Modifizierung von Kollagenmatrizes zur Verbesserung der Angiogenese:
Eigenschaften von heparinisierten und mit VEGF beladenen
Kollagenschwämmen
Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-WestfälischenTechnischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Medizin
genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Gerrit Christian Grieb
aus
Göttingen
Berichter: Herr Universitätsprofessor Dr.med. Dr.univ.med. N. Pallua
Herr Universitätsprofessor
Dr.rer.nat. J. Bernhagen Tag der mündlichen Prüfung: 26. Juni 2006 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar
II
Meinen Eltern Hildegard und Norbert Grieb
III
1 Einleitung ........................................................................................................... 1
1.1 Wundersatz .................................................................................................................................. 1
1.1.1 Wundersatz allgemein ....................................................................................................... 1 1.1.2 Hautdefekt am Beispiel der chronischen Wunde............................................................... 2 1.1.3 Bekannte Hautersätze und Therapieformen zur Deckung von Hautdefekten................... 3
1.2 VEGF............................................................................................................................................. 7
1.2.1 Angiogenese, Bildung von neuen Blutgefäßen ................................................................. 7 1.2.2 Wachstumsfaktoren mit angiogenetischer Wirkung .......................................................... 8 1.2.3 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)..................................................................... 9
1.3 Kollagen ..................................................................................................................................... 11
1.3.1 Kollagen als Gewebsersatz und Trägermaterial.............................................................. 11 1.3.2 Eigenschaften von Kollagen ............................................................................................ 12 1.3.3 Struktur und natürliche Vernetzung ................................................................................. 12 1.3.4 Kollagenabbau und exogene Verknüpfungen ................................................................. 15 1.3.5 Künstliche Vernetzung von Kollagen............................................................................... 15 1.3.6 Vernetzung mit EDC/NHS ............................................................................................... 16
1.4 Bindungen von VEGF an Kollagen über Heparin .................................................................. 18
1.4.1 Heparin, Struktur und Funktion........................................................................................ 18 1.4.2 Bindung von Heparin an Kollagen ................................................................................... 19 1.4.3 Bindung von Wachstumsfaktoren an Heparin ................................................................. 20
1.5 Arbeitsziel und Aufgabenstellung........................................................................................... 21
2 Material............................................................................................................. 22
2.1 Geräte ......................................................................................................................................... 22
2.2 Reagenzien und Lösungen ...................................................................................................... 24
2.3 Trägermaterial ........................................................................................................................... 26
2.4 Zellen .......................................................................................................................................... 26
3 Methoden ......................................................................................................... 27
3.1 Herstellung der modifizierten Schwämme ............................................................................. 27
IV
3.2 Quantitative Bestimmung von VEGF mittels ELISA.............................................................. 29
3.2.1 Prinzip des ELISA............................................................................................................ 29 3.2.2 Durchführung des VEGF-ELISA...................................................................................... 30 3.2.3 Bestimmung der VEGF-Stabilität in vitro ......................................................................... 30 3.2.4 VEGF-Freisetzung der modifizierten Schwämme in vitro................................................ 31
3.3 Bestimmung von biologischen Effekten modifizierter Kollagenschwämme in der Zellkultur .......................................................................................................................................... 32
3.3.1 Zellkultivierung von HUVECs........................................................................................... 32 3.3.2 Bestimmung des proliferativen Effektes modifizierter Kollagenschwämme in der
24-well-Platte..... .............................................................................................................. 33 3.3.3 Bestimmung des proliferativen Effektes modifizierter Kollagenschwämme in der
6-well-Platte.... ................................................................................................................. 35 3.3.4 Ermittlung der VEGF-Freisetzung modifizierter Schwämme in der Zellkultur ................. 37 3.3.5 Ermittlung der Zellproliferation mittels BrdU-Test............................................................ 37 3.3.6 Ermittlung der Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Kammer................................................. 38
3.4 Histologische Untersuchung ................................................................................................... 40
3.5 Datenverarbeitung und statistische Auswertung.................................................................. 40
4 Ergebnisse ....................................................................................................... 41
4.1 ELISA-Messungen..................................................................................................................... 41
4.1.1 VEGF-Stabilität in vitro .................................................................................................... 41 4.1.2 VEGF-Release-Kinetik in vitro ......................................................................................... 43
4.2 Zellkultur .................................................................................................................................... 55
4.2.1 VEGF-Release-Kinetik in der Zellkultur........................................................................... 55 4.2.2 Der proliferative Effekt der modifizierten Kollagenschwämme in der 24-well-Platte mit
je 10000 HUVECs pro well .............................................................................................. 57 4.2.3 Der proliferative Effekt der modifizierten Kollagenschwämme in der 24-well-Platte mit
je 25000 HUVECs pro well .............................................................................................. 60 4.2.4 Der proliferative Effekt der modifizierten Kollagenschwämme in der 6-well-Platte mit
je 125000 HUVECs pro well ............................................................................................ 63
4.3 Histologie ................................................................................................................................... 64
V
5 Diskussion ....................................................................................................... 69
5.1 Biomaterialen............................................................................................................................. 69
5.1.1 Kollagen als artifizieller Hautersatz.................................................................................. 69 5.1.2 Vorteile der modifizierten Matrix ...................................................................................... 70
5.2 Eigenschaften von VEGF ......................................................................................................... 71
5.2.1 VEGF-Verhalten in vitro................................................................................................... 71 5.2.2 VEGF-Verhalten in vivo ................................................................................................... 72
5.3 Eigenschaften und biologische Effekte der modifizierten Kollagenmatrix ........................ 73
5.3.1 Freisetzungskinetik von VEGF ........................................................................................ 73 5.3.2 Einfluß der Matrix auf die Proliferation von Endothelzellen............................................. 78
5.4 Ausblick ..................................................................................................................................... 84
6 Zusammenfassung.......................................................................................... 88 7 Literatur............................................................................................................ 90 8 Abkürzungsverzeichnis…………………………………….………...……..……..104 9 Danksagung….…....………………..…….….………...…..………………………..105
10 Curriculum Vitae………………..……..………...…..………………......…...……..107
VI
1
1 Einleitung 1.1 Wundersatz 1.1.1 Wundersatz allgemein Bei großflächigen Zerstörungen des Hautorgans, z.B. durch ausgedehnte chronische
Wunden oder bei schweren Verbrennungen kann nur eine ausreichende und
rechtzeitige Deckung bzw. Schließung der Wunde schwere Komplikationen, wie z.B.
eine tödliche Sepsis verhindern (Aubock and Fritsch 1987, Ward 1998, Zacchi et al.
1998). Die Behandlung von großflächigen Wunden nimmt somit in der plastischen
Chirurgie einen sehr hohen Stellenwert ein.
Neben dem reinen Verschluss der Wunde, z.B. durch autologe Transplantate oder
Biomaterialien, spielt auch die Wiederherstellung der angrenzenden Gewebe eine
wesentliche Rolle. Nicht nur die Rekonstruktion der ursprünglichen Form und
Funktion, sondern auch das ästhetische Ergebnis sind dabei von großer Bedeutung.
Die plastische Deckung durch autologe Hauttransplantate stellt eine gängige
Methode in der rekonstruktiven Chirurgie dar, bedeutet aber immer einen
zusätzlichen chirurgischen Eingriff in gesundes Gewebe mit weiteren möglichen
Komplikationen (Infektion, unbefriedigendes ästhetisches Ergebnis) (Grikscheit and
Vacanti 2002, Przybilski et al. 2004). Hinzu kommt, daß bei sehr ausgedehnten
Hautdefekten die Spenderareale auch einen limitierenden Faktor darstellen.
Diskussionen in der Literatur verdeutlichen, daß das Missverhältnis zwischen
Gewebebedarf und Gewebevorrat bei der Deckung von großflächigen Wunden
immer noch große Einschränkungen bedeutet (Peters et al. 1998). Auf der Suche
nach möglichen Alternativen, verweist die Literatur häufig auf die Herstellung von
Biomaterialien, welche die autologen Transplantate ersetzen können und
möglicherweise die Wundheilung, z.B. durch den Einsatz von Wachstumsfaktoren,
noch zusätzlich beschleunigen könnten. Die in-vitro-Herstellung von menschlichem
Gewebe, dem sogenannten „Tissue Engineering“, wird dabei eine besonders große
Bedeutung zugemessen (Badiavas et al. 2002).
2
1.1.2 Hautdefekt am Beispiel der chronischen Wunde Chronische Wunden stellen einen beachtlichen Anteil der in der Klinik anzutreffenden
Fälle mit ausgedehnter Zerstörung des Hautorgans dar. Kenntnisse der Ätiologie und
Therapiemöglichkeiten von chronischen Wunden sind somit für einen schnellen,
komplikationslosen Verschluss mit gutem funktionellem und ästhetischem Ergebnis
absolut essentiell (Falanga 1998).
Chronische Wunden sind per Definition Wunden, die nach vier Wochen
konsequenter lokaler und ursachenbezogener Behandlung makroskopisch keine
Heilungstendenzen aufweisen (Siewert 2001). Für das Auftreten solcher
Wundheilungsstörungen sind verschiedene Ursachen verantwortlich. Neben lokalen
Störfaktoren, wie Fremdkörper, Wundödem und Wundinfektion führen Mikro- (z.B.
bei Polyneuropathie) und Makroangiopathien (z.B. arterielle Verschlusskrankheit) zur
Ischämie. Dies hat eine Verminderung der nutritiven Substanzen im Gewebe, vor
allem aber eine lokale Hypoxie zu Folge (Siewert 2001). Der daraus resultierende
niedrige pO2 korreliert signifikant mit einer Verminderung der Zellproliferation und
Zunahmen der Wundgröße (Coerper et al. 1999). Auch eine chronisch venöse
Insuffizienz kann zu einer gestörten Wundheilung mit Ulcerationen führen. Als
Ursache wird neben einer Aktivierung der Leukozyten (Burnand et al. 1992) auch
eine Extravasion von Proteinen, u.a. auch Fibrin vermutet. Fibrinogen wird im
umliegenden Gewebe zu Fibrin aktiviert und bindet andere Proteine, wie z.B.
Wachstumsfaktoren. Somit wird die Wirkung für die Wundheilung wichtiger Faktoren
unterdrückt (Falanga and Eaglstein 1993). Neben den lokalen werden auch noch
systemische Störfaktoren in der Literatur beschrieben. Hierzu zählen u.a. reduzierter
Ernährungszustand, Stoffwechselerkrankungen (Diabetes mellitus), Immun-
suppression, Chemotherapie und Radiatio (Hehenberger et al. 1999).
Bei der Therapie von chronischen Wunden nimmt neben der feuchten
Wundbehandlung (Siewert 2001), der chirurgischen Wundsäuberung (Coerper et al.
1995) und der chirurgischen Revaskularisierung bzw. venenchirurgischen Sanierung
(Bello et al. 1999) der Hautersatz einen entscheidenden Stellenwert ein (Falanga et
al. 2002).
3
1.1.3 Bekannte Hautersätze und Therapieformen zur Deckung von Hautdefekten
Mittlerweile existiert eine große Anzahl an verschiedenen Methoden zur
Wundabdeckung. Die Gängigsten sollen hier kurz dargestellt werden.
Eine Möglichkeit des Wundverschlusses stellt die autogene Spalthaut dar (Heimbach
1987), die mittels eines Dermatoms aus einem intaktem Hautareal entnommen wird
(Smirnov et al. 1998). Eine mögliche Modifizierung des Spalthauttransplantates ist
das Mesh-Graft. Durch Einschnitte wird ein Gittertransplantat konstruiert, das eine
Flächenvergrößerung auf das eineinhalb- bis sechsfache erzielen kann (Hanselka
1974, Vandeput et al. 1995). Bei einer weiteren von Meek entwickelten Technik wird
eine Vergrößerung der Fläche auf das zehnfache durch die Verteilung kleiner
quadratischer Hautinseln auf dem Wundgrund erreicht (Kreis et al. 1993, Lari and
Gang 2001, Papp and Harma 2003).
Eigenhauttransplantate sind schnell verfügbar und stellen eine permanente,
funktionelle Wundabdeckung sicher. Da dies jedoch durch beschränkte
Hautentnahmeflächen und den Allgemeinzustand des Patienten limitiert ist (Herndon
and Spies 2001, Hettich and Koslowski 1984, Koslowski 1984, Zellner 1971), muß
auf andere Hautdeckungsverfahren ausgewichen werden (Bozinko et al. 1998,
Eaglstein and Falanga 1998, Helvig 1997, McHugh et al. 1997). Es gelang zu zeigen,
dass kultivierte Epidermis viele charakteristische Eigenschaften von natürlichem
Epithel aufweist (Green et al. 1979, Sun and Green 1976).
Das 1975 von Rheinwald und Green entwickelte Feeder-Layer-Verfahren wird heute
zur Herstellung von Keratinozytenkulturen häufig angewendet (Rheinwald and Green
1975). Aus zwei bis vier Quadratzentimetern Spalthaut wird enzymatisch mit Trypsin
eine Einzelzellsuspension aus Basalzellen erzeugt, die gemeinsam mit subletal
bestrahlten 3T3-Fibroblasten kokultiviert werden (Green et al. 1979, Pittelkow and
Scott 1986, Rheinwald and Green 1977). Diese Technik ermöglicht aus einem
Quadratzentimeter durch Subkultivierung nach zwei bis drei Wochen etwa
sechstausend Quadratzentimeter anzuzüchten. Die kultivierten Epithelzellen stehen
als Sheet oder als Zellsuspension zur Verfügung. O´Connor beschrieb als Erster den
Einsatz von autologen Keratinozytensheets zur Wunddeckung am Menschen
(O´Connor 1981). In vitro gezüchtete autologe Epithelzellen wurden in vielen Kliniken
gezüchtet und angewandt (De Luca et al. 1989, Eldad et al. 1987, Gallico et al. 1984,
4
Hefton et al. 1986, McAree et al. 1993, Munster et al. 1990, Rue et al. 1993, Schaller
et al. 1991). Seit 1989 sind sie kommerziell erhältlich.
Ein Nachteil der alleinigen Wunddeckung durch autologe Epidermis ist die Dauer des
Zeitintervalls von zwei bis drei Wochen bis eine ausreichende Anzahl von
gezüchteten Zellen zur Verfügung steht. In diesem Zeitraum muß der Hautdefekt
anderweitig temporär gedeckt werden (Aubock and Fritsch 1987). Zusätzlich ergeben
sich häufig Probleme hinsichtlich der Stabilität des Transplantates wie Blasenbildung,
Ulzerationen, Narben- und Kontrakturbildungen (Freedlander 1998, Putland et al.
1995).
Viele Arbeitsgruppen beschäftigten sich auch mit sogenannten Mischhauttrans-
plantaten, die neben autologen Hautanteilen auch aus homologen Hautanteilen
bestehen. Für die Herstellung solcher Mischhauttransplantate wurden verschiedenste
Methoden und Modifizierungen angewandt (Alexander et al. 1981, Hafemann et al.
1989, Heck et al. 1985, Kaiser et al. 1994).
Auf der Suche nach Alternativen zu homologer Dermis bzw. autologer Spalthaut
wurden in den letzten Jahren enorme Anstrengungen unternommen artifizielle
Hautersatzverfahren zu entwickeln. Hier hat der Begriff des „Tissue Engineering“
rasch an Bedeutung gewonnen. Dieses Verfahren ist nicht nur für den Bereich der
rekonstruktiven Chirurgie von großem Interesse, da im gesamten Medizinbereich ein
großer Bedarf an Ersatzmaterialien herrscht, um die unterschiedlichsten Defekte zu
versorgen. Daher handelt es sich beim Tissue Engineering um ein Forschungsgebiet,
das auf der Zusammenarbeit zwischen Biomaterialforschung, Zellbiologie,
Zellkulturtechnik und verschiedenen medizinischen Fachrichtungen basiert. Eine
künstliche Herstellung von Gewebe wie Knorpel, Knochen oder sogar komplette
Organe wie Herz oder Leber könnte therapeutisch sehr gute Ergebnisse erzielen und
erhebliche Kosten reduzieren. Beim Tissue Engineering handelt es sich allerdings
erst um ein sehr junges Fachgebiet, das noch am Anfang steht und kann sicherlich
erst mittelfristig eine mögliche Alternative für einen Hautersatz bieten.
Derzeitige Alternativen stellen unter anderem die schon kommerziell erhältlichen
Hautersatzprodukte dar. AlloDerm® (LifeCell Corporation) z.B. kommt bei
ausgedehnten Hautdefekten zum Einsatz und besteht aus azellulärer humaner
Dermis. Dabei bleiben Kollagen Typ IV und VII sowie Teile des Basalmembran-
komplexes (Laminin 1 und 5) chemisch und strukturell erhalten. Da das Transplantat
frei von MHC-I und –II -Komplexen ist, erfolgt keine Abstoßungsreaktion. Als
5
Epidermisersatz dienen Keratinozytensheets oder Spalthaut, die bereits bei der
Transplantation appliziert werden können. Klinische Studien zeigen, daß Alloderm®
das Auftreten von Myofibroblasten mit nachfolgender Wundkontraktion verhindern
kann (Freedlander 1998, Wainwright 1995).
Abb. 1: Alloderm®
Ein weiterer kommerziell erhältlicher Hautersatz ist das zweischichtige Produkt
Integra® (Integra Lifesciences Corporation, USA). Es besteht aus einer
Wasserdampfdurchlässigen Silikonschicht als temporärer Epidermisersatz sowie
einer dreidimensionalen Porenmatrix aus bovinem Kollagen und Chondroitin-6-Sulfat.
Integra® ist für drittgradige Verbrennungen zugelassen (Bozinko et al. 1998, Ryan et
al. 2002, Sheridan et al. 2000) und erwies sich im klinischen Einsatz
erfolgversprechend (Heitland et al. 2004, Lorenz et al. 1997). Jedoch erwies sich die
zweizeitige epidermale Deckung als ein Nachteil. Die Silikonschicht verhindert
Wunddrainage und erhöht das Risiko der Ausbildung von Infektionen, Hämatomen
und Narben (Heimbach et al. 1988, Nanchahal and Ward 1992). Ein weiteres
Problem ist die schlechte Revaskularisierung des Wundgrundes.
6
Abb. 2:
Integra®
Ein weiteres kommerziell erhältliches Produkt ist Apligraf® (Organogenesis Inc.,
USA). Es handelt sich dabei um eine Kollgenmatrix mit Fibroblasten und
Keratinozyten (Bell et al. 1981, Coulomb et al. 1986, Fray et al. 1998), die bei
chronisch-venösen Beinulzera gute Ergebnisse zeigt (Guerret et al. 2003). Apligraf®
regt neben der Synthese von Matrix- und Basalmembrankomponenten auch die von
Wachstumsfaktoren an, die durch beschleunigte Angiogenese zu einer schnelleren
Wundheilung führen.
Abb. 3:
Apligraf®
7
Wünschenswert wäre als Hautersatz ein Material, das nicht nur Synthese von
Wachstumsfaktoren anregt, sondern auch selber welche freisetzt, so daß im
Wundgebiet auch über einen längeren Zeitraum eine konstante angiogenetische
Wirkung erhalten bleibt. Somit wäre eine schnellere und komplikationsfreie
Wundheilung gewährleistet.
1.2 VEGF 1.2.1 Angiogenese, Bildung von neuen Blutgefäßen Die fundamentalen Prozesse, durch die neue Blutgefäße entstehen, bezeichnet man
als Angiogenese und Vaskulogenese (Carmeliet 2000, Risau 1997, Risau and
Flamme 1995). Vaskulogenese ist definiert als Differenzierung von Angioblasten in
Endothelzellen und die de novo Formation eines primitiven Netzwerks aus Gefäßen.
Angiogenese dagegen ist als Wachstum von neuen Kapillaren von einem bereits
existierenden Blutgefäß aus definiert (Risau 1997). In der Embryonalzeit entstehen
neue Gefäße durch Vaskulogenese und Angiogenese. Beim Erwachsenen dagegen
tritt die Bildung neuer Blutgefäße nur unter bestimmten physiologischen
Bedingungen auf (z.B. bei Placentawachstum in der Schwangerschaft oder
Wundheilungsprozessen) und entsteht in erster Linie durch Angiogenese. Um durch
Bioimplantate ein gerichtetes und schnelles Gefäßwachstum zu induzieren, müssen
angiogenetische Prozesse im Detail verstanden werden.
Die Angiogenese ist ein sehr komplexer Vorgang, der zur Zeit noch Gegenstand
intensiver Grundlagenforschung ist. Viele angiogenetische Moleküle spielen hier eine
essentielle Rolle, darunter auch Wachstumsfaktoren wie VEGF (Vascular Endothelial
Growth Factor) (Folkman and Shing 1992). Zwei Mechanismen von Angiogenese
sind in der Literatur beschrieben, Sprouting (=Sprießen) und Intussusception. Bei der
Intussusception kommt es zur Abgabe von interstitiellen Endothelzellreihen in das
Lumen eines bereits bestehenden Gefäßes. Stabilisierung und kontinuierliches
Wachstum dieser Zellreihen induzieren eine Teilung des Gefäßes und eine
Neuformung des lokalen Gefäßnetzes (Risau 1997). Beim Sprouting müssen zwei
Phasen differenziert betrachtet werden: das Wachstum des neuen Gefäßes und
dessen Stabilisierung (neovessel growth and stabilization). Beim Wachstum kommt
es zunächst zur Auflösung der Basalmembran und der angrenzenden interstitiellen
8
Matrix des „Muttergefäßes“. Die Endothelzellen migrieren in diesen erschaffenen
Raum in Richtung des auslösenden angiogenetischen Faktors und proliferieren. Es
kommt zur Ausbildung von Gefäßlumen und Anastomosen. In der
Stabilisierungsphase wird die Endothelzellproliferation gestoppt, eine neue
Basalmembran angelegt und das neue Gefäß mit Perizyten umschlossen. Beide
Phasen sind gleich wichtig, denn ohne Stabilisierung würde jede neue Kapillare
sofort durch Apoptose untergehen (Benjamin et al. 1998).
