Immunologische Labormethoden

Dr. Manfred Fobker

Institut für Klinische Chemie & Laboratoriumsmedizin-Zentrallabor

Universitätsklinikum Münster

UKMUniversitätsklinikumMünster

Immunglobulin-Antigenbindung

Antigen

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FabFab

FcFc

COOHCOOH COOHCOOH

S-S S-SS-SS-S

VVHH

CCH1H1

VVLL

CCLL

Schwere KetteSchwere Kette

CCH2H2

CCH3H3CCH3H3

CCH2H2

CCH1H1

VVHH

CCLL

VVLL

Flexible Flexible ÜbergangsregionÜbergangsregion

NHNH22

NHNH22

NHNH22

NHNH22Antigen Antigen Bindung Bindung sregionsregion

AntigenAntigen EpitopEpitop

ParatopParatopLeichte KetteLeichte Kette

Spezifität von Antikörpern

PSA

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Analytische Spezifität: Fähigkeit nur den gesuchten Analytennachzuweisen

Kreuzreaktivität: Antikörper erkennt ähnliche Antigene

Antigen: Stoffe (z.B. Proteine), die „Antikörper-generierend“ sind

Was möchte ich messen? Beispiel: PSA-Fraktionen

PSAPSA PSA

Freies PSA PSA-ACT PSA- α2M

10-15% 85-90% nicht detektierbar

ACT= α 1-antichymotrypsin α2M= α 2-Makroglobulin

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• Bildung von Antigen-Antikörper-Netzwerken (Präzipitate)• bivalent•Vernetzungsgrad von ihren relativen Mengen abhängig

Antikörper-Reaktionen UKMUniversitätsklinikumMünster

Quantitative immunchemische Verfahren:Nephelo- und Turbidimetrie

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PSA

Antigen Antikörper Markierung

• radioaktive Isotope

• fluorogene Moleküle

• Enzym

• luminogeneMoleküle

• polyklonal• monoklonal

Spezifität:

Herkunft:• Mensch/Tier

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Immunoassay-Testformen (heterogen) UKMUniversitätsklinikumMünster

Konzentration

A. Kompetitive Testform

Sign

al

Ag

AgAg

Ag

Ag AgAg

AgAg

AgAg

Immunoassay-Testformen (heterogen)

B. Sandwich-Typ (immunometrischer Test)

PSA

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Mes

ssig

nal

Ag

Ag

Ag

Ag

AgAg

Konzentration

Waschen

Ag

Ag

Ag

Enzyme Linked Fluorescent Assay(ELFA)

Antigen markierter AKAntigen markierter AK

Ag

„ Sandwich-Prinzip “

AP

MUP

MU

O O

CH3

R

+P

4-Methylumbelliferyl-Phosphat

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TeststreifenGLORIA-Technik (Gold Labelled Optical-read Rapid Immuno Assay)

FilterMischzone Testfeld Kontrolle Löschpapier

PSA PSA

PSA

PSA

PSA

FilterMischzone Testfeld Kontrolle Löschpapier

POSITIV

NEGATIV

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+ +AgAg

a) EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique)

AgAgAg

Substrat

Produkt

Substrat

ProduktProduktAg

E

AgAgAg

E

Ag

E

AgAgAgAg

E

hohe Ag-Konzentration

niedrige Ag-Konzentration

hohe Ag-Konzentration

niedrige Ag-Konzentration

Homogene Immunoassays(„Eintopfverfahren“)

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AgAg

a) FETI (Fluorescence Energy Transfer Immunoassay)

Energietransfer

++

Antikörper-Donor-Komplex

Antikörper-Akzeptor-Komplex

langlebige

Fluoreszenz620 nm

langlebige

Fluoreszenz620 nm

Anregung

337 nm

Anregung

337 nm337 nm

337 n

m33

7 nm

kurzl

ebige

Fluor

esze

nz665 n

mku

rzleb

ige

Fluor

esze

nz665 n

m66

5 nm

Anregung

337 nm337 nm

DD DD

AgAg

A

langle

bige

Fluores

zenz66

5 nm

langle

bige

Fluores

zenz66

5 nm

langle

bige

Fluores

zenz66

5 nm

A

Sandwich-Komplex

Homogene Immunoassays(„Eintopfverfahren“)

Test-Spezifikationen

Probenmaterial: SerumHaltbarkeit: wenige Stunden- mehrere Wochen

(Peptide !)

Probenvolumen: 10-50 µl

Kalibratoren: WHO-Standard (methodenabhängige Werte)

Inkubationszeit: 10 min-60 min

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Immunoassays-Anwendungen-

• Hormonbestimmungen (Schilddrüsen- und Fertilitätshormone, Insulin)

• Tumormarker (z.B. CEA, PSA, CA 15-3)• Medikamentenspiegel (z.B. Digoxin, Antibiotika)• Herzmarker (z.B. Troponin I)• Virusdiagnostik (z.B. HBsAg)

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PSA_Kalibration

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60

Konzentration ng/ml

Sign

alst

ärke

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Wie sensitiv ist mein Verfahren?

