Ruhr-Universität Bochum
Prof. Dr. med. T. Griga
Dienstort: Knappschaftskrankenhaus Dortmund
Abt.: Medizinische Klinik
Einfluss der anti-entzündlichen Therapie bei Patienten mit einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung durch den Promotor-
Polymorphismus T/C an Position –159 des CD14-Gens
Inaugural Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Christian Wilkens
aus Diepholz
2009
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. med. T. Griga
Koreferent: PD Dr. med. C. Teschendorf
Tag der mündlichen Prüfung: 20. April 2010
Abstract
Einfluss der anti-entzündlichen Therapie bei Patien ten mit einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung durch den Promotor-Pol ymorphismus T/C an Position –159 des CD14-Gens
In der täglichen Routine werden unterschiedliche Therapieerfolge bei der anti-inflammatorischen Therapie von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen beobachtet. Endoluminale Bakterien und deren Toxine spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankung. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Analyse der Assoziation des Polymorphismus T/C an der Position –159 des CD14-Endotoxin-Rezeptor-Gens und der kumulativen Steroiddosis.
Methodik: Bei 72 Patienten mit chronisch-entzündlicher Darmerkrankung (Morbus Crohn: n = 37; Colitis ulcerosa: n = 35) wurde der Polymorphismus T/C an der Position –159 des CD14-Endotoxin-Rezeptor-Gens analysiert und mit der kumulativen Steroiddosis korreliert.
Ergebnisse: Die kumulative Steroiddosis war bei Colitis ulcerosa-Patienten mit dem TT-Genotyp signifikant höher (2447,7 ± 927,0 mg/a, n = 10) verglichen mit dem CT-Genotyp (142,3 ±142,3 mg/a, n = 13, p = 0,016) und dem CC-Genotyp (391,7 ± 272,7 mg/a, n = 9, p = 0,047). Bei Patienten mit Morbus Crohn zeigten sich keine signifikanten Unterschiede.
Zusammenfassung: Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Polymorphismus T/C an der Position –159 des CD14-Endotoxin-Rezeptor-Gens einen Einfluss auf die anti-inflammatorische Therapie von Patienten mit einer Colitis ulcerosa hat. Weitere Untersuchungen dieser prädisponierenden Gene werden neue stratifizierte Therapiewege von Patienten mit einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankung eröffnen.
meinen Eltern in Dankbarkeit gewidmet
I
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG ......................................................................................................1
1.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen............................................................1
1.1.1 Morbus Crohn..........................................................................................................1
1.1.1.1 Epidemiologie...................................................................................................1
1.1.1.2 Ätiologie und Pathogenese ...............................................................................2
1.1.1.3 Pathologie .........................................................................................................3
1.1.1.4 Klinik ................................................................................................................3
1.1.1.5 Therapie ............................................................................................................7
1.1.1.6 Prognose............................................................................................................8
1.1.2 Colitis ulcerosa ........................................................................................................8
1.1.2.1 Epidemiologie...................................................................................................8
1.1.2.2 Ätiologie und Pathogenese ...............................................................................9
1.1.2.3 Pathologie .......................................................................................................10
1.1.2.4 Klinik ..............................................................................................................10
1.1.2.5 Therapie ..........................................................................................................11
1.1.2.6 Prognose..........................................................................................................11
1.1.2.7 Karzinomprophylaxe ......................................................................................12
1.2 CD14-Antigen .............................................................................................................12
1.2.1 Membrangebundenes (m) CD14-Antigen .............................................................13
1.2.2 Lösliches (s) CD14-Antigen..................................................................................14
1.3 Zielsetzung und Fragestellung ..................................................................................15
2 MATERIAL UND METHODEN.............................. ............................................17
2.1 Material .......................................................................................................................17
2.1.1 Patientenkollektiv ..................................................................................................17
2.1.2 Oligonukleotide .....................................................................................................20
II
2.1.3 Chemikalien...........................................................................................................20
2.1.4 Lösungen ...............................................................................................................21
2.1.5 Enzyme..................................................................................................................22
2.1.6 Längenstandards ....................................................................................................22
2.2 Methoden ....................................................................................................................22
2.2.1 Genomische DNA-Extraktion aus Vollblut...........................................................22
2.2.2 Reinheitsgrad- und Konzentrationsbestimmung der DNA....................................23
2.2.3 Amplifikation der genomischen DNA mit der Polymerasekettenreaktion............24
2.2.4 Spaltung der PCR-Produkte mittels des Restriktionsfragment-
Längenpolymorphismus (RFLP) ........................................................................................25
2.2.5 Agarose-Gelelektrophorese ...................................................................................25
2.2.6 Schematische Darstellung des Fragebogens..........................................................26
2.2.7 Ermittlung der kumulativen Steroiddosis..............................................................27
2.2.8 Statistik ..................................................................................................................27
3 ERGEBNISSE...................................................................................................28
3.1 Morbus Crohn ............................................................................................................28
3.1.1 Geschlecht .............................................................................................................28
3.1.2 Familienanamnese .................................................................................................28
3.1.3 Extraintestinale Manifestation...............................................................................29
3.1.4 Befallsmuster des Darmes .....................................................................................29
3.1.5 Kumulative Steroiddosis .......................................................................................29
3.2 Colitis ulcerosa ...........................................................................................................30
3.2.1 Geschlecht .............................................................................................................30
3.2.2 Familienanamnese .................................................................................................31
3.2.3 Extraintestinale Manifestationen ...........................................................................31
3.2.4 Dauer der CED ......................................................................................................31
3.2.5 Befallsmuster des Darmes .....................................................................................31
3.2.6 Kumulative Steroiddosis .......................................................................................31
4 DISKUSSION....................................................................................................33
III
5 ZUSAMMENFASSUNG .................................... ................................................38
6 LITERATURVERZEICHNIS............................... ...............................................39
IV
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Kaskade der Immunantwort bei einer gram-negativen Sepsis.
(http://www.biochem.duke.edu/Raetz/Lipid%20A1.html) ................15
Abbildung 2: Prozentuale Altersverteilung ...........................................................17
Abbildung 3: Verteilung der homo- und heterozygoten Allele ..............................18
Abbildung 4: Box-Plot über die Altersverteilung entsprechend des
Genpolymorphismus........................................................................18
Abbildung 5: Prozentuale Anteile des Gen-Codes bei Männern und Frauen mit
Morbus Crohn. ................................................................................19
Abbildung 6: Prozentuale Anteile des Gen-Codes bei Männern und Frauen mit
Colitis ulcerosa................................................................................20
Abbildung 7: Fragebogen zur Dissertation ...........................................................26
Abbildung 8: Kumulative Steroiddosis beim Morbus Crohn .................................30
Abbildung 9: Kumulative Steroiddosis bei der Colitis ulcerosa ............................32
V
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Initialsymptome der CED .....................................................................4
Tabelle 2: Extraintestinale Befallsmuster ..............................................................6
VI
Abkürzungsverzeichnis
5-ASA-Präparat 5-Aminosalicylacid-Präparat
CARD15 caspase activating recruitment domain 15
CDAI Crohn´s disease activity index
CED Chronisch entzündliche Darmerkrankung
CU Colitis ulcerosa
DGVS Deutsche Gesellschaft für Verdauungs- und Stoffwechselkrankheiten
DNA Deoxyribonucleinacid
EDTA-Blut Ethylenediaminetetraacetic acid
GPI-Anker Glykosyl-phosphatidyl-inositol-Anker
HDL High Density Lipoprotein
HLA human lymphocyte antigen
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
LBP Lipoprotein bindendes Protein
LDL Low Density Lipoprotein
LPS Lipopolysaccharid
MC Morbus Crohn
mCD14 Membrangebundenes CD14
PAMP pathogen assoziated molecular pattern
PCR polymerase chain reaction
RFLP Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus
sCD14 lösliches CD14
SNP single nucleotid polymorphism
Taq Bakterium Thermus aquaticus
TLR Toll-like-Rezeptor
- 1 –
1 Einleitung
1.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen
Allen Formen der „chronisch entzündlichen Darmerkrankungen“ (CED) gemeinsam
ist eine meist in Schüben verlaufende Entzündung des Gastrointestinaltraktes. Das
Leitsymptom sind chronisch auftretende Diarrhoen (Siegenthaler 2000).
Differentialdiagnostisch finden sich infektiöse Enteritiden, medikamentös allergische
Kolitiden, pseudomembranöse Kolitiden, Strahlenkolitiden, immundefekt-assoziierte
Kolitiden oder die idiopathisch entzündlichen Darmerkrankungen (Hahn et al. 1996).
Hierbei lassen sich bei den idiopathischen Formen Morbus Crohn (MC) und Colitis
ulcerosa (CU) unterscheiden.
1.1.1 Morbus Crohn
Betrachtet man die Historie dieses Krankheitsbildes, so wurde bereits 1761 durch
Morgagni eine „ileal passion“ beschrieben. Im Jahre 1806 konnte bei einem
Patienten, der jahrelang an kolikartigen Bauchschmerzen litt, bei der Autopsie ein
verdicktes, deutlich entzündlich verändertes Ileum gefunden werden. Erst durch die
Autoren Crohn, Ginzburg und Oppenheimer fand die Erkrankung 1932 ihre heutige
Namensgebung, die sich damals insbesondere durch ihre subakute Entzündung mit
Beschränkung auf das terminale Ileum auszeichnete (Crohn et al. 1932).
