1954. - - 27 JA~NIOKE, L.: UnverSffentlicht. - - 2s J-~E~ICK~, L. : Conversion of fl-carbon of serine to Nl°-formyltetrahydrofolic acid. Fed. Proe. 15,281 (1956). - - 29 JAEIClOX~, L. : l~eehanisms of action of tetrahydrofolate eofactors in one- carbon transfer. In: A.V.S . n~ REIrOK and M. O'Co~I~Ol~, The mechanism of action of watersoluble vitamins. Ciba Foundation Study Group No 11, p.38. London: ChurchilILtd. 1961.-- ~o JAE- ~IOKE, L. : Ein biologisch aktives Methylfolat. Itoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 826, 168 (1961). - - 31 J ~ c x ~ , L. : Angriffs- oft yon Fols/iure-Antagonisten. Acta biol. reed. germ. 2, 186 (1963). - - a2 JA~IOKE, L. : Die Fols~ure im StoffwechseI der Einkohlenstoff-Einheiten. Angew. Chem. 78, 449 (1961). - - a~ JA]~lCZCKE, L., u. 1). C. CHAN: Die Biosynthese der Fols~i.ure. Angew. Chem. 72, 752 (1960). - - 3a JA~IOKE, L., u. P .C. C m ~ : UnverSffentlicht. - - 3~ JA~rmK~, L., u. 1V[. S~vv.~r~¢: UnverSffentlicht. - - 36 jV~KES, T. II. : Compounds with folio acid activity. In: D. GLIOK, Methods of biochemical analysis, vol. I I , p. 121. New York: Intcrscienee Publ. 1955. - - a~ ~ v ~ ' ~ L ~ , S.: Studies on the mechanism, of the enzymatic conversion of phenylalanine to tyrosine. J . biol. Chem. 284, 2677--2682 (1959). - - as K A v ~ ' ¢ , S. : The nature of the prima- ry oxydation product formed from tetrahydropteridines during phenylalanine hydroxylation. J . biol. Chem. 286, 804 (1961).-- 33 KAU~A~, S., and B. LEV~NBERG: Further studies on the phenyI-alanine-hydroxylation cofactor. J . biol. Chem. 234, 2683--2688 ~1959). - - ~°KEl~SZ~S¥, J .C . , and K . O . D o w ~ s m ¢ : Synthetic prefolic A. Biochem. biophys. Res. Commun. ~, 286 (1961). - - a~ K~sn~t~K, R. L. : Studies on the mechanism of formaldehyde incorporation into serine. J , biol. Chem. 227, 805 (1957). - - a3 KIsL~vK, R. L. : Reduced folio acid analogues as an~imetabolites. Nature (Lond.) 188, 584 (1960). - - ~ KIs~IvK, R. L., and W. S A K e s : A study of the mechanism of serine biosynthesis. J . biol. Chem. 214, 47 (1955). - - ~ K o o I L J . , u. L. JAE~OK~: l~ber S-Oxalyl- Thiole. Justus Liebigs Ann. Chem. 6~2, 129 (1962). - - ~ LAICt~A]3E:~, A. R:, and J . M . Bvo~A~A~: A. new intermediate of methionine biosynthesis. Fed. Proc. 20, 9 (1961). - - 46 LIFHBY, A . L . , J . M. COOPEXClVfAN and D. N. T~L~,~R: ttist- idin metabolic loading test to distinguish folio acid defeciency from Vitamin BI~ in megaloblastie anaemias. Proe. Soc. exp. Biol. (N.Y.) 101, 350 {1959). --- ~ MulLEt, A., and H. WAELSO~, Formimino transfer fro m formamidinoghVarie acid to tetrahydrofolic acid. J . biol. Chem. 228, 397 (1957). - - as MiIm~I;, A., and H. W±~LsoI~: The conversion of urocanic acid to iormamidinoglutaric acid. J. biol. Chem. 228, 365 (1957). - - ~ M I ~ o ~ [ ~ , H . K . , E. E. S~EL~ and R. J . ~V~- L~A~S: The concentration of 'frolic acid". J . Amer. chem. 8oc. 63, 2284 (1941). - - ~0 N~_T~[, R., and D. M. G R E E ~ O : Dihydrofolie acid reductase of calf thymus. Biochemistry 1, 435 (1962). - - ~IN~c~o~, C.A., and A . D . W ~ o ) z : On the mechanism of action of aminopterin. Proc. 8oc. exp. Biol. (N.Y.) 74, 403-411 {1950). - - ~ N o g o ~ , J . l~., and M. SILyEI~A~: On folio acid, Vitamin B~e, methionine and formiminoglutamic acid metabolism. In: H.C. I - I r l ~ i o s , Vit- amin Bxs and Intrinsic Factor, p. 728. Stuttgart : Ferdinand Enke 1962. - - ss O s ~ o ~ , M. J . , M. :~'RE~A~¢ and F. M. HVEx- ~K~l~S: Inhibition of dihydrofolic reductase by aminopterin and amethopterin. Proe. Soe. exp. Biol. (N.Y). 97, 429--431 (1958). - - ~ Os~ons, M. J . , Y. I-IATE~, L. D. K~¥ and F. l~i H V ~ E K E ~ S : Evidence for the enzymic deacylation of N~°-formyl tetrahy&:ofolic acid. Bioehem. biophys. Acta (Amst.) 26, 208 (1957). - - ss F]~AVL~, A.~5~[., and B. PWI~L- ~A~¢: Electronic structure and biochemical function of folio acid coenzymes. Biochim. biophys. Aeta (Amst.) 44,251 (1960). ~s PE~S, J. i~I., and D. M. G~EE~C:~E]~G: Studies on the conversion of citrovorum factor to a serine aldolase cofaetor. J . biol. Chem. 226, 329 (1957). - - ~7 P ~ y ~ E a , J . J . , S .B. Br~K~ny, E .S . , Bnoo~, O.D. Bump, A.D. E ~ n ~ , A .G. H o ~ and B. L. O'DELL: Isolation of the antianemia factor (Vitamin Be) in crystalline form frbm liver. Science 97, 404 (1943). - - ~s ~ r ~ ¢ ~ , J . J . , D. G. CALKI~S, E. S. BLoo~ and B. L. O'DE~L: On the peptide nature of Vitamin Bc conjugate from Yeast. J . Amer. chem. Soc. 68,1392 (1946). - - s~ Qv~y~E, J . R . : Enzymic decarboxylation of oxalylcoenzyme A to formylcoenzyme A. Biochem. J. 81, 108 (1963). - - ~0 Qv~¥.LE, J. R. : Metabolism of C ~ compounds in autotrophic and hetero- trophic microorganisms. Ann. Roy. Microbic]. 1~, 119 (1961).-- ~R~cOW~TZ, J . C . : Folio acid. In: R .O . Bo~E~, H . A . LAI~D¥ and K. ~Y~EXCK, The enzymes, vo]. I I , p. 185.