Der komplexe Vorgang der Angiogenese wird durch zahlreiche Moleküle und
Faktoren gesteuert. Neben wasserlöslichen Wachstumsfaktoren kontrollieren auch
unlösliche extrazelluläre Matrixmoleküle die Angiogenese. Lösliche Wachstums-
faktoren können über große Distanzen kapillares Endothelzellwachstum auslösen,
wohingegen die extrazellulare Matrix (ECM) die Zellsensibilität für diese
Wachstumsstimuli im lokalen Mikrosystem reguliert (Ingber and Folkman 1989,
Ingber et al. 1995). Diese permanente Interaktion von unterschiedlichsten pro-
angiogenetischen und angiostatischen Faktoren führt zum Begriff der angio-
genetischen Balance, der häufig in der Literatur verwendet wird (Iruela-Arispe and
Dvorak 1997). Einer der potentesten pro-angiogenetischen Faktoren ist der
Wachstumsfaktor VEGF (Beck and D'Amore 1997), der in dieser Studie eine zentrale
Rolle spielt.
1.2.2 Wachstumsfaktoren mit angiogenetischer Wirkung Wachstumsfaktoren sind körpereigene Substanzen, die das Zell- bzw. das
Körperwachstum durch Bindung an spezifische Rezeptoren stimulieren (Gruyter de
1997). Dazu gehören Hormone, wie z.B. das somatotrope Hormon (STH), Zytokine,
wie z.B. Interleukine und eine Vielzahl anderer Peptide und Proteine.
Wachstumsfaktoren können einerseits Zellteilung, Zelldifferenzierung und
Zellmigration stimulieren, andererseits auch reduzieren, je nachdem auf welche Art
von Zellen sie wirken (Nimni 1997). Mit der Hilfe verschiedener Methoden wie
Chromatographie, PCR (polymerase chain reaction), DNA-Sequenzzierung und
Immunoassays konnten Wachstumsfaktoren genauer definiert werden. Folkmann
konnte zeigen, daß menschliche Zellen durch angiogenetische Wachstumsfaktoren
so stimuliert werden können, daß sie neue Gefäße bilden (Folkmann et al., 1979).
Bei Krankheitsbildern wie Psoriasis, diabetische Retinopathie oder rheumatoide
9
Arthritis traten auch pathologische Gefäßneubildungen auf (Folkman 1995). Selbst
bei physiologischen Vorgängen, wie Entzündungsreaktion und Wundheilung spielen
Gefäßneubildungen eine herausragende Rolle (Vailhe et al. 2001). Fournier gelang
es durch die Anwesenheit von angiogenetischen Wachstumsfaktoren die Angio-
genese auch in künstlichen Geweben zu steigern (Fournier and Doillon 1996).
Zu den bedeutendsten Wachstumsfaktoren mit angiogener Potenz gehören neben
VEGF, FGF (Fibroblast Growth Factor), TGF (Transforming Growth Factor), EGF
(Epidermal Growth Factor) und PDGF (Platelet Derived Growth Factor).
Angiogenetische Faktoren lassen sich in indirekte und direkte angiogenetische
Wachstumsfaktoren unterteilen. Indirekte wirken über Mechanismen wie Chemotaxis,
Mobilisation von Makrophagen oder Freisetzung direkter Wachstumsfaktoren. Direkte
angiogenetische Wachstumsfaktoren wirken direkt über Rezeptoren auf die
Endothelzelle. Zu ihnen gehören z.B. FGF, TGF α und VEGF.
1.2.3 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) VEGF ist ein 34- bis 42- KD großes Glykoprotein und besteht aus zwei identischen
Untereinheiten (Senger et al. 1993). Es gibt mindestens vier verschieden VEGF-
Formen mit unterschiedlicher Anzahl von Aminosäuren (VEGF 121, VEGF 165,
VEGF 189, VEGF 206). Diese unterschiedlichen Formen entstehen durch Spleißen,
d.h. durch Herausschneiden verschiedener Sequenzen aus einer ursprünglichen
RNA. VEGF 121 und VEGF 165 werden von Zellen freigesetzt, VEGF 189 und VEGF
206 liegen in der extrazellulären Matrix gebunden vor. In dieser Studie wird VEGF
165 verwendet, da es etwa hundertmal potenter ist als VEGF 121 (Keyt et al. 1996).
VEGF 165 besitzt eine Masse von 38,2 KD und besteht aus zwei identischen
Polypeptidketten mit je 165 Aminosäuren.
Die Sequenz des Proteins kann Abb. 4 entnommen werden.
10
MNFLLSWVHW 1
SLALLLYLHH 11
1 AKWSQAAPMA 21
11 EGGGQNHHEV 31
21 VKFMDYVQRS 41
31 YCHPIETLVD 51
41 IFQEYPDEIE 61
51 YIFKPSCVPL 71
61 MRCGGCCNDE 81
71 GLECVPTEES 91
81 NITMQIMRIK 101
91 PHQGQHIGEM 111
101 SFLQHNKCEC 121
111 RPKKDRARQE 131
KKSVRGKGKG 141
QKRKRKKSRY 151
KSWSVPCGPC 161
121 SERRKHLFVQ 171
131 DPQTCKCSCK 181
141 NTDSRCKARQ 191
151 LELNERTCRC 201
161 165 DKPRR 211
Abb. 4:
Translatierte Sequenz des VEGF-Gens. Aminosäuren 1–26 stellen das Signalpeptid dar, Aminosäuren
142-165 werden durch „Splicing“ entfernt. Das VEGF165 Polypeptid ist in rot gekennzeichnet (Chen,
2001)
VEGF ist zuerst als Produkt von Tumorzellen entdeckt worden (Dvorak et al. 1991,
Senger et al. 1983) konnte später aber auch in gesundem Gewebe z.B. in der Niere
(Brown et al. 1992, Iijima et al. 1993), in aktivierten Makrophagen (Fava et al. 1994),
in der Lunge (Berse et al. 1992), in der Leber und in glatten Muskelzellen (Monacci et
al. 1993) nachgewiesen werden.
VEGF zeigt hohe Affinität zu bestimmten Rezeptoren auf der Endothelzelloberfläche.
Zwei sogenannte Tyrosin-Kinase Rezeptoren reagieren sehr sensibel auf VEGF.
Zum Einen die 180 KD große fas-like tyrosin kinase (flt-1), zum Anderen der 2000
KD Kinase inset Domain-containing Receptor (KDR), wobei KDR bei Endothelzellen
den weitaus wichtigeren Rezeptor darstellt (Klagsbrun and D'Amore 1996, Shen et
al. 1998). Studien zeigen, daß VEGF ein sehr potentes und spezifisches Mitogen für
Endothelzellen ist (Ferrara and Alitalo 1999), das als einziger Wachstumsfaktor die
11
Fähigkeit besitzt, allein auf Endothelzellen proliferierend zu wirken (Ferrara and
Alitalo 1999, Keyt et al. 1996, Neufeld et al. 1999, Vernon and Sage 1999). Somit
würden z.B. Fibroblasten, von denen man vermutet, daß sie bei der Narbenbildung
beteiligt sind keinen Proliferationsstimuls erhalten. VEGF wird als eine Antwort
verschiedener Stimuli, z.B. Hypoxie, von vielen differenzierten Zellen synthetisiert
und sezerniert. VEGF ist in der Lage in vivo die Zahl der Blutgefäße und die
Permeabilität von Blutgefäßen zu steigern (Clauss et al. 1990). In der Literatur wird
aus diesem Grund auch die Bezeichnung VPF (Vasculary Permeability Factor)
verwendet (Senger et al. 1993). In vitro induziert VEGF verstärkt vaskuläre Pro-
liferation, Migration und Gefäßformung (Clauss et al. 1990).
Die hohe angiogenetische Potenz von VEGF könnte möglicherweise ein Lösungs-
ansatz sein, die geringe Vaskularisierung der unter 1.1.3 genannten Hautersätze zu
verbessern und somit die Wundheilung zu beschleunigen. Allerdings wird VEGF von
körpereigenen Proteinasen sehr schnell abgebaut besitzt daher eine extrem kurze
Halbwertszeit in vivo (Elcin et al. 2001). Um allerdings eine gesteigerte Angiogenese
über mehre Tage zu erhalten, muß ein konstanter Einfluß von pro-angiogentischen
Faktoren im Wundmilieu vorhanden sein. Durch die Bindung von VEGF an eine
Trägersubstanz könnte man eine kontinuierliche Abgabe und Wirkung von VEGF im
Wundmilieu erhalten. Ein bisher erfolgreich eingesetztes Trägermaterial in der Wund-
behandlung ist Kollagen (Friess 1998), das auch in dieser Studie als Trägersubstanz
dienen soll.
1.3 Kollagen 1.3.1 Kollagen als Gewebsersatz und Trägermaterial Gewebsersatz sollte biokompatibel und leicht zu sterilisieren sein. Weiterhin sollten
seine Abbauprodukte vom Körper leicht zu metabolisieren oder ausgeschieden
werden können. Auf der Suche nach einem geeigneten Biomaterial verweist die
Literatur häufig auf Kollagen: Kollagen eignet sich hervorragend als Grundlage für
ein Biomaterial zum Verschluss oder vollständigen Ersatz von Weichteildefekten
(Mikos et al. 1998).
12
1.3.2 Eigenschaften von Kollagen Kollagen ist ein Protein, das etwa 30% aller Körperproteine von Vertebraten
ausmacht. Mehr als 90% der extrazellulären Matrixproteine in Sehnen und Knochen
und mehr als 50% der Haut bestehen aus Kollagen. Die geringe Toxizität, die
geringe Immunogenität und die hohe Biokompabilität lassen sich auf die große
Übereinstimmung der Aminosäuresequenz zwischen den einzelnen Spezies und auf
die geringe Anzahl an aromatischen Aminosäuren zurückführen. Ferner stellt
Kollagen ein gutes Substrat für Zelladhäsion durch Integrinkleber dar und erzielt
durch chemotaktische Wirkungen eine beschleunigte Infiltration der Umgebungs-
zellen (Anselme et al. 1990, Chvapil 1977, Matton et al. 1985).
Durch den Fortschritt in der Technologie ist es mittlerweile möglich, Kollagen in
verschiedensten Formen wie Gele, Filme, Röhren oder Schwämme einzusetzen
(Ellis and Yannas 1996, Friess 1998). Dies ermöglicht den Einsatz von Kollagen in
der Klinik als Grundlage für Haut und- Bindegewebsersatz. Der größte Anteil der
kommerziell erhältlichen Hautersätze wie Alloderm® oder Integra® bestehen aus
Kollagen (s. a. 1.1.3). Nehrer (Nehrer et al. 1997) nutzte Kollagen als Gerüst für
Chondrozytenkulturen und konnte zeigen, daß allein der Kollagentyp und die Poren-
größe der Kollagenmatrix einen großen Einfluß auf Chondrozyten ausüben. Daneben
gibt es verschiedene therapeutische Möglichkeiten Kollagen als Trägesubstanz für
Medikamente zu nutzen, wie z.B. in der Ophthalmologie (Rubin et al. 1973). Dies
gelang mit Medikamenten wie Antibiotika, lokalen Anästhetika, Steroiden und
Chemotherapeutika, aber auch mit bioaktiven Molekülen wie Zytokinen oder
Wachstumsfaktoren (Friess 1998). Die durch den natürlichen Abbau von Kollagen
bedingte kontrollierte Freisetzung solcher bioaktiven Subtanzen, hat im Bereich des
Tissue Engineering einen großen Stellenwert eingenommen, denn sie ermöglicht
eine Steuerung der zellulären Aktivität und somit eine bessere Funktionssteuerung
eines gesamten Gewebekomplexes (Friess et al. 1999). Durch eine kontinuierliche
Freisetzung von Wachstumsfaktoren ließe sich z.B. Angiogenese besser
kontrollieren.
1.3.3 Struktur und natürliche Vernetzung Die verschiedenen Polypeptidketten von Kollagen bestehen aus allen 20
Aminosäuren, wobei die genaue Zusammensetzung vom Gewebetyp, in dem das
13
jeweilige Protein synthetisiert worden ist, abhängt. Die verschiedenen Variationen an
Aminosäuresequenzen haben unterschiedliche Längen der Kollagenhelizes zur
Folge. Hinzukommen noch Unterschiede in Aufbau und Länge der nicht helikalen
Anteile, so daß eine Vielzahl an verschiedenen Kollagenen existiert, die von Kollagen
Typ I bis XIX klassifiziert sind. Mehr als 90% aller fibrillösen Proteine bestehen aus
Kollagen Typ I. In Biomaterialien ist Typ I daher das mit Abstand am häufigsten und
erfolgreichsten angewandte Kollagen (Friess 1998).
Der Name Kollagen umfasst eine große Anzahl von Molekülen, die supramolekulare
Matrixstrukturen bilden. Sie bestehen alle aus 3 individuellen α-Helizes, die
biosynthetisch vernetzt und zu einer Tripplehelix (Tertiärsruktur) gefaltet sind. Die α–
Helizes sind ca. 300kD schwer, besitzen eine Länge vom etwa 300 nm und einen
mittleren Durchmesser von etwa 1,5 nm. Kollagen Typ I besteht aus zwei identischen
Peptidketten (α1) und einer dritten mit anderer Aminosäuresequenz (α2). Die
anderen Kollagentypen bestehen je aus drei identischen α1-Ketten. Die drei
linksdrehenden α-Helizes bestehen etwa aus 1000 Aminosäuren. Die Ketten sind mit
einer Distanz von 2,91 Angström und einem Winkel von –110° ineinander verdreht,
so daß der Abstand zwischen den einzelnen Glycinsäuren, die sich an jeder dritten
Stelle befindet, 8,7 Angström beträgt. Etwa 3,27 Aminosäuren beschreiben eine volle
Umdrehung der Kette.
Kollagene weisen ein sehr homogene Struktur auf: Neben Glycin, der kleinsten
Aminosäure, sind Kollagene durch einen sehr hohen Anteil an Hydroxylysin und
Hydroxyprolin charakterisiert. Diese Aminosäuren entstehen posttranslational aus
Prolin und Lysin durch die Enzyme Peptidyl-Prolin-Hydroxylase und Peptidyl-Lysin-
Hydroxylase. Bei Hydroxylysin kommt es weiterhin zu einer Glykolysierung. Dabei
wird eine unterschiedliche Anzahl von α-1,2-Glukosylgaktoseresten mit der OH-
Gruppe des Hydroxylysins verbunden; dadurch entstehen unterschiedliche
Kollagentypen, z.B. für Basalmembranen mit hohem Glykosylierungsgrad, für die
Haut mit geringerem (Junqueira and Carneiro 1996). Durch die zyklischen
Aminosäuren Prolin (Pro) und Hydroxyprolin (Hyp) wird die Tertiärstruktur stabilisiert.
Die verschiedenen Strukturen zeigt Abb. 5.
14
Abb. 5:
Struktur von Kollagen
Daneben sind Hydroxylgruppen des Hydroxyprolins an Wasserstoffbrücken-
bindungen beteiligt, die auch einen großen Anteil zur Stabilisierung beitragen. Pro
Triplet lassen sich zwei verschiedene Wasserstoffbrückenbindungen identifizieren:
zum Einen zwischen der NH-Gruppe von Glycin und der Co-Gruppe der Aminosäure
an zweiter Stelle des Triplets der gegenüberliegenden Kette und zum Anderen über
Wassermoleküle zu den Hydroxylgruppen von Hydroxyprolin an der dritten Stelle
eines Triplets. Dieses Wasserstoffbrückenmodell wurde durch physiochemische
Studien von Kollagenmolekülen in wässriger Lösung bestätigt. Es erklärt möglicher-
weise die Tatsache, daß die thermische Stabilität der Kollagenhelix stark von
Hydroxyprolin und nicht von Prolin abhängig ist. In der Literatur werden Glycin,
Hydroxyprolin und Prolin als triple-Helix bildende Aminosäuren bezeichnet, da nur
Moleküle, die diese 3 Aminosäuren enthalten, in der Lage sind, solch eine spezielle
Struktur wie eine Helix darzustellen (Zeeman et al. 1999a).
Die mechanische und chemische Stabilität des Kollagens entsteht durch intra- und
intermolekulare Verknüpfungen. Intramolekulare Verknüpfungen entstehen zwischen
zwei α-Ketten in einem nicht helikalen Abschnitt durch eine Aldolkondensation zweier
Aldehyde, die aus einer Oxidation von Lysyl-Aminogruppen durch das Enzym
Lysyloxidase hervorgehen. Brücken zwischen verschiedenen Tropokollagen-
molekülen resultieren aus einer Bindung zwischen Aldehydresten und ε-Amino-
a) Primärstruktur
Gly-Pro-y-Gly-x-Hyp
b) Sekundärstruktur
c) Tertiärstruktur d) Quartärstruktur
15
gruppen von Lysin und Hydroxilysin. Sie ermöglichen es, daß Kollagenfasern durch
eine enorme Festigkeit und Stabilität ausgezeichnet sind (Friess 1998).
1.3.4 Kollagenabbau und exogene Verknüpfungen Kollagen besitzt eine sehr hohe Widerstandskraft gegenüber neutralen Proteasen.
Diese ist auch notwendig, denn sonst hätte es keine Beständigkeit als lebens-
notwendiges Protein im Körper. Nur spezifische Kollagenasen können die native
Helix spalten.
Der Abbau von Kollagenfasern beginnt durch die Bindung von Kollagenase an die
Triple-Helizes. Nach der Aufspaltung der Tripplehelix zerteilen Enzyme wie
Gelatinase oder unspezifische Proteinasen das primäre Fragment in kleinere Peptide
und Aminosäuren. Elastase und Chatepsine unterstützen den Abbau durch ihre
Fähigkeit nichthelikale Telopeptide zu verdauen.
Der in-vivo-Abbau von Kollagen ist ein multienzymatischer und komplexer Prozess,
der daher in vitro nur vereinfacht durch den Einsatz von Kollagenase, Cathepsin,
Pepsin oder Trypsin dargestellt werden kann.
Kollagen, das nicht speziell modifiziert ist, wird im Körper schnell abgebaut. Daher
muß die Halbwertszeit von Kollagen, das länger im Körper verbleiben soll, angepasst
werden. Optimal wäre ein fließender Übergang vom Bioimplantat zu körpereigenem
Gewebe ohne ein Gewebedefizit oder –überschuss. Um eine De-novo-Synthese von
Kollagen anzuregen, wird allerdings eine biologisch aktive Form des Kollagens
benötigt. Dafür muß aus Kollagen die dreidimensionale Struktur der extrazellulären
Matrix nachgebaut werden. Da die Zellen direkt auf Kontakt des Kollagens reagieren
ist die Porengröße der Matrix von entscheidender Bedeutung (Nehrer et al. 1997).
Die daraus resultierenden hochspezifischen Zell-Matrix-Interaktionen steuern den
Ablauf des Wundheilungsprozesses (Murphy et al. 1990).
1.3.5 Künstliche Vernetzung von Kollagen Grundsätzlich gibt es zwei Möglichkeiten Kollagen zusätzlich zu stabilisieren und
somit die biologische Halbwertszeit zu erhöhen. Einerseits läßt sich eine
physikalische Vernetzung durchführen, andererseits stellt die chemische Vernetzung
eine interessante Alternative dar. Bei der physikalischen Vernetzung kommen
16
Methoden wie das Dehydrothermal Treatment (DHT) oder UV-Bestrahlung zum
Einsatz. Der Vorteil dieser Vorbehandlung von Kollagen besteht darin, daß keine
Substanzen in den lebenden Organismen gebracht werden, die potentiell gefährlich
sein könnten. Ein Nachteil der Methoden zeichnet sich allerdings dadurch aus, daß
die Kollagenmatrizes durch Verhärtungs- und Schrumpfprozesse ihre ursprüngliche
Form verlieren. Die chemische Vernetzung hingegen beruht auf der Bildung neuer
Bindungen zwischen den Kollagenmolekülen durch bestimmte Substanzen. Vorteil-
haft ist, daß bei vielen chemischen Vernetzungsmethoden die natürlichen Eigen-
schaften von Kollagengewebe, wie z.B. Flexibilität in der Matrix erhalten bleiben
(Khor 1997). Eine der am häufigsten beschriebenen Vernetzungsmethoden ver-
wendet Glutaraldehyd. Sie weist einen besonders hohen Vernetzungsgrad im
Vergleich zu anderen Substanzen, wie z.B. Formaldehyd, Epoxy-Komponenten,
Cyanamid und Acyazide auf (Jayakrishnan and Jameela 1996). Allerdings konnte
man neben Kalzifikation der mit Glutaraldehyd modifizierten Kollagenmatrizes auch
zelltoxische Rückstände bei der Zersetzung in vivo nachweisen (Doillon et al. 1994,
Zeeman et al. 1999b). Aus diesem Grund suchte man nach weiteren Substanzen,
Glutaraldehyd ersetzen zu können. Eine grundlegende Überlegung besteht darin,
Carboxyl-Gruppen eines Kollagenmoleküls mit den Aminogruppen eines anderen
Kollagenmoleküls zu verknüpfen, so daß die Substanzen die zur Vernetzung
notwendig waren letzten Endes ausgespült werden können und keine Reste von
toxischen Substanzen in der Kollagenmatrix zurückbleiben (Katalysatoreffekt). Eine
solche Art von Vernetzung wurde mit Carbodiimiden schon häufig in der Literatur
beschrieben (Wissink et al. 2001, Wissink et al. 2000a) und soll auch Grundlage
dieser Studie sein.
