Ruth Prassl 10. Thüringer Biomaterial – Kolloquium
17. September 2015
LiposomaleLiposomale WirkstoffträgersystemeWirkstoffträgersysteme Vom Konzept bis zur klinischen AnwendungVom Konzept bis zur klinischen Anwendung
1
Drug Drug DeliveryDelivery Systeme Systeme -- WirkstoffträgerWirkstoffträger
Schutz des Wirkstoffes vor enzymatischen Abbau Erhöhung der Löslichkeit des Wirkstoffes
Geschützter Transport an den Wirkort und gezielte Freisetzung des Wirkstoffes vor Ort (targeted drug delivery)
Wozu überhaupt Wirkstoffträger ?
Reduktion der verabreichten Wirkstoffmenge Reduktion der Toxizität von Wirkstoffen Reduktion unerwünschter Nebenwirkungen Langzeitwirkung durch verlangsamte Freisetzung (Retardeffekt)
Erwartete Vorteile:
2
Herausforderungen:
Biologische Verträglichkeit
Beladbarkeit des Wirkstoffträgers
Lagerungsstabilität
Stabilität im Körper, Aufnahme von den Zellen
Freisetzung des Wirkstoffes
Reproduzierbarkeit im Herstellungsverfahren
Up-scaling (Herstellung großer Mengen)
Regulatorische Hürden
Kosten ………
Drug Drug DeliveryDelivery Systeme Systeme -- WirkstoffträgerWirkstoffträger
Oral
Alternative Darreichungsformen zu Injektionen
Inhalativ
3
Flüssigkristalle
..... und viele mehr
Nano-Kapsel
Nano-Kugeln
Protikel - Peptide
Mizellen
S
S
S
S
SH
HS
S
S
S
S
SH
HS
Thiomere
NanotechnologieNanotechnologie Platform für Platform für WirkstoffträgerWirkstoffträger
Liposomen Albumin
4
Alec Bangham (1921-2010)
Geschichte Geschichte –– LiposomenLiposomen als Wirkstoffträger als Wirkstoffträger
1990
Danilo Lasic
Demetrios Papahadjopoulos
1965
Gregory Gregoriadis
1970
5 Yechezkel „Chezy“ Barenholz
Liposomal Doxorubicin FDA approved 1995
Phospholipid Moleküle
amphiphil Hydrophile Kopfgruppe Hydrophobe Ketten
Liposomen sind modulare selbstassemblierende
Systeme
Warum Liposomen ?
MLV Multi Lamellar Vesicles
H2O
LiposomenLiposomen als Wirkstoffträgersysteme als Wirkstoffträgersysteme
“plain“ Liposomen
Wirkstoffe Kontrastmittel
Zielfindungsmoleküle Signalgebende Moleküle
Polymer Oberflächen Polymer Oberflächen Polymer Oberflächen
LUV Large Unilamellar Vesicles
6
DSPE-PEG 2000
„Stealth Liposome“
SterischSterisch stabilisierte stabilisierte LiposomenLiposomen
Wirkstoffbeladung &
„targeting“
Phospholipide: Phosphatidylcholine – Lecithin (EggPC, SoyPC, POPC, DPPC…) Phosphatidylethanolamin - (DPPE, DOPE…..) Kationische oder anionische Phospholipide (DOTMA/DOTAP/DC-Chol oder PS/PA/PG…) Cholesterin PEGyliertes Phosphatidylethanolamin (3-5 mol % DSPE – PEG2000)
7
Polymer Ummantelung
Funktionalisierte Funktionalisierte sterischsterisch--stabilisierte stabilisierte LiposomenLiposomen
Wirkstoffe Signalgebende Gruppen
Radionuklide : 111In, 68Ga MRI : Gd3+, Ironoxid- NPs Fluoreszenz Marker : e.g. Atto655
Erkranktes Gewebe: Tumor, atherosklerotischer Plaque….
Marker Moleküle
Aktives Targeting
8
Zielmoleküle
Regulatorische Peptide, Proteine oder Antikörper
Passives Targeting EPR Effekt
„enhanced permeation and retention“
Gesundes Gewebe
Endothel
Basalmembran
Blutgefäß
Tumor Gewebe
Lysosom
Spezifische oder unspezifische Absorption
Fusion
Zytoplasma
Pinozytose
Lipidaustausch
Endozytose
Endosom
ZellulärereZellulärere Aufnahme von Aufnahme von LiposomenLiposomen
Caveolin Clathrin
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Polymer Coating: Thiomer gecoatete Liposomen
Kopplung von thiolierten Polymeren an funktionalisierte Liposomen
Orale Applikation: - verbesserte mucoadhäsive Eigenschaften erhöhen die orale Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen
thioliertes Chitosan maleimide-funktionalisiertes Phospholipid
H
SH
H
CH 2 OH
NH
O
OH
H
O
H O O H
SH
H
CH 2 OH
NH
O
OH
H
O
H O O O
O
O
O H
O P
O
O O H
N
N
O
O
Na + Na +
O R 1
R 2
Gradauer et al, J. Control.Release (2014) 10
Lipidmischungen in
organischen
Lösungsmittel
Chloroform/Methanol
Lipide, funktionalisierte Lipide
Markermoleküle
Hydratation
& Vortex
Abdampfen
N2-Strom
Trockener Lipidfilm
Vakuumtrocknung
Liposomen
unterschiedlicher
Größe in Puffer
Dispersion
Beladung / Labelling
Freeze/thaw Suspension
Herstellungsmethoden von Liposomen
Homogenisieren - Beschallen
Membranfilter mit definierter Porengröße z.B. sequentiell 400 nm, 200 nm, 100 nm Filter
Größenextrusion
11
Reversed phase separation, Ethanolinjektion ....