72a

1038 F. Hm¢~ und H. S~EBN~,n: Strnkturelles und numerisches Chromosomenmosaik (Gruppe A und E) Klinische Wochenschrift

lqew York: Academic Press 1960. - - ~ I~ABINOWITZ, J .C . , and R. H. I-II~nS: Folio acid coenzymes. Fed. Prec . 19, 963 (1960). - - sa RiBnVOW~TZ, J . C., and W. E. P m c ~ jr.: The enzymatic synthesis of Ni°-formyltetrahydrofolic acid and its role in ATP formation during formiminoglycine degradation. J . Amer. chem. Soc. 78, 4176 (1956). - - ~a RiB~NOW~Z, J. C., and W. E. P ~ c ] ~ jr. : Formimino-tetrahydrofolic acid and methei~yltetrahydrofolic acid as intermediates in the formation of l~i°-formyltetrahydrofolic acid. J. Amer. chem. Soc. 78, 5102 (1956). - - ~ R ~ S i S T R I , B.V. , and R. L. Br~AK~Y: 5,10-Methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase from baker's yeast, I. Partial purification and some properties. J. biol. Chem. 287, 1982 (1962). - - ¢~ R i v ~ , tI . M., u. L. JAv, N~C~]~: Uber , ,aktivierte Ameisens~ure" and die fermentative Trans- formylierung, ttoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 293, 46 (1953). - - ~7 Rooz]L V., W. S ~ ] ~ I and D. B~xm: The role of methyltetrahydrofolate in methionine biosynthesis in pig liver. Fed. Prec. 21, 4 (1962). - - ss S i K ~ I , W. : The biochemical relationship between glycine and serine. In: W. D. MCEL- ~o¥ and B. G~ASS, Amino acid metabolism, p. 658. Baltimore: Johns Hopkins Press 1955. - - s9 S~J~_~I, W., and I. UKST~CS: Enzymatic methylation of homocysteine by a synthetic tetrahydrofolate derivative. J . biol. Chem. 236, PC 50 (1961). ~0 Sc]~oEmt~n~v.n, R. : The dynamic state of body constituents. Cambridge: Havard University Press 1942. - - 71 S]~E~E~, D. R., J . ~ . S ~ I ~ jr. and iVI. E. I-IV~QVIST: Antagonist for pteroylglutamic acid. J. Amer. chem. Soc. 69, 2567 (1947), - - 72Sn~oT~, T . , H. lq. DIs~i]~L¥ and M.P . McCAN~: Pre- paration of dihydropteridine diphosphate, an intermediate in dihydrofolate synthesis. Biochem. biophys. Res. Commun. 7, 194 (1962). - - ~ Smv~, W. : Utilization of antimetabolites in the study of biochemical processes in living organisms. Ann. N.Y. Acad. Sci. 52, 1212 (1950). - - 71 S I L V ~ x ~ , M., J. C. KEnl~sz~s¥, G. J . K o v ~ and R. C. GA/~DII~ER: Citrovorum factor and the synthesis of formylglut~mic acid. J . biol. Chem. 226, 83 (1957). - - ~ SILVEn~i~¢, M., L. W. L i w and B. Kiv]~- ~_~¢: The distribution of folio acid activities in lines of leucemic cells of the mouse. J . biol. Chem. 236, 2530 (1961). - - ~ SI~v]~n- ~i~¢, ~ . , and A. J . P~lc]~Y: Dietary methionine and the ex- cretion of formiminoglutamic acid by the rat. J . biol. Chem. 233, 1179--1182 (1958). - - ~ SLAVIKOVK, V., and K. SL±ViK: On the mechanism of action of some 4-aminoanalogues of folio acid. Experientia (Basel) 17, 113 (1961). __Ts S~v.Im, E. E., and W. H. PF,~SOW: Growth factors of bacteria. X. Additional factors required by certain lactic acid bacteria. J. Bact. 89, 273 (1940). - - ~ SPl~I~so~, D. B.: On the formatio n of C i fragments from serine. In: W. D. MCELRo¥ and B. GLiss, Amino acid metabolism, p. 608. Baltimore: Johns Hopkins Press (1955). - - s o ST]~v]~ws, A., and W. S~x~_~: Biosynthesis of methionine in liver. J . biol. Chem. 284, 2063 (1959). - - si SWO]~STiD, E. L. R. : Some properties of a growth factor for lactobacilIus casei. J . biol. Chem. 149, 573 (1943). - - su STOK- sw.tn, E. L. R. : Pteroylglutamic acid. In: W. H. S~ .Bm~ jr. and R. S. HARRIS, The vitamins, vol. I I I , p. 89. New York: Academic Press 1954. - - sa STOKS~iD, E. L. R., L. Hv~c~IN¢S,

