Immunologische Labormethoden
Dr. Manfred Fobker
Institut für Klinische Chemie & Laboratoriumsmedizin-Zentrallabor
Universitätsklinikum Münster
UKMUniversitätsklinikumMünster
Immunglobulin-Antigenbindung
Antigen
UKMUniversitätsklinikumMünster
FabFab
FcFc
COOHCOOH COOHCOOH
S-S S-SS-SS-S
VVHH
CCH1H1
VVLL
CCLL
Schwere KetteSchwere Kette
CCH2H2
CCH3H3CCH3H3
CCH2H2
CCH1H1
VVHH
CCLL
VVLL
Flexible Flexible ÜbergangsregionÜbergangsregion
NHNH22
NHNH22
NHNH22
NHNH22Antigen Antigen Bindung Bindung sregionsregion
AntigenAntigen EpitopEpitop
ParatopParatopLeichte KetteLeichte Kette
Spezifität von Antikörpern
PSA
UKMUniversitätsklinikumMünster
Analytische Spezifität: Fähigkeit nur den gesuchten Analytennachzuweisen
Kreuzreaktivität: Antikörper erkennt ähnliche Antigene
Antigen: Stoffe (z.B. Proteine), die „Antikörper-generierend“ sind
Was möchte ich messen? Beispiel: PSA-Fraktionen
PSAPSA PSA
Freies PSA PSA-ACT PSA- α2M
10-15% 85-90% nicht detektierbar
ACT= α 1-antichymotrypsin α2M= α 2-Makroglobulin
UKMUniversitätsklinikumMünster
• Bildung von Antigen-Antikörper-Netzwerken (Präzipitate)• bivalent•Vernetzungsgrad von ihren relativen Mengen abhängig
Antikörper-Reaktionen UKMUniversitätsklinikumMünster
Quantitative immunchemische Verfahren:Nephelo- und Turbidimetrie
UKMUniversitätsklinikumMünster
PSA
Antigen Antikörper Markierung
• radioaktive Isotope
• fluorogene Moleküle
• Enzym
• luminogeneMoleküle
• polyklonal• monoklonal
Spezifität:
Herkunft:• Mensch/Tier
UKMUniversitätsklinikumMünster
Immunoassay-Testformen (heterogen) UKMUniversitätsklinikumMünster
Konzentration
A. Kompetitive Testform
Sign
al
Ag
AgAg
Ag
Ag AgAg
AgAg
AgAg
Immunoassay-Testformen (heterogen)
B. Sandwich-Typ (immunometrischer Test)
PSA
UKMUniversitätsklinikumMünster
Mes
ssig
nal
Ag
Ag
Ag
Ag
AgAg
Konzentration
Waschen
Ag
Ag
Ag
Enzyme Linked Fluorescent Assay(ELFA)
Antigen markierter AKAntigen markierter AK
Ag
„ Sandwich-Prinzip “
AP
MUP
MU
O O
CH3
R
+P
4-Methylumbelliferyl-Phosphat
UKMUniversitätsklinikumMünster
TeststreifenGLORIA-Technik (Gold Labelled Optical-read Rapid Immuno Assay)
FilterMischzone Testfeld Kontrolle Löschpapier
PSA PSA
PSA
PSA
PSA
FilterMischzone Testfeld Kontrolle Löschpapier
POSITIV
NEGATIV
UKMUniversitätsklinikumMünster
UKMUniversitätsklinikumMünster
+ +AgAg
a) EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique)
AgAgAg
Substrat
Produkt
Substrat
ProduktProduktAg
E
AgAgAg
E
Ag
E
AgAgAgAg
E
hohe Ag-Konzentration
niedrige Ag-Konzentration
hohe Ag-Konzentration
niedrige Ag-Konzentration
Homogene Immunoassays(„Eintopfverfahren“)
UKMUniversitätsklinikumMünster
AgAg
a) FETI (Fluorescence Energy Transfer Immunoassay)
Energietransfer
++
Antikörper-Donor-Komplex
Antikörper-Akzeptor-Komplex
langlebige
Fluoreszenz620 nm
langlebige
Fluoreszenz620 nm
Anregung
337 nm
Anregung
337 nm337 nm
337 n
m33
7 nm
kurzl
ebige
Fluor
esze
nz665 n
mku
rzleb
ige
Fluor
esze
nz665 n
m66
5 nm
Anregung
337 nm337 nm
DD DD
AgAg
A
langle
bige
Fluores
zenz66
5 nm
langle
bige
Fluores
zenz66
5 nm
langle
bige
Fluores
zenz66
5 nm
A
Sandwich-Komplex
Homogene Immunoassays(„Eintopfverfahren“)
Test-Spezifikationen
Probenmaterial: SerumHaltbarkeit: wenige Stunden- mehrere Wochen
(Peptide !)
Probenvolumen: 10-50 µl
Kalibratoren: WHO-Standard (methodenabhängige Werte)
Inkubationszeit: 10 min-60 min
UKMUniversitätsklinikumMünster
Immunoassays-Anwendungen-
• Hormonbestimmungen (Schilddrüsen- und Fertilitätshormone, Insulin)
• Tumormarker (z.B. CEA, PSA, CA 15-3)• Medikamentenspiegel (z.B. Digoxin, Antibiotika)• Herzmarker (z.B. Troponin I)• Virusdiagnostik (z.B. HBsAg)
UKMUniversitätsklinikumMünster
PSA_Kalibration
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60
Konzentration ng/ml
Sign
alst
ärke
UKMUniversitätsklinikumMünster
Wie sensitiv ist mein Verfahren?
Analytische Sensitivität (Nachweisgrenze)
Immunologische Meßmethoden sind die sensitivsten Verfahren zum Nachweis von Substanzen in menschlichen Körperflüssigkeiten.
mg (10g-3)
ng (10g-9)
μg (10g-6)
pg (10g-12)
fg (10g-15)
Die Nachweisgrenze AaseeAaseeFläche: 40 HektarFläche: 40 HektarTiefe: Tiefe: ∅∅ 2 m2 m= 8 x 10= 8 x 1088 LiterLiter
Immunologischer Immunologischer Test: z.B. PSATest: z.B. PSANachweisgrenzeNachweisgrenze≤≤ 0,01 ng/ml = 100,01 ng/ml = 10--88 g/lg/lZuckerwürfel 2 g:Zuckerwürfel 2 g:
UKMUniversitätsklinikumMünster
Nachweisgrenzen
AnalytischAnalytisch: „0: „0--Kalibrator“Kalibrator“⌧⌧ ≥≥ 20 Messungen + 220 Messungen + 2--3 SD3 SD
BiologischBiologisch: : „„AnalytAnalyt--freiesfreies“ Serum “ Serum ⌧⌧ ≥≥ 20 Messungen + 220 Messungen + 2--3 SD 3 SD
FunktionellFunktionell:: „„AnalytAnalyt--freiesfreies“ Serum “ Serum Konzentration, bei der VK > 20%Konzentration, bei der VK > 20%oder aufgehobene Verdünnungslinearitätoder aufgehobene Verdünnungslinearität
PSA_Kalibration
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60
Konzentration ng/ml
Sign
alst
ärke
UKMUniversitätsklinikumMünster
Kalibration (Standardkurve)
„High-dose-hook-Effekt“
• Sandwich-Typ (immunometrischer Test)
PSA
UKMUniversitätsklinikumMünster
Mes
ssig
nal
Ag
Ag
Ag
Ag
AgAg
PSA-Konzentration
Waschen
Ag
Ag
Ag
AgAg
Ag
AgAg
Ag
AgAg
Ag
Ag
Ag
AgAg
UKMUniversitätsklinikumMünster
UKMUniversitätsklinikumMünster
Messgrenze bzw. Linearitätsgrenze
StörfaktorenheterophileAntikörper
Anti-Tier-Antikörper
Medikamente
Hämolyse, Lipämie,Hyperbilirubinämie
kreuzreagierende Substanze
Serumproteine (z.B. Rheuma-faktoren, Bindungsproteine)
n
UKMUniversitätsklinikumMünster
PSA falsch niedriges Ergebnis
PSA falsch hohes Ergebnis
HAMAEpitop
Human-Anti-Maus-Antikörper (HAMA) UKMUniversitätsklinikumMünster
UKMUniversitätsklinikumMünster
TT--PSAPSA--AssaysAssays
Abbott PSA AxSymAbbott PSA IMxBaxter/Dade Stratus-PSABayer Technicon Immuno 1Behring Berilux PSABehring N Latex PSABehring Opus PSABiochem Immunosystems
MAIAcloneBiochem Immunosystems
SR1 PSABiomar PSA ELISABiomar psaQuick stickBioMedTech BioSign PSAbioMerieux Vidas PSABoehringer Elecsys PSA
Boehringer Enzymun PSAByk-Sangtec IRMA-matByk-Sangtec LiaisonByk-Sangtec LIA-matCanAg Equi-molar EIAChembio PSA Membrane T.Chimica PSA ELISAChiron ACS2 PSACIS ELSA2 PSACIS Kryptor PSACIS RIACT PSADiag. Systems Active PSADiag. Systems Active Ultrasens PSADianova PSA DIA 0301 EDianova PSA ELISA TM 10DiaSorin ETI-PSAKDiaSorin PSACTKDPC Biermann Coat-A-CountDPC Biermann Immulite 3. Gen.
DPC Biermann Immulite PSADPC Biermann IRMA-countDPC Biermann Milenia PSADRG Instruments PSA EIAEiken PSAEurogen./Tosoh AIA-Pack PAFF Diagnost. PSA OncoquantFF Diagnost. PSA OncoscreenHybritech Tandem-EHybritech Tandem-RImmunocorp PSA IRMAImmunotech Liana PSAInt. Immunodiagn. PSA IEMAJant Pharmacal Accustrip PSAMedpro PSA EIAMedpro PSA Membrane T.Melotec SA Melotest PSAMerck PSA-US MagiaMitsui Pharm. High-Sens-MPMitsui Pharm. PSA-MP Quartus
Nichols PSA CELIANobis Nobi-Well TMBOrtho-Clin.-Diag. Vitros PSAPrinceton BioSign PSARoche Cobas Core PSASeratec PSA ELISA 270 Seratec PSA SemiquantSerono PSA MAIAcloneSerono SR1 PSASorin/Yang Pros-CheckSyntron QuikPac 2Syntron QuikStrip 1United Biotech Ubi MagwelVeda Lab PSA EIAVeda Lab PSA Membrane T.Wallac Delfia PSA EQMWallac Dual Label
= 70 = 70 AssaysAssays
Analytische Beurteilung und Wertigkeit einer Bestimmungsmethode
UKMUniversitätsklinikumMünster
•Präzision
•Richtigkeit
•Stabilität (Drift)
•Verschleppung
•Robustheit
•Analytische Sensitivität und Spezifität
•Diagnostische Sensitivität und Spezifität
Diagnostische Sensitivität:
Wahrscheinlichkeit mit der Kranke richtig erkannt werden (alle richtig positiven Ergebnisse/ alle Kranken)
Diagnostische Spezifität:
Wahrscheinlichkeit mit der Nicht-Kranke richtig erkannt werden (alle richtig negativen Ergebnisse/ alle Gesunden)
Positiver prädiktiver Wert:
Wahrscheinlichkeit bei positivem Testergebnis, das der Patient krank ist (alle richtig positiven Ergebnisse/ alle positiven Ergebnisse) abhängig von der Prävalenz
UKMUniversitätsklinikumMünster
UKMUniversitätsklinikumMünster
Screeninguntersuchung
KrankheitKrankheit “Y” “Y” istist asymptomatischasymptomatisch ((InzidenzInzidenz: 1 / 1000) : 1 / 1000)
KrankheitKrankheit “Y” “Y” istist imim Serum Serum nachweisbarnachweisbar
SensitivitätSensitivität: “Y”: “Y”--Assay = 99 % (1 von 100 Assay = 99 % (1 von 100 KrankenKranken wirdwirdübersehenübersehen))
SpezifitätSpezifität “Y”“Y”--Assay = 98 % ( 2 von 100 Assay = 98 % ( 2 von 100 GesundenGesundenfälschlichfälschlich imim VerdachtVerdacht
UKMUniversitätsklinikumMünster
Screeninguntersuchung
••Assay “Y” Assay “Y” ergibtergibt einein positivespositivesTestergebnisTestergebnis in in IhrerIhrer ProbeProbe
••WieWie hochhoch schätzenschätzen SieSie IhrIhr RisikoRisikoeinein, an , an KrankheitKrankheit “Y” “Y” zuzu leidenleiden ??