1.3.6 Vernetzung mit EDC/NHS Die wasserlösliche Substanz N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-Ethylcarbodiimid (EDC)
ermöglicht die Vernetzung zwischen Carboxylgruppen und Aminogruppen. EDC
aktiviert lediglich die Carboxylgruppen und ist daher in der Bindung selbst nicht
enthalten (Nimni et al. 1987). Die Zugabe des nukleophilen N-hydroxysuccinimid
(NHS) zu EDC während der Vernetzung verschiebt die Gleichgewichtsreaktion von
EDC mit den nicht aktivierten Carboxylgruppen zugunsten der aktiven Form (Olde
Damink et al. 1996). Grundsätzlich läßt sich das Vernetzugsprozedere mit EDC und
17
NHS im Kollagen folgendermaßen beschreiben: Durch die Aktivierung mit EDC
entstehen aus den Carboxylgruppen von Aspartat oder Glutamat O-Acylisourea
Gruppen. Durch Zugabe von NHS entsteht wiederum eine aktivierte Carboxylgruppe,
die an Aminogruppen von Lysin bzw. Hydroxylysin bindet (Grabarek and Gergely
1990) (s. Abb. 6). EDC/NHS ist somit nicht Bestandteil der Bindung und kann so
nicht als potentiell zytotoxische Substanz aus der Kollagenmatrix freigesetzt werden.
Die Endprodukte von EDC/NHS die aus der Reaktion hervorgehen sind wasserlöslich
und leicht durch Spülen der Matrix zu entfernen (Gratzer and Lee 2001).
Abb. 6:
Crosslink durch EDC/NHS
Durch die Vernetzung mit EDC/NHS zeigt Kollagen eine höhere Stabilität und eine
höhere enzymatische Resistenz als Glutaraldehyd. Weiterhin zeigt es eine geringe
Kalzifizierungsneigung und besitzt eine hohe Biokompatibilität (van Wachem et al.
N C
N
N ( C H 3 ) 2
N
O H
O O
C
O
O N
O
O
H 2 N - K o l l a g e n
C
O
N K o l l a g e n
H
C
O
O C
N
R2
N H
R1
R1
R2
C O O H
+
18
1994). EDC-vernetzte Kollagenmatrizes können mehr Wasser als unbehandelte
Kollagenmatrizes aufnehmen, was unter anderem Zellproliferation und –migration
unterstützt (Park et al. 2002). EDC/NHS befindet sich bei pH 6 – 7 in einem stabilen
Zustand, bei pH 5 ist es allerdings sehr reaktiv (Gilles et al. 1990). Für die
Vernetzung von Kollagen ist ein pH-Wert von 5.5 optimal (Olde Damink et al. 1996).
1.4 Bindungen von VEGF an Kollagen über Heparin 1.4.1 Heparin, Struktur und Funktion Heparin ist ein Biopolymer und gehört zu der Klasse der Mucopolysaccharride
(Glykosaminoglykane, GAGs). Es zeichnet sich in erster Linie durch seine
antikoagulatorische Wirkung aus, die den etablierten Einsatz von Heparin in der
Klinik erklärt (Classen et al. 1994). Aber auch eine lipolytische Funktion von Heparin
konnte nachgewiesen werden (Löffler and Petrides 2003). Rund 70% des Heparins
können durch sich wiederholende Dissaccharideinheiten aus 1,4-verknüpfter L-
Iduronsäure und D-Glucoamine beschrieben werden (s. Abb. 7). Die Iduronsäuren
sind an Position 2 O-Sulfatisiert und die Glucoamine an Position 6 N-Sulfatisiert. Dies
wurde auch durch nukleare Magnet-Resonanz (NMR) Spektroskopie bestätigt (Perlin
1977).
Abb. 7:
Struktur von Heparin
O O
O O O O
O
CH OH2
OH
NHSO H3
CH OH2COOH COOH
OSO H3 OSO H3
OSO H3NHSO H3
OH
OH
19
Bei physiologischem pH sind die Carboxyl- und Sulfatgruppen von Heparin ionisiert.
Dadurch ist Heparin ein starker Polyelektrolyt, der mit anderen Proteinen interagieren
und diese binden kann. Einige Plasmaproteine z.B., die normalerweise im Blut in
sehr geringer Konzentration auftreten, zeigen eine sehr hohe und spezifische
Bindungsaffinität zu Heparin. Der bekannte antithrombotische Effekt von Heparin läßt
sich möglicherweise auch durch solch eine Bindung erklären. Heparin bindet
Antithrombin über eine spezifische Pentasacharidsequenz, die nur zu einem sehr
kleinen Teil in Heparin vertreten ist. Durch diese Bindung verändert Antithrombin
seine Struktur, die zu einer etwa eintausendmal stärkeren Thrombin und Faktor Xa
Inaktivierung führt (Hirsh et al. 1998). Die lipolytische Aktivität von Heparin läßt sich
durch Formieren eines Komplexes mit Lipoproteinlipasen (LPL) erklären (Olivecrona
et al. 1977).
Heparin besitzt selbst eine angiogenetische Potenz und scheint eine sehr wichtige
Rolle in der Angiogenese zu spielen (Bombardini and Picano 1997).
1.4.2 Bindung von Heparin an Kollagen Wie bereits zuvor erwähnt läßt sich Kollagen mit EDC/NHS über Carboxylgruppen
vernetzen (s. 1.3.6). Da Heparin auch über Carboxylgruppen verfügt, besteht somit
die Möglichkeit auch Heparin kovalent an Kollagen zu binden. Dadurch entsteht ein
Biomaterial, welches zusätzlich eine angiogenetische Potenz besitzt.
Die Bindung von Heparin an Biomaterialien wurde bisher in erster Linie für die
antithrombotische Wirkung verwendet. Die Bildung von Blutgerinnsel an Blut- oder
Plasma ausgesetzten Oberflächen wie z.B. von künstlichen Gefäßen, Herzklappen
oder Katheter sollte verhindert werden (Kang et al. 1996). Neben diesen im Körper
beständigen Materialien wurde Heparin auch mit nicht beständigen Biomaterialen als
Heparin-delivery-system angewandt (Ahola et al. 2001, Yang et al. 1999), wie z.B.
Kollagen, das mit Abstand am häufigsten eingesetzte Biomaterial (s. 1.3). Diverse
Studien beschreiben die Verknüpfung von Heparin an Kollagen, da Kollagen als
thrombogenetisches Material neben Blutplättchenadhäsionen und –aggregationen
auch das intrinsische Gerinnungssystem aktiviert. Senatore et al. konnten zeigen,
daß durch an Kollagen gebundenes Heparin die genannten gerinnungsaktivierenden
Faktoren reduzieren kann (Senatore et al. 1990). Einige Arbeitsgruppen beschäftigen
sich auch mit der Wirkung von heparinisierten Kollagen auf Endothelzellen. Hier
20
konnte neben einem inhibierenden Effekt (Nojiri et al. 1987) in erster Linie eine
verstärkte Endothelzellproliferation festgestellt werden (Bos et al. 1998). Neben
diesen in-vitro-Untersuchung gibt es auch in-vivo-Studien, die zeigen, daß
heparinisiertes Kollagen als Implantat sowohl die Vaskularisierung in der Ratte
steigern (van Wachem et al. 2001) als auch die Wundheilung verbessern kann (Kratz
et al. 1998).
1.4.3 Bindung von Wachstumsfaktoren an Heparin Wachstumsfaktoren können genau wie andere Proteine an Heparin gebunden
werden. Wachstumsfaktoren, die eine besonders hohe Affinität zu Heparin haben,
werden als heparinbindende Wachstumsfaktoren bezeichnet. Zu Ihnen gehören u.a.
aFGF, bFGF und VEGF. bFGF zeigt eine proliferierende Wirkung auf Endothelzellen
in vitro und eine Gefäßzunahme in vivo (Bhora et al. 1995). Auch VEGF besitzt eine
Heparinbindungstelle und wird als sehr potenter Wachstumsfaktor beschrieben. Eine
Bindung solcher angiogenetisch hoch potenter Wachstumsfaktoren über Heparin an
Kollagen würde aufgrund des natürlichen Abbaus von Kollagen in vivo die gewünscht
kontinuierliche Freisetzung von Wachstumsfaktoren (s. 1.1.3) ermöglichen und die
natürliche Degradation der Wachstumsfaktoren verhindern (Bos et al. 1999, Doi and
Matsuda 1997, van Wachem et al. 2001). So wäre eine konstante Konzentration von
Wachstumsfaktoren und damit ein konstanter Proliferationsreiz im Gewebe
gewährleistet. Die angiogenetische Wirkung von Wachstumsfaktoren wäre durch den
Einfluß von Heparin zusätzlich potenziert. Eine so modifizierte Kollagenmatrix hat
somit ein optimales angiogenetisches Potential (s. Abb. 8).
21
Abb. 8:
Modell der modifizierten Matrix
Die hohe angiogenetische Wirkung solch einer Matrix ist bereits in der Literatur
beschrieben. Wissink zeigte, daß heparinisierte Trägermaterialen, die mit bFGF
beladen worden sind, Endothelzellproliferation in vitro und Vaskularisierung in vivo im
Gegensatz zu nicht heparinisierten Trägermaterialien steigern können (Wissink et al.
2001). Diese Studie soll ähnliche Ergebnisse mit der Kopplung von VEGF an
heparinisierte Kollagenmatrizes erzielen.
1.5 Arbeitsziel und Aufgabenstellung Ziel und Aufgabe dieser Arbeit war es:
1) den Wachstumsfaktor VEGF an eine mit Heparin und EDC/NHS modifizierte
Kollagenmatrix zu binden
2) die VEGF-Freisetzung einer solchen Matrix in vitro zu bestimmen
3) den biologischen Effekt dieser Matrix in der Zellkultur zu untersuchen
VEGF
fibrilläres Kollagen
Heparin
EDC/NHS-Vernetzung
22
2 Material 2.1 Geräte
Feinwaage Sartorius
IKA Vibrax® Janke & Kunkel
Thermoshake Gerhardt
Gefrierschrank –73°C GFl, Jürgens
Gefrierschrank –73°C Jewett
N2-Behälter Arpege
Kühlschrank 4°C Bosch
Elisareader Victor® Wallac
Elisareader Dynex Technologies
Brutschrank Heraeus
Autoklav Melag
Lamina Flow Kojair
Absaugvorrichtung Integra Biosciences
Zentrifuge Minifuge T® Heraeus
Wasserbad GFL
Mikroskop Zeiss
96-well-Immunoplate Nunc
23
24-well-Platten (d:15mm, A:1,8cm) Becton, Dickison
6-well-Platten (d:34 mm; A:9,07cm) Becton, Dickison
Kulturflaschen (250ml, 75 cm²) Greiner
Petrischalen Sarstedt
Pasteurpipetten (Glas) Brand
Beerenkanülen Braun
Stöpsel für Kanüle Braun
Skalpell Feather
10 ml-Spritzen Braun
Bechergläser 100 ml Schott Duran
Multipipette Eppendorf
Pipetus-akku® Hirschmann
Pipetten (5, 10, 25 ml) Greiner, Sarstedt
Pipetten (10, 20, 100, 1000 µl) Gilson, Eppendorf
Multichannelpipette Research pro® Eppendorf
Pipettenspitzen (10, 20, 100, 1000µl) Eppendorf
Eppendorfcups Eppendorf
Spatel Rochem
Pinzette Rochem
Reagenzgläser Greiner
Zentrifugenröhrchen 50 ml Greiner
Parafilm American National Can
24
Ceiling Tape Nunc
Neubauer-Kammer Brand
Deckplättchen BB medica
Stückzähler IVU
2.2 Reagenzien und Lösungen
Heparin (170 U/mg) Sigma
EDC Sigma
NHS Sigma
VEGF Tebu
Capture-VEGF-Antibody Tebu
Detection-VEGF-Antibody Tebu
Avidin-peroxidase Tebu
ABTS Sigma
PBS Biochrom
Tween 20 Fluka
Bovines Serumalbumin (BSA) Sigma
Kollagenase Typ I Worthington
Kollagenase CLS1 (210 U/ml) Biochrom
NaCl 0,9% Delta-Pharma
Trypsin-EDTA PAA
25
Alkohol 70% Hofmann
0,2-mol-Na2HPO4 Merck
4 mol-NaCl Merck
bidestiliertes H2O Uk Aachen
MES-Puffer (ph= 5,6) Merck
0,05-mol 2-Morpholinoethansulonsäure Merck
HEPES-Puffer Merck
Trypsin-EDTA Merck
Zellkulturrmedium A Bio Whittaker
EBM-2, Clonetics®
Mit folgenden Zusätzen:
FBS, 10 Ml
Hydrocortison, 0,2 Ml
HFGF-B, 2Ml
R³-IGF-1, 0,5 Ml
VEGF, 0,5 Ml
Ascorbinsäure, 0,5 Ml
HEGF, 0,5 Ml
GA-1000, 0,5Ml
Heparin, 0,5 Ml
Zellkulturmedium B Bio Whittaker
EBM-2, Clonetics®
Mit folgenden Zusätzen:
FBS, 10 Ml
26
Hydrocortison, 0,2 Ml
R³-IGF-1, 0,5 Ml
Ascorbinsäure, 0,5 Ml
HEGF, 0,5 Ml
GA-1000, 0,5Ml
Heparin, 0,5 Ml
BrdU-Kit Roche
Mit folgenden Zusätzen:
BrdU-Lösung
FixDenat®
Detection-BrdU-Antibody
Anitbody-Verdünnungs-Lsg
Waschpuffer (PBS)
Substratlösung
2.3 Trägermaterial
Kollagen Suwelack Skin & Health Care AG
2.4 Zellen HUVECs Marienhospital Aachen
(Human umbilical vein endothelial cells)
27
3 Methoden 3.1 Herstellung der modifizierten Schwämme Beim verwendeten Kollagen handelt es sich um Kollagen Typ I, das aus Rinderhaut
isoliert worden ist. Hergestellt wird es von der Firma Suwelack Skin & Health Care
AG, Billerbeck, die durch bestimmte thermische Verfahren eine uniforme
Mikrostruktur mit einer Porengröße von ca. 40 µm im bovinen Kollagen erreicht. Das
Produkt ist zertifiziert unter GMP Bedingungen lieferbar. Die weitere Modifizierung
erfolgte nach Steffens et al (Steffens et al. 2003).
Das Kollagen wird mit einem Skalpell in würfelförmige Schwämme mit einer Größe
von 5*5*5 mm (3,8- 4,2 mg) oder 10*10*10 mm (24- 26 mg) geschnitten (s. Abb. 9).
Abb. 9:
Kollagenschwämme
28
Die Carboxylgruppen des für die Modifizierung benötigten Heparins (Hep-COOH)
werden mit EDC/NHS für 10 min bei 37°C in 0,05-mol 2-Morpholinoethansulonsäure
(MES-Puffer, pH= 5,6) aktiviert. Das Gewichtsverhältnis von Heparin und EDC/NHS
in der Lösung wird variiert und ist kennzeichnend für die Modifikation des
Kollagenschwammes. Die nativen Schwämme werden für vier Stunden bei 37°C
unter leichtem Schütteln in der erstellten Lösung inkubiert. Anschließend werden die
Schwämme gründlich in 0,2 mol-Na2HPO4 (über 2 h), in 4 mol-NaCl (viermal in 24 h)
und destilliertem Wasser (viermal in 24 h) gewaschen. Die modifizierten Kollagen-
schwämme werden nun bei –70°C über Nacht gefroren und anschließend für 12 h
lyophilisiert. Bis zu ihrer Verwendung werden die modifizierten Kollagenschwämme in
geschlossenen Reagenzgläsern bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Wie bereits zuvor erwähnt spielt das Massenverhältnis von EDC/NHS und Heparin
eine wichtige Rolle. Ein Kollagenschwamm, der in einer Lösung inkubiert wird, die 1
mg Heparin und 1 mg EDC/NHS pro 500 µl Lösung enthält, wird z.B. als „H1E1“
bezeichnet. Somit erhält man durch Variierung der Massenverhältnisse von Heparin
und EDC/NHS eine ganze Reihe von verschieden modifizierten Schwämmen,
ausgehend vom nativen, unbehandelten Schwamm H0E0 bis zum einfach
heparinisierten und stark vernetzten Schwamm H1E2. Die Nomenklatur der
verschiedenen Schwämme ist in Tabelle 1 nochmals dargestellt.
Tabelle 1:
Unterschiedlich modifizierte Kollagenschwämme nach Steffens et al. Die in schwarz
gedruckten Schwämme sind Teil der Studie.
H1E2 H0E2
2 mg EDC
H1E1 H0E1 1 mg EDC
H1E0 H0E0 0 mg EDC
1 mg Heparin
0 mg Heparin
In 500µl Lsg
29
Alle in der Zellkultur verwendeten Schwämme werden folgendermaßen sterilisiert:
Die Schwämme lagern vorerst für 24 Stunden in 70%igen Ethanol, anschließend für
weitere 24 Stunden in 0,9%igen NaCl und schließlich für 24 Stunden in Zellkultur-
medium (B).
3.2 Quantitative Bestimmung von VEGF mittels ELISA 3.2.1 Prinzip des ELISA Mit Hilfe eines ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) lassen sich
spezifische Antigene quantitativ nachweisen. Das Prinzip dieses Assays beruht auf
der immunspezifischen Bindung von Antigenen und den zugehörigen Antikörper
(Sandwich-Prinzip). Ein für das zu untersuchende Antigen spezifischer monoklonaler
Antikörper (Capture-Ab) wird auf dem Boden einer Mikrotiterplatte adsorbiert. Die
verschiedenen Proben werden aufgetragen und das vorhandene Antigen gebunden.
Ein weiterer enzymgekoppelter spezifischer Antikörper (Detection-Ab) wird
aufgetragen und bindet an das Antigen (s. Abb. 10). Anschließend wird eine
Substratlösung zugefügt, die sich durch das gebundene Enzym verfärbt. Diese
Farbentwicklung ist der Menge an gebundenen und somit in den aufgetragenen
Lösungen vorhandenen Antigenen proportional und kann über das Lambert-
Beer´sche Gesetz photometrisch bestimmt werden.
Abb. 10:
Prinzip des Sandwich-ELISA
Enzymgekoppelter spezifischer Antikörper
Antigen (z. B. VEGF)
spezifischer Antikörper am Boden des Wells
30
3.2.2 Durchführung des VEGF-ELISA In jedes well einer 96-well-Platte werden 100 µl der VEGF-Capture-Ab-Lösung (0,5
µg/ml) pipettiert. Die Platte wird mit Hilfe eines Tapes verschlossen und über Nacht
(min. 12 h) bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wird viermal mit einem
Waschpuffer (0,5 ml Tween 20 in 1 l PBS) gewaschen (400 µl/well) und die nicht
durch Antikörper belegten Anteile des Plattenbodens mittels einer Block-Lösung (1%
BSA in PBS) (300 µl/well) unspezifisch belegt. Nach erneut viermaligem Waschen
wird ein mit dem verwendeten VEGF erstellter Messstandard aufgetragen. Von den
unterschiedlich konzentrierten VEGF-Standardlösungen (2560, 1280, 640, 160, 40
und 0 pg/ml) werden je 100 µl in zwei wells pipettiert (insgesamt zwölf wells für den
Standard). Die restlichen wells werden mit 100 µl/well der zu untersuchenden VEGF-
Lösung gefüllt und die ganze Platte für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Platte wird nochmals viermal gewaschen und in jedes well 100 µl einer
Peroxidase-Lösung pipettiert, die eine weitere halbe Stunde bei Raumtemperatur
inkubiert wird. Um absolut alle Rückstände des Enzyms zu entfernen wird die Platte
zehnmal gewaschen und nun 100 µl der ABTS-Substrat-Lösung aufgetragen. Die zu-
nehmende Farbentwicklung wird mittels Victor®-ELISA-Reader bei 405 nm durch
Messen der Absorption beobachtet. Die Messung, in der der höchste Wert der
VEGF-Standardkurve eine Absorption von 1,2 noch nicht überschreitet wird für die
Auswertung herangezogen.
3.2.3 Bestimmung der VEGF-Stabilität in vitro 2 ml einer VEGF-Lösung (3000 pg/ml) werden über 48 Stunden in einem
Reagenzglas permanent leicht geschüttelt. Zu den Zeitpunkten 0, 1, 3, 24 und 48 h
werden Proben von je 250 µl entnommen und bei –70°C eingefroren. Spätestens
nach 48 Stunden werden alle Proben aufgetaut, um im ELISA gemessen zu werden.
Die in vitro Stabilität von VEGF wird so über 48 Stunden ermittelt.
Mit einer weiteren 2 ml VEGF-Lösung (3000 pg/ml) wird ähnlich verfahren, nur daß
der Lösung von Beginn an Kollagenase (160 u/ml) zugesetzt wird. Der Einfluß von
Kollagenase über 48 Stunden auf die VEGF-Stabilität soll somit bestimmt werden.
Beide Versuchsreihen werden bei Raumtemperatur und bei 37°C durchgeführt um
einen möglichen Einfluß der Temperatur auf die Stabilität von VEGF zu erkennen.
31
3.2.4 VEGF-Freisetzung der modifizierten Schwämme in vitro Modifizierte Kollagenschwämme (s. 3.1) vom Typ H0E0, H0E1, H1E1 und H1E2
(Größe: 5*5*5 mm) werden auf mögliche unterschiedliche VEGF-Freisetzungs-
Kinetiken untersucht. Je ein Schwamm wird mit Hilfe einer Pinzette in ein
Reagenzglas gelegt und mit 100 µl einer VEGF-Lösung (100 ng/ml) versetzt, so daß
jeder Schwamm mit 10 ng VEGF beladen ist. Die Reagenzgläser werden mit
Parafilm verschlossen und für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Bei Versuchsstart (t=0) werden 1 ml Diluent (0,5 ml Tween 20 in 1 l PBS mit 1%
BSA) in die Reagenzgläser gegeben und nun die Schwämme über 48 Stunden
permanent geschüttelt. An den Messzeitpunkten t=0, 1, 3, 24 und 48 h wird die
überschüssige Flüssigkeit in den Reagenzgläsern in Eppendorfcups gegossen und
bis zur Auswertung durch ELISAs (max. 48 h) bei -70°C eingefroren. Bei jeder
Probenentnahme wird die abgenommene Flüssigkeit erneut durch 1 ml Diluent
ersetzt. Spätestens nach 48 Stunden werden alle Proben aufgetaut um im ELISA
gemessen zu werden.