J. H. MowAT, J . H. BOOTHV,, C. W. WAT.L]~n, 1~. B. ANGIEn, J . Sv.~]3 and Y. Sv]lBi Row: The degradation of the fer- mentation lactobacfllus easel factor. I. J . Amer. chem. Soc. 70, 5 (1948). - - s ~ TA]~o~, H., and J . C. R~BIlCOWITZ: Inter- mediate steps in the formylation of tetrahydrofolic acid by formiminoglutamic acid in rabbit liver. J . Amer. chem. Soc. 78, 5705 (1956). - - 85T~o~ , H., and C . W ¥ ~ x x n n ~ ¢ : Determination of formimidoyl-glutamic acid in urine. J . olin. Invest. 37, 824 (1958). - - s~ T~]~o~, H., and C. W:ZN¢~R~)]~ : The enzymatic formation of formimino-tetrahydrofolic acid, 5,10-methenyltetrahydrofolic acid, and 10-formyltetrahydrofolic acid in the metabolism of formiminoghtamic acid. J. biol. Chem. 234,1830 (1959). ~s~ To~s~.K, A. J . , H. J . KIlL,Y, M. R. R~I~ and H. E. SKI~r]~: Chromatographic studies of purine metabolism. 1I. The mechanism of E. cell inhibition by amethopterin. Arch. Bioehem. 76, 45--55 (1958). -:-ss Tsc]~- scH~, 1%. : Eine none Deutung des antibakteriellen Wirkungs- mechanismus der Sulfonamide. Z. Naturforseh. 26, 10 (1947). 89 W~cKEn, A., H. K o ~ u. M. E ] ~ : ~ber den Stoffwechsel. der Paraaminosalicylsiure und Salieyls~ure bei Enterococcus Z. Naturforsch. 18b, 147 (1958). - - 90 W ~ B i , A. J . , and M. FRI]~DKIN: Direct spectrophotometric evidence for the oxydation of tetrahydrofolate during the enzymatic synthesis of thymidylate. J . biol.C hem. 236, PC 11(1961) . - 9i Wxw~Rs, A. H., u. L. J-~:N~O~:~ : Unver6ffentlicht. --92 W_AT]~ns, A. H., and D. L. 1VIo~rs: Studies on the folio acid activity of human serum. J . olin. Path. 14, 335 (1961). - - 93 W]~c~, A. D., and C. A. N~c~o~: Water-soluble vitamins concerned with one- and two-carbon intermediates. Ann. Rev. Biochem. 21, 633 (1952). - - 9~ W]~r,~s, W., and R. J . W~CZL]m: Metabolism of human leukoeytes in vitro. I I I . Incorporation of formate-C i~ into cellular components of leukemic human leukocyCes. Can- cer Res. 19, 1086--1090 (1959). - - 9~ WE~K~]~SV, n, W. C. : Specific binding of 4-amino folio acid analogues by folio acid reductase. J . biol. Chem. 236, 888 (1961). - - 9~ W~I~LW.r, I t . R., and F. M. Hvmc~C~K~S: Mechanism of the reaction catalyzed by the formate activating enzyme from micrococcus aerogenes. J . biol. Chem. 237, 1290 (1962). - -97 WILLS, L., ~ . A . CoNTA]~ and B . S . Lo~n: Treatment of "pernicious anaemia of pregnancy" and "tropical anaemia". Brit. reed. J . 1931I, 1059. - -9s W~i~c~cs , W., B. RiicKnn u. L. JiE~ICK~: Zur Biogenese yon Methionin. ttoppe-Seylers Z. physiol. Chefn. 322, 283 (1960). - - 9 s~ Wi~lvri~Ns, W.: Bestimmung, Eigenschaften und Bedeutung der DihydrofolsEurereduktase in den weiBen Blutzellen bei Leuk~mien. Klin. Wschr. 40, 533 (1962). - -99 Woons, D. D. : Biosynthesis and breakdown of folio acid. Prec. 4th internat, congr, biochemistry, vol. XI , p. 97. London: Pergamon Press 1958. - - 100 Whi l sT , B. E. : Folio acid coenzyme forms and function. Prec. 4th internat. congr, biochemistry, vol. XI , p. 266. London: Pergamon Press 1958. - - i ° i W g ~ T , B. E. : Poly-glutamyl pteridine coenzymes. J . Amer. chem. Soc. 77, 3930 (1955). - - i ° ~ Z ~ z ~ W S K ~ , S .F . , and C. A. N~c]~o~: Evidence for a single enzyme re- ducing folate and dihydrofolate. J . biol. Chem. 235, 2984 (1960).