1.1.1.1 Epidemiologie
Für die Inzidenz des MC konnte ein deutliches Nord-Süd-Gefälle nachgewiesen
werden, mit den höchsten Raten für skandinavische Länder. Dabei bewegen sich
die Inzidenzen gegenwärtig zwischen 1,5 und 6,1 neuen Fällen pro Jahr auf 100000
Einwohner (Hahn et al. 1996). Das Erstmanifestationsalter liegt zwischen dem 15.
und 35. Lebensjahr, wobei eine eindeutige Geschlechtspräferenz nicht
nachgewiesen werden konnte (Caspary, Bargon 1999). Allerdings zeichnet sich ein
deutlicher Einfluss von Umweltfaktoren auf die Inzidenz der Erkrankung ab, wie an
- 2 –
jüdischen Patienten gezeigt werden konnte. So haben beispielsweise
amerikanische Juden ein 4-fach höheres Erkrankungsrisiko als die übrige
amerikanische Bevölkerung, wobei in Israel lebende Juden eine der übrigen weißen
Bevölkerung ähnliche Inzidenz vorweisen (Hahn et al. 1996). Neben
sozioökonomischen Faktoren wie arm-reich, oder Stadt-Landbevölkerung scheinen
aber auch genetische Faktoren eine wesentliche Rolle zu spielen. Dabei stellt die
Erkrankung eines Verwandten ersten Grades den größten Risikofaktor dar. Man
vermutet ein heterogenes genetisches Modell (Hahn et al. 1996). Über die
diagnostische Latenz von Beginn der Symptomatik bis zur Erstdiagnose finden sich
noch unterschiedliche Ergebnisse, die sicherlich internationalen und auch
nationalen Abweichungen unterliegen. Beispielhaft zeigte eine Arbeit über die
Inzidenz der CED in der Oberpfalz, dass die mittlere Latenz im Median bei 61
Tagen liegt (Range 0 – 10 Jahre).
1.1.1.2 Ätiologie und Pathogenese
Sowohl beim MC, als auch bei der CU konnte eine definitive Ätiologie bisher nicht
nachgewiesen werden. Bezüglich der Prädisposition des MC scheinen dennoch
unterschiedliche Mechanismen Einfluss zu nehmen. Umweltfaktoren wie veränderte
Ernährungsgewohnheiten, Verstädterung der Bevölkerung, Wohlstand,
Auswanderungen, oder aber das Nord-Süd-Gefälle weisen auf einen
Zusammenhang mit dem Ausbruch der Erkrankung hin. So führt zum Beispiel eine
ausschließlich parenterale Ernährung, oder aber eine operative Ausschaltung des
entzündeten Darmabschnittes zu einer klinischen Besserung (Caspary, Bargon
1999). Im Gegensatz zur CU findet sich bei MC Patienten eine erhöhte Inzidenz bei
Rauchern (Adler 1997). Eine ähnliche Korrelation fand sich bei der Einnahme oraler
Kontrazeptiva, wobei die Einnahme die Inzidenz positiv beeinflusste. Wie bereits
erwähnt, haben genetische Konstellationen einen wesentlichen Einfluss, einen MC
zu entwickeln. Dabei ist ein polygener Erbgang sehr wahrscheinlich, wobei noch
nicht bekannt ist, in welchem Umfang mehrere Gene interagieren, damit es zur
phänotypischen Ausprägung des klinischen Krankheitsbildes kommt. Insbesondere
die HLA-Typisierung nimmt einen hohen Stellenwert in der Forschung ein. So zeigte
sich in Tiermodellen, dass sich bei einer transgenen Ratte mit dem menschlichen
- 3 –
HLA B27-Merkmal eine Kolitis entwickelte. Eine mögliche infektiöse Genese des
MC wird bis heute kontrovers diskutiert. Dennoch scheint eine Regulationsstörung
der Immunantwort das Bindeglied zwischen genetischer Disposition und
Umweltfaktoren zu sein. Durch das entstehende Missverhältnis zwischen IgA- und
IgG-, bzw. IgM-Sekretion bei MC Patienten kommt es in der Mukosa zu einer
vermehrten Aktivierung des Komplement aktivierenden Systems. Dies hat durch die
zytotoxischen Eigenschaften eine konsekutive Zerstörung von intestinalen
Epithelzellen zur Folge (Caspary, Bargon 1999). Uneinstimmig werden mögliche
Zusammenhänge mit psychosozialen Faktoren diskutiert, da überwiegend
retrospektive Daten vorliegen und somit auch bei fehlenden Kontrollstudien keine
eindeutigen Korrelationen gefunden werden konnten.
1.1.1.3 Pathologie
Im Gegensatz zur CU zeigt sich ein diskontinuierliches Befallsmuster mit so
genannten skip lesions, wobei der gesamte Gastrointestinaltrakt betroffen sein
kann. In bis zu 75% der Fälle ist das terminale Ileum das am häufigsten entzündete
Teilstück des Darmes. In dreiviertel aller Fälle ist das Rektum nicht mit befallen.
Eine isolierte Entzündung des Rektums beim MC ist nur in 2-6% der Fälle
beschrieben (Hahn et al. 1996). Typisch ist eine transmurale Entzündung der
Schleimhaut, die bis auf die Serosa übergreift. Durch die resultierenden
Ulzerationen bietet sich makroskopisch das Bild eines Pflastersteinreliefs mit
intermittierender intakter Schleimhaut. Histologisch können sich in 40 – 60% der
Fälle epitheloidzellige Granulome finden, die allerdings nicht als pathognomonisch
gelten, da sie zudem bei gastrointestinalen Krankheitsbildern wie Campylobacter
jejuni, Mykobakteriosen, Divertikulitis, Morbus Whipple, oder chronischen
Ischämiereaktionen auftreten können (Caspary, Bargon 1999).
1.1.1.4 Klinik
Zu den Leitsymptomen des MC zählen abdominelle Schmerzen, Diarrhoen,
Gewichtsabnahme, Fieber. Durch den häufigen Befall des terminalen Ileums kann
ebenfalls eine perniziöse Anämie bestehen.
- 4 –
Tabelle 1: Initialsymptome der CED
Initialsymptome Morbus Crohn
(%)
Colitis ulcerosa
(%)
Durchfälle 49,5 96,4
Blutbeimengungen 27,3 89,3
Schmerzen 86,9 81,3
Allgemeines Unwohlsein 81,7 40,2
Gewichtsverlust 59,6 38,4
Arthralgien 29,2 27,7
Fieber 24,7 20,5
Hautveränderungen 14,2 15,2
Appetitlosigkeit 18,7 11,6
Ophthalmopathien 3,8 7,1
Übelkeit 28,1 6,3
Erbrechen 20,2 4,5
Abszesse 25,8 3,6
Fisteln 39,3 3,6
Lymphknotenschwellungen 2,6 1,8
- 5 –
Aufgrund der Leitlinien der Deutschen Gesellschaft für Verdauungs- und
Stoffwechselkrankheiten (DGVS) werden fünf unterschiedliche Stadien
unterschieden:
- akuter Schub (leicht, mittelschwer, schwer), definiert durch die klinische
Symptomatik, sowie durch erhöhte Entzündungsparameter
- Chronisch aktiver Verlauf, bei Persistenz der Symptome über ein halbes Jahr
hinaus
- Steroidabhängiger Verlauf, wenn 10mg oder mehr Prednisolon für eine
anhaltende Remission notwendig sind
- Steroidrefraktärer Verlauf, wenn nach der Akuttherapie und fortgesetzter
Steroidgabe die klinische Symptomatik durch anhaltend hohe Steroidgabe
nicht zu durchbrechen ist
- Remission, mit normalisierter klinischer Symptomatik und regelhaften
Entzündungsparametern
Neben dem eigentlichen Befall des Intestinums gibt es zudem diverse
extraintestinale Manifestationen, die auf eine CED hindeuten. Allgemein werden
extraintestinale Komplikationen bei ca. 20 % der Erkrankten gefunden.
- 6 –
Tabelle 2: Extraintestinale Befallsmuster
Betroffenes Organ Befallsmuster
Haut - Erythema nodosum
- Pyoderma gangränosum
Oropharynx - Aphten
Augen - Episkleritis
- Uveitis
- Konjunktivitis
- Keratitis
- Retrobulbärneuritis
- Choroiditis
- Iridozyklitis
Entzündliche Gelenkerkrankungen - Arthritiden
- Sakroileitis
- Ankylosierende Spondylitis
Knochen - Osteoporose
- Osteomalazie
- Ischämische und aseptische
Knochennekrosen
Vaskulitiden - Vaskulitiden
- Myositiden
Bronchopulmonale
Manifestationen
- Alveolitis
- Lungenfibrose
- 7 –
Pankreas - Akute Pankreatitis
- Autoantikörper gegen exokrines
Pankreasgewebe
Leber und Gallenwege - Chronisch aktive Hepatitis
- Primär sklerosierende
Cholangitis
- Cholelithiasis
- Pericholangitis
Nieren - Glomerulonephritis
- Interstitielle Nephritis
- Nephrolithiasis
1.1.1.5 Therapie
Generell werden medikamentöse von chirurgischen Maßnahmen unterschieden.
Letztere sollten nur beim Auftreten von Komplikationen durchgeführt werden, da
eine Heilung durch die operative Entfernung eines entzündeten Teilstücks des
Darmes nicht erfolgt (Adler 1997). Zu den therapeutischen Möglichkeiten gehören
unter anderem Kortikosteroide. Sie zeigen eine immunsuppressive und
entzündungshemmende Wirkung, wodurch sowohl die frühe, als auch die späte
Phase behandelt wird. Einen weiteren festen Bestandteil in der Behandlung der
CED bilden die Aminosalicylate. Sie zeichnen sich ebenfalls durch eine
antiinflammatorische Wirkung aus. Vorteile durch die Gabe von Immunsupressiva
wie Azathioprin ergaben sich durch die Möglichkeit der Reduktion der Steroiddosis,
sowie durch eine Verbesserung eines Fistelleidens. Ein Therapieerfolg stellte sich
zumindest bei zwei Drittel der Patienten ein (Caspary, Bargon 1999). Die kurative
Behandlung der CED durch Antibiotika konnte bisher nicht belegt werden. Lediglich
in der Therapie von Komplikationen (Abszesse, Sepsis oder bakterielle
Fehlbesiedlungen) kommen sie zum Einsatz. Neben den beiden genannten
- 8 –
Therapieoptionen ist insbesondere bei Patienten mit Mangelerscheinungen auch
eine enterale Formuladiät sinnvoll (Dignass 2001).