Eine weitere Versuchsreihe wird analog durchgeführt, nur daß zusätzlich
Kollagenase zugeführt wird. Das mit Kollagenase versetzte Diluent (160 u/ml) wird
stets erst kurz vor Gebrauch angesetzt und bei allen Messzeitpunkten (jeweils 1 ml)
anstatt des unbehandelten Diluents zugegeben.
Beide Versuchsreihen werden jeweils bei Raumtemperatur und bei 37°C durch-
geführt.
Eine zusätzliche Versuchsreihe basiert auf einer Kombination der beiden zuvor
genannten. Bis einschließlich zum Messzeitpunkt t=3 h wird die entnommene
Lösungen durch Diluent ohne Kollagenase ersetzt. Ab t=24 h Stunden erfolgt der
Ersatz durch das bereits beschriebene kollagenasehaltige Diluent.
32
3.3 Bestimmung von biologischen Effekten modifizierter Kollagenschwämme in der Zellkultur
3.3.1 Zellkultivierung von HUVECs 3.3.1.1 Isolierung
HUVECs (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) sind Endothelzellen, die aus
venösem Blut humaner Nabelschnüre isoliert werden. Die Vorgehensweise zur
Isolierung entspricht der von Jaffe et al. beschriebenen Methode (Jaffe et al. 1973).
Grundsätzlich sind alle verwendeten Materialen, die in direktem Zellkontakt stehen,
vorher autoklaviert worden. Für die Isolierung der Endothelzellen werden die
Nabelschnüre bis zur weiteren Verarbeitung in HEPES-Transport-Puffer gelagert.
Innerhalb von maximal zwei Tagen sollte die Isolierung der Endothelzellen erfolgen.
Hierzu wird die Vena umbilicalis an beiden Enden kanüliert und zweimal mit sterilem
HEPES-Puffer gespült, um Blutreste und –koagel zu entfernen. Zum Ablösen der
Endothelzellen wird die Vene mit einer 0,1%igen Kollagenase-HEPES-Lösung
gefüllt, in ein Gefäß mit HEPES-Puffer gegeben und zehn Minuten im Wasserbad
bei 37°C inkubiert. Mit 10 ml Medium (A) werden die Zellen in ein
Zentrifugenröhrchen gespült. Durch die Calciumionen wird die Aktivität der
Kollagenase gestoppt. Nach zehn Minuten Zentrifugation (1200 Umdrehungen/min ≈
300 g) wird der Überstand dekantiert, das Zellpellet in 5 ml Medium erneut
resuspendiert und die Lösung in eine vorgewärmte Kulturflasche überführt. Im
Brutschrank werden die Zellen bei einer Atmosphäre mit 5% CO2, 10% O2, 95%
Luftfeuchtigkeit und bei einer Temperatur von 37°C inkubiert.
3.3.1.2 Zellwachstum
Während der Wachstums- und Proliferationsphase werden die Zellen täglich
lichtmikroskopisch begutachtet. Es wird auf Proliferation, Zellform und –dichte und
mögliche Kontamination z.B. durch Bakterien oder Pilze geachtet. Zweimal pro
Woche werden die Zellen mit frischem Endothelzellmedium (A) versorgt (ca. 10 ml/
Kulturflasche). Sobald sich ein konfluenter Zellrasen in der Kulturflasche gebildet hat,
erfolgt eine Zellpassage.
33
3.3.1.3 Zellpassage
Zuerst wird das Medium abgesaugt und die Zellen mit 10 ml sterilem PBS zweimal
gespült. Anschließend werden die Zellen mit ca. 3 ml Trypsin-EDTA-Lösung fünf
Minuten bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von weiteren 7 ml Medium wird Trypsin
inaktiviert. Die Zellsuspension wird anschließend zentrifugiert (1200 Um-
drehungen/min ≈ 300 g). Die Aussaht erfolgt im Verhältnis 1:3, d.h. mit den Zellen
einer Flasche werden drei neue Flaschen beschickt. Für die Experimente dieser
Studie wurden ausschließlich Zellen der zweiten Passage (P2) verwendet.
3.3.2 Bestimmung des proliferativen Effektes modifizierter
Kollagenschwämme in der 24-well-Platte HUVECs werden entsprechend einer Zellpassage aus der Kulturflasche abgelöst,
zentrifugiert und mit 5 ml Endothelzellmedium (B) resuspendiert. Es erfolgt eine
Bestimmung der Zellzahl durch die Neubauer-Kammer (s. 3.3.5) und Verdünnung mit
Endothelzellmedium (B) auf 20000 HUVECs/ml. In jedes well einer 24-well-Platte
werden 500 µl dieser Zellsuspension gegeben, so daß jedes well 10000 Zellen
enthält (5555 Zellen/cm²). Bei einer zweiten Versuchsreihe wird die Zellsuspension
auf 50000 HUVECs/ml verdünnt, so daß jedes well 25000 Zellen enthält. Dies ent-
spricht einer Zelldichte von 13888 Zellen/cm². Um die Zellen am Boden der wells
adhärieren zu lassen, werden die 24-well-Platten für 24 Stunden im Brutschrank
inkubiert.
Falls die Zelladhäsion regelrecht und ohne Kontamination verläuft, beginnt der
Versuch mit den zu untersuchenden Kollagenschwämmen (t=0 d). Es handelt sich
dabei um Kollagenschwämme der Größe 5*5*5 mm und der Gruppen H0E0, H0E1
und H1E1. Die in Medium (B) schwimmenden Schwämme werden auf eine
Petrischale gelegt und vorsichtig mit einer Pinzette ausgedrückt. Von jeder Gruppe
werden pro Platte sechs Schwämme verwendet von denen jeweils drei mit 25 ng
VEGF (in 50 µl) beladen werden. Die Schwämme werden anschließend für zwei
Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Absaugen des Mediums aus den
wells, werden die Schwämme mit einer Pinzette in die Mitte des jeweiligen wells
gelegt. Die genaue Anordnung kann Abb. 11 entnommen werden. Abb. 12 zeigt eine
Aufnahme der 24-well-Platte mit den Schwämmen in Kultur.
34
Abb. 11
Schematische Darstellung der Versuchsanordnung in der 24-well-Platte
Abb. 12:
Kollagenschwämme in der 24-well-Platte
V
VV V
H1E1
H0E1
H0E0
+VEGF +VEGF +VEGF25000 Huvecs/ Well
V
VVV
VVV
VV
35
Die wells werden vorsichtig wieder mit 500 µl Endothelzellmedium (B) aufgefüllt,
ohne daß der Schwamm aus seiner zentralen Position im well verrutscht.
Die Zugabe von VEGF für die Kontrollgruppen ohne Schwamm erfolgt direkt ins
Medium. Die Platten werden anschließend im Brutschrank inkubiert. Die Platten
werden entweder am ersten, dritten oder fünften Tag nach Aufgabe der Schwämme
mittels BrdU-Test (s. 3.3.5) oder Zellzählung in der Neubauer-Kammer (s. 3.3.6)
untersucht. Mediumwechsel finden am ersten, dritten und fünften Tag statt.
3.3.3 Bestimmung des proliferativen Effektes modifizierter Kollagenschwämme in der 6-well-Platte
Der Versuchsablauf in den 6-well-Platten ist prinzipiell vergleichbar, zu den
Versuchen mit 24-well-Platten. HUVECs werden entsprechend einer Zellpassage aus
der Kulturflasche abgelöst, zentrifugiert und in Endothelzellmedium (B)
resuspendiert. Nach Bestimmung der Zellzahl in der Neubauer-Kammer (s 3.3.6)
erfolgt allerdings eine Verdünnung auf 62500 HUVECs/ml. In jedes well werden 2 ml
der Zellsuspension gegeben, so daß 125000 HUVECs/well enthalten sind. Dies
entspricht einer Zelldichte von 13888 Zellen/ml, also identisch mit der Zelldichte der
zweiten Versuchsreihe mit 24-well-Platten. Der weitere Versuchsablauf wird in
gleicher Weise wie mit 24-well-Platten durchgeführt, nur daß größere Schwämme
(10*10*10 mm) verwendet werden, die mit 100 ng VEGF (in 400 µl) beladen sind.
Eine mögliche Anordnung kann Abb. 13 entnommen werden. Abb. 14 zeigt eine
Aufnahme der 6-well-Platte mit Schwämmen in Kultur.
36
Abb. 13:
Schematische Darstellung der Versuchsanordnung in der 6-well-Platte
Abb. 14:
Kollagenschwämme in der 6-well-Platte
H0E0
+VEGF125000 Huvecs/ Well
V
V
37
Die Zellzählung in der Neubauer-Kammer erfolgt am ersten, dritten oder fünften Tag.
3.3.4 Ermittlung der VEGF-Freisetzung modifizierter Schwämme in der Zellkultur
Bei dem unter 3.3.2 beschriebenen Versuchsablauf mit 24-well-Plattten wird
zusätzlich vor jedem Mediumwechsel 200 µl des sich in Kultur befindenden
verbrauchten Mediums in Eppendorfcups abpipettiert und bei –70°C eingefroren.
Damit werden Proben der Medien von t=0 d bis t=1d, t=1 d bis t=3 d und t= 3 d bis
t=5 d der verschiedenen Schwämme gewonnen, die auf VEGF-Konzentration im
ELISA (s. 3.3.2) untersucht werden. Im zeitlichen Verlauf läßt sich somit die VEGF-
Freisetzungskinetik der verschiedenen Schwämme in der Zellkultur bestimmen.
3.3.5 Ermittlung der Zellproliferation mittels BrdU-Test 3.3.5.1 Prinzip des BrdU-Test
Der BrdU-Test ist ein Zellproliferationstest, der eine Alternative zu dem radioaktiven
[³H]-Thymidin-Test darstellt. BrdU (5´-Bromo-2-desoxyuridin) ist ein Thymidin-
analogon, das von proliferierenden Zellen anstelle von Thymidin in die DNA
eingebaut wird. Nach einer bestimmten Inkubationszeit werden mit einer speziellen
Denaturierungslösung die Zellen zerstört und die BrdU-haltige DNA freigesetzt. Mit
Hilfe eines enzymgekoppelten spezifischen monoklonalen Antikörpers wird die BrdU-
haltige DNA nach dem ELISA-Prinzip (s. 3.2.1) markiert. Durch die Zugabe einer
Substratlösung kann die Menge an BrdU-haltiger DNA photometrisch bestimmt
werden. Die Menge an BrdU-haltiger DNA ist der Proliferationsrate der untersuchten
Zellen proportional.
3.3.5.2 Durchführung des BrdU-Test
Die für den jeweiligen Tag zur Auswertung vorgesehene 24-well-Platte wird dem
Brutschrank entnommen und das Endothelzellmedium (B) durch frisches ersetzt. Die
Schwämme werden mit einer Pinzette aus den wells genommen und in 70% Ethanol
zur histologischen Untersuchung eingelegt (s. 3.4). In zwei Kontroll-wells wird 50 µl
70% Ethanol gegeben um eine weitere Proliferation zu unterbinden. Der an diesen
38
beiden wells photometrische gemessene Wert stellt somit den Nullwert der
Zellproliferation dar. 13 µl der BrdU-Lösung (Markierungsreagenz) werden mit 1,287
ml Endothelzellmedium (B) auf 1:100 verdünnt und 50 µl dieser Lösung in jedes well
pipettiert. Die Platte wird nun für zwei Stunden bei 37°C im Brutschrank inkubiert.
Anschließend wird die BrdU-Lösung abgesaugt und 500 µl der FixDenat®-
Lösung/well aufgetragen. Nach 30 Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur wird
die Lösung abgesaugt und die Platte auf Filterpapier ausgeklopft. Es folgt die
Applikation von 400 µl/well der Detection-BrdU-Antibody-Lösung, von der unmittelbar
zuvor 120 µl der Originallösung mit 11,88 ml Antibody-Verdünnungs-Lösung
verdünnt worden sind. Diese wird für weitere 90 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend wird das Antikörperkonjugat abgesaugt, jedes well dreimal
mit 2 ml Waschpuffer gespült und abgesaugt und die gesamte Platte auf Filterpapier
ausgeklopft. Nach Zugabe von 400 µl Substratlösung pro well und 10 minütiger
Inkubationszeit bei Raumtemperatur wir die Farbreaktion durch die Zugabe von 100
µl H2SO4 gestoppt. Innerhalb von fünf Minuten wird nun die Zellproliferation durch
Messen der Absorption am ELISA-Reader (Dynex-Technologies) bestimmt.
3.3.6 Ermittlung der Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Kammer Die zur Auswertung vorgesehene 24- bzw. 6-well-Platten werden dem Brutschrank
entnommen und das Medium wird abgesaugt. Die 24-well-Platten werden je zweimal
mit 1 ml/well PBS gespült und es wird 300 µl/well Trypsin-EDTA-Lösung aufgetragen.
Nach einer Inkubationszeit von fünf Minuten im Brutschrank wird die Trypsinlösung
mit 700 µl/well Zellmedium neutralisiert. Mit den 6-well-Platten wird in analoger
Weise verfahren, nur daß 4 ml PBS, 1 ml Trypsin und 2 ml Medium pro well
verwendet werden.
Die Neubauer-Kammer wird mit einem Deckplättchen durch Adhäsionskräfte
abgedeckt. Das verwendete Modell der Neubauer-Kammer enthält zwei Kammern,
die beide mit der zu untersuchenden Zellsuspension gefüllt werden. Unter dem
Mikroskop lassen sich pro Kammer vier große Quadrate identifizieren, die je aus 16
kleineren Quadraten bestehen. Abb. 15 stellt schematisch eine Zählkammer dar.
39
Abb. 15:
Zählfelder der Neubauer-Kammer
In beiden Kammern werden alle vier großen Quadrate mit dem Zähler ausgezählt.
Beide Kammern werden anschließend nach Reinigung der Kammern mit 70%-
Ethanol erneut mit einer Probe der gleichen Zellsuspension gefüllt und ausgezählt.
Insgesamt werden somit für eine bestimmte Probe 16 große Quadranten ausgezählt.
Die Zellzahl pro ml kann mit folgender Formel berechnet werden.
Zellzahl gezählte Zellzahl ----------- = --------------------------------- X 10000 ml Anzahl der großen Quadrate
40
3.4 Histologische Untersuchung Die aus den 24-well-Platten entnommenen Kollagenschwämme (s. 3.3.5.2) werden in
Plastikgitternetze gelegt und in einem Becherglas in 70%-Ethanol eingelegt. Nach
der Einbettung in Paraffin werden histologische Schnitte erstellt und diese mit
Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt. Die H.E.-Färbungen werden auf Zelladhäsionen
oder Migrationen in die verschiedenen Schwämme in unterschiedlichen Vergrös-
serungen unter dem Mikroskop untersucht.
3.5 Datenverarbeitung und statistische Auswertung Die Weiterverarbeitung und Strukturierung der Daten wurde mit dem Programm
Microsoft Exel® durchgeführt. Nach Beratung durch das Institut für medizinische
Statistik der RWTH Aachen (Direktor: Prof. Dr. rer. nat. R.-D. Hilgers) dienten als
Signifikanztests die einfaktorielle Annova und der T-Test. Als Statistikprogramm
wurde SPSS für Windows eingesetzt. Aufgrund der explorativen Datenanalyse im
Bereich der Grundlagenforschung wurde auf die Adjustierung des Signifikanzniveaus
verzichtet. Die statistischen Tests wurden somit auf einem lokalem Signifikanzniveau
von 5% durchgeführt.
41
4 Ergebnisse 4.1 ELISA-Messungen 4.1.1 VEGF-Stabilität in vitro Die Abb. 16-19 zeigen den prozentualen Anteil der zu Anfang gegebenen VEGF-
Menge, die nach den Messzeitpunkten (t=0, 1, 3, 24, 48 h) bei Raumtemperatur und
37°C jeweils ohne und unter dem Einfluß von Kollagenase (160 U/ml) noch im ELISA
nachzuweisen ist.
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60
Zeit (h)
VEG
f (%
)
Abb. 16:
VEGF-Stabilität in vitro bei Raumtemperatur (n=9)
42
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60
Zeit (h)
VEG
F (%
)
Abb. 17:
VEGF-Stabilität in vitro bei Raumtemperatur unter Einfluß von Kollagenase (160 U/ml) (n=9)
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60
Zeit (h)
VEG
F(%
)
Abb. 18:
VEGF-Stabilität in vitro bei 37°C (n=9)
43
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60
Zeit (h)
VEG
F (%
)
Abb. 19:
VEGF-Stabilität in vitro bei 37°C unter Einfluß von Kollagenase (160 U/ml) (n=9)
Eine signifikante Veränderung der VEGF-Menge im Messzeitraum von 48 Stunden
kann in keiner der Versuchsanordnungen nachgewiesen werden.
4.1.2 VEGF-Release-Kinetik in vitro 4.1.2.1 VEGF-Freisetzung der modifizierten Kollagenschwämme in vitro ohne
Einfluß von Kollagenase
Abb. 20 zeigt die VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme (H0E0, H0E1, H1E1,
H1E2) zu den verschiedenen Messzeitpunkten (t=0, 1, 3, 24, 48 h) bei
Raumtemperatur. Die VEGF-Menge ist prozentual von der anfangs applizierten
VEGF-Menge angegeben (100%=10ng).
44
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 3 24 48
Messzeitpunkte (h)
VEG
F (%
) H0E0H0E1H1E1H1E2
Abb. 20:
VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme bei Raumtemperatur (n=9)
Nach 24 Stunden zeigt sich eine signifikant höhere VEGF-Abgabe von H0E0
gegenüber H1E1 (p=0,001) und H1E2 (p<0,001). Die maximale VEGF-Freisetzung
nach 48 Stunden zeigt H0E0 mit durchschnittlich 8,5% der aufgetragenen Menge.
Sie ist somit signifikant höher als die der modifizierten Schwämme (alle p<0,001).
In Abb. 21 sind die kumulativ freigesetzten Mengen von VEGF über den Versuchs-
zeitraum von 48 Stunden dargestellt.
45
05
1015202530
0 20 40 60Zeit (h)
VEG
F (%
) H0E0H0E1H1E1H1E2
Abb. 21:
VEGF-Freisetzung (Summe) der Kollagenschwämme bei Raumtemperatur (n=9)
Die Summierung der Ergebnisse zeigt nach 24 Stunden eine signifikant höhere
VEGF-Freisetzung von H0E0 (beide p<0,001) und H0E1 (p=0,001; p=0,014)
gegenüber den mit Heparin modifizierten Kollagenschwämmen (H1E1, H1E2). Die
insgesamt höchste freigesetzte Menge von VEGF zeigt H0E0 nach 48 Stunden. Sie
ist signifikant höher als die von H0E1, H1E1 und H1E2 (alle p<0,001). Weiterhin zeigt
auch H0E1 eine signifikant höhere Freisetzung als die beiden heparinisierten
Schwämme H1E1 (p<0,001) und H1E2 (p<0,001).
Abb. 22 zeigt den gleichen Versuch bei einer Temperatur von 37°C. Die VEGF-
Menge ist prozentual von der anfangs applizierten VEGF-Menge angegeben
(100%=10ng).
46
-5
0
5
10
15
20
25
0 1 3 24 48
Messzeitpunkt (h)
VEG
F (%
)
H0E0H0E1H1E1H1E2
Abb. 22:
VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme bei 37°C (n=9)
Nach drei Stunden zeigt sich eine signifikant höhere VEGF-Abgabe von H0E0 und
H0E1 gegenüber den heparinisierten Kollagenschwämmen H1E1 (p=0,001) und
H1E2 (p=0,001). Zum Messzeitpunkt nach 24 Stunden läßt der unbehandelte
Schwamm (H0E0) die höchste VEGF-Freisetzung erkennen, die sich signifikant
höher darstellt als die aller anderen Schwämme (p=0,004; p=0,007; p=0,001). Die
maximale VEGF-Freisetzung nach 48 Stunden zeigt H0E0 mit durchschnittlich 16,2%
der applizierten Menge nach 48 Stunden. Sie ist signifikant höher als die der
modifizierten Schwämme (alle p<0,001). Weiterhin zeigt auch der einfach vernetzte
Kollagenschwamm (H0E1) nach 48 Stunden eine signifikant größere VEGF-
Freisetzung als die mit Heparin Modifizierten (H1E1, H1E2) (p=0,032; p<0,001).
In Abb. 23 sind die kumulativ freigesetzten Mengen von VEGF über den
Versuchszeitraum von 48 Stunden dargestellt.
47
0
10
20
30
40
50
0 20 40 60Zeit (h)
VEG
F (%
) H0E0H0E1H1E1H1E2
Abb. 23:
VEGF-Freisetzung (Summe) der Kollagenschwämme bei 37°C (n=9)
Auch bei 37°C ist die insgesamt freigesetzte VEGF-Menge von H0E0 nach 24 und
48 Stunden signifikant höher als die aller modifizierten Kollagenschwämme (alle
p<0,001 außer nach 24 Stunden H0E0 vs. H0E1: p=0,029). Auch der einfach
vernetzte Schwamm (H0E1) zeichnet sich sowohl nach 24 Stunden (p=0,003;
p<0,001) als auch nach 48 Stunden (p=0,002; p<0,001) durch eine signifikant höhere
Freisetzung gegenüber den heparinisierten Kollagenschwämmen (H1E1, H1E2) aus.
4.1.2.2 VEGF-Freisetzung der modifizierten Kollagenschwämme in vitro unter
Einfluß von Kollagenase
Abb. 24 zeigt die VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme (H0E0, H0E1, H1E1,
H1E2) zu den verschiedenen Messzeitpunkten (t=0, 1, 3, 24, 48 h) bei
Raumtemperatur unter dem Einfluß von Kollagenase (160 u/ml). Die VEGF-Menge
ist prozentual von der anfangs applizierten VEGF-Menge angegeben (100%=10ng).
48
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
0 1 3 24 48
Messzeitpunkte (h)
VEG
F (%
) H0E0H0E1H1E1H1E2
Abb. 24:
VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme bei Raumtemperatur unter Einfluß von
Kollagenase (160 U/ml) (n=9)
Der unbehandelte Kollagenschwamm (H0E0) zeigt seine höchste VEGF-Freisetzung
beim Messzeitpunkt nach drei Stunden. Sie ist mit 40% signifikant höher als die der
übrigen Schwämme (alle p<0,001). Die mit Heparin modifizierten Kollagen-
schwämme (H1E1, H1E2) weisen ihre höchste Freisetzung zum Messzeitpunkt nach
24 Stunden auf, die mit 50% zu diesem Zeitpunkt auch signifikant höher liegen als
die des nativen (H0E0) (beide p<0,001) und des einfachen vernetzten
Kollagenschwammes (H0E1) (p=0,01; p= 0,017).
Die kumulativ freigesetzten Mengen von VEGF über den Versuchszeitraum von 48
Stunden zeigt Abb. 25.
49
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60
Zeit (h)
VEG
F (%
) H0E0H0E1H1E1H1E2
Abb. 25:
VEGF-Freisetzung (Summe) der Kollagenschwämme bei Raumtemperatur unter Einfluß von
Kollagenase (160 U/ml) (n=9)
Im Durchschnitt werden bei allen Schwämmen zwischen 70% und 90% des
applizierten VEGF nachgewiesen. Signifikante Unterschiede der VEGF-Freisetzung
zeigen sich beim Messzeitpunkt nach drei Stunden. Der unbehandelte
Kollagenschwamm (H0E0) zeigt hier eine höhere Gesamtfreisetzung als die
Modifizierten (alle p<0,001). Unter den modifizierten Kollagenschwämmen zeigt der
einfach vernetzte Schwamm (H0E1) eine signifikant höhere VEGF-Freisetzung als
die Heparinisierten (H1E1, H1E2) (beide p<0,001). Zum Messzeitpunkt nach 48
Stunden zeigen die Schwämme H0E0, H1E1 und H1E2 wieder eine etwa gleich
hohe VEGF-Gesamtfreisetzung um 90%.
Abb. 26 zeigt den gleichen Versuch bei einer Temperatur von 37°C. Die VEGF-
Menge ist prozentual von der anfangs applizierten VEGF-Menge angegeben
(100%=10ng).
50
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 1 3 24 48
Messzeitpunkte (h)
VEG
F (%
)
H0E0H0E1H1E1H1E2
Abb. 26:
VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme bei 37°C unter Einfluß von Kollagenase (160 U/ml) (n=9)
Der unbehandelte Kollagenschwamm (H0E0) zeigt seine höchste VEGF-Freisetzung
beim Messzeitpunkt nach einer Stunde. Sie ist mit 37,5% signifikant höher als die der
übrigen Schwämme (alle p<0,001). Auch der einfach modifizierte Schwamm läßt hier
eine signifikant höhere Freisetzung als die mit Heparin modifizierten Schwämme
(H1E1, H1E2) erkennen (p=0,005; p<0,001). Nach drei Stunden kann der native
Schwamm (H0E0) signifikant von H1E2 abgegrenzt werden (p=0,008). Die mit
Heparin modifizierten Kollagenschwämme (H1E1, H1E2) wiederum zeigen hohe
Freisetzungen von VEGF nach 24 Stunden. Diese stellen sich signifikant höher als
die der Schwämme H0E1 (p= 0,002; p=0,003) und H0E0 (beide p<0,001) dar. Auch
nach 48 Stunden ist die VEGF-Freisetzung gegenüber den Schwämmen H0E1
(beide p=0,006) und H0E0 (beide p<0,001) weiterhin signifikant erhöht.
In Abb. 27 sind kumulativ freigesetzten Mengen von VEGF über den
Versuchszeitraum von 48 Stunden unter Einfluß von Kollagenase bei 37°C
dargestellt.
51
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60
Zeit (h)
VEG
F (%
) H0E0H0E1H1E1H1E2
Abb. 27:
VEGF-Freisetzung (Summe) der Kollagenschwämme bei 37°C unter Einfluß von Kollagenase
(160 U/ml) (n=9)
Auch bei 37°C lassen sich bei allen Schwämmen durchschnittlich rund 90% des
aufgetragenen VEGF nachweisen. Signifikante Unterschiede in der Freisetzung
lassen sich lediglich zum Messzeitpunkt nach insgesamt drei Stunden feststellen.
Hier läßt sich vom unbehandelten Schwamm (H0E0) erneut eine statistisch
signifikante größere VEGF-Freisetzung gegenüber den Modifizierten verzeichnen
(p=0,002, p<0,001; p<0,001). Der Vergleich zwischen den modifizierten Schwämmen
weist eine statistisch signifikante höhere VEGF-Freisetzung von H0E1 gegenüber
den Heparinschwämmen (H1E1, H1E2) (p=0,031; p=0,002) auf.
4.1.2.3 VEGF-Freisetzung der modifizierten Kollagenschwämme in vitro unter
verzögerter Zugabe von Kollagenase
Abb. 28 zeigt die VEGF-Freisetzung der modifizierten Schwämme (H0E0, H0E1,
H1E1 und H1E2) zu den verschiedenen Messzeitpunkten (t=0, 1, 3, 24 und 48 h) bei
Raumtemperatur mit Zugabe von Kollagenase (160 u/ml) ab dem Messzeitpunkt
52
nach 24 Stunden. Die Angabe der VEGF-Menge erfolgt prozentual, bezogen auf die
anfangs applizierte VEGF-Menge (100%=10ng).
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
0 1 3 24 48
Messzeitpunkte (h)
VEG
F (%
) H0E0H0E1H1E1H1E2
Abb. 28:
VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme bei Raumtemperatur unter Einfluß von Kollagenase (160
U/ml) ab t=24 h
Nach Zugabe der Kollagenase zeigt sich, daß nach 24 Stunden noch ein signifikant
hoher Prozentsatz (~50%) des applizierten VEGF in jedem der Schwämme
vorhanden ist (alle p<0,001).
Die kumulativ freigesetzten Mengen von VEGF sind in Abb. 29 dargestellt.
Zugabe Kollagenase
53
010203040506070
0 20 40 60
Zeit (h)
VEG
F (%
) H0E0H0E1H1E1H1E2
Abb. 29:
VEGF-Freisetzung (Summe) der Kollagenschwämme bei Raumtemperatur unter Einfluß
von Kollagenase (160 U/ml) ab t=24 h
Insgesamt lassen sich bei dieser Versuchsanordnung ~60% des applizierten VEGF
bei jedem Schwamm nachweisen.
Ähnliche Ergebnisse wie bei Raumtemperatur zeigt dieser Versuch bei 37°C (Abb.
30).
Zugabe Kollagenase
54
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 3 24 48
Messzeitpunkte (h)
VEG
F (%
) H0E0H0E1H1E1H1E2
ZugabeKollagenase
Abb. 30:
VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme bei 37°C unter Einfluß von Kollagenase (160 U/ml) ab
t=24 h
Auch bei 37°C ist nach Zugabe der Kollagenase (t=24h) bei jedem Schwamm eine
signifikant hohe VEGF-Abgabe (~60%) zu erkennen (alle p<0,001).
Die kumulativ freigesetzten VEGF-Mengen ist in Abb. 31 dargestellt.
55
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60
Zeit (h)
VEG
F (%
) H0E0H0E1H1E1H1E2
ZugabeKollagenase
Abb. 31:
VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme bei 37°C unter Einfluß von Kollagenase (160 U/ml) ab
t=24 h
Insgesamt lassen sich in dieser Versuchsanordnung bei jedem Schwamm ~70% des
applizierten VEGF nachweisen.
4.2 Zellkultur 4.2.1 VEGF-Release-Kinetik in der Zellkultur Abb. 32 zeigt die VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme H0E0, H0E1 und H1E1
in der HUVEC-Kultur. Das Endothelzellmedium wird jeweils zu den verschiedenen
Messzeitpunkten (t=1, 3, 5 d) in den 24-well-Platten mit jeweils 25000 HUVECs pro
well auf VEGF-Gehalt untersucht. Die VEGF-Menge ist prozentual von der anfangs
applizierten VEGF-Menge angegeben (100%=25ng).
56
0
1020
30
40
5060
70
1 3 5
Messzeitpunkt (d)
VEG
F (%
)
H0E0H0E1H1E1
Abb. 32:
VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme in der HUVEC-Kultur
Der unbehandelte Kollagenschwamm (H0E0) zeigt zum Messzeitpunkt nach einem
Tag eine signifikant höhere VEGF-Freisetzung als die beiden Modifizierten (beide
p<0,001). Auch der einfach vernetzte Kollagenschwamm (H0E1) zeigt nach einem
Tag noch eine signifikant höhere VEGF-Freisetzung als der Heparinisierte (H1E1)
(p<0,001). Nach fünf Tagen zeigen hingegen die beiden modifizierten Schwämme
eine signifikant höhere VEGF-Freisetzung als der unbehandelte Kollagenschwamm
(beide p<0,001).
Die kumulativ abgegebenen VEGF-Mengen über den Versuchszeitraum von fünf
Tagen zeigt sich in Abb. 33.
57
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6
Zeit (d)
VEG
F (%
)
H0E0H0E1H1E1
Abb. 33:
VEGF-Freisetzung (Summe) der Kollagenschwämme in der HUVEC-Kultur
Insgesamt lassen sich bei den Schwämmen zwischen 70% und 100% des
aufgetragenen VEGF nachweisen. Der unbehandelte Schwamm (H0E0) zeigt nach
fünf Tagen eine höhere VEGF-Abgabe als die modifizierten Schwämme (H0E1,
H1E1) (p<0,001; p=0,039). Am ersten und dritten Tag zeigt H0E0 die signifikant
höchste und H1E1 die signifikant niedrigste VEGF-Abgabe (alle p<0,001).
4.2.2 Der proliferative Effekt der modifizierten Kollagenschwämme in der 24-
well-Platte mit je 10000 HUVECs pro well 4.2.2.1 BrdU-Test mit 10000 HUVECs pro well in der 24-well-Platte
Die Ergebnisse der BrdU-Tests mit je 10000 Zellen pro well sind in der folgenden
Abb. 34 dargestellt. Die Messungen erfolgten wie in 3.3.2 und 3.3.5 beschrieben am
ersten, dritten und fünften Tag.
58
00,050,1
0,150,2
0,250,3
0,350,4
0,45
H1E1 +
VEGF
H1E1
H0E1 +
VEGF
H0E1
H0E0 +
VEGF
H0E0
Zellen
+ VEGF
Zellen
Zellen
in E
thano
l
Abs
Tag 1Tag 3Tag 5
Abb. 34:
BrdU-Test in der 24-well-Platte mit 10000 HUVECs pro well (n=9)
An allen drei Messzeitpunkten zeigt der heparinisierte und vernetzte
Kollagenschwamm (H1E1) mit VEGF die höchste Endothelzellproliferation (alle
p<0,001 außer H1E1 + VEGF vs. H1E1 am dritten und fünften Tag: p=0,001;
p=0,002). Auch ohne VEGF zeigt dieser an den Tagen drei und fünf eine signifikant
höhere Zellproliferation als die anderen Schwämme (alle p<0,001). Weiterhin läßt
sich zu jedem Messzeitpunkt eine signifikant höhere Endothelzellproliferation des
einfach vernetzten Schwamms (H0E1) mit VEGF gegenüber H0E0 mit (p<0,001;
p=0,002; p=0,003) und ohne VEGF (p<0,001; p<0,001; p=0,001) abgrenzen.
Ein signifikanter Unterschied durch die Zugabe von VEGF ist bei H1E1 (p<0,001;
p<0,001; p=0,001) und H0E1 (p<0,001; p=0,007; p<0,001) zu allen Messzeitpunkten
und bei den Zellen ohne Kollagenschwamm nach einem (p=0,004) und drei
(p=0,001) Tagen festzustellen. Die mit Ethanol fixierten Zellen weisen durchgehend
den signifikant kleinsten Wert auf (alle p<0,001 außer Zellen in Ethanol vs. Zellen am
fünften Tag: p=0,007).
Weiterhin läßt sich feststellen, daß während des Messzeitraumes von fünf Tagen die
Endothelzellproliferation bei allen untersuchten Kollagenschwämmen stagniert. Dies
59
ist bei allen Gruppen, außer den in Ethanol fixierten Zellen signifikant messbar (alle
p<0,001).
4.2.2.2 Zellzählung in der Neubauer-Kammer mit 10000 HUVECs pro well in der 24-
well-Platte
Die Ergebnisse der Zellzählung mit je 10000 Zellen pro well sind in der folgenden
Abb. 35 dargestellt. Die Messungen erfolgten wie beim BrdU-Test und in 3.3.2 und
3.3.6 beschrieben am ersten, dritten und fünften Tag.
02000400060008000
100001200014000160001800020000
H1E1 +
VEGF
H1E1
H0E1 +
VEGF
H0E1
H0E0 +
VEGF
H0E0
Zellen
+ VEGF
Zellen
Zellz
ahl (
n) Tag 1Tag 3Tag 5
Abb. 35:
Zellzählung in der 24-well-Platte mit 10000 HUVECs pro well (n=9)
Der vernetzte und heparinisierte Kollagenschwamm (H1E1) mit VEGF zeigt zu allen
drei Messzeitpunkten stets die größte Zellzahl (alle p<0,001 außer H1E1+VEGF vs.
H1E1 am ersten Tag: p=0,004). Des Weiteren zeigt dieser Schwamm am ersten und
dritten Tag auch ohne VEGF eine signifikant höhere Zellzahl als der unbehandelte
Schwamm (H0E0) (p=0,001 und p<0,001) und als die Kontrollgruppen (Zellen +
60
VEGF, Zellen) (alle p<0,001). Gleiches gilt auch für den einfach vernetzten
Schwamm (H0E1) mit VEGF (alle p≤0,001 außer H0E1+VEGF vs. H0E0 am ersten
und am dritten Tag: p=0,006; p=0,018 ). Die Zugabe von VEGF zeigt nur bei dem
vernetzten und heparinisierten Schwamm (H1E1) signifikante Unterschiede, welche
sich allerdings zu allen Messzeitpunkten nachweisen lassen (p=0,004; p<0,001;
p<0,001).
Des Weiteren läßt sich keine statistisch signifikante Veränderung der Zellzahl der
verschiedenen Gruppen nachweisen.
4.2.3 Der proliferative Effekt der modifizierten Kollagenschwämme in der 24-well-Platte mit je 25000 HUVECs pro well
4.2.3.1 BrdU-Test mit 25000 HUVECs pro well in der 24-well-Platte
Die Ergebnisse der BrdU-Tests mit je 25000 Zellen pro well lassen sich in der
folgenden Abb. 36 entnehmen. Die Messungen erfolgten wie mit 10000 Zellen pro
well am ersten, dritten und fünften Tag.
00,10,20,30,40,50,60,70,80,9
H1E1 +
VEGF
H1E1
H0E1 +
VEGF
H0E1
H0E0 +
VEGF
H0E0
Zellen
+ VEGF
Zellen
Zellen
in E
thano
l
Abs
Tag 1Tag 3Tag 5
Abb. 36:
BrdU-Test in der 24-well-Platte mit 25000 HUVECs pro well (n=9)
61
Zu allen drei Messzeitpunkten zeigt der vernetzte und heparinisierte
Kollagenschwamm (H1E1) mit VEGF deutlich die höchste Endothelzellproliferation
(alle p<0,001). Des Weiteren zeigt dieser Schwamm auch ohne VEGF zu allen
Messzeitpunkten eine signifikant höhere Zellproliferation als der unbehandelte
Schwamm (H0E0) (alle p<0,001) und als die Kontrollgruppen (Zellen + VEGF, Zellen)
(alle p<0,001). Gleiches gilt auch für den einfach vernetzten Schwamm (H0E1) mit
VEGF (p<0,001; p<0,001; p=0,001). Zwischen H0E0 (mit / ohne VEGF) und den
Zellen lassen sich keine signifikanten Unterschiede der Proliferation nachweisen. Der
Einfluß von VEGF wird bei den Kollagenschwämmen H1E1 (alle p<0,001) und H0E1
(p<0,001; p<0,001; p=0,023) zu allen Messzeitpunkten, bei H0E0 nur am ersten Tag
(p=0,007) und bei den Zellen ohne Schwamm nur am dritten Tag (p=0,004)
signifikant deutlich. Die in Ethanol fixierten Zellen zeigen an allen Tagen die
signifikant kleinste Proliferation (alle p<0,001).
Weiterhin verdeutlicht die Abbildung über den gesamten Messzeitraum eine
signifikante Endothelzellproliferationsstagnation von allen untersuchten Gruppen (alle
p<0,001 außer Zellen in Ethanol: p=0,041).
4.2.3.2 Zellzählung in der Neubauer-Kammer mit 25000 HUVECs pro well in der 24-
well-Platte
Die Ergebnisse der Zellzählung mit je 25000 Zellen pro well sind in der
nachfolgenden Abb. 37 dargestellt. Auch hier erfolgte die Messung am ersten, dritten
und fünften Tag.
62
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
H1E1 +
VEGF
H1E1
H0E1 +
VEGF
H0E1
H0E0 +
VEGF
H0E0
Zellen
+ VEGF
Zellen
Zellz
ahl
Tag 1Tag 3Tag 5
Abb. 37:
Zellzählung in der 24-well-Platte mit 25000 HUVECs pro well (n=9)
Zu allen drei Messzeitpunkten zeigt der vernetzte und heparinisierte
Kollagenschwamm (H1E1) mit VEGF signifikant die größte Endothelzellzahl (alle
p<0,001 außer H1E1 + VEGF vs. H1E1 am ersten Tag: p=0,002). Auch ohne VEGF
zeigt dieser Schwamm stets eine größere Endothelzellzahl als der unbehandelte
Schwamm (H0E0) mit und ohne VEGF (alle p<0,001 außer H1E1 vs. H0E0 + VEGF
am ersten Tag: p=0,002). Der einfach vernetzte Kollagenschwamm (H0E1) zeigt nur
am fünften Tag eine größere Zellzahl als der Unbehandelte (H0E0), jeweils mit
(p<0,001) und ohne VEGF (p=0,001). H0E0 wiederum weist keine signifikant höhere
Zellzahl als die Kontrollgruppen (Zellen + VEGF, Zellen) auf. Die Zugabe von VEGF
zeigt bei H1E1 zu allen Messzeitpunkten (p=0,002; p<0,001; p<0,001), bei H0E1 nur
nach dem ersten und fünften Tag (p=0,023; p=0,005) und bei den Zellen ohne
Schwamm (Kontrolle) nur am dritten Tag (p=0,019) signifikante Unterschiede.
Des Weiteren zeigt die Abbildung, daß allein der vernetzte und heparinisierte
Schwamm (H1E1) mit VEGF beladen eine signifikante Steigerung der Endothel-
zellzahl bis zum fünften Tag zeigt (p=0,001). Der unbehandelte Kollagenschwamm
63
(H0E0 + VEGF, H0E0) (p=0,002; p=0,015) und die Zellen ohne Schwamm aber mit
VEGF (p=0,005) weisen eine signifikante Abnahme der Endothelzellzahl über den
gesamten Messzeitraum auf.
4.2.4 Der proliferative Effekt der modifizierten Kollagenschwämme in der 6-well-Platte mit je 125000 HUVECs pro well
4.2.4.1 Zellzählung in der Neubauer-Kammer mit 125000 HUVECs pro well in der 6-
well-Platte
Die Ergebnisse der Zellzählung mit je 125000 Zellen pro well sind in der nach-
folgenden Abb. 38 dargestellt. Auch hier erfolgten die Messungen am ersten, dritten
und fünften Tag.
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
H1E1 +
VEGF
H1E1
H0E1 +
VEGF
H0E1
H0E0 +
VEGF
H0E0
Zellen
+ VEGF
Zellen
Zellz
ahl (
n)
Tag 1Tag 3Tag 5
Abb. 38:
Zellzählung in der 6-well-Platte mit 125000 HUVECs pro well (n=9)
An allen drei Messpunkten zeigt der vernetzte und heparinisierte Kollagenschwamm
(H1E1) mit VEGF signifikant die größte Endothelzellzahl bzw. den größten Zuwachs
64
an Endothelzellen (alle p<0,001 außer am ersten Tag H1E1 + VEGF vs. H1E1 und
H0E1 + VEGF: p=0,038 p=0,002). Des Weiteren zeigt dieser Schwamm auch ohne
VEGF an allen Messzeitpunkten, neben dem einfach vernetzten Schwamm (H0E1)
mit VEGF, einen signifikant höheren Zellzuwachs als der unbehandelte Schwamm
(H0E0 + VEGF, H0E0) und als die Kontrollgruppen (Zellen + VEGF, Zellen) (alle
p<0,001 außer am ersten Tag H1E1 vs. H0E0 + VEGF und H0E0: p=0,002;
p=0,039). Auch der einfach vernetzte Kollagenschwamm (H0E1) mit VEGF zeigt an
allen Messzeitpunkten einen signifikant höheren Zellzuwachs als der unbehandelte
Schwamm (H0E0 + VEGF, H0E0) und als die Kontrollgruppen (Zellen + VEGF,
Zellen) (alle p<0,001 außer H0E1 + VEGF vs. H0E0 + VEGF: p=0,002). Zudem weist
dieser ohne VEGF nach dem ersten (p=0,003) und nach dem dritten Tag (p=0,005)
einen signifikant höheren Zellzuwachs als der unbehandelte Schwamm H0E0 auf.
Dieser wiederum zeigt mit VEGF zu allen drei Messzeitpunkten einen signifikant
höheren Zellzuwachs als die Kontrollgruppen (Zellen mit (p=0,025; p<0,001;
p<0,001) und ohne VEGF (p=0,016; p<0,001; p<0,001)). Auch ohne VEGF zeigt
dieser Schwamm zu allen drei Messzeitpunkten einen signifikant höheren
Zellzuwachs als die Kontrollgruppen (Zellen mit (p=0,04; p=0,001; p=0,02) und ohne
VEGF (p=0,028; p<0,001; p<0,001)). Die Zugabe von VEGF führt bei H1E1 zu allen
Messzeitpunkten (p=0,002; p<0,001; p<0,001), bei H0E1 (beide p<0,001) und der
Kontrollgruppe (Zellen) (p=0,013; p=0,001) nur nach dem dritten und fünften Tag und
bei H0E0 nur nach dem fünften Tag zu signifikanten Zellzahlunterschieden
(p<0,001).
Weiterhin sind bei allen untersuchten Gruppen über den gesamten Messzeitraum
signifikante Zunahmen der Zellzahl zu beobachten (alle p<0,001).
4.3 Histologie
Die HE-Färbung in den Schnittbildern färben Bindegewebe wie Kollagen und lassen
daher die Porenstruktur der Kollagenschwämme gut erkennen. Abb. 39 und Abb. 40
zeigen einen der mit Heparin modifizierten Kollagenschwämme (H1E1) nach fünf
Tagen in der HUVEC-Kultur.
65
Abb. 39:
H1E1 + VEGF nach Tag 5 in 5000facher Vergrößerung (Mitte)
66
Abb. 40:
H1E1 + VEGF nach Tag 5 in 20000facher Vergrößerung (Mitte)
Abb. 41 und Abb. 42 zeigen Aufnahmen der gleichen Kollagenschwämme (H1E1).
Sie stellen den Rand des Schwammes dar, der Kontakt zum Boden des wells und
somit zu den Zellen hatte.
67
Abb. 41:
H1E1 + VEGF nach Tag 5 in 5000facher Vergrößerung (Rand)
68
Abb. 42:
H1E1 + VEGF nach Tag 5 in 20000facher Vergrößerung (Rand)
Die Abbildungen zeigen keine signifikanten Ansammlungen von Endothelzellen im
Schwamm selbst oder an dessen Rand. Auch eventuelle Migrationen von
Endothelzellen in den Kollagenschwamm lassen sich nicht nachweisen. Auch bei
den weiteren Schwammtypen (H0E0 und H0E1) lassen sich keine signifikanten
Ansammlungen oder Migrationen nachweisen.
69
5 Diskussion 5.1 Biomaterialen 5.1.1 Kollagen als artifizieller Hautersatz Für den erfolgreichen Einsatz von Biomaterialien sind biochemische Eigenschaften
von großer Bedeutung. Neben der Biokompatibilität spielen auch Reproduzierbarkeit
und Kosten bei der Herstellung eine wichtige Rolle. Synthetische Materialien (z.B.
organische Polymere) können relativ einfach und preiswert in variablen Strukturen
hergestellt werden. Auch ihre Eigenschaften wie z.B. Hydrophobie oder mechanische
Stärke lassen sich gut kontrollieren. Ein großer Nachteil synthetischer Materialien ist,
daß viele über einen langen Zeitraum immunologische Reaktionen hervorrufen
können (Bostman 1991). Im Gegensatz dazu führen natürliche Materialen meist zu
keiner immunologischen Reaktion, weshalb sie als biokompatibel angesehen
werden. Eines der am häufigsten eingesetzten natürlichen Biomaterialen ist Kollagen
(Chevallay et al. 2000, Orwin and Hubel 2000, Pieper et al. 1999). Es stellt den
größten Anteil der extrazellulären Matrix des Bindegewebes dar (van der Rest and
Garrone 1991). Aufgrund der Vielzahl von unterschiedlichen Strukturen lassen sich
die Kollagene von Typ I bis XIX klassifizieren. Das im Körper am häufigsten
vorkommende Kollagen, Kollagen Typ I läßt sich leicht aus Schweine- oder
Rinderhaut isolieren und ist durch besondere Festigkeit charakterisiert (Schoof et al.
2001). Vor allem ist es aber leicht zu sterilisieren und gehört daher zu den am
meisten eingesetzten Biomaterialien (Friess 1998).
Die vielseitige Verwendbarkeit von Kollagen als Implantatgrundgerüst spiegeln
zahlreiche Studien wieder. Rocha et al. zeigten, daß allein die Modifizierung der
Kollagenstruktur und –porengröße Einfluß auf Immunreaktion und Gewebe-
wachstum haben (Rocha et al. 2002). Mehrere Studien, die sich mit Zellen in
direktem Kontakt mit einer Kollagenmatrix befassten, lieferten vielversprechende
Ergebnisse. Es gelang Hepatozyten (Glicklis et al. 2000), Chrondrozyten (Glicklis et
al. 2000) und Fibroblasten (Doillon et al. 1984) durch den Kollagenkontakt zu
verstärkter Proliferation und Wachstum anzuregen. Zusätzlich stellt Kollagen ein
mögliches Trägergerüst für Wachstumsfaktoren dar. Die Bindung von Wachstums-
faktoren an Trägermatrizes hat mittlerweile einen hohen Stellenwert erreicht, denn
70
Gewebeform und Zellfunktion können hierdurch positiv beeinflußt werden (Lu et al.
2000). In der Literatur sind erfolgreiche Bindungen von Wachstumsfaktoren, wie z. B.
EGF, bFGF und VEGF an Kollagen beschrieben (Dellian et al. 1996, Fujisato et al.
1996). Zusätzlich ließ sich durch Einsatz von bioaktiven Molekülen, wie z.B.
Hyaluronsäuren, Glykosaminoglykane oder Heparin, die Bindung von Wachstums-
faktoren an Kollagen besser steuern und zellproliferative und angiogenetische
Effekte weiter steigern (Jansen et al. 2004, Park et al. 2002, Pieper et al. 2000,
Wissink et al. 2000b).
Die bisher in der Literatur beschriebenen vielseitigen Ansätze und Möglichkeiten von
Kollagen unterstreichen seine große Bedeutung als Grundgerüst bei der Herstellung
eines optimalen Gewebeersatzes.
5.1.2 Vorteile der modifizierten Matrix Das Ziel des „Tissue Engineering“ ist es, einen Gewebsersatz zu entwickeln, der
vergleichbare Eigenschaften des zu ersetzenden Gewebes besitzt und nach
Implantation Form und Funktion übernehmen kann. Somit ist das Überleben der an
das künstliche Gewebe angrenzenden Zellen essentiell. Eine ausreichende
Versorgung dieser Zellen mit Sauerstoff und nutritiven Substanzen ist jedoch nur
durch eine ausreichende Vaskularisierung gewährleistet. Dies verdeutlicht warum die
Entwicklung eines künstlichen Gewebes mit hohem angiogenetischen Potential eines
der führenden Interessen im „Tissue engineering“ darstellt (Nomi et al. 2002).
Es sind viele Methoden beschrieben worden das angiogenetische Potenzial eines
Ersatzgewebes zu erhöhen. Eine Möglichkeit besteht darin, Wachstumsfaktoren so
an Biomaterialen zu binden, daß diese kontinuierlich freigesetzt werden und somit
über einen längeren Zeitraum eine konstante angiogenetische Wirkung gewähr-
leistet ist. Dies gelang etwa durch die Bindung von VEGF an „calcium alginate
microspheres“ (Elcin et al. 2001) und an Polyglycolide (Murphy et al. 2000). Auch die
erfolgreiche Bindung von NGF (Nerve Growth Factor) an eine Fibrinmatrix konnte
dargestellt werden (Sakiyama-Elbert and Hubbell 2000). Pieper et al. beschrieb eine
Kollagenmatrix, die durch eine Modifizierung mit EDC (1-ethyl-3-(3-dimethyl
aminopropyl)carbodiimid) in der Lage war, Chondroitinsulfat kovalent zu binden
(Pieper et al. 1999). Die Verwendung von EDC und NHS (N-hydroxysuccinimid) als
intra- und intermolekularer Vernetzer zeichnet sich dadurch aus, daß es nach der
71
Reaktion mit Wasser ohne Rückstände ausgewaschen werden konnte (Nimni et al.
1987). Nach Implantation in den Empfänger treten somit keine toxischen Substanzen
auf, wie man sie bei Verwendung anderer Chemikalien zur Modifizierung von
Biomaterial anwendet. Zusätzlich können Wachstumsfaktoren unter Verwendung von
EDC/NHS an Kollagen gebunden werden (Wissink et al. 2000a). Die höchste Menge
von gebundenem Heparin ließ sich bei einem Verhältnis von 2:1 (EDC/NHS zu
Heparin) nachweisen (Yao 2003). Auch die in vitro Degradation war stark von der
verwendeten EDC/NHS-Konzentration und dem Verhältnis EDC/NHS zu Heparin
abhängig. Eine höhere EDC/NHS-Konzentration oder ein hohes Verhältnis von
EDC/NHS zu Heparin resultierten in einer langsameren Degradation der
Kollagenmatrix (Yao 2003). Dies beruht auf dem Effekt, daß durch EDC/NHS nicht
nur Heparin gebunden wird, sondern auch kovalente intra- und intermolekulare
Verbindungen entstehen, die den entsprechenden Kollagenschwamm stabilisieren.
Heparin selbst besitzt neben seiner starken antithrombotischen Wirkung auch eine
angiogenetische Potenz (Bombardini and Picano 1997) und ist in der Lage
Wachstumsfaktoren zu binden. Wissink et al. verwendeten eine mit EDC/NHS und
Heparin modifizierte Kollagenmatrix zur Bindung von bFGF und konnten die
gewünschte kontinuierliche Freisetzung von bFGF nachweisen (Wissink et al.
2000a). Ähnlich vielversprechende Ergebnisse ließen sich in der vorliegenden Studie
unter Verwendung einer analogen Kollagenmatrix zur Bindung des
Wachstumsfaktors VEGF realisieren.
5.2 Eigenschaften von VEGF 5.2.1 VEGF-Verhalten in vitro Die hohe angiogenetische Potenz von VEGF ist ein möglicher Lösungsansatz, die
verzögerte Revaskularisierung im Wundareal zu verbessern (Soker et al. 2000). Der
Grundgedanke VEGF an eine Matrix zu koppeln, beruht in erster Linie auf der extrem
hohen Instabilität von VEGF in vivo (s. 5.2.2). Allerdings wird auf das Verhalten von
VEGF in vitro in der Literatur wenig eingegangen. Es ist jedoch von großer
Bedeutung, da die gewünschte kontinuierliche VEGF-Freisetzung in dieser Studie
unter anderem in vitro untersucht wurde.
72
Die Bestimmung der in-vitro-Stabilität von VEGF wurde unter vier verschiedenen
Versuchsbedingungen durchgeführt (s. 3.2.3 und 4.1.1). Dies ist notwendig, denn die
VEGF-Stabilitätsbestimmung muß unter den gleichen Versuchsbedingungen
durchgeführt werden wie die Freisetzungskinetik (s. 3.2.4). Somit wurde die Stabilität
von VEGF je bei Raumtemperatur und 37°C ohne und unter Einfluß von
Kollagenase bestimmt.
Bei allen vier Versuchsbedingungen zeigte VEGF eine überraschend hohe Stabilität
in vitro. Bis zum letzten Messpunkt bei t=48 h ließ sich bei keiner der Versuchs-
bedingungen ein Rückgang der VEGF-Konzentration feststellen. Ein möglicher
spontaner Zerfall des VEGF-Moleküls in eine im ELISA nicht mehr nachweisbare
Form, würde somit nur auf einen nicht signifikanten, minimalen Teil zutreffen.
Trotz der sehr hoch gewählten Konzentration von Kollagenase (s. 3.2.3 und 5.3) ließ
sich kein Einfluß dieses Enzyms auf VEGF unter den oben genannten Bedingungen
nachweisen.
Somit erwies sich VEGF unter den getesteten in-vitro-Bedingungen als aus-
gesprochen stabil.
5.2.2 VEGF-Verhalten in vivo In vivo verfügen die verschiedensten Wachstumsfaktoren, Zytokine und Gonado-
tropine über unterschiedlichen starken Einfluß auf die Angiogenese. Ein Großteil
dieses Einflusses ist nicht durch eine direkte Reaktion des betreffenden Moleküls mit
Endothelzellen bedingt, sondern über eine Interaktion mit VEGF. Die VEGF
Expression läßt sich daher in einem sehr komplexen System sehen, die je nach
unterschiedlichen Stimuli einen angiogenetischen oder anti-angiogenetischen Effekt
auslöst (Neufeld et al. 1999). Daher nimmt VEGF eine wichtige Schlüsselposition in
der Regulierung der Angiogenese ein.
Die eigentliche Angiogeneseinduktion über Proliferationssteigerung von
Endothelzellen durch VEGF konnte in verschiedensten in-vivo-Studien verifiziert
werden. Neovaskularisationen und Angiogenese durch VEGF in der Netzhaut sind
mehrfach in der Literatur beschrieben (Adamis et al. 1994, Pierce et al. 1995). Auch
bei der Angiogenese von Tumorgewebe spielt VEGF eine bedeutende Rolle.
Tumorwachstum ist direkt von der durch VEGF bedingten Angiogenese abhängig
(Kim et al. 1993). Auch Versuche mit mirkochirurgischen Lappen an Ratten zeigten
73
unter dem Einsatz von VEGF bessere Ergebnisse als ohne Verwendung von VEGF
(Machens et al. 2003). Eine wichtige Tatsache, die bei der Verwendung von VEGF in der Literatur mehrfach
beschrieben und diskutiert wurde, ist die hohe Instabilität in vivo. VEGF wird
innerhalb von kürzester Zeit durch körpereigenen Proteasen abgebaut und besitzt
daher eine extrem kurze Halbwertszeit in vivo (Elcin et al. 2001). Die Bindung von VEGF an Kollagen ermöglicht, unter der Vorraussetzung, daß ein
kontinuierlicher Abbauprozess von Kollagen stattfindet, eine konstante Freisetzung
von VEGF. Diese gewährleistet trotz der hohen Instabilität von VEGF in vivo eine
konstante VEGF-Konzentration im vorhandenen Milieu, die eine konstante
angiogenetische Wirkung und somit in eine beschleunigte Wundheilung zur Folge
hat.
5.3 Eigenschaften und biologische Effekte der modifizierten Kollagenmatrix
5.3.1 Freisetzungskinetik von VEGF Für die Bestimmung der Freisetzungskinetik der Kollagenmatrizes in vitro wurden
vier verschiedene Modifikationen ausgewählt. Ein einfach vernetzter Kollagen-
schwamm ohne Heparin (H0E1), ein einfach vernetzter Schwamm mit Heparin
(H1E1), ein stark vernetzter Schwamm mit Heparin (H1E2), da dieser die größt-
mögliche Aufnahme von Heparin zeigte (s. 5.1.2) und ein unbehandelter Kollagen-
schwamm als Kontrolle (H0E0). Die Versuche der Freisetzungskinetik in vitro wurden
je bei Raumtemperatur und 37°C sowohl ohne, als auch unter permanentem bzw.
verzögertem Einfluß von Kollagenase durchgeführt (s. 3.2.4). Die Raumtemperatur
bietet den Vorteil, die Versuche ohne extremen technischen Aufwand durchzuführen
und diese jeder Zeit gut zu überwachen. Die Ergebnisse geben des Weiteren
Auskunft über die Einflußgröße der Temperatur bei der VEGF-Freisetzung, wenn
diese mit den Ergebnissen bei einer Temperatur von 37°C verglichen werden. 37°C
wurde als zweite Messtemperatur gewählt, da diese Temperatur der
Körpertemperatur näherungsweise gleicht. Sakiyma-Ebert und Hubbel beschrieben
die Freisetzung von NGF (Nerve Growth Fachtor) von einer Fibrinmatrix bei
Raumtemperatur (Sakiyama-Elbert and Hubbell 2000). Wissink et al. führten den
74
Nachweis einer konstanten Freisetzung von bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)
ausschließlich bei 37°C durch (Wissink et al. 2000a).
Der zusätzliche Einsatz von Kollagenase simuliert einen Abbau der Kollagenmatrix in
vitro. Die in diesen Versuchsreihen gewählte Kollagenasekonzentration von 160 U/ml
ist bewusst hoch gewählt um einen deutlichen Abbaueffekt der Kollagenschwämme
zu erzeugen. Die Versuchsreihen, die auf einer einmaligen Gabe von Kollagenase
(160 U/ml) nach dem Zeitpunkt (t=24 h) basieren, dienen in erster Linie der
Beurteilung, wieviel VEGF sich nach 24 Stunden ohne den Einfluß von Kollagenase
im Kollagenschwamm noch nachweisen läßt.
In der Versuchsreihe der VEGF-Freisetzung ohne Einfluß von Kollagenase bei
Raumtemperatur (s. 4.1.2.1) zeigte der unmodifizierte Kollagenschwamm (H0E0)
eine höhere Freisetzung von VEGF als die modifizierten und einen deutlichen
Unterschied zu den mit Heparin modifizierten Schwämmen (Abb. 21). Dies spricht für
eine stärkere Bindung von VEGF an die modifizierten Schwämme. Allerdings ließ
sich mit einer maximalen VEGF-Freisetzung der heparinisierten Schwämme von ca.
8% nur recht wenig des aufgetragenen VEGF nachweisen. Als Ursache dieser
geringen Freisetzung kommen mehrere Gründe in Frage. Zum Einen können
theoretisch VEGF-Moleküle in Gegenwart der Kollagenmatrix nicht mehr
nachzuweisen sein; z. B. durch eine hohe Instabilität, die in den zuvor
durchgeführten Stabilitätsversuchen (s. 4.1.1) nicht gemessen werden konnte. Viel
wahrscheinlicher ist jedoch, daß die Bindung von VEGF an Kollagen die Ursache für
eine geringe VEGF-Freisetzung ist (s. 1.4, Abb. 28-31). Dies zeigen die Ergebnisse
der analogen Versuchsanordnung (s. 3.2.4) mit dem Unterschied, daß erst nach 24
Stunden eine Zugabe von Kollagenase (160 U/ml) erfolgte. Diese
Versuchsanordnung ermöglicht es, VEGF in noch an den Kollagenschwamm
gebundener Form nachzuweisen. Die Ergebnisse (s. 4.1.2.3) zeigen einen Anstieg
der VEGF-Freisetzung nach Zugabe der Kollagenase bei Raumtemperatur und bei
37°C. Dies ist auf die enzymatische Aktivität der Kollagenase zurückzuführen, die
einen Abbau des Kollagens bewirkt und somit das gebundene VEGF freisetzt.
Insgesamt ließen sich somit nach weiteren 24 Stunden (t=48 h) 55 bis 77 % des
anfangs aufgetragenen VEGF nachweisen.
75
Daraus läßt sich schlussfolgern, daß die geringe Freisetzung von VEGF bei
Raumtemperatur ohne Einfluß von Kollagenase auf der gewünschten Bindung von
VEGF an die Kollagenmatrix beruht.
Gleiches gilt für die VEGF-Freisetzung bei einer Temperatur von 37°C. Auch hier
ließen sich nach 48 h nur maximal 37 % der aufgetragenen VEGF-Menge
nachweisen (s. 4.1.2.1). Die Ergebnisse mit Zugabe von Kollagenase nach 24
Stunden (s. 4.1.2.3) machen deutlich, daß auch bei diesem Versuchsaufbau eine
Bindung von VEGF an die Kollagenmatrix für die verzögerte VEGF-Freisetzung
verantwortlich ist. Dies wird durch die Tatsache bestätigt, daß auch bei 37°C der
native Kollagenschwamm (H0E0) die höchste Freisetzung zeigte. Die modifizierten
Kollagenmatrizes wiesen hingegen eine stärkere VEGF-Bindung auf. Insbesondere
die heparinisierten Kollagenschwämme (H1E1, H1E2) zeigten nochmals eine
langsamere Freisetzung als der einfach vernetzte Kollagenschwamm (H0E1). Dies
könnte auf einer stärkeren Bindung an Kollagen durch Heparin als Bindeglied
beruhen, welche auch in der Literatur bereits beschrieben ist. Wissink et al. konnten
nachweisen, daß mit Heparin behandelte Kollagenmatrizes, im Gegensatz zu nativen
Kollagenmatrizes eine verzögerte Freisetzung des Wachstumsfaktors bFGF zeigen
(Wissink et al. 2000b). Ferner gelang Sakiyama-Elbert und Hubbell die verzögerte
Freisetzung von NGF von einer mit Heparin modifizierten Fibrinmatrix im Gegensatz
zur Fibrinmatrix ohne Heparin (Sakiyama-Elbert and Hubbell 2000).
Der identische Versuchsaufbau unter permanentem Einfluß des Enzyms Kollagenase
zeigte eine deutliche Veränderung der Ergebnisse (s. 4.1.2.2). In Abb. 24 läßt sich
erkennen, daß die maximale VEGF-Freisetzung der verschieden modifizierten
Kollagenschwämme zu verschiedenen Messzeitpunkten auftrat. Der unbehandelte
Schwamm (H0E0) zeigte diese nach drei Stunden, die mit Heparin modifizierten
Schwämme (H1E1, H1E2) nach 24 Stunden. Die gemessene VEGF-Menge zu den
Messzeitpunkten stellt allerdings die Menge des VEGFs dar, die über den gesamten
Zeitraum zwischen den Messzeitpunkten freigesetzt wurde. Exakt formuliert zeigte
somit der unbehandelte Kollagenschwamm seine höchste Freisetzung an VEGF im
Zeitraum von einer bis drei Stunden, die heparinisierten Schwämme dagegen im
Zeitraum von drei bis 24 Stunden. Dies bedeutet, daß die unbehandelte
Kollagenmatrix die maximale VEGF-Menge nicht nur früher sondern auch in einem
wesentlich kürzeren Zeitraum abgab. Dies unterstützt die zuvor genannte
Schlussfolgerung, daß die modifizierten und insbesondere die mit Heparin
76
modifizierten Kollagenschwämme eine stärkere Bindung zu VEGF aufweisen als die
Unbehandelten.
Abb. 25 verdeutlicht die insgesamt im Versuch wiederauffindbare VEGF-Menge. Es
ließ sich ein recht hoher Anteil zwischen 70% und 90% des aufgetragenen VEGF
nachweisen. Die schwächere Bindung von VEGF zu den unbehandelten
Schwämmen wurde beim Messzeitpunkt von drei Stunden deutlich. Auch hier zeigte
sich eine höhere VEGF-Freisetzung des nicht modifizierten Kollagenschwammes.
Die Versuche unter Einfluß von Kollagenase bei 37°C zeigten analoge Ergebnisse
(Abb. 26 und 27). Sie verdeutlichen die schwächere Bindung von VEGF an die
nativen Kollagenmatrizes und die daraus resultierende schnellere Freisetzung des
Proteins.
Eine nahezu vollständige Freisetzung des gesamten VEGF binnen 2 Tagen in vivo
wäre für klinische Anwendungen jedoch nicht sinnvoll, da es sich bei chronische
Wunden per Definition um Wunden handelt, die nach vier Wochen konsequenter
lokaler und ursachenbezogener Behandlung makroskopisch keine
Heilungstendenzen aufweisen (Siewert 2001). Hier ist zu beachten, daß sich
Freisetzungskinetiken dieses in-vitro-Modellversuchs nicht eins zu eins auf die
klinische Situation übertragen lassen. Die für die Versuchsreihen gewählte
Konzentration von Kollagenase ist mit 160 U/ml sehr hoch und ermöglicht einen
zügigen Abbau von Kollagen mit einer entsprechend hohen VEGF-Freisetzung. Die
Freisetzung ohne den Einfluß einer so hohen Kollagenasekonzentration ermöglicht
hingegen die kontinuierliche VEGF Freisetzung bis zu 14 Tagen, was im Rahmen
eines klinischen Einsatzes sinnvoller wäre (Murphy et al. 2000).
Die durchgeführten Freisetzungsversuche verdeutlichen, daß unter verschiedenen
Bedingungen, wie z. B. unterschiedlichen Temperaturen, mit bzw. ohne Einfluß von
Kollagenase, die unbehandelten Kollagenschwämme zu einem früheren
Messzeitpunkt als die modifizierten Schwämme einen Großteil des aufgetragenen
VEGF abgeben. Dies kann auf eine verstärkte Bindung von VEGF an Kollagen
zurückgeführt werden. Besonders die mit Heparin behandelten Kollagenmatrizes
zeigen darüber hinaus eine sehr hohe Affinität zu VEGF. Auch anderen
Arbeitsgruppen gelang es eine solch verzögerte Freisetzung von verschiedensten an
Kollagen gebundenen Wachstumsfaktoren zu realisieren. Neben verzögerten
Freisetzung von Wachstumsfaktoren über eine Bindung an Heparin (Sakiyama-Elbert
and Hubbell 2000, Wissink et al. 2001), sind weiterhin Bindungen an „calcium
77
alginate microspheres“ oder Polyglukolide beschrieben (Elcin et al. 2001, Murphy et
al. 2000).
Darüber hinaus zeigten die modifizierten Kollagenschwämme unter Einfluß von
Kollagenase bei Raumtemperatur und bei 37°C eine geringere Degradation. Dies
wurde nicht quantitativ bestimmt, allerdings ließ sich der unbehandelte
Kollagenschwamm (H0E0) nach 24 Stunden mit bloßem Auge nicht mehr erkennen
und war komplett aufgelöst. Alle modifizierten Schwämme hingegen waren nach 48
Stunden zumindest teilweise noch vorhanden. Dies wird durch die Ergebnisse von
Yao bestätigt (Yao 2003). Er postulierte, daß die Zugabe von EDC/NHS nicht nur zu
einer stärkeren Heparinbindung an Kollagen führt, sondern daß auch kovalente
intramolekulare Kollagenbindungen entstehen, die den Kollagenschwamm
stabilisieren. Dadurch resultiert eine verlangsamte VEGF-Abgabe der einfach
vernetzten Kollagenmatrix (H0E1) im Vergleich zur Unbehandelten (H0E0). Die
nochmals verzögerte VEGF-Abgabe der heparinisierten Kollagenmatrizes gegenüber
der einfach Vernetzten beruht auf der zusätzlichen Bindung von VEGF an Heparin.
Die optimierte Verzögerung der VEGF-Freisetzung besitzt somit eine zusätzliche
vernetzte und mit Heparin behandelte Kollagenmatrix.
Die Bedingungen für die VEGF-Freisetzungsversuche in der Zellkultur wurden exakt
denen der Zellversuchen angepasst (s. 3.3.4). Wie bei den Zellversuchen wurden die
Schwämme (H0E0, H0E1 und H1E1) mit je 25 ng VEGF beladen und das
Zellmedium jeweils nach einem, drei und fünf Tag(en) auf den VEGF-Gehalt
untersucht (s 3.3.4 und 4.2.1). Somit differieren die aufgetragene VEGF-Menge und
die gewählten Messzeitpunkte etwas von denen der reinen in-vitro-Versuche (s.
3.2.4).
Abb. 33 (s. 4.2.2) zeigt deutliche Unterschiede in der VEGF-Freisetzung der
verschiedenen Kollagenschwämme. Zu allen drei Messzeitpunkten zeigte der
unbehandelte Kollagenschwamm (H0E0) die größte, der einfach vernetzte
Kollagenschwamm (H0E1) die zweitgrößte und der heparinisierte Kollagenschwamm
(H1E1) stets die kleinste VEGF-Gesamtfreisetzung. Dies bestätigt auch unter den
Zellkulturbedingungen und etwas anders gewählten Messzeitpunkten, die bereits
aufgrund der in-vitro-Versuche (s. 4.1.2) aufgestellte Annahme, daß VEGF zu den
behandelten Schwämme eine stärkere Bindung aufweist als zu den Unbehandelten.
Ebenfalls zeigte auch in diesem Versuch der vernetzte und heparinisierte
Kollagenschwamm (H1E) die stärkste Bindung zu VEGF. Bei genauer Betrachtung
78
lassen sich sehr ähnlich Kurvenverläufe zur in-vitro-VEGF-Freisetzung bei 37°C
ohne Kollagenase (s. 4.1.2.1), zumindest bis zum Zeitpunkt nach 48 Stunden
feststellen. Andere Arbeitsgruppen, die mit vergleichbaren Trägermatrizes arbeiteten,
die eine langsame Freisetzung von Wachstumsfaktoren ermöglichen sollen, zeigten
ähnliche Ergebnisse (Sakiyama-Elbert and Hubbell 2000).
Beim weiteren Vergleich der VEGF-Freisetzung in der Zellkultur mit der VEGF-
Freisetzung unter Einfluß von Kollagenase ließen sich bei beiden Versuchen am
Ende des Messzeitraums etwa die gleichen Mengen des aufgetragenen VEGFs
nachweisen (70-90%). Trotzdem stellten sich die Kurvenverläufe insbesondere der
modifizierten Kollagenschwämme sehr unterschiedlich dar. Dies hängt
möglicherweise mit dem Einfluß der Kollagenase zusammen.
Wissink et al. arbeiteten auch mit einer mit Heparin modifizierten Kollagenmatrix,
verzichteten aber auf den Einsatz von Kollagenase und vergrößerten stattdessen
den Messzeitraum auf 28 Tage (Wissink et al. 2000b). Andere Studien beschreiben
wiederum kürzere Messzeiträume und gelangten zu einem ähnlichen Ergebnis
(Murphy et al. 2000, Sakiyama-Elbert and Hubbell 2000). Grundsätzlich gibt es
verschiedene Möglichkeiten eine verzögerte Freisetzung von Wachstumsfaktoren zu
erreichen. Als Trägermatrix können Polymere, Polyglukolide oder Kollagen dienen
(Murphy et al. 2000, Pieper et al. 1999, Sheridan et al. 2000). Die Art der Bindung
des Wachstumsfaktors an die Trägermatrix bietet weiterhin die Möglichkeit,
Eigenschaften der verknüpfenden Struktur zu nutzen. Die in dieser Studie
durchgeführte Bindung von VEGF an Kollagen über Heparin bietet den Vorteil, daß
Heparin selbst, neben seiner intrinsischen Wirkung auf das Gerinnungssystem, eine
angiogenetische Potenz besitzt (Bombardini and Picano 1997). Dies ermöglicht, die
angiogenetische Wirkung einer Kollagenmatrix zusätzlich zu steigern und somit
letztlich die Angiogenese zu beschleunigen.
5.3.2 Einfluß der Matrix auf die Proliferation von Endothelzellen In den Versuchsreihen mit Endothelzellen wurden drei verschiedene modifizierte
Gruppen von Kollagenschwämmen verwendet. Dies ermöglichte einen direkten
Vergleich zwischen vernetzten und heparinisierten (H1E1), einfach vernetzten
(H0E1) und nativen Kollagenmatrizes (H0E0). Die Gruppe H1E2 (maximaler Anteil
von Heparin) wurde nicht eingesetzt, da sie in der VEGF-Freisetzungskinetik keinen
79
signifikanten Unterschied zur der Gruppe H1E1 zeigte (s. 4.1.2). Die VEGF-Mengen
für die 5*5*5 mm großen Schwämme in der 24-well-Platte und für die 10*10*10 mm
großen Schwämme wurden aufgrund von Ergebnissen der Vorversuche auf 25 bzw.
100 ng VEGF pro Kollagenschwamm festgelegt. Während des gesamten
Versuchablaufs wurde ausschließlich Endothelzellmedium (B) verwandt, das im
Gegensatz zu Endothelzellmedium (A) kein zusätzliches FGF oder VEGF enthält.
Dadurch wirkt ausschließlich das im Versuch aufgetragene VEGF. Die Zelldichte
wurde auf einheitliche 13900 Zellen/cm² festgelegt um die unterschiedlichen
Ergebnisse der beiden Plattentypen direkt miteinander zu vergleichen. Die weitere
Versuchsreihe mit 24-well-Platten und einer Zelldichte von 5600 Zellen/cm² er-
möglichte die Bestimmung des Einflusses der Zelldichte selbst auf das Ergebnis. Der
BrdU-Test (s. 3.3.5) machte eine genaue Bestimmung der Zellproliferation in den
verschieden wells möglich, zusätzlich wurde die Zellzahl mittels Neubauer-Kammer
bestimmt (s. 3.3.6). Diese Methode ist ungenauer als der BrdU-Test und die
Ergebnisse zeigen größere Streuungen. Dennoch wurden auch hier signifikante
Unterschiede deutlich.
In allen durchgeführten Versuchsreihen zeigte sowohl in den BrdU-Tests, als auch in
den Zellzählversuchen der vernetzte und heparinisierte Kollagenschwamm (H1E1)
mit VEGF stets die höchste Zellproliferation bzw. die größte Zellzahl. Der
Unterschied zum gleichen Kollagenschwamm ohne VEGF ließ sich bei allen
Versuchsreihen abgrenzen. Somit erzielte der heparinisierte Schwamm mit Zugabe
von Wachstumsfaktoren den größten zellproliferierenden Effekt. Dies zeigten auch
bereits zuvor durchgeführte Versuche von Markowicz et al., Aachen (bisher noch
unveröffentlicht). Auch Sikayana-Elbert und Hubbel konnten dies mit einer
heparinisierten Fibrinmatrix und NGF (Nerve Growth Factor) nachweisen (Sakiyama-
Elbert and Hubbell 2000). Allerdings zeigte der identische Kollagenschwamm ohne
VEGF auch in allen Versuchsreihen eine höhere Zellproliferation bzw. größere
Zellzahl als der native Kollagenschwamm (H0E0), unabhängig davon, ob dieser mit
oder ohne VEGF eingesetzt worden ist. Dies legt die Schlussfolgerung nahe, daß die
Art der Vernetzung der Kollagenschwämme und somit ihre Struktur und Porengröße
sehr viel größeren Einfluß auf die Zellproliferation haben als die Zugabe von VEGF.
Tsuruga et al. konnten zeigen, daß die Porengröße einer Matrix von großer
Bedeutung ist und daß es für unterschiedliche Versuchsbedingungen jeweils eine
optimale Porengröße zu geben scheint (Tsuruga et al. 1997). Dies wird auch durch
80
die Tatsache bestätigt, daß einige Versuchsreihen (s. 4.2) eine höhere
Zellproliferation bzw. größere Zellzahl des einfach vernetzten Schwammes (H0E1)
als des unbehandelten Kollagenschwammes (H0E0) aufwiesen, teilweise
unabhängig davon, ob VEGF eingesetzt wurde oder nicht. Somit bewirkt allein die
Veränderung der Struktur der Matrix einen Unterschied auf die
Endothelzellproliferation, denn die verwendete Vernetzungsreagenz EDC/NHS wird
nach der festgelegten Reaktionszeit aus der Matrix ausgespült und hinterläßt
ausschließlich inter- und intramolekulare Verknüpfungen im Kollagen (Nimni et al.
1987). Darüber hinaus wird in verschiedenen Versuchsreihen (s. 4.2) deutlich, daß
allein der unbehandelte Schwamm (H0E0) eine höhere Endothelzellproliferation bzw.
größere Zellzahl zeigte als die Kontrollgruppen ohne Schwamm, unabhängig davon,
ob VEGF verwendet wurde oder nicht. Daraus läßt sich schließen, daß allein die
Gegenwart einer dreidimensionalen Kollagenmatrix einen proliferationssteigernden
Effekt in der Zellkultur induziert. Der additive proliferationssteigernde Effekt durch die
Zugabe von VEGF ließ sich beim heparinisierten und vernetzten Kollagenschwamm
(H1E1) immer, bei den anderen Versuchsreihen nur zu bestimmten Messzeitpunkten
nachweisen (s. 4.2). Wissink et al. beschrieben den proliferativen Effekt von an
Kollagen gebundene Wachstumsfaktoren in der Zellkultur, indem die Trägermatrizes
mit unterschiedlichen Mengen von bFGF beladen worden (Wissink et al. 2001). Der
additive proliferationssteigernde Effekt durch die Zugabe von VEGF ist aber sehr viel
kleiner als der proliferationssteigernde Effekt, der durch die Veränderungen der
Kollagenmatrix auftritt. Dies konnte auch bei Versuchen an der Chorio-
allantoismembran von Hühnereiern und an Ratten gezeigt werden (Yao 2003).
Zudem wiesen die beiden für die Zellversuche eingesetzten Plattentypen (24-well-
Platte und 6-well-Platte) deutliche Unterschiede untereinander auf. In der 6-well-
Platte wiesen alle untersuchten Gruppen eine Zunahme der Zellzahl auf, während in
der 24-well-Platte dies nur bei der Gruppe des Kollagenschwammes H1E1
nachzuweisen war. Überwiegend zeigte sich aber keine Veränderung der Zellzahl
oder gar eine Stagnation der Zellzahl über den gesamten Messzeitraum. Dies ist
bislang in der Literatur noch nicht beschrieben und kann wie folgt erklärt werden.
81
S1
S2
d1
d2
d1
S1
d2
S2
Durchmesser der 6-well-Platte
Durchmesser der 24-well-Platte
Kollagenschwamm in der 6-well-Platte
Kollagenschwamm in der 24-well-Platte
6-well-Platte 24-well-PlatteVerlust der Zellwachstumsfläche
Abb. 43:
Konstellation der Versuche mit 6- und 24-well-Platten
Abb. 43 zeigt eine schematische Darstellung je eines wells aus einer 6-well-Platte
(links) und einer 24-well-Platte (rechts) mit einer Kollagenmatrix in der Mitte. Die
Zellzahl zu Versuchsbeginn beträgt in der 6-well-Platte 125000 und in der 24-well-
Platte 25000. Die 6-well-Platte hat einen Durchmesser von 34 mm (d1) und somit
eine Fläche von 9,07 cm², die 24-well-Platte besitzt einen Durchmesser von 15 mm
(d2) und somit eine Fläche von 1,8 cm². Somit beträgt in beiden wells die Zelldichte
13900 Zellen/cm². Die täglichen mikroskopischen Beobachtungen des Zellwachs-
tums zeigten, daß sich Zellen nach Zugabe der Kollagenmatrizes ausschließlich am
Rande des wells auffinden ließen. Der Raum unter dem Schwamm und dessen
unmittelbare Umgebung blieben stets zellfrei. Angenommen die Endothelzellen
adhärieren nicht bis zu einer willkürlich gewählten Distanz von <4 mm zum
Schwamm (in blau dargestellt), würde dies für eine 6-well-Platte (bei einer
Kollagenschwammgröße von 10*10*10 mm), einen Flächenverlust für potentielles
Zellwachstum von ca. 1,96 cm² und somit 21% der Gesamtfläche bedeuten. Bei
einer 24-well-Platte hätte dies (bei einer Kollagenschwammgröße von 5*5*5mm)
einen Flächenverlust für potentielles Zellwachstum von ca. 0,81 cm² und somit einen
Gesamtflächenverlust von 45% zur Folge. Also mehr als der doppelte Anteil im
82
Vergleich zur 6-well-Platte. Dies könnte das schlechtere Gesamtwachstum der
Versuchsgruppen in der 24-well-Platte erklären.
Dennoch zeigte bei allen Versuchsgruppen der heparinisierte und vernetzte
Kollagenschwamm (H1E1) mit VEGF die höchste Zellproliferation bzw. die größte
Zellzahl. Auch andere Arbeitsgruppen konnten zeigen, daß mit Heparin und
Wachstumsfaktoren modifizierte Kollagenmatrizes stärkeren proliferativen Einfluß auf
Zellen haben als unbehandelte. Wissink et al. gelang es, starkes Zellwachstum
nachzuweisen indem HUVECs direkt auf eine mit Heparin und EDC/NHS behandelte
Kollagenmatrix ausgesät worden. Mit dem Wachstumsfaktor bFGF konnte somit
verstärktes Wachstums der Endothelzellen bis zu zehn Tagen nachgewiesen werden
(Wissink et al. 2000a). Auch andere Studien konnten zeigen, daß eine heparinisierte
und vernetzte Kollagenmatrix mit VEGF den größten angiogenetischen Effekt besitzt.
Bei Tierversuchen wurden Ratten im Dorsalbereich subkutan verschieden
modifizierte Kollagenschwämme implantiert. Nach 15 Tagen wurden diese wieder
entnommen und auf den Gehalt an Hämoglobin untersucht. Der heparinisierte und
vernetzte Kollagenschwamm (H1E1) zeigte hier den größten Anteil an Hämoglobin
(Yao 2003). Ferner wies der gleiche Kollagenschwamm bei Versuchen an der
Chorioallantoismembran von Hühnereiern den größten Zuwachs an Kapillaren
gegenüber den Kontrollgruppen auf (Yao 2003). Auch hier erwies sich der additive
Effekt durch die Zugabe von VEGF wesentlich kleiner, als die Veränderung des
Kollagenschwammes selbst. Eine mögliche Erklärung wäre, daß VEGF nach
Adhäsion an die Kollagenmatrix, immer noch im ELISA als Antigen nachzuweisen ist,
aber nicht mehr die gleiche biologische Aktivität besitzt. Allerdings konnten Sheridan
et al. zeigen, daß VEGF nach Adhäsion an eine Trägermatrix durchaus noch eine
sehr hohe biologische Aktivität besitzt (Sheridan et al. 2000). Der angiogenetische
Effekt einer Matrix wird somit in erster Linie durch die Art ihrer Modifizierung
bestimmt. Neben Struktur und Porengröße haben daher auch andere Moleküle, die
Teil der Matrix sein können, Einfluß auf ihr angiogenetisches Potential. Die
Gegenwart von Heparin, dem selbst ein großes angiogenetisches Potential
zugeschrieben wird (Bombardini and Picano 1997), könnte die angiogenetische
Wirkung einer Kollagenmatrix potenzieren. Dies wäre eine mögliche Erklärung für
den großen proliferativen Effekt, die der heparinisierte und vernetzte
Kollagenschwamm (H1E1) in diesen Versuchsreihen zeigt. Abb. 44 zeigt ein
83
mögliches Model der verschiedenen Wirkungsmechanismen der Matrix auf die
Zellen.
Kollagenschwamm
Zellen
VEGFStruktur der
MatrixHeparin
Abb. 44:
Wirkungsmechanismen des Kollagenschwamms auf die Endothelzellen
Darüber hinaus hat möglicherweise die Art und Weise der Sterilisierung der
Kollagenschwämme Einfluß auf die Ergebnisse. Das Einlegen in hochprozentiges
Ethanol ist ein einfaches und effizientes Verfahren, möglicherweise jedoch nicht die
optimale Methode. Durch Einfluß von Ethanol wäre eine Art Fixierung und somit eine
Veränderung der Kollagenmatrix denkbar. Eine mögliche Alternative, die γ-
Sterilisierung zeigte allerdings, daß die Kollagenmatrix selbst einer solchen Prozedur
nicht standhält (Noah et al. 2002). Andere Arbeitsgruppen legten die
Kollagenmatrizes lediglich für 24 Stunden in eine Penicillin/Streptomycin-Lösung und
berichteten dabei nicht von Problemen mit Kontaminationen (Wissink et al. 2001).
84
Dies könnte durchaus eine Alternative darstellen, da diese Methode die Struktur der
Kollagenmatrix vergleichbar wenig beeinflußt.
Entscheidend aber ist, das stets die mit Heparin behandelte Kollagenmatrix, die
langsamste VEGF-Abgabe bzw. das größte Endothelzellwachstum zeigte. Dies deckt
sich nicht nur mit den Ergebnissen von Sakiyama-Elbert et al., Sheridan et al. und
Wissink et al. (Sakiyama-Elbert and Hubbell 2000, Sheridan et al. 2000, Wissink et
al. 2000a, Wissink et al. 2000b) sondern führt schließlich auch zur der Erfüllung der
anfangs gestellten Aufgabenstellung.
5.4 Ausblick Die Entwicklung eines künstlichen Hautersatzes mittels „Tissue Engineering“ stellt
gegenüber der plastischen Deckung durch autologe Hautransplantate eine vielver-
sprechende Alternative dar. Im Gegensatz zu einem reinen Epidermisersatz, wie z.B.
Keratinozytenkulturen, handelt es sich bei einem kompletten Dermisersatz um eine
neue Herausforderung. Neben bindegewebigen Konstruktionen müssen komplexe
Strukturen wie vollständige Gefäß- und Nervensysteme hergestellt werden. Diese
komplexe Aufgabe konnte bislang noch nicht überzeugend experimentell gelöst
werden. Eine biokompatible Trägermatrix zu verwenden und diese mit wachstums-
beschleunigenden Substanzen zu verknüpfen, ist dennoch ein vielversprechender
Ansatz um beispielsweise lokal eine gerichtete Angiogenese zu induzieren. Die
Applikation und Freisetzung von Wachstumsfaktoren innerhalb von Wundauflagen
könnten darüber hinaus zu einer beschleunigten Wundheilung und damit zum
schnelleren Wundverschluß führen. Neben Kollagen als Trägersubstanz werden
derzeit sowohl bereits erprobte Materialen wie Fibrin oder Hyaluronsäuren optimiert,
als auch neuartige Polymere auf Biokompatibilität untersucht. Neben VEGF wurden
andere Wachstumsfaktoren wie bFGF, β-NGF oder EGF erfolgreich an
Trägermatrizes gekoppelt. Im Rahmen dieser Untersuchungen wird deutlich, daß
weitere umfassende Untersuchungen notwendig sind, um eine optimale Matrix mit
dem optimalen Wachstumsfaktor oder gar mit einer Kombination verschiedener
Wachstumsfaktoren, die sich gegenseitig potenzieren, zu definieren. Der sequentielle
Prozess der Angiogenese ist jedoch äußerst komplex und vielschichtig. Für den
lokalen Einsatz von Wachstumsfaktoren ist der Zeitpunkt entscheidend in dem
85
Wachstumsfaktoren appliziert werden, da sie teils agonistische und teils
antagonistische angiogenetische Effekte aufweisen. Oftmals fehlt es noch an dem
grundlegenden Wissen über die genauen Wirkmechanismen von Wachstumsfaktoren
und deren Bedeutung für die Angiogenese. Trotzdem ist die vorgestellte
Kollagenmatrix, an die über Heparin neben VEGF auch bFGF gebunden werden
kann ein viel versprechender Lösungsansatz. Die von uns modifizierte
Kollagenmatrix lässt eine Vielzahl weiterer biochemischer, mechanischer und
physikalischer Variationsmöglichkeiten zu. Möglicherweise lassen sich durch Ver-
änderung der Struktur und Porengröße der Kollagenschwämme noch größere angio-
genetische Effekte erzielen. Zusätzlich sollte die Versuchsmethodik zur Unter-
suchung unserer modifizierten Kollagenmatrix erweitert werden. Neben weiteren
Untersuchungen der Freisetzungskinetik von VEGF aus den verschiedenen
Kollagenschwämmen unter unterschiedlichen Versuchsbedingungen sollten auch
andere Methoden, die eine genauere Bestimmung des Zellwachstums als der BrdU-
Test ermöglichen in Betracht gezogen werden. Eine molekularbiologische Methode
wie die RT-PCR ermöglicht z.B. eine genaue Untersuchung der verstärkt aktivierten
Zellwachstums-, Zellteilungs- und Zellmigrationsgene. Ähnlich Untersuchungen
lassen sich auch mit der FACS-Messung (Fluorescence Activated Cell Sorting)
durchführen.
Des Weiteren sollten neben den schon durchgeführten Experimenten an Ratten
weitere Tierexperimente durchgeführt werden. Größere Studien an Versuchstieren
mit verschiedenen Implantationsorten über einen langen Beobachtungszeitraum
könnten neue Daten liefern.
Die in dieser Studie durchgeführte Histologie ließ leider keine Zellmigration in die
Kollagenmatrix erkennen. Wahrscheinlich ist es notwendig, die zu untersuchenden
Zellen direkt auf oder sogar in der Kollagenmatrix zu positionieren.
Eine Aufnahme einer Immunhistologie in einer Kollagenmatrix zeigt Abb. 45.
86
Abb. 45:
Immunhistologische Aufnahme von Endothelzellen in der Kollagenmatrix
Die in die Matrix injizierten Zellen sind deutlich dargestellt, es lassen sich sogar
tubulusähnliche Formationen erkennen.
Neben Endothelzellen sollten auch andere Zellkulturen in Betracht gezogen werden.
Eine Mischkultur aus z.B. HUVECs (Human Umbilical Endothelial Cells) und
Fibroblasten würde dem Ziel einen vollständigen Dermisersatz zu schaffen
näherkommen. Diese wäre neben der Gefäßneubildung auch in der Lage
bindegewebige interzelluläre Strukturen zu generieren.
HUVECs bieten sich für experimentelle in-vitro-Untersuchungen an, jedoch können
diese Daten nicht ohne weiteres aufgrund der größeren proliferativen Potenz dieser
Zellen auf die in-vivo-Situation übertragen werden. Auch stehen sie bei einer
möglichen humanen klinischen Anwendung als autologe Endothelzellresource in den
seltensten Fällen zur Verfügung. Da der alleinige Einsatz von homologen Zellen oder
Geweben aufgrund der umfassenden und komplexen Immunreaktion stets
problematisch ist, müssen Alternativen in Betracht gezogen werden. Eine Möglichkeit
autologe Endothelzellen zu kultivieren besteht in den Zellkulturen von EPCs
(Endothelial Progenitor Cells). Diese Endothelvorläuferzellen lassen sich relativ
einfach aus Blut isolieren und kultivieren. Nach erfolgter Differenzierung zu
Endothelzellen und Herstellung des gewünschten Transplantats, ließe sich dieses
aus immunologischer Sicht problemlos wieder am Spender einsetzen. Abb. 46
verdeutlicht dieses Prinzip.
87
Empfänger / Spender
Isolierung von Zellen (u.a. EPC)
Synthese der Matrix
Implantation der Matrix
Abb. 46:
Prinzip der autologen Matrixsynthese
Insgesamt sind noch erhebliche Forschungsanstrengungen notwendig, um einen
kompletten Dermisersatz für klinische Anwendungen herzustellen. Einfache
neuartige Wundauflagen für eine verbesserte Angiogenese im Rahmen der
Wundheilung sind jedoch auch kurzfristig realisierbar.
88
6 Zusammenfassung Die Behandlung von großflächigen Wunden und ausgedehnten dermalen Defekten
nimmt in der plastischen Chirurgie einen sehr hohen Stellenwert ein. Die Deckung
durch autologe Hauttransplantate stellt eine gängige Methode in der rekonstruktiven
Chirurgie dar, bedeutet aber immer einen zusätzlichen chirurgischen Eingriff in
gesundes Gewebe mit möglichen Komplikationen und hinterläßt einen Hebedefekt.
Der Einsatz von Biomaterialien als artifizieller Dermisersatz stellt somit eine
vielversprechende Alternative dar. Die bisher erhältlichen kommerziellen Dermis-
produkte können allerdings, aufgrund einer sehr niedrigen angiogenetischen Potenz,
nur eingeschränkt eingesetzt werden. Eine Immobilisierung von Wachstumsfaktoren
könnte die starke in-vivo-Degradation von Wachstumsfaktoren verhindern und mittels
Steigerung der Revaskularisierung zu einer verbesserten Wundheilung führen. In
dieser Studie wurden mit Heparin und EDC/NHS modifizierte Kollagenmatrizes auf
die in-vitro-Freisetzungskinetik des Wachstumsfaktors VEGF (Vasculary Endothelial
Growth Factor) und auf ihre biologische Wirkung in der Endothelzellkultur untersucht.
Durch den Einsatz von EDC/NHS wurde eine Bindung von Heparin an Kollagen und
gleichzeitig eine Vernetzung des Kollagens selbst erreicht. Dadurch entstanden
verschiedene Gruppen von Kollagenschwämmen (Größe: 5*5*5 mm und 10*10*10
mm): Inkubation in einer Lösung mit 0 mg EDC/NHS und 0 mg Heparin in 500 µl, mit
1 mg EDC/NHS und 0 mg Heparin in 500µl, mit 1 mg EDC/NHS und 1 mg Heparin in
500µl und mit 2 mg EDC/NHS und 1 mg Heparin in 500µl. Die verschiedenen
Schwämme wurden mit VEGF beladen und die in-vivo-Freisetzung von VEGF wurde
über 48 Stunden (mit und ohne Einfluß von Kollagenase) bzw. fünf Tage (Zellkultur)
mittels ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) quantifiziert. Zusätzlich
wurde die in-vitro-Stabilität von VEGF bestimmt. Weiterhin wurde die
Endothelzellproliferation (HUVECs) unter Einfluß der verschiedenen Kollagen-
schwämme untersucht. Hierfür wurden 24 Stunden vor Versuchsbeginn HUVECs mit
unterschiedlichen Zelldichten (5600 und 13900 HUVECs/cm²) in verschiedene
Zellkulturplatten (6- und 24-well-Platten) ausgesät. Der Proliferationszuwachs wurde
mittels BrdU-Test und mittels Bestimmung der absoluten Zellzahl durch Auszählen in
der Neubauer-Kammer nach einem, drei und fünf Tagen bestimmt.
In dem Versuchszeitraum von 48 Stunden zeigte sich VEGF in vitro als sehr stabil.
Der Vergleich der VEGF-Freisetzungskinetiken der verschiedenen Kollagen-
89
schwämme wies sowohl in vitro als auch in der Zellkultur deutliche Unterschiede auf.
Hier wurde eine verlangsamte VEGF-Freisetzung der modifizierten Kollagen-
schwämme im Gegensatz zu den nativen Kollagenschwämmen deutlich. Die stärkste
Verzögerung der VEGF-Freisetzung wiesen die zusätzlich mit Heparin modifizierten
Kollagenschwämme auf. Dies galt für die Experimente bei Raumtemperatur und
37°C, für die Experimente mit und ohne Kollagenase und für die Experimente in der
Zellkultur. Auch in den Versuchsreihen der Endothelzellproliferation zeigten die
modifizierten Kollagenschwämme sowohl im BrdU-Test als auch in der Auszählung in
der Neubauer-Kammer in 24- und in 6-well-Platten einen größeren zellproliferativen
Effekt als die nativen Kollagenschwämme. Den größten Zuwachs an Zellproliferation
zeigten die zusätzlich mit Heparin modifizierten Kollagenschwämme. Zudem ließen
sich Steigerungen der Zellproliferation durch die Zugabe von VEGF nachweisen.
Diese Ergebnisse zeigen, daß durch die Bindung von VEGF an eine mit Heparin
modifizierte Kollagenmatrix die Endothelzellproliferation gesteigert werden kann.
Neben der angiogenetischen Wirkung von VEGF bestimmen auch die Art und Weise
der Modifizierung des Kollagens und additive Stoffe wie Heparin das angio-
genetische Potential der Trägermatrix.
Neben weiteren Untersuchungen der Kollagenmatrix sind für die Zukunft auch
Studien an anderen Trägermatrizes (wie z.B. Fibrin) mit weiteren Wachstumsfaktoren
(wie z.B. bFGF oder NGF) von großer Bedeutung. Auch die Variation der
Versuchsmethodik ist ein wichtiger Bestandteil des weiteren Vorgehens. Die erzielten
Ergebnisse müssen durch molekularbiologische Methoden (RT-PCR, FACs) und in-
vivo-Experimente am Tier verifiziert werden. Nur durch eine permanente
Weiterentwicklung des künstlichen Hautersatzes ist es möglich, zu dem optimalen
artifiziellen Dermisersatz zu gelangen, der letztendlich als Gewebsersatz am
Menschen eingesetzt werden kann.
90
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8 Abkürzungsverzeichnis BrdU 5´-Bromo-2-desoxyuridin
DHT Dehydrothermal Treatment
ECM Extrazelluläre Matrix
EDC N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-Ethylcarbodiimid
EGF Epidermal Growth Factor
FGF Fibroblast Growth Factor
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
EPCs Endothelial Progenitor Cells
FACS Flourescence Activated Cell Sorting
flt fas-like tyrosin Kinase
H0E0 unbehandelter Kollagenschwamm
H0E1 einfach vernetzter Kollagenschwamm
H1E1 einfach vernetzter und mit Heparin modifizierter Kollagenschwamm
H1E2 stark vernetzter und mit Heparin modifizierter Kollagenschwamm
HUVECs Human Umbilical Vein Endothelial Cells
Hyp Hydroxyprolin
KDR Kinase inset Domain containing Receptor
LPL Lipoproteinlipasen
MHC Major Histocompatibility Complex
NHS N-Hydroxysuccinimid
NGF Nerve Growth Factor
NMR Nukleare Magnet Resonanz
PCR Polymerase Chain Reaction
PGDF Platelet Derived Growth Factor
pO2 Sauertstoffpartialdruck
Pro Prolin
STH Somatotropes Hormon
TGF Transforming Growth Factor
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
VPF Vascular Permeability Factor
105
9 Danksagung Als erstes möchte ich herzlich meinem Doktorvater Herrn Universitätsprofessor
Dr. Dr. med. Norbert Pallua für die Überlassung des Themas, für das stetige
Interesse am Fortschritt meiner Arbeit und für die Möglichkeit, die Ergebnisse auf
Kongressen vorzustellen danken.
Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Dr. med. Andreas Gröger für die persönliche
Betreuung, uneingeschränkte Unterstützung und kompetente Beratung. Während der
gesamten Zusammenarbeit fand er vor allem immer wieder Zeit für aufbauende
Gespräche und anregende Diskussionen.
Ein großes Dankeschön auch an Dr. rer. nat. Guy Steffens für die Betreuung des
biochemischen Teils meiner Arbeit und für die vielen anregenden Ratschläge.
Herrn Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Jürgen Bernhagen danke ich für die
Möglichkeit zur Nutzung der Laboratorien des Instituts für Biochemie.
Weiterhin möchte ich Herrn PD Dr. med. Ernst Magnus Noah für die Organisation
des gesamten Projektes danken, wodurch meine Arbeit erst ermöglicht wurde.
Bedanken möchte ich mich weiterhin bei allen Kollegen und Mitarbeitern der
Laboratorien für Plastische Chirurgie und Biochemie, die mir stets mit Rat und Tat
zur Seite standen. Insbesondere möchte ich an dieser Stelle Dr. med. Chang Yao,
Dr. med. Marta Markowicz, Dr. med. Andrzej Piatkowski, Dr. med. vet. Pascal Prével,
Sabine Koch, Tanja Oepen, Helge Fünfzig und Michael Thiele erwähnen.
Ein großes Dank auch an die Firma Suwelack Skin & Health Care AG für die
Herstellung der verwendeten Kollagenprodukts.
Mein Dank richtet sich auch an Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Ralf-Dieter Hilgers
und seine Mitarbeiter für die statistische Beratung meiner Ergebnisse.
106
Meinen Eltern Hildegard und Norbert Grieb gilt mein Dank für ihre uneingeschränkte
Unterstützung und Motivation. Sie allein haben mir die ärztliche Ausbildung
ermöglicht. Ihnen möchte ich diese Arbeit widmen.
Außerdem danke ich meiner Frau Jule, die immer an mich glaubte und allzu oft
geduldig Korrektur las. Sie bestärkte mich in meinen Ideen und stand mir
ausnahmslos in allen Höhen und Tiefen zur Seite.
Leipzig im Juni 2006
107
Curriculum Vitae
Persönliche Daten:
Name: Gerrit Christian Grieb
Geburtsdatum: 08. Februar 1978
Geburtsort: Göttingen
Familienstand: verheiratet, keine Kinder
Schulausbildung: 08/1984 – 07/1990 Grundschule Bonifatius, Göttingen
08/1990 – 07/1992 Gymnasium Isernhagen, Isernhagen
08/1992 – 07/1997 Gymnasium Syke, Syke Abschluss: Abitur (Note: 1,7)
10/1994 – 03/1995 11. Klasse an der Ross. S. Sterling Highschool, Baytown, Texas, USA
Zivildienst: 08/1997 – 08/1998 Deutsches Rotes Kreuz, Rettungswache Bassum Ausbildung zum Rettungssanitäter (Abschlussnote: 1,1)
Hochschulausbildung: 10/1998 – 10/2001 Philipps Universität Marburg
09/2000 Physikum
08/2001 1. Staatsexamen
10/2001 – 09/2003 RWTH Aachen
10/2003 – 06/2004 “Universidad de Santiago de Compostela”, Spanien
Einjähriges ERASMUS-Stipendium an der Universität von Santiago de Compostela
Teilnahme an Vorbereitungskursen für das „Médico Interno Residente“ (spanisches Staatsexamen)
07/2004 – 11/2005 RWTH Aachen
09/2004 2. Staatsexamen (Note: „gut“)
108
11/2005 3. Staatsexamen (Note: „sehr gut) Ärztliche Gesamtnote: 1,9
12/2005 Approbation als Arzt
Praktisches Jahr: 10/2004 – 02/2005 Plastische Chirurgie, Hand- und Verbrennungschirurgie,
Universitätsklinikum der RWTH Aachen
02/2005 – 05/2005 Innere Medizin, Anstellung als Unterassistent am Regionalspital Emmental, Schweiz
05/2005 – 09/2005 Viszeral-, Thorax- und Gefäßchirurgie, Medizinisches Zentrum Kreis Aachen GmbH
Klinische Ausbildung: Basisweiterbildung für Chirurgie:
seit 01/2006 Assistenzarzt in der Klinik für Intensivmedizin und Anästhesiologie, Gesundheitszentrum Bitterfeld/Wolfen, Klinikum Bitterfeld
Forschung:
Kongressbeiträge:
Grieb G., Gröger A., Steffens G., Noah E.M., Pallua N. „Die Entwicklung von modifizierten Kollagen-Matrizes als verbesserter Wunderersatz für Schwerbrandverletzte“.
23. Jahrestagung der deutschsprachigen Arbeitsgemeinschaft für Verbrennungschirurgie (DAV), 2005, Falera, Schweiz, Vortrag Grieb G., Groger A., Steffens G., Noah E.M., Pallua N. “Modification of collagen matrices for enhanced angiogenesis: Characteristics of heparinized collagen sponges loaded
with Vascular Endothelial Growth Factor”. 16th European Students Conference (ESC), 2005, Berlin, Germany, Oral Presentation, Winner in Session Surgery
Gröger A., Grieb G., Steffens G., Noah E.M., Pallua N. „Eigenschaften und biologische Wirkung von modifizierten Kollagen-Matrizes zur Verbesserung der
Angiogenese“. 121. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie, 2004, Berlin, Deutschland, Vortrag
Groger A., Grieb G., Steffens G., Noah E.M., Pallua N. ”Enhancing angiogenetic potential of collagen matrices“. 7th European Conference of Scientists and Plastic
Surgeons (ECSAPS), 2003, Geneva, Switzerland, Oral Presentation
109
Publikationen: Groger A.*, Grieb G.*, Markowicz M., Piatkowski A., Noah E. M., Schenck P., Steffens G.,
Pallua N. *Groger A. and Grieb G. contributed eqaully to this paper “Modification of collagen matrices for enhanced
angiogenesis: Characteristics of heparinized collagen sponges loaded with Vascular Endothelial Growth Factor”. Journal of Artificial Organs, submitted 2006
Koch S., Yao C., Grieb G., Prevel P., Noah E.M., Steffens G. “Enhancing angiogenesis in collagen matrices by covalent incorporation of VEGF“. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, accepted 2005
Auslandspraktika: 02/2001 – 03/2001 Interplastcamp 2001, Rekonstruktive Chirurgie am „Asha Niketan
Hospital“ in Bhopal, Indien und am „Katra Hospital“ in Mandla, Indien
02/2002 – 03/2002 Plastische Chirurgie am Universitätsklinikum Groningen, Holland, Prof. J. P. Nicolai, M.D., Ph.D.
Zusatzqualifikationen: 04/2002 – 07/2002 Kurs der mikroskopischen Chirurgie Leiter: PD Dr. med. Franz Lassner
11/2004 – 12/2004 Kurs der abdominellen Sonographie Leiter: PD Dr. med. R. Winograd
voraussichtlich Kurs für die Zusatzbezeichnung Notfallmedizin 11/06
Sprachkenntnisse: Deutsch: Muttersprache Englisch: Fließend Spanisch: Fließend Französisch: Gute Kenntnisse
Tätigkeiten neben der Ausbildung: 04/2000 – 07/2001 Betreuung von Kursen der makroskopischen und mikroskopischen
Anatomie, Institut für Anatomie, Philipps Universität Marburg, Prof. Dr. med. E. Weihe
Seit 02/2000 Nebenberufliche und Ehrenamtliche Tätigkeit als Skilehrer und Reiseleiter beim Deutschen Skiverband und verschiedenen Reiseanbietern
Seit 10/2001 Ehrenamtliche Tätigkeit als Segelfluglehrer beim Deutschen Aeroclub
Leipzig, im Juni 2006