Analytische Sensitivität (Nachweisgrenze)

Immunologische Meßmethoden sind die sensitivsten Verfahren zum Nachweis von Substanzen in menschlichen Körperflüssigkeiten.

mg (10g-3)

ng (10g-9)

μg (10g-6)

pg (10g-12)

fg (10g-15)

Die Nachweisgrenze AaseeAaseeFläche: 40 HektarFläche: 40 HektarTiefe: Tiefe: ∅∅ 2 m2 m= 8 x 10= 8 x 1088 LiterLiter

Immunologischer Immunologischer Test: z.B. PSATest: z.B. PSANachweisgrenzeNachweisgrenze≤≤ 0,01 ng/ml = 100,01 ng/ml = 10--88 g/lg/lZuckerwürfel 2 g:Zuckerwürfel 2 g:

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Nachweisgrenzen

AnalytischAnalytisch: „0: „0--Kalibrator“Kalibrator“⌧⌧ ≥≥ 20 Messungen + 220 Messungen + 2--3 SD3 SD

BiologischBiologisch: : „„AnalytAnalyt--freiesfreies“ Serum “ Serum ⌧⌧ ≥≥ 20 Messungen + 220 Messungen + 2--3 SD 3 SD

FunktionellFunktionell:: „„AnalytAnalyt--freiesfreies“ Serum “ Serum Konzentration, bei der VK > 20%Konzentration, bei der VK > 20%oder aufgehobene Verdünnungslinearitätoder aufgehobene Verdünnungslinearität

PSA_Kalibration

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60

Konzentration ng/ml

Sign

alst

ärke

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Kalibration (Standardkurve)

„High-dose-hook-Effekt“

• Sandwich-Typ (immunometrischer Test)

PSA

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Mes

ssig

nal

Ag

Ag

Ag

Ag

AgAg

PSA-Konzentration

Waschen

Ag

Ag

Ag

AgAg

Ag

AgAg

Ag

AgAg

Ag

Ag

Ag

AgAg

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Messgrenze bzw. Linearitätsgrenze

StörfaktorenheterophileAntikörper

Anti-Tier-Antikörper

Medikamente

Hämolyse, Lipämie,Hyperbilirubinämie

kreuzreagierende Substanze

Serumproteine (z.B. Rheuma-faktoren, Bindungsproteine)

n

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PSA falsch niedriges Ergebnis

PSA falsch hohes Ergebnis

HAMAEpitop

Human-Anti-Maus-Antikörper (HAMA) UKMUniversitätsklinikumMünster

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TT--PSAPSA--AssaysAssays

Abbott PSA AxSymAbbott PSA IMxBaxter/Dade Stratus-PSABayer Technicon Immuno 1Behring Berilux PSABehring N Latex PSABehring Opus PSABiochem Immunosystems

MAIAcloneBiochem Immunosystems

SR1 PSABiomar PSA ELISABiomar psaQuick stickBioMedTech BioSign PSAbioMerieux Vidas PSABoehringer Elecsys PSA

Boehringer Enzymun PSAByk-Sangtec IRMA-matByk-Sangtec LiaisonByk-Sangtec LIA-matCanAg Equi-molar EIAChembio PSA Membrane T.Chimica PSA ELISAChiron ACS2 PSACIS ELSA2 PSACIS Kryptor PSACIS RIACT PSADiag. Systems Active PSADiag. Systems Active Ultrasens PSADianova PSA DIA 0301 EDianova PSA ELISA TM 10DiaSorin ETI-PSAKDiaSorin PSACTKDPC Biermann Coat-A-CountDPC Biermann Immulite 3. Gen.

DPC Biermann Immulite PSADPC Biermann IRMA-countDPC Biermann Milenia PSADRG Instruments PSA EIAEiken PSAEurogen./Tosoh AIA-Pack PAFF Diagnost. PSA OncoquantFF Diagnost. PSA OncoscreenHybritech Tandem-EHybritech Tandem-RImmunocorp PSA IRMAImmunotech Liana PSAInt. Immunodiagn. PSA IEMAJant Pharmacal Accustrip PSAMedpro PSA EIAMedpro PSA Membrane T.Melotec SA Melotest PSAMerck PSA-US MagiaMitsui Pharm. High-Sens-MPMitsui Pharm. PSA-MP Quartus

Nichols PSA CELIANobis Nobi-Well TMBOrtho-Clin.-Diag. Vitros PSAPrinceton BioSign PSARoche Cobas Core PSASeratec PSA ELISA 270 Seratec PSA SemiquantSerono PSA MAIAcloneSerono SR1 PSASorin/Yang Pros-CheckSyntron QuikPac 2Syntron QuikStrip 1United Biotech Ubi MagwelVeda Lab PSA EIAVeda Lab PSA Membrane T.Wallac Delfia PSA EQMWallac Dual Label

= 70 = 70 AssaysAssays

Analytische Beurteilung und Wertigkeit einer Bestimmungsmethode

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•Präzision

•Richtigkeit

•Stabilität (Drift)

•Verschleppung

•Robustheit

•Analytische Sensitivität und Spezifität

•Diagnostische Sensitivität und Spezifität

Diagnostische Sensitivität:

Wahrscheinlichkeit mit der Kranke richtig erkannt werden (alle richtig positiven Ergebnisse/ alle Kranken)

Diagnostische Spezifität:

Wahrscheinlichkeit mit der Nicht-Kranke richtig erkannt werden (alle richtig negativen Ergebnisse/ alle Gesunden)

Positiver prädiktiver Wert:

Wahrscheinlichkeit bei positivem Testergebnis, das der Patient krank ist (alle richtig positiven Ergebnisse/ alle positiven Ergebnisse) abhängig von der Prävalenz

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Screeninguntersuchung

KrankheitKrankheit “Y” “Y” istist asymptomatischasymptomatisch ((InzidenzInzidenz: 1 / 1000) : 1 / 1000)

KrankheitKrankheit “Y” “Y” istist imim Serum Serum nachweisbarnachweisbar

SensitivitätSensitivität: “Y”: “Y”--Assay = 99 % (1 von 100 Assay = 99 % (1 von 100 KrankenKranken wirdwirdübersehenübersehen))

SpezifitätSpezifität “Y”“Y”--Assay = 98 % ( 2 von 100 Assay = 98 % ( 2 von 100 GesundenGesundenfälschlichfälschlich imim VerdachtVerdacht

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Screeninguntersuchung

••Assay “Y” Assay “Y” ergibtergibt einein positivespositivesTestergebnisTestergebnis in in IhrerIhrer ProbeProbe

••WieWie hochhoch schätzenschätzen SieSie IhrIhr RisikoRisikoeinein, an , an KrankheitKrankheit “Y” “Y” zuzu leidenleiden ??

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Screeninguntersuchung

BeiBei einemeinem positivenpositiven TestergebnisTestergebnis imim Assay “Y” Assay “Y” würdewürdeichich schätzenschätzen, , daßdaß ichich mitmit dieserdieser WahrscheinlichkeitWahrscheinlichkeittatsächlichtatsächlich an an KrankheitKrankheit “Y” “Y” leideleide::

~ ~ 99 %99 %~ 98 %~ 98 %~ 95 %~ 95 %~ 50 %~ 50 %~ 5 %~ 5 %~ 1 %~ 1 %

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Screeninguntersuchung

BeiBei einemeinem positivenpositiven TestergebnisTestergebnis imim Assay “Y” Assay “Y” würdewürdeichich schätzenschätzen, , daßdaß ichich mitmit dieserdieser WahrscheinlichkeitWahrscheinlichkeittatsächlichtatsächlich an an KrankheitKrankheit “Y” “Y” leideleide::

~ ~ 99 %99 %~ 98 %~ 98 %~ 95 %~ 95 %~ 50 %~ 50 %~ 5 %~ 5 %~ 1 %~ 1 %

XX

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Screeninguntersuchung100.100 100.100 getestetgetestet100 100 KrankeKranke, 100 000 , 100 000 GesundeGesunde99 99 derder 100 100 KrankenKranken erkannterkannt, 1 , 1 übersehenübersehen98.000 98.000 derder GesundenGesunden alsals gesundgesund erkannterkannt2.000 2.000 derder GesundenGesunden falschfalsch--positives positives TestergebnisTestergebnis99 + 2000 99 + 2000 habenhaben positives positives TestergebnisTestergebnis

WahrscheinlichkeitWahrscheinlichkeit, , daßdaß SieSie beibei positivempositivem TestergebnisTestergebnis an an KrankheitKrankheit “Y” “Y” leidenleiden: : richtigrichtig positivpositiv / / allealle positivenpositiven ErgebnisseErgebnisse

99 / 2099 = 0,047 x 100 = 4,7 %99 / 2099 = 0,047 x 100 = 4,7 %

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Screeninguntersuchung100.100 100.100 getestetgetestet100 100 KrankeKranke, 100 000 , 100 000 GesundeGesunde99 99 derder 100 100 KrankenKranken erkannterkannt, 1 , 1 übersehenübersehen98.000 98.000 derder GesundenGesunden alsals gesundgesund erkannterkannt2.000 2.000 derder GesundenGesunden falschfalsch--positives positives TestergebnisTestergebnis99 + 2000 99 + 2000 habenhaben positives positives TestergebnisTestergebnis

WahrscheinlichkeitWahrscheinlichkeit, , daßdaß SieSie beibei negativemnegativem TestergebnisTestergebnis nichtnichtan an KrankheitKrankheit “Y” “Y” leidenleiden: : richtigrichtig negativnegativ / / allealle negativennegativen ErgebnisseErgebnisse

98000 / 98001 = 0,99 x 100 = 99,9999 %98000 / 98001 = 0,99 x 100 = 99,9999 %