1.1.1.6 Prognose
Aufgrund der akuten Schübe und den spontanen Remissionen handelt es sich um
einen chronisch-rezidivierenden Verlauf. Etwa 30% der Betroffenen kommen
innerhalb von 4 Monaten in eine spontane Remission. Innerhalb von 2 Jahren
beträgt die Gefahr eines erneuten Schubes ca. 50%. Die bereits in Tabelle 2
erwähnten Komplikationen führen bei rund 90% der Patienten zu mindestens einer
Operation in ihrem Leben. Dabei gibt es keinen geschlechtsspezifischen
Unterschied. Trotz einer Operation treten bei 70% der Patienten bereits nach einem
Jahr endoskopisch sichtbare Läsionen auf. Nach 5 Jahren haben rund 40% der
Patienten ein symptomatisches Rezidiv. Die Mortalitätsrate beim MC ist aufgrund
der fortschreitend verbesserten Therapien deutlich gesunken. So ist das Risiko um
das maximal 1,5 fache erhöht. Überwiegend wurden als Todesursachen die Sepsis,
Malnutrition oder eine massive Blutung, Amyloidose, postoperative Mortalität,
Gallenwegs- und Atemwegserkrankungen angegeben (Adler 1997).
1.1.2 Colitis ulcerosa
Erstmals wurde diese Form der CED 1859 durch Wilks und Moxon als
eigenständiges Syndrom beschrieben und damit die bakteriell verursachte Form
von der idiopathischen Kolitis unterschieden. Hurst beschrieb 1935 die
entsprechenden sigmoidoskopischen Veränderungen als ulzeröse Kolitis.
1.1.2.1 Epidemiologie
Für die Inzidenz der CU zeigt sich ebenfalls wie beim MC eine geographische
Abhängigkeit. So werden in Nordeuropa, Nordamerika und Australien höhere
Inzidenzen vermerkt, als in Süd- und Osteuropa, oder Asien, bzw. Südamerika
(Hahn et al. 1996). Das Erstmanifestationsalter liegt zwischen dem 20. und 40.
Lebensjahr und zeigt einen zweiten Altersgipfel zwischen dem 50. und 60.
- 9 –
Lebensjahr. Longitudinale Untersuchungen ergaben jedoch eine stabile
Inzidenzrate, im Gegensatz zum MC, wo sich eine deutliche Zunahme von
Neuerkrankungen pro 100000 Einwohner darstellt. Die ethnische Zugehörigkeit
spielt ebenfalls eine Rolle. So erkranken Schwarze deutlich seltener. Ebenso im
Kontrast zum MC steht, dass die Inzidenzrate von Emigranten konstant bleibt, statt
anzusteigen.
1.1.2.2 Ätiologie und Pathogenese
Wie auch beim MC wird auch bei der CU ein komplexes Zusammenspiel von
mehreren Faktoren vermutet. Als protektiver Umweltfaktor wurde das Rauchen
beobachtet, wobei der Pathomechanismus noch nicht näher untersucht wurde. Eine
mögliche Milchallergie im Zusammenhang mit der CU wurde diskutiert, konnte
allerdings nicht eindeutig nachgewiesen werden. Des weiteren konnte durch
parenterale Ernährung, bzw. eine passagere Ileostomie keine wesentliche
langfristige Besserung wie beim MC erreicht werden. Die Einnahme oraler
Kontrazeptiva zeigte keine wesentliche Beeinflussung bezüglich Manifestation oder
Verlauf. Auch bei der CU wird eine familiäre Häufung und damit eine genetische
Abhängigkeit beschrieben (Caspary, Bargon 1999). In einer schwedischen
Zwillingsstudie von Tysk et al. konnte 1988 nachgewiesen werden, dass die
Konkordanzrate bei CU mit 6,3% wesentlich geringer ausfiel, als bei MC mit 58,3%
(Tysk et al. 1988). Demnach scheinen beim MC genetische Faktoren stärkeren
Einfluss zu nehmen. Bezüglich der Immunpathogenese scheint es sich im
Gegensatz zum MC bei der CU um eine Autoimmunkrankheit zu handeln. Diese
These wird durch die erhöhte Koinzidenz zu anderen Autoimmunkrankheiten wie
Diabetes mellitus, Thyreoiditiden oder perniziöse Anämie unterstützt. Während die
pathologische Immunantwort beim MC eine vermehrte IgG2-Produktion hervorruft,
kommt es bei der CU zu einer Überproduktion an IgG1 und IgG3 Subklassen.
Letztere rufen eine starke Autoimmunantwort hervor.
- 10 –
1.1.2.3 Pathologie
Markant für die CU ist die sich nach proximal kontinuierlich ausbreitende
Entzündung. Dabei beginnt die Entzündung meistens im Rektum und kann sich bis
zum Caecum als so genannte Pankolitis ausbreiten. In Einzelfällen ist auch das
terminale Ileum mitbetroffen. Dieser Zustand wird dann als Backwash-ileitis
beschrieben. Makroskopisch findet sich initial eine ödematöse Schwellung, sowie
eine Friabilität. Es kann durch mechanische Reizungen zu Kontaktblutungen
kommen. Im weiteren Verlauf kommt es zu solitären Erosionen mit longitudinal
ausgerichteten und zunehmend flächenhaft konfluierenden Ulzerationen. So
genannte Pseudopolypen entsprechen dabei den verbliebenen Schleimhautinseln.
Durch rezidivierende Schübe verliert das Kolon seine Haustrierung. Histologisch ist
hauptsächlich die Mukosa, nur selten die Submukosa betroffen. Neben
Kryptenabszessen findet sich ein deutlicher Verlust an Becherzellen.
1.1.2.4 Klinik
Zu den Leitsymptomen der CU zählen weniger die abdominellen Schmerzen, als
vielmehr peranale Blutabgänge, Diarrhöen mit kleinvolumigen, schleimig-blutigen
Stuhlentleerungen, sowie Tenesmen, Fieber oder Gewichtsverlust. Teilweise wurde
aufgrund des distalen Befalls auch eine Obstipationsneigung beschrieben (Hahn et
al. 1996). Vorwiegend haben Patienten im akuten Schub jedoch bis zu 30
Stuhlentleerungen pro Tag.
Es werden drei unterschiedliche Stadien unterschieden:
- Chronisch rezidivierender Verlauf, in etwa 70% der Fälle kommt es zu
langandauernden Remissionen. Sowohl NSAR, als auch Antibiotika oder 5-
Aminosalicylate können ein Rezidiv auslösen.
- Chronisch aktiver Verlauf, es werden trotz maximaler konservativer Therapie
keine langandauernden Remissionen erreicht
- Akut-fulminante Verlaufsform (toxisches Megakolon), die durch eine akute
Perforationsgefahr gekennzeichnet ist
- 11 –
Die extraintestinalen Manifestationen gelten in gleicher Weise für die CU und
wurden bereits in Tabelle 2 aufgelistet.
Die typischen Komplikationen im natürlichen Verlauf der CU sind (Hahn et al. 1996):
- Massive Blutungen
- Stenosen und Strikturen
- Perforation im Rahmen eines toxischen Megakolons oder durch
periproktitische Abszesse, bzw. Analfisteln bedingt
- Prästomale Ileitis, Pouchitis
- Primär sklerosierende Cholangitis
- Kolonkarzinom
1.1.2.5 Therapie
Die Therapie ist wie die des MC. Die CU ist durch eine Kolektomie heilbar,
allerdings nur ratsam für Patienten mit hohem Leidensdruck, bzw. fulminantem
Krankheitsverlauf.
1.1.2.6 Prognose
Das Ausmaß der Colitis bei Erstdiagnose hat eine entscheidende prognostische
Wertigkeit. So hat erwartungsgemäß die Pankolitis bzw. das toxische Megakolon
eine deutlich schlechtere Prognose, da eine sofortige Kolektomie notwendig ist.
Nach Operation ist die CU ausgeheilt. Allerdings zeigen sich auch unter der
konservativen Therapie langjährige Remissionen. Nur 37% der Patienten stehen
nach 10 Jahren weiterhin unter einer Dauermedikation. Es findet sich eine nur leicht
erhöhte Mortalitätsrate durch die sich möglicherweise einstellenden Komplikationen
wie kolorektales Karzinom und Erkrankungen der Gallenwege (sklerosierende
Cholangitis). Eine in regelmäßigen Abständen durchzuführende endoskopische
Kontrolle ist somit zur Vorbeugung eines Karzinoms leitliniengerecht indiziert
(DGVS 2008).
- 12 –
1.1.2.7 Karzinomprophylaxe
Die Krebsvorbeugung kann medikamentös mittels der 5-ASA-Präparate erfolgen.
Darüber hinaus ist eine regelmäßige endoskopische Kontrolle unabdingbar.
Entsprechend der Leitlinien sollte bei Patienten mit subtotaler/totaler CU ab dem
achten Jahr bzw. bei einer linksseitigen CU ab dem 15. Jahr nach Diagnosestellung
jährlich eine komplette Spiegelung des Darmes erfolgen mit Stufenbiopsie-
Entnahmen. Am aussagekräftigsten sind diese Biopsien, wenn sie während einer
Remissionsphase gewonnen werden. Wenn fragliche Dysplasien entdeckt werden,
ist eine Kontrolluntersuchung innerhalb von sechs Monaten indiziert, um den
Befund zu verifizieren. Erst nach Bestätigung einer hochgradigen Dysplasie durch
einen Referenzpathologen ist die Colektomie inklusive Entfernung des Rektums
empfohlen. Bei niedriggradigen Dysplasien besteht eine relative
Operationsindikation. (DGVS 2008)
1.2 CD14-Antigen
Die CED zeichnet sich durch eine multifaktorielle Genese aus. Wie bereits eingangs
beschrieben scheinen die Immunantwort auf darmpathogene Keime, sowie die
genetischen Faktoren eine entscheidende Rolle bei der Klinik zu spielen.
Verschiedene Polymorphismen wurden dabei untersucht. Die Aufgabe des CD14-
Antigens ist in der zellulären und humoralen Immunantwort zu finden. Dabei werden
insbesondere Lipopolysaccharide (LPS) der gram-negativen Bakterien neutralisiert
um einen möglichen septischen Schock zu verhindern. Wegen dieser Fähigkeit
bezeichnet man das CD14-Antigen auch als LPS-Rezeptor, da bereits geringe LPS-
Konzentrationen durch diesen Mechanismus eine Aktivierung von Monozyten zu
Folge hat. Allerdings werden auch weitere verschiedene Faktoren von gram-
negativen oder gram-positiven Bakterien, sowie Pilzinfektionen erkannt. Folgende
Funktionen werden dem CD14-Antigen ebenfalls zugeschrieben, wodurch sich eine
universelle Einsetzbarkeit des Proteins vermuten lässt (Antal-Szalmas 2000):
- 13 –
- Regulation des programmierten Zelltodes in Monozyten
- LPS-vermittelte Knochenresorption
- Phagozytose gram-negativer Bakterien (in vitro)
- Rolle bei der Aufnahme von apoptotischen Fragmenten im Serum
Das CD14-Antigen ist ein Glykoprotein mit 356 Aminosäuren und einem 19
Aminosäuren langen N-terminalen Hauptprotein. Zu finden ist das kodierende Gen
auf dem Chromosom 5 und enthält zwei Exons. Das CD14-Gen ist somit innerhalb
eines Zytokin-Clusters in der Chromosomenregion 5q22-q32 zu finden (Klein et al.
2002). CD14 ist kein transmembranöses Protein, sondern bindet sich an die
Plasma-Membran mittels eines Glykosyl-phosphatidyl-inositol-Ankers (GPI-Anker)
(Antal-Szalmas 2000). Präsentiert wird das CD14-Antigen hauptsächlich auf den
Zellen der myeloischen Reihe wie zum Beispiel Monozyten, Neutrophile,
Makrophagen, aber auch Zellen, wie zum Beispiel B-Lymphozyten, Basophile, oder
Trophoblasten zeigen geringe Konzentrationen. Bemerkenswert ist die Tatsache,
dass frühe Formen der myeloischen Zellreihe dieses Antigen nicht aufweisen. Auch
innerhalb einer Zellpopulation finden sich je nach Einsatzort unterschiedliche CD14-
Konzentrationen auf den Zellen. Makrophagen des Peritoneums, der Pleura oder
der perivaskulären Gehirnanteile verzeichnen höhere Konzentrationen als
Makrophagen der intestinalen Mukosa, der Alveolen, oder Mikroglia.
In der Literatur werden zwei Hauptformen des CD14 unterschieden.
1.2.1 Membrangebundenes (m) CD14-Antigen
Durch die Interaktion mit dem Lipopolysaccharid-bindenden Protein (LBP) hat es
eine rund 10² bis 10³ höhere Affinität zum LPS. LBP ist ein in der Leber und der
Lunge produziertes Protein und essentiell für eine schnelle Immunantwort auf eine
Infektion mit gram-negativen Bakterien. Somit können bis zu 15 LPS-Moleküle pro
CD14-Rezeptor gebunden werden. Diese sind durch einen GPI-Anker fest mit der
jeweiligen Zelle verbunden, wodurch eine transmembranöse Verbindung nach
intrazellulär fehlt. Mittels eines Toll-like-Rezeptors (TLR) erfolgt die
Signaltransduktion nach intrazellulär, wodurch nun die Immunantwort in Form einer
- 14 –
Zytokinkaskade beginnt (Takeuchi et al. 1999). Je nach Infektionsverlauf lassen
sich unterschiedliche Konzentrationen des CD14-Antigen nachweisen. In der ersten
Stunde kommt es durch intrazelluläre Translokation eines CD14-Pools an die
Zelloberfläche zu einem deutlichen Konzentrationsanstieg um die erste LPS-
Einschwemmung abzufangen. Da die Produktion des CD14-Antigens zunächst
langsam startet, kommt es in den nächsten Stunden zu einem Konzentrationsabfall
der Oberflächenkonzentration, da die intrazellulären Speicher aufgebraucht sind
und die Halbwertzeit des Oberflächenantigens kleiner ist. Die maximale Kapazität
ist somit nach drei Tagen durch eine gesteigerte Proteinsynthese erreicht (Antal-
Szalmas 2000).
1.2.2 Lösliches (s) CD14-Antigen
Im Gegensatz zur membrangebundenen Form dient bei der löslichen Form das LBP
lediglich als Katalysator, so dass maximal zwei LPS pro sCD14 aufgenommen
werden können. Es findet seine Hauptfunktion in der Neutralisierung und
Eliminierung von LPS im Serum. Zudem zeigt sich eine Interaktion mit CD14-
negativen Zellen wie dem Endothel und Epithel, oder der glatten Muskulatur.
Das CD14-Antigen reagiert nicht nur spezifisch auf das LPS. Vielmehr erweist es
sich als ein universell einzusetzendes Molekül zum Erkennen verschiedener
Infektionen. Beispielhaft führen Mycobakterien, Klebsiellen, Borrellien,
Streptokokken, oder Treponemen ebenfalls zu einer nachfolgenden Aktivierung der
Immunantwort. Ebenso führen verschiedene Erkrankungen neben der CED zu
einem erhöhten Serumlevel des CD14-Antigens. Neben der rheumatoiden Arthritis
sei auch der systemische Lupus erythematodes, die Psoriasis, Malaria, chronische
Hepatitiden, oder HIV-Infektionen erwähnt (Antal-Szalmas 2000).
- 15 –
Abbildung 1: Kaskade der Immunantwort bei einer gram-negativen Sepsis. (http://www.biochem.duke.edu/Raetz/Lipid%20A1.html)
1.3 Zielsetzung und Fragestellung
In vorangegangenen Studien wurde nachgewiesen, dass es verschiedene Allele
des CD14-Gens gibt. An der Position -159 (bezogen auf den Translationsstart)
befindet sich ein sog. single nucleotid polymorphism (SNP) T/C an Position -159,
der die Transkriptionsrate des CD14-Gens beeinflusst. Es konnte nachgewiesen
werden, dass Patienten, bei denen das T-Allel in homozygoter Form vorliegt,
signifikant höhere Plasmakonzentrationen des sCD14 haben. In einer anderen
Studie wurden inaktive Crohn Patienten untersucht. Durch die Inaktivität wollte man
den Einfluss des möglichen Schweregrades der Erkrankung auf die CD14-
Konzentrationen möglichst gering gehalten. Dabei wurden neben endoskopischen
und radiologischen Befunden auch der Crohn´s disease activity index (CDAI)
herangezogen. Des Weiteren wurde als Einschlusskriterium auf eine vergleichbare
Medikation bei fehlender Steroideinnahme geachtet. Das Ergebnis zeigte bei
inaktiven Crohn-Patienten einen signifikant erhöhten sCD14-Plasmaspiegel im
- 16 –
Gegensatz zu den gesunden Probanden bei allen drei möglichen Genvarianten
(CC, CT, TT). Innerhalb der Crohn-Patienten fand sich kein signifikanter
Unterschied in der Höhe der Plasmakonzentration. Ganz anders verhielt sich das
Ergebnis bezüglich der membrangebundenen Variante. Hier gab es keinen
signifikanten Unterschied zwischen inaktiven Crohn-Patienten und den Probanden,
wohl aber innerhalb der Patientengruppe. Hier zeigte sich eine signifikant höhere
mCD14-Konzentration bei Patienten mit dem Genotyp CC im Gegensatz zum
Genotyp TT. Diese beiden Ergebnisse führen uns zu der Fragestellung, in wiefern
dieser Polymorphismus nicht nur Einfluss nimmt auf die jeweilige Konzentration des
CD14-Antigens, sondern möglicherweise auch auf die Therapie entscheidend
einwirkt (Griga et al. 2005). In der vorliegenden Arbeit wurde mittels retrospektiver
Analytik versucht, eine Korrelation zwischen dem SNP T/C an Position -159 des
CD14-Gens und dem Therapieverlauf bei Patienten mit einer CED zu finden.
- 17 –
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Patientenkollektiv
In dieser Arbeit wurden bei insgesamt 72 Patienten mit einer CED der SNP T/C an
Position -159 des CD14-Gens genotypisiert. Zuvor wurde entsprechend der
europäischen Gesellschaft für chronisch entzündliche Darmerkrankungen durch
klinische, endoskopische, sowie histologische Parameter die Diagnose festgelegt.