O R I G I N A L I E N Strukturelles und numerisehes Chromosomenmosaik (Gruppe A und E)

bei einem M~idehen mit einem Pendred-Syndrom* Von

F . I t ] ~ I u n d H . SI~B~E~

Aus der ~edizinischen Poliklinik der Universit/~t Tiibingen (Direktor: Prof. Dr. ~. HENI)

U n t e r e i n e m c h r o m o s o m a l e n M o s a i k v e r s t e h t m a n das V o r k o m m e n y o n zwei odor m e h r e r e n Z e l l s t / i m m e n m i t v e r s c h i e d e n e n K a r y o t y p e n in e i n e m I n d i v i d u u m . N o r m a l e r w e i s e k o m m t in d e n K J r p e r z e l l e n e iner P e r s o n n u r e ine e inhe i f l i che C h r o m o S o m e n z a M , in b e s t i m m t e n Geweben , z . B . L e b e r p a r e n c h y m , a u c h d e r e n ge radzah l iges Vie l faches vor . B e i m a l i g n e n T u m o r e n , b e i d e r c h r o n i s c h e n m y e l o i s c h e n Leuk/~mie u n d in e i n z e l n e n F / i l l en y o n ch ron i sche r l y m p h a t i s c h e r L e u k / i m i e f i n d e n s ich n e b e n n o r m a l e n Ze l l en m i t

* Herrn Professor H. BE~CN~OLD zum 70. Geburtstag ge- widmet.

46 C h r o m o s o m e n i m e r k r a n k t e n G e w e b e a u c h a t y p i - sche Zel ls t i£mme m i t n u m e r i s c h e n odor s t r u k t u r e l l e n A b w e i c h u n g e n (ATxnv, Gv~cz u. iV[itarb., Tlz. Lff~Rs u. Mi ta rb . , TOUGH u. Mi t a rb . u . a . ) . B e i d e r Makro - globulin/~mie W a l d e n s t r J m l a n d m a n b i she r in ein- z e l n e n l~/illen n e b e n n o r m a l e n Mi tosen Ze l l en m i t e i n e m E x t r a c h r o m o s o m , das sioh w a h r s c h e i n l i c h v o m A u t o - s o m 2 her le i~et (B]~]xcSO~KV, u. Mi ta rb . , BOTTU~, U. Mi ta rb . , GERI~AI~ U. Mi ta rb . , PFEIFFV.R u. Mi t a rb . u n d PXTAU). E i n /£hnlichos Mosa ik w u r d e y o n uns bei e iner F a m i l i e m i t e ine r P o l g e r - t t u ~ t s c h e n K e r n - a n o m a l i e besohr ieben . A u c h die T r i s o m i e 21 k a n n