Rapid One Step Assay
Charm ROSA Technologie
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Antibiotika
• Arzneimittel, die gegen Bakterien und andere Mikroorganismen, nicht aber gegen Viren wirksam sind, indem sie sie entweder abtöten (bakterizide Antibiotika) oder in ihrem Wachstum hemmen (bakteriostatische Antibiotika).
Antibiotika
Penicillin: Ursprüglich ein metabolisches Produkt von Penicillium Schimmelpilze
Penicillin- Alexander Fleming 1928
Antibiotika
Antibiotikafamilien
Betalaktame Penicillin, Ampicillin, Cloxacillin Tetracycline Tetracyclin, Oxytetracyclin, Chlortetracyclin, Doxycyclin Macrolide Erythromycin, Lincomycin, Spiramycin Aminoglykoside Streptomycin, dihydrostreptomycin, Gentamicin Sulfonamide Sulfamethazin Amphenicole Chloramphenicol Gyrasehemmer Enrofloxacin
Penicillinase (b Lactamase)
• Spaltet den Betalaktam Ring • Antibiotikum wird unwirksam
Antibiotika Penicillin
Antibiotika Penicillin
Die Gefahr Resistenzentwicklung
• Erhöhte Minimale HemmKonzentrationen • Multi-Resistenz Methicillin, Vancomycin • Antibiotikafamilien Resistenz • Infektionen schwer zu bekämpfen • Hohe Kosten
Charm ROSA Technologie
• Streifentechnologie • Keine Probenvorbereitung • Antibiotikanachweis nach internationalen Höchstmengen • Aflatoxin M1 Nachweis 50ppt • Mykotoxine DON, Zearalenone, Fumonisin, Aflatoxin B1 etc.
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Testprinzip
Testlinie
Probekammer
Rezeptor
Kontrollinie Kompetitive Rezeptortests
Antibiotika in der Probe und Antibiotika im Rezeptorgemisch konkurrieren um die Bindungs-stellen des Rezeptors
Milchprobe mit Antibiotikum
T C
Milchprobe OHNE Antibiotikum T C
Antibiotikum
Colloidales Gold
Rezeptor
Testlinie Kontrollinie
Charm ROSA Technologie
T C
Milchprobe mit Antibiotikum
Milchprobe OHNE Antibiotikum T C
Antibiotikum bindet am Rezeptor
Bindungsstellen Rezeptor nicht besetzt
Charm ROSA Technologie
T C
T C
Lateral flow
Milchprobe mit Antibiotikum
Milchprobe OHNE Antibiotikum
Charm ROSA Technologie
T C
T C
Milchprobe mit Antibiotikum
Milchprobe OHNE Antibiotikum
Lateral flow
Charm ROSA Technologie
T C
T C
Milchprobe mit Antibiotikum
Milchprobe OHNE Antibiotikum
Lateral flow
Charm ROSA Technologie
T C
T C
Milchprobe mit Antibiotikum
Milchprobe OHNE Antibiotikum
Lateral flow
Charm ROSA Technologie
T C
T C
Milchprobe mit Antibiotikum
Milchprobe OHNE Antibiotikum
Rezeptor bindet an Testlinie
Charm ROSA Technologie
T C
T C
Rest Rezeptor bindet an Kontrollinie
Milchprobe mit Antibiotikum
Milchprobe OHNE Antibiotikum
Charm ROSA Technologie
T C
Kann der Charm Test falsch negativ werden?
Nein … Keine Bindung am Rezeptor Test Positiv….
Charm ROSA Technologie
•
Schnelltests zum Nachweis von Antibiotika und Aflatoxin M1
Untersuchungszeit 1 – 8 Minuten
Internationale Nachweisgrenzen EU MRL, USA SL, KIWI, Russland etc.