Diesen Patienten entnahmen wir mit deren Einverständnis während eines
stationären Aufenthaltes Blut zur Genotypisierung. Weitere klinische Daten aller
Patienten wurden mittels eines detaillierten Fragebogens erfasst. Alle
durchgeführten Untersuchungen erfolgten mit der Zustimmung der Patienten. Ein
positives Votum der Ethikkomission der Ruhr-Universität-Bochum liegt vor
(Registriernummern: 2022 A und 829).
männlich
weiblich
Geschlecht des Patienten
20 bis <3030 bis <40
40 bis <5050 bis <60
60 bis <7070 bis <80
80 bis <90
Gruppierung nach Alter
0%
10%
20%
30%
Pro
zen
tual
er A
nte
il
8%
6%
18%
17%
13%
6%
13%
3%
3%
11%
3% 1%
Abbildung 2: Prozentuale Altersverteilung
- 18 –
männlich
weiblich
Geschlecht des Patienten
CC CT TT
Gen-Code
10%
20%
30%
40%
Pro
zen
tual
er A
nte
il
13%
15%29%
17%
14%
13%
Abbildung 3: Verteilung der homo- und heterozygoten Allele
20
40
60
80
Alte
r de
s P
atie
nten
(Ja
hre)
CC-Allel CT-Allel TT-Allel
Abbildung 4: Box-Plot über die Altersverteilung entsprechend des Genpolymorphismus
- 19 –
Von diesen Patienten hatten 37 einen klinisch gesicherten MC. Davon waren 15
Patienten Männer und 22 Frauen mit einem Durchschnittsalter von 40,75 Jahren
(Variationsbreite 21 – 70). Die mittlere Erkrankungsdauer der Patienten betrug
14,68 Jahre (Variationsbreite 4 – 31).
männlich
weiblich
Geschlecht des Patienten
CC CT TT
Gen-Code
10%
20%
30%
40%
50%
Pro
zen
tual
er A
nte
il b
eim
Mo
rbu
s C
roh
n
10%
15%
33%
15%
18%
8%
Abbildung 5: Prozentuale Anteile des Gen-Codes bei Männern und Frauen mit Morbus Crohn.
Bei den übrigen Patienten handelt es sich um insgesamt 35 Personen mit einer
klinisch gesicherten CU. Davon waren wiederum 17 Patienten Männer und 18
Patienten Frauen mit einem Durchschnittsalter von 46,36 Jahren (Variationsbreite
20 – 82). Mit 15,76 Jahren lag die mittlere Erkrankungsdauer ähnlich hoch wie beim
MC.
- 20 –
männlich
weiblich
Geschlecht des Patienten
CC CT TT
Gen-Code
10%
20%
30%
40%
Pro
zen
tual
er A
nte
il b
ei C
olit
is u
lcer
osa
15%
15%
24%
18%
9%
18%
Abbildung 6: Prozentuale Anteile des Gen-Codes bei Männern und Frauen mit Colitis ulcerosa.
2.1.2 Oligonukleotide
CD14 Pro-F: 5’-gtgccaacagatgaggttcac-3’
CD14 Pro-R: 5’-gcctctgacagtttatgtaatc-3’
2.1.3 Chemikalien
Agarose ultra pure Gibco BRL
Borsäure: J.T. Baker
Bromphenolblau Merck
Ethidiumbromid Sigma
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Merck
Ficoll Typ 400 Pharmacia
Magnesiumchlorid p.A. Merck
Natriumacetat J.T. Baker
- 21 –
Natriumhydroxid J.T. Baker
Nukleotide MBI-Fermentas
Xylencyanol Bio Rad
2.1.4 Lösungen
Bidestilliertes Wasser wurde zur Erstellung der Lösungen verwendet.
Ethidiumbromidfärbelösung: 0,5 mg Ethidiumbromid
ad 1000 ml 1xTBE
Ladepuffer:
für Agarosegele: 0,25% w/v Bromphenolblau
0,25% w/v Xylencyanol FF
15% w/v Ficoll (Typ 400)
Gelelektrophoreselaufpuffer (1 x TBE): 89 mM TBE
89 mM Borsäure
2 mM EDTA
Magnesiumchlorid: 50 mM MgCl2
Nukleotide: 2 mM jedes Nukleotides in
H2O
PCR-Reaktionspuffer: 16 mM (NH2) 2SO4
67 mM Tris HCl (pH 8,8)
0,01% Tween-20
Oligonukleotide: 10 pmol/µl in H2O
- 22 –
2.1.5 Enzyme
Die von den Herstellern empfohlenen Puffer und Zusätze fanden Verwendung.
Taq DNA-Polymerase: Gene Craft
Restriktionsendonuklease:
Ava II NEB
2.1.6 Längenstandards
pUC19 DNA/MspI Marker MBI Fermentas
2.2 Methoden
2.2.1 Genomische DNA-Extraktion aus Vollblut
Zur Gewinnung der genomischen DNA aus Leukozyten wurde in unserer Arbeit die
Aussalzungsmethode nach Miller, Dykes und Polesky modifiziert angewandt (Miller
et al. 1988).
Dafür wurden je Proband 5 bis 10 ml EDTA-Blut für die DNA-Isolierung verwendet.
Das Blut wurde zuvor bis zu drei Monate bei konstanten –20°C gelagert. Um die
Erythrozyten zu lysieren wurde das Blut mit destilliertem Wasser in einem 50 ml
Röhrchen auf 45 ml aufgefüllt, das Blut/Wassergemisch geschüttelt und bei 3500
rpm bei 4°C für 15 min zentrifugiert. Nach Verwerfe n des Überstandes wurde das
Sediment mit NP 40, einem schwachen Detergens, resuspensiert, gemischt und
anschließend erneut unter den oben genannten Bedingungen zentrifugiert. NP 40
lysiert die Zellmembranen der Leukozyten, ohne die Kernmembran anzugreifen. Im
weiterführenden Schritt wurde zum Aufbruch der Kernmembranen und zum
Proteinverdau das Sediment mit 3 ml TEN pH 8,2, 200 µl 10%igem SDS und 100 µl
- 23 –
Proteinase K 10 mg/ml resuspendiert und intensiv geschüttelt. Daraufhin erfolgte
die Inkubation über Nacht bei 37°C im Wasserbad. Na ch dieser Wärmebehandlung
wurden sie zur besseren Peptidfällung ca. 1 h bei 4°C gekühlt und anschließend mit
gesättigtem NaCl versetzt, das Präzipitat dann bei 3500 rpm bei 4°C 15 min
zentrifugiert und der Überstand in ca. 8 ml 100%iges Äthanol gegeben. Nach 15
min wurde die nun an der Oberfläche schwimmende DNA mit einer Pipettenspitze
in 1 ml 70%iges Äthanol überführt, abzentrifugiert und luftgetrocknet. Die DNA dann
in 200 µl TE aufgenommen und im Brutschrank bei 38°C über Nacht gelöst.
2.2.2 Reinheitsgrad- und Konzentrationsbestimmung d er DNA
Der Reinheitsgrad und die Konzentration der DNA-Proben kann durch Messung des
Absorptionsspektrums zwischen 200 bis 400 nm bestimmt und mittels einem
Spektralphotometer (Uvicon 930 Kontron) durchgeführt werden. Die Proben werden
dafür 1:200 verdünnt, in eine Quarzküvette überführt und bei Wellenlängen von
230, 260, 280 und 320 nm gemessen. Eine Abschätzung der Verunreinigung mit
Proteinen, Polysacchariden bzw. Salzen erreicht man durch die Quotienten 260/280
und 230/260. Wenn der Küvetten-Leerwert (A. bidest bei 320 nm) vom
Extinktionswert bei 260 subtrahiert erhält man die Dichte der DNA.
Eine optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm entspricht 50 µg
doppelsträngiger DNA.
Die Formel zur Berechnung der DNA-Konzentration lautet:
DNA in ng/µl = (OD 260 nm OD 320 nm) x Verdünnung x 50 µg
Von den DNA-Proben wurden Verdünnungen mit einer Konzentration von 100 ng/µl
hergestellt.
- 24 –
2.2.3 Amplifikation der genomischen DNA mit der Pol ymerasekettenreaktion
Die Polymerasekettenreaktion oder polymerase chain reaction (PCR) ist eine
schnelle und effiziente Methode, um aus wenigen DNA-Fragmenten genügend
spezifische DNA-Mengen herzustellen. Unter der Nutzung der Thermostabilität der
DNA-Polymerase des thermophilen Bakteriums Thermus aquaticus (Taq) gelang es
Mullis erstmalig, die DNA vollautomatisch und exponentiell zu vermehren (Mullis,
Faloona 1987; Mullis et al. 1986).
Mit Hilfe von spezifischen Primern (siehe 2.1.2) wurde ein 479 Basenpaare (bp)
langer Bereich des Promotors des CD14-Gens amplifiziert. Jede Amplifikation
wurde in einer Mikrotiter-Platte (Thermowell Costar) im Uno-Thermoblock
(Biometra) vorgenommen. Sämtliche Ansätze wurden unter sterilen Kautelen
pipettiert.
Für die DNA-Amplifikation wurde ein Programm gewählt, welche erst im dritten
Zyklus der PCR die endgültige Hybridisierungstemperatur des strangspezifischen
Oligonukleotid-Primers erreichte. Begonnen wurde mit 62°C und 59°C. Die
Anfangstemperatur lag um 6°C höher als die Endtempe ratur und wurde für den
zweiten und dritten Zyklus um jeweils 3°C verringer t. Die Denaturierungsphase
dauerte bei 95°C in der ersten Schleife 3 min und b ei allen anderen Schleifen 30 s.
Für die Elongationsreaktion wurde 1 min gewählt. Insgesamt wurden 25 Zyklen
durchgeführt. Der Ansatz für die PCR hatte ein Endvolumen von 10 µl.
- 25 –
PCR
DNA (100 ng/µl) 0,5 µl
10 x Taq-Puffer (Genecraft) 1 µl
dNTP 2 mM 0,1 µl
5´-Primer (10 pmol/µl) 1,0 µl
3´-Primer (10 pmol/µl) 1,0 µl
MgCl2 50 mM 0,2 µl
Taq-Enzym (5 U/µl) 0,2 µl
H20 ad 10 µl
Als Verdunstungsschutz wurde den Reaktionsansätzen ein Tropfen Mineralöl
zugesetzt.
2.2.4 Spaltung der PCR-Produkte mittels des Restrik tionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)
Mit dieser Methode kann man durch so genannte Restriktionsenzyme die DNA in
Fragmente zerschneiden. Das eingesetzte Enzym Ava II erkennt spezifisch die
Basensequenz GGWCC (wobei der Buchstabe W für A bzw. T steht). Beim
Vorhandensein des T-Allels war eine Schnittstelle für Ava II vorhanden und man
erhielt nach dem Verdau zwei Fragmente der Länge von 353bp und 144bp. Bei
Vorhandensein des C-Allels wurde das Amplifikat nicht geschnitten. Es wurden 2 U
Enzym pro µg genomischer DNA und der entsprechende Puffer bei der vom
Hersteller empfohlenen Temperatur eingesetzt. Die Inkubationszeit lag zwischen 4
und 12 h.
2.2.5 Agarose-Gelelektrophorese
Die Auftrennung der amplifizierten DNA-Fragmente erfolgte in 2%igen horizontalen
- 26 –
Agarosegelen bei 100 V in einem 1xTBE Laufpuffer. Als Längenmarker (200
ng/DNA) diente pUC 19/Msp I. Nach 15 minütigem Schwenken der Agarosegele in
mit H2O verdünnter EtBr-Lösung (1µl/ml) wurde die DNA unter UV-Licht erkennbar.
Mittels einer fest installierten Videokamera, gekoppelt mit einem Computersystem
incl. Thermodrucker, wurden die Ergebnisse dokumentiert.
2.2.6 Schematische Darstellung des Fragebogens
Neben der Genotypisierung der Patienten spielt der Fragebogen eine zentrale Rolle
in dieser Arbeit. Wichtig war, einen übersichtlichen und einfach zu bewältigenden
Fragebogen zu erstellen, um eine möglichst hohe Rückläuferquote zu erhalten. Es
wurden verschiedene Daten erhoben, wie zum Beispiel nähere Angaben zur Person
(Körpergröße, Körpergewicht, Raucher, Beginn der Darmerkrankung, Anzahl der
Krankenhausaufenthalte), Familienanamnese, Angaben zur CED (Befall welcher
Regionen, extraintestinale Manifestationen, Operationen), Medikation der letzten
drei Jahre.
Name: ____________ Vorname:_______________ Geburtsdatum:______________
O Morbus Crohn O Colitis ulcerosa Allgemeine Fragen zu Ihrer Person: Körpergröße:_________ cm Körpergewicht: _________ kg Raucher: O ja O nein Beginn Ihrer Darmerkrankung: ____________ Wie oft lagen Sie wegen Ihrer Darmerkrankung schon im Krankenhaus: _____________ Wer ist in der Familie an Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa erkrankt? O Niemand O Morbus Crohn O Morbus Crohn Vater Mutter O Colitis ulcerosa O Colitis ulcerosa O Morbus Crohn O Morbus Crohn Geschwister Großeltern O Colitis ulcerosa O Colitis ulcerosa Wissen Sie, welche Darmabschnitte bei Ihnen schon befallen waren? Bitte markieren sie die zutreffenden Regionen, oder kreuzen Sie an:
O Rektum O Sigma O re. Colon O li. Colon O terminales Ileum O Sonstige Darmabschnitte:__________________
Hatten Sie schon einmal in diesem Zusammenhang eine der folgenden Beschwerden? O Gelenkschmerzen oder Gelenkentzündungen großer Gelenke O Augenentzündungen (Iridozyklitis, Skleritis, Uveitis) O Hauterkrankungen (Pyoderma gangränosa, Erythema nodosa) O Abszesse, Fissuren oder Fisteln O Darmverengung (Stenose) Wurden Sie schon einmal bezüglich Ihrer Darmkrankheit operiert? O ja O nein Wenn ja, welche OP und wann?:_____________________________________________
Bitte tragen sie in den folgenden Monatskalendern ein, welche Dosierung Sie in den letzten drei Jahren vom entsprechenden Medikament eingenommen haben. 1. Cortisonpräparate (z.B. Decortin, SDH, Budenosid, Kortisonklysmen, oder . ________ )
2. Azathioprine (z.B. Imurek, Azafalk, oder: __________________________ ) Jan 00 Feb 00 Mrz 00 Apr 00 Mai 00 Jun 00 Jul 00 Aug 00 Sep 00 Okt 00 Nov 00 Dez 00
Jan 01 Feb 01 Mrz 01 Apr 01 Mai 01 Jun 01 Jul 01 Aug 01 Sep 01 Okt 01 Nov 01 Dez 01
Jan 02 Feb 02 Mrz 02 Apr 02 Mai 02 Jun 02 Jul 02 Aug 02 Sep 02 Okt 02 Nov 02 Dez 02
3. Antibiotika (z.B. Ciprobay, Clont, oder: ___________________________ )
Jan 00 Feb 00 Mrz 00 Apr 00 Mai 00 Jun 00 Jul 00 Aug 00 Sep 00 Okt 00 Nov 00 Dez 00
Jan 01 Feb 01 Mrz 01 Apr 01 Mai 01 Jun 01 Jul 01 Aug 01 Sep 01 Okt 01 Nov 01 Dez 01
Jan 02 Feb 02 Mrz 02 Apr 02 Mai 02 Jun 02 Jul 02 Aug 02 Sep 02 Okt 02 Nov 02 Dez 02
Jan 00 Feb 00 Mrz 00 Apr 00 Mai 00 Jun 00 Jul 00 Aug 00 Sep 00 Okt 00 Nov 00 Dez 00
Jan 01 Feb 01 Mrz 01 Apr 01 Mai 01 Jun 01 Jul 01 Aug 01 Sep 01 Okt 01 Nov 01 Dez 01
Jan 02 Feb 02 Mrz 02 Apr 02 Mai 02 Jun 02 Jul 02 Aug 02 Sep 02 Okt 02 Nov 02 Dez 02
Abbildung 7: Fragebogen zur Dissertation
- 27 –
2.2.7 Ermittlung der kumulativen Steroiddosis
Anhand des Fragebogens wurde die kumulative Steroiddosis erhoben. Durch
Addition der angegebenen Dosis pro Zeitraum wurde die kumulative Steroiddosis
des einzelnen Patienten in mg/Jahre ermittelt.
2.2.8 Statistik
Die statistische Auswertung wurde mit Hilfe der SPSS®-Software Version 15
durchgeführt. Bindend für alle statistische Analysen war ein Signifikanzlevel von
α = 0,05. Um qualitative Eigenschaften von Gruppen beurteilen zu können wurde
der Chi-Quadrat-Test nach Pearson angewandt.
Mittels Mann-Whitney-U-Test wurden voneinander unabhängige Stichproben
miteinander verglichen. Es wird überprüft, ob zwei beprobte Grundgesamtheiten die
gleiche Lage besitzen. Die Beobachtungen aus beiden Gruppen werden kombiniert
und in eine gemeinsame Reihenfolge gebracht, wobei im Falle von Rangbindungen
der durchschnittliche Rang vergeben wird.
Mehrere voneinander unabhängige Stichproben aus derselben Grundgesamtheit
wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test überprüft.
- 28 –
3 Ergebnisse
In dieser Arbeit wurde ein SNP in der Promotor-Region (T/C an Position –159) des
CD14-Gens untersucht. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte in zwei
unterschiedlichen Gruppen. Es erfolgte jeweils eine getrennte Auswertung der
Daten bezüglich des Polymorphismus sowohl für den MC als auch für die CU.
3.1 Morbus Crohn
3.1.1 Geschlecht
Zunächst wurde untersucht, ob es innerhalb der Datenreihe einen signifikanten
Unterschied in der Verteilung bezüglich des Genotyps und des Geschlechts gibt.
Insgesamt wurden 15 Männer und 22 Frauen untersucht. Eine mögliche
Abhängigkeit des Geschlechts auf die Allelverteilung konnte nicht nachgewiesen
werden. Die männlichen Probanden hatten eine mittlere Körpergröße von 178,1
±2,6 cm, während die Frauen einen Mittelwert von 165,4 ± 3,7 cm aufwiesen. Auch
bezüglich des Gewichtes zeigten die Männer mit 82,4 ± 3,7 kg einen höheren Wert
als die Frauen mit 67,6 ± 3,3 kg. Bezüglich einer möglichen Korrelation zwischen
der Cortisondosis und der Dauer der Steroideinnahme konnten keine Unterschiede
zwischen den Geschlechtern festgestellt werden.
3.1.2 Familienanamnese
Mit dieser Fragestellung wurde untersucht, ob es einen signifikanten Unterschied
zwischen den einzelnen Genotypen bezüglich einer familiären Disposition gibt. Es
konnte herausgefunden werden, dass in dieser Studie beim MC ausschließlich bei
Patienten mit dem CC-Genotyp eine positive familiäre Disposition vorhanden ist. Es
zeigte sich eine exakte Signifikanz zwischen dem CC- und dem CT-Allel von p =
0,031 und zwischen dem CC-Genotyp und dem TT-Genotyp eine asymptotische
Signifikanz von p = 0,016.
- 29 –
3.1.3 Extraintestinale Manifestation
In der Studie wurden die Patienten zu den verschiedenen und gängigen
extraintestinalen Manifestationen befragt. Mit einbezogen wurden folgende
Gruppen:
- Arthralgien, Arthritis
- Iritis, Uveitis, Skleritis
- Pyoderma, Erythema nodosum
- Abszesse, Fisteln
- Darmstenose
- Anzahl der extraintestinalen Manifestationen
Allein Patienten mit dem Genotyp CC bilden keine Hautmanifestationen aus. Das
asymptotische Signifikanzniveau lag gegenüber dem TT-Genotyp bei 0,021. Die
übrigen Berechnungen konnten keine weiteren Abhängigkeiten zwischen dem
Polymorphismus und den extraintestinalen Manifestationen feststellen
3.1.4 Befallsmuster des Darmes
Anhand der vorliegenden Daten konnte kein Zusammenhang zwischen dem
Darmbefall von MC-Patienten und seiner CD14-Zugehörigkeit gefunden werden.
3.1.5 Kumulative Steroiddosis
Es zeigte sich bei den MC-Patienten kein signifikanter Unterschied der Steroiddosis
zwischen den Genotypen mit einer mittleren kumulativen Steroiddosis des TT-
Genotypen von 61,1 ± 45,3 mg/Jahr (n = 9) zu den Genotypen CT mit 1993,0 ±
858,7 mg/Jahr (n = 18) und CC mit 377,7 ± 214,7 mg/Jahr (n = 10).
- 30 –
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
CC CT TT
Gen-Code
kum
ulat
ive
Cor
tison
dosi
s be
i Mor
bus
Cro
hn (
mg/
Jahr
)
Abbildung 8: Kumulative Steroiddosis beim Morbus Crohn
3.2 Colitis ulcerosa
3.2.1 Geschlecht
Auch in dieser Kohorte konnte keine unterschiedliche Verteilung der Genotypen
zwischen den Geschlechtern gefunden werden. Ähnlich wie beim MC fand sich
auch bei diesem Patientenkollektiv, dass die Männer mit 178,3 cm ± 1,3 cm größer
waren als die Frauen mit 166,9 ± 1,2 cm. Somit waren die Männer mit 77,9 ± 2,3 kg
ebenfalls schwerer als die Frauen mit 65,3 ±2,3 kg.
- 31 –
3.2.2 Familienanamnese
Die zuvor beim MC festgestellte Abhängigkeit zwischen der familiären Disposition
und dem Genotyp konnte für die CU nicht nachgewiesen werden.
3.2.3 Extraintestinale Manifestationen
CU Patienten zeigten in Hinblick auf die Häufigkeit von Arthralgien eine exakte
Signifikanz zwischen dem CC-Genotyp (22,2%) gegenüber dem TT-Genotyp
(85,7%) mit p = 0,02. Demnach hat das letztgenannte Patientenklientel wesentlich
häufiger Arthralgien angegeben.
3.2.4 Dauer der CED
Die Patienten mit dem Phänotypen CC wiesen einen wesentlich länger anhaltenden
Verlauf der Erkrankung auf, als die Patienten mit dem Phänotypen TT 17,8 ± 2,8
Jahre versus 8,7 ± 1,6 Jahre). Bemerkenswert ist, dass die letztgenannte Gruppe
ein im Mittel um 4 Jahre höheres Alter der Erstmanifestation zeigte.
3.2.5 Befallsmuster des Darmes
Auch für die CU konnte keine Korrelation zwischen dem Genotyp und einer
bevorzugten Darmregion erhoben werden.
3.2.6 Kumulative Steroiddosis
Die kumulative Steroiddosis bei den CU-Patienten mit dem Genotyp TT war mit
2447,7 ± 920.0 mg/Jahr (n = 10) signifikant höher ausgefallen als beim CT-Genotyp
mit 142,3 ± 142,3 mg/Jahr, (n = 13, p = 0,016) und dem CC-Genotyp mit 391,7 ±
272,7 mg/Jahr (n=9, p=0,047).
- 32 –
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
CC CT TT
Gen-Code
kum
ulat
ive
Cor
tison
dosi
s be
i Col
itis
ulce
rosa
(m
g/J
ahr)
Abbildung 9: Kumulative Steroiddosis bei der Colitis ulcerosa
- 33 –
4 Diskussion
Die Rolle des CD14-Antigens im menschlichen Körper spiegelt sich in diversen
Aufgaben wieder. Es gehört unter anderem zu den akute Phase Proteinen und wird
entsprechend bei Entzündungen, aber auch Traumata vermehrt aus den Zellen
sezerniert, bzw. präsentiert. Dazu gehören die Monozyten, Neutrophile und
Makrophagen welche die beiden unterschiedlichen Formen, zum einen sCD14 und
zum anderen mCD14 produzieren. Deren Zuständigkeit beläuft sich vor allem
darauf, die bei einer Infektion von gram-negativen Bakterien exprimierten LPS zu
erkennen und unschädlich zu machen. Neuere Studien haben ergeben, dass das
mCD14, aufgrund seiner nicht-transmembrösen Verankerung den TLR 4 für die
Signalübertragung nach intrazellulär benötigt. Die TLR sind Pendants zu dem Toll-
Protein der Drosophila. Im Gegensatz dazu kommt es durch das sCD14 zu einer
unspezifischen Reaktion gegenüber dem LPS. Entscheidend ist zudem auch das
vorhanden sein von LBP, welches als Katalysator zwischen CD14 und LPS fungiert
und die Bindungskapazität des mCD14 um das bis zu 100 bis 1000-fache erhöhen
kann. Letztlich wurde durch Tierversuche mit Mäusen herausgefunden, dass das
CD14 sowohl pro-, als auch anti-inflammatorische Reaktionen im Körper hervorruft
(Schutt 1999). Eine erhöhte Expression des CD14 konnte bei Monozyten der
Lamina propria in den entzündeten Darmabschnitten bei CED-Patienten gefunden
werden, währenddessen Probanden mit reizlosen Darmabschnitten eine signifikant
niedrigere CD14-Expression aufwiesen (Grimm et al. 1995; Rugtveit et al. 1995).
Bei den CED-Patienten konnte eine hohe Konzentration des sCD14-Antigens
gefunden werden. Allerdings haben die homozygoten TT-Träger einen signifikant
höheren Serum-Level der löslichen Form, als die CT oder CC-Träger (Griga et al.
2005).
Wie bedeutend der Einfluss genetischer Polymorphismen ist, konnte bereits in einer
ähnlichen Arbeit herausgestellt werden, wo ein entsprechender Polymorphismus mit
dem Erkrankungsrisiko verglichen wurde. Hier zeigte sich, dass das T-Allel zudem
mit einem erhöhten Risiko einen akuten Myokardinfarkt zu erleiden assoziiert ist
(Hubacek et al. 1999). Grundlage der Untersuchungen war die Fragestellung, ob
- 34 –
eine Beeinflussung zwischen dem Risiko eines Myokardinfarktes und der
Expression des CD14-Rezeptors besteht. Unterschiede bezüglich der bekannten
Risikofaktoren (LDL/HDL, Cholesterin, BMI, Diabetes-Häufigkeit, arterielle
Hypertonie oder Rauchen) wurden zuvor ausgeschlossen. In dieser Arbeit wurde
der gleiche Polymorphismus untersucht (die Bezeichnung C(-260) → T in dieser
Arbeit bezieht sich auf den Transkriptionsstart) und ein Zusammenhang zwischen
der Infektion mit gram-negativen Bakterien und der Entwicklung einer
Arteriosklerose vermutet (z.B. durch Chlamydia pneumoniae Orfila 1998; Leinonen
et al. 1990). In der dargestellten Kaskade kommt es durch eine Komplexbildung von
CD14 mit LPS zu einer Aktivierung von Monozyten. LPS gilt als bedeutendes
Endotoxin gram-negativer Bakterien. Es wird als pathogen assoziated molecular
pattern (PAMP) bezeichnet, dessen hauptsächlicher Ligand, das Lipid A, die
Interaktion mit dem Immunsystem mediiert. Über CD14 kommt es mit LBP zu einer
Komplexbildung, wodurch eine TLR assoziierte Immunantwort beginnt. Dies hat die
Produktion proinflammatorischer Zytokine, wie IL-1, IL-6 und INF-Gamma zur Folge
(Aderem, Ulevitch 2000; Antal-Szalmas 2000; Cario, Podolsky 2000; Cario et al.
2000). Die stimulierte Produktion von Interleukinen in Endothelzellen führt zu einer
gesteigerten Adhäsion von Monozyten, Leukozyten und Thrombozyten an die
Gefäßwand. Dadurch unterstützt letztlich auch eine erhöhte CD14-Konzentration
den Prozess der Arteriosklerose. Meisel et al. (1998) konnten zeigen, dass
Patienten in der akuten Myokardinfarkt-Phase erhöhte Konzentrationen von CD14
aufwiesen. Entsprechend wird das Vorhandensein CD14-positiver Zellen in der
intestinalen Mukosa gedeutet, wo normalerweise nur CD14-negative Monozyten
vorhanden sind. Dieser Befund mag eine Rolle bei der Entwicklung von Crohn und
Colitis spielen, da lokal pro-entzündliche Zytokine und andere aktivierte Mediatoren
freigesetzt werden. Kortison kann nachweislich die Konzentration von mCD14 und
sCD14 sowohl in vitro als auch in vivo senken (Fingerle-Rowson et al. 1998).
Es wird davon ausgegangen, dass sowohl Umweltfaktoren, zusammen mit einer
genetischen Disposition zu Crohn und Colitis führen. So sind intraintestinale
Bakterien notwendige Cofaktoren, um die entsprechende Entzündungsreaktion zu
initiieren und zu unterhalten. Bakterien enthalten toxische Substanzen, die potent
genug sind, als Stimulus für eine Immunantwort zu agieren, beispielsweise das
- 35 –
LPS. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Oberfläche von intestinalen
Epithelzellen eine defensive Barriere des Immunsystems bildet. Viele epitheliale
Zellreihen exprimieren transmembranöse Rezeptoren, die als TLR benannt werden.