NanoAssemblr
Scale-up
Herstellungsmethoden von Liposomen
Mikrofluidics - schnelles Mischen
Einschrittsynthese
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Flussraten 2-12 ml/min
Reinigung : Dialyse Zentrifugation Chromatographische Methoden
Liposome Suspension
Charakterisierung : Chemische Charakterisierung Lipid Zusammensetzung / Lipid Integrität Dünnschichtchromatographie Lipidquantifizierung Enzymatische Assays, Anorganischer Phosphor Wirkstoff / Markerkonzentation HPLC/MS, Fluoreszenz Elektrophoresen ….
Reinigung und Charakterisierung von Liposomen
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Biophysikalische Charakterisierung Größenmessung – Photonenkorrelationsspektroskopie Dynamische Lichtstreuung (Malvern Instruments)
Oberflächenladung – Zetapotential Morphologie – Elektronenmikroskopische Methoden Morphologie / Form – Röntgenkleinwinkelstreuung (Small Angle X-ray Scattering, SAXS) Thermisches Verhalten – Differentielle Mikrokalorimetie (Differential Scanning Calorimetry, DSC)
DSC
q (Å-1
)
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
I (a
rb. units)
0
2000
4000
6000
8000
10000
z (Å)
-40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40
(a
rb.
un
its)
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
SAXS
TEM
14
Mikroskop
Metalloberfläche Glas
Nanopartikel in Lösung
Nanopartikel streuen das Laserlicht
Laserstrahl (ca. 50 µm Durchmesser)
Nanopartikel Tracking Analyse - NTA
Malvern Instruments
Brown´sche Bewegung + Lichtstreuung
15
Gezielte Freisetzung des Wirkstoffes
pH sensitive Lipide
Temperaturerhöhung
Photoaktivierung
Ultraschall
Stabilität, Beladungseffizienz, Freisetzungsverhalten, Wirkung …….
Zellkultur, Biologische Barrieren, Proteincorona, zelluläre Aufnahme …..
Pharmazeutische Entwicklung
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Präklinische Validierung – geeignetes Tiermodell
Alzheimer
virale Infektionen
Stoffwechsel krankheiten
kardiovaskuläre Krankheiten
bakterielle Infektionen
Krebs
Autoimmun- erkrankungen
Potential
mit
tel
mittel hoch
ho
ch
Wah
rsch
ein
lich
keit
fü
r R
eal
isie
run
g
Anwendungbereiche & Umsetzung
Therapiepotential und Realisierungswahrscheinlichkeiten bis 2020
Baumgartner und Jäckli, 2007
Teilweise in klinischer Phase und erste Produkte schon am Markt
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18
Liposomale Produkte am Markt
AmBisome ® (Gilead Sciences), Albelcet®(ELAN) : Pilzinfektion Membran interkaliertes Amphotericin B SUV, lyophilisiert Lipide : H-SPC (hydrogenated Soy PC), Cholesterin, DSPG
O
OH O
H
CO2H
OH
OH
O OHOH
OH
OHOH
O
O
OH
NH2
OH
DaunoXome® (Gilead Sciences) : Krebstherapie enkapsuliertes Daunorubicin SUV, wässrige Suspension Lipide : DSPC, cholesterol
Doxil® (ALZA), Caelix® (Janssen-Cilag), Myocet® (Enzon) : Krebstherapie enkapsuliertes Doxorubicin LUV, wässrige Suspension – Blutstabilität 4 Tage Lipide : MPEG-DSPE, H-SPC, Cholesterin Ammonium-gradient Wirkstoffeinbau
http://www.nanopharmaceuticals.org/Liposomes.html
19 Bozzuto G., Molinari, A., (2015), Int.J.Nanomedicine
20 Bozzuto G., Molinari, A., (2015), Int.J.Nanomedicine
21
2015
22 22 22
Nanomedizin von „Nanomedizin von „benchbench toto bedsidebedside“ “
Vom Labor zur Klinik bis zum Market rechnet man mit 10-16 Jahren
Preclinical Phase
Clinical Phase I
Clinical Phase II
Clinical Phase III
Marketing Production
Search /Optimization
of a drug
Search /Optimization
of a drug
Search /Optimization
of a drug
Nanomedicine Start-ups Pharmaceutical Industry
Basic Research Drug screening, galenics
Clinical Phase IV Observation after approval
PreclinicaL Studies in vitro
in vivo animal
Approval market
Clinical Phase I Tolerance, healthy
individuals
Clinical Phase III Tolerance, large group
of patients
Clinical Phase II Tolerance, small group
of patients
Acknowledgements
23