UKMUniversitätsklinikumMünster
Screeninguntersuchung
BeiBei einemeinem positivenpositiven TestergebnisTestergebnis imim Assay “Y” Assay “Y” würdewürdeichich schätzenschätzen, , daßdaß ichich mitmit dieserdieser WahrscheinlichkeitWahrscheinlichkeittatsächlichtatsächlich an an KrankheitKrankheit “Y” “Y” leideleide::
~ ~ 99 %99 %~ 98 %~ 98 %~ 95 %~ 95 %~ 50 %~ 50 %~ 5 %~ 5 %~ 1 %~ 1 %
UKMUniversitätsklinikumMünster
Screeninguntersuchung
BeiBei einemeinem positivenpositiven TestergebnisTestergebnis imim Assay “Y” Assay “Y” würdewürdeichich schätzenschätzen, , daßdaß ichich mitmit dieserdieser WahrscheinlichkeitWahrscheinlichkeittatsächlichtatsächlich an an KrankheitKrankheit “Y” “Y” leideleide::
~ ~ 99 %99 %~ 98 %~ 98 %~ 95 %~ 95 %~ 50 %~ 50 %~ 5 %~ 5 %~ 1 %~ 1 %
XX
UKMUniversitätsklinikumMünster
Screeninguntersuchung100.100 100.100 getestetgetestet100 100 KrankeKranke, 100 000 , 100 000 GesundeGesunde99 99 derder 100 100 KrankenKranken erkannterkannt, 1 , 1 übersehenübersehen98.000 98.000 derder GesundenGesunden alsals gesundgesund erkannterkannt2.000 2.000 derder GesundenGesunden falschfalsch--positives positives TestergebnisTestergebnis99 + 2000 99 + 2000 habenhaben positives positives TestergebnisTestergebnis
WahrscheinlichkeitWahrscheinlichkeit, , daßdaß SieSie beibei positivempositivem TestergebnisTestergebnis an an KrankheitKrankheit “Y” “Y” leidenleiden: : richtigrichtig positivpositiv / / allealle positivenpositiven ErgebnisseErgebnisse
99 / 2099 = 0,047 x 100 = 4,7 %99 / 2099 = 0,047 x 100 = 4,7 %
UKMUniversitätsklinikumMünster
Screeninguntersuchung100.100 100.100 getestetgetestet100 100 KrankeKranke, 100 000 , 100 000 GesundeGesunde99 99 derder 100 100 KrankenKranken erkannterkannt, 1 , 1 übersehenübersehen98.000 98.000 derder GesundenGesunden alsals gesundgesund erkannterkannt2.000 2.000 derder GesundenGesunden falschfalsch--positives positives TestergebnisTestergebnis99 + 2000 99 + 2000 habenhaben positives positives TestergebnisTestergebnis
WahrscheinlichkeitWahrscheinlichkeit, , daßdaß SieSie beibei negativemnegativem TestergebnisTestergebnis nichtnichtan an KrankheitKrankheit “Y” “Y” leidenleiden: : richtigrichtig negativnegativ / / allealle negativennegativen ErgebnisseErgebnisse
98000 / 98001 = 0,99 x 100 = 99,9999 %98000 / 98001 = 0,99 x 100 = 99,9999 %