Die Nachweisbarkeit von intestinalem TLR2 und TLR4 ist bei Crohn- und Colitis-
Patienten signifikant erhöht, im Gegensatz zu gesunden Probanden, wobei TLR2
eine untergeordnete Rolle spielt (Cario et al. 2000). Es konnte nachgewiesen
werden, dass LPS durch die TLR´s an epithelialen Zellen eine große Anzahl an
proinflammatorischen Zytokinen freisetzt. Die Toll-Proteine dienen als
Schlüsselmoleküle, um mikrobiologische Pathogene zu erkennen und zu
neutralisieren. TLR2 und TLR4 scheinen die hauptsächlichen Moleküle zu sein,
welche die transmembranöse Signalweitergabe bei LPS-Exposition bewirken. Dies
führt nachfolgend in den Monozyten zu einer Aktivierung und Freisetzung von
Zytokinen. Mutationen führen zu einer Dysregulation der TLR-Funktion (Cario,
Podolsky 2000; Cario et al. 2000). Schließlich führt bereits die erhöhte
Konzentration der TLR´s im intestinalen Epithel und der Lamina propria zu einer
verminderten Toleranz gegenüber luminalem LPS. Durch eine
Schleimhautverletzung kann es dann zur Einschleusung von Monozyten in die
Mukosa kommen, wobei diese mittels dem vermehrt produzierten Co-Rezeptor
CD14 eine überschießende Immunantwort bei CED-Patienten hervorrufen. (Cario,
Podolsky 2000). Limitierend bei der Arbeit ist allerdings die Unklarheit, ob das
Ungleichgewicht des Immunsystems bei CED-Patienten durch die TLR-
Dysregulation in intestinalen Epithelzellen eine Folge ist, oder aber die Ursache.
In der hier vorliegenden Studie konnten signifikant höhere kumulative Steroiddosen
bei homozygoten Trägern des T-Allels bei CU Patienten gefunden werden. Im
Gegensatz dazu fanden sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den
unterschiedlichen Genotypen beim MC, eventuell verursacht durch die kleine
Anzahl an Patienten. Unser Ergebnis deutet an, dass das T-Allel und der TT-
Genotyp eventuell einen Hinweis auf die Höhe der antiinflammatorischen Therapie
geben können. Der oben genannte Polymorphismus, ebenso wie weitere Gene, die
in die Regulation der zellvermittelten Immunität eingreifen, führen zu einer
qualitativen und quantitativen Änderung der zellulären Zytokinroduktion.
Die Identifikation weiterer Gene ist noch immer eine enorme Aufgabe, weil die Rolle
- 36 –
eines bestimmten prädisponierenden Allels nur in einem kleinen Anteil von
Patienten, einer speziellen Bevölkerungsgruppe oder aber die Kombination mit
anderen prädisponierenden Allelen erst relevant ist (Helio et al. 2003; Hisamatsu et
al. 2003).
Stellvertretend dafür sei die caspase activating recruitment domain 15 (CARD 15)
genannt. Es handelt sich dabei um ein Gen in der chromosomalen Region 16q12,
und gehört zu der Familie des Apoptose-Protease aktivierenden Faktors 1
bezogenen Protein. Es wird überwiegend in Monozyten exprimiert. Die Funktion
scheint in der intrazellulären Erkennung von LPS zu sein um daraufhin den
Transkriptiondfaktor NfκB zu aktivieren. Es wurden mehr als 60 verschiedene
Sequenz-Varianten des CARD15-Gens gefunden. Dabei gibt es drei
Hauptvarianten. Es ist gezeigt worden, dass CARD15 Gen-Varianten zu einem
unterschiedlichen Risiko für die Entwicklung einer CED beitragen. Für UC konnte
das nicht bestätigt werden. Es wurde bestätigt, dass Träger homozygote bzw.
compound heterozygote Träger der drei Varianten ein wesentlich höheres Risiko
haben einen MC zu entwickeln als heterozygote Träger. Es wird postuliert, dass
wohl neben der CARD15 Mutation noch andere genetische Polymorphismen, ggf.
sogar auf anderen Genen eine Prädisposition für MC bewirken. Es konnten keine
signifikanten Unterschiede bezüglich der Therapie der CED gefunden werden (5-
ASA, Steroide, Metronidazole), (Helio et al. 2003).
Erst die Identifikation dieser prädisponierenden Gene wird zu einer therapeutischen
Konsequenz für Patienten mit einer CED führen.
Deshalb reicht die Untersuchung eines Genpolymorphismus nicht aus, um die
Prädisposition und die Schwere des Verlaufes einer CED zu verstehen. Es gilt
herauszufinden, welche Polymorphismen generell einen Einfluss auf die CED
haben. Überdies muss allerdings auch untersucht werden, ob es Interaktionen der
verschiedenen Genloki untereinander gibt. Gegebenenfalls lassen sich
Synergismen finden, die miteinander den Schweregrad der CED verstärken, oder
aber Varianten, welche mit gleicher Intensität unabhängig voneinander die
Erkrankung unterhalten. Durch die letztere These könnte zudem eine Möglichkeit
darin bestehen, dass sich die Intensität und damit die Therapie der CED von Patient
- 37 –
zu Patient unterscheidet (Gu et al. 2008; Baumgart et al. 2007).
Verschiedene chronische, aber auch akute Krankheitsbilder stehen in enger
Assoziation mit dem CD14 T/C -159 Polymorphismus. Mittlerweile wurde CD14 als
Risikofaktor in den verschiedensten Fachbereichen erkannt. Sei es die Sepsis, die
Entwicklung einer Tuberkulose, oder eines Asthma bronchiale, der akute
Myokardinfarkt, die progrediente Arteriosklerose oder aber die CED (Rosas-Taraco
et al. 2007; Lachheb et al. 2008; Rechcinski et al. 2007). In dieser Arbeit wurde
nicht nur die mögliche Ausprägung des CD14 T/C –159 Polymorphismus
untersucht, sondern auch der Einfluss auf eine mögliche Therapie dargestellt. Erst
wenn die Beeinflussbarkeit der Krankheitsausprägung durch eine suffiziente
Therapie erreicht wird, können die jetzigen Grundlagenforschungen als erfolgreich
bezeichnet werden. Sicherlich können viele Unklarheiten erst durch die
Zusammenführung diverser Arbeiten und Evaluation neuer Daten behoben werden.
Diese Arbeit dient lediglich dazu, eine Relation zwischen dem Genpolymorphismus
und seiner Ausprägung wieder zu geben.
Aufgrund unterschiedlicher Bedingungen dieser Arbeit sind die Ergebnisse nicht nur
durch die voran beschriebenen Möglichkeiten eingeschränkt zu bewerten. Da es
sich um eine retrospektive Untersuchung handelt ist insbesondere das Ausfüllen
des Fragebogens vom Erinnerungsvermögen der Patienten abhängig. Eine
prospektive Studie wäre dahingegen die bessere Methode um möglichst genau die
einzelnen Punkte zu erheben. Allerdings lassen sich Tendenzen erkennen,
aufgrund derer eine Vertiefung der Ergebnisse durch weitere Studien sinnvoll ist.
Letztlich sollten durch weitere Untersuchungen sich zufällig ergebende
Signifikanzen herausgefiltert, oder aber berechtigte Ergebnisse untermauert
werden.
- 38 –
5 Zusammenfassung
Zusammenfassende Darstellung der wichtigsten Ergebnisse dieser Dissertation:
In der vorliegenden Arbeit wurde mittels retrospektiver Analytik versucht, eine
Korrelation zwischen dem SNP T/C an Position -159 des CD14-Gens und dem
Therapieverlauf bei Patienten mit einer CED zu finden.
- Es konnten keine geschlechts-spezifischen Zusammenhänge bezüglich der
Aufteilung der Allele dargestellt werden
- Es konnte eine signifikante positive familiäre Disposition ausschließlich beim
MC für den CC-Genotyp gefunden werden
- Die extraintestinalen Manifestationen scheinen sich unabhängig von dem
Polymorphismus auszubilden
- Ebenfalls fand sich kein Zusammenhang bezüglich des Befallsmusters bei
Patienten mit CED
- Die Dauer der CED scheint allerdings durch den entsprechenden Genotyp
beeinflussbar. Entsprechend fand sich für den CC-Genotyp bei der CU, dass
die Patienten eine wesentlich länger anhaltende Erkrankungsdauer
aufwiesen
- Bezüglich der kumulativen Steroiddosis konnte festgestellt werden, dass CU
Patienten mit dem TT-Genotyp eine signifikant höhere kumulative
Steroiddosis angaben als Patienten mit dem CT- oder CC-Genotyp.
- 39 –
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Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. Thomas Griga danke ich herzlichst für die Anregungen und
Realisierung der Promotion. Besonders dankbar bin ich für die unermüdliche
Betreuung der Arbeit.
Herrn Dr. med. Wolfram Klein danke ich insbesondere für die wertvollen Tipps
während der Erstellung der Arbeit.
Lebenslauf
Name: Christian Wilkens
Geburtsdatum: 21.09.1975
Geburtsort: Diepholz
Familienstand: ledig
Eltern: Edelhard Wilkens (geb. 21.06.1943), Verkaufsleiter
Renate Wilkens, geb. Tuchen (geb. 04.03.1947),
Chefarztsekretärin
Geschwister: Sören Wilkens (geb. 14.05.1986), Student
Schulausbildung: 1982 – 1986 Grundschulbesuch in Diepholz
1986 – 1988 Besuch der Orientierungsstufe in Diepholz
1988 – 1996 Besuch des Diepholzer Gymnasiums
Grundwehrdienst: 1995 – 1996 Einsatz als Stationsleitung der Sanitätsstaffel
In Diepholz
Studium: 1996 – 2003 Studium der Humanmedizin in Bochum
Arbeit: seit 2003 Klinik der Inneren Medizin im
Knappschaftskrankenhaus Dortmund