Mehrere Gerätekonfigurationen EZ Reader, ROSA Reader
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1. Betalaktame – klassische und synthetische Antibiotika 2. Tetracycline – Tetracyclin, Oxytetracyclin, Chlortetracyclin, Doxycyclin 3. Aminoglykoside – Streptomycin, dihydrostreptomycin, Gentamicin 4. Makrolide 5. Sulfonamide – Sulfamethazin 6. Chloramphenicol 7. Sonstige Antibiotika – Enrofloxacin
Nachweispriorität der Antibiotikafamilien
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Penicillin G Klassisches Betalaktam Amoxicillin Klassisches Betalaktam Ampicillin Klassisches Betalaktam Cefacetril Synthetisches Betalaktam Cephalonium Synthetisches Betalaktam Cefazolin Synthetisches Betalaktam Cefoperazon Synthetisches Betalaktam Cefquinom Synthetisches Betalaktam Ceftiofur und Metaboliten Synthetisches Betalaktam Cephapirin Synthetisches Betalaktam Cloxacillin Klassisches Betalaktam Dicloxacillin Klassisches Betalaktam Oxacillin Klassisches Betalaktam
Familie der Betalaktame
Charm ROSA Technologie
Rezeptor Technologie – Extrakt aus Bakterienzellwand PBP PBP = Penicillin Binding Protein
Betalaktame zerstören die Zellwand von Mikroorganismen Alle Betalaktame besitzen einen Betalaktam Ring
Vorteile Rezeptortechnologie: Alle Betalaktame werden in nur einem Untersuchungsvorgang
nachgewiesen! Schnelle, spezifische Reaktion
Charm ROSA Betalaktam Tests
Charm ROSA Technologie
Maximal zulässige Konzentration eines Antibiotikums
Betalaktam Codex/EU MRL Nachweisgrenze Amoxicillin 4 3 – 4 Ampicillin 4 3 – 4 Cefacetril 125 30 – 40 Cephalonium 20 8 – 12 Cefazolin 50 40 – 50 Cefoperazon 50 3 – 5 Cefquinom 20 20 – 30
Ceftiofur und Metaboliten* 100 60 – 100
Cephapirin 60 15 – 20 Cloxacillin 30 15 – 20 Dicloxacillin 30 10 – 15 Oxacillin 30 10 – 20 Penicillin G 4 2 – 3
* metabolisiert sofort
(M)aximum (R)esidue (L)imit
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Warum sollen Höchstmengen nicht überschritten werden?
Resistenz klassische Betalaktame
Resistenz synt. Betalaktame 2. Generation
Resistenz synt. Betalaktame 3. Generation
z.B. Penicillin, Ampicillin, Cloxacillin
z.B. Cephapirin, Cefazolin
Resistenz Methicillin
z.B. Cefotaxim
MRSA, ESBL
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Charm ROSA Tetracycline
Nach Betalaktamen die Nummer 2 in der Antibiotikastatistik Starke Resistenzentwicklung Resistenzproblem vorallem in Süd-Europa Erhöhte M(inimale) (H)emm (K)onzentrationen bzw. Resistenz der
isolierten Mikroorganismen gegen Tetracycline
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Anforderungen für Export nach Russland
Betalaktame EU MRL = Rusland MRL Tetracycline Maximal 10ppb Gesamt-Tetracycline Streptomycin < 100 ppb Chloramphenicol < 0.1 ppb
Charm ROSA Technologie
Russland Export Tetracycline
2 Minutentest 3 Linien Kontrolle, Betalaktame und Tetracycline
EU MRL (ppb) RF (ppb) Nachweisgrenze
(ppb) Chlortetracyclin 100 10 6 – 10
Doxycyclin 100 10 6 – 10
Oxytetracyclin 100 10 6 – 10
Tetracycline 100 10 6 – 10
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Russland Export Streptomycin
8 Minutentest 2 Linien Kontrolle und Testlinie
EU MRL (ppb) RF (ppb) Nachweisgrenze
(ppb) Streptomycin 200 500 50
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8 Minutentest 2 Linien Kontrolle und Testlinie
EU MRL (ppb) RF (ppb) MRPL * (ppb)
Chloramphenicol < 0.1 10 < 0.3
* MRPL: Minimum Required Performance Limit
Russland Export Chloramphenicol
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Monatlich mindestens zwei Untersuchungen zur Feststellung von Hemmstoffen nach den Bestimmungen der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 Abs. 1 des Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuches.
Festgelegt vom Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit
Rückstandshöchstgehalte werden in der EU in einem Gemeinschaftsverfahren festgesetzt EU MRL
Antibiotikanachweis Milchgüteverordnung
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Mikrobiologische Screeningtest
BR Test – Brilliantschwarz Reduktionstest Delvo Test – Vergleichbar mit BR Test Copan – Vergleichbar mit BR Test Charm Sciences Blue Yellow - Verbesserte Empfindlichkeit
Sporen von Bacillus Stearothermophilus Briljant Schwarz Redox Indikator
Alle Tests funktionieren nach dem gleichen Prinzip!
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Charm ROSA Test vs Mikrob. Screeningtests
Charm ROSA Test ist auf immunologischer Basis - Antigen ( Antibiotikum ) / Rezeptor Reaktion
- z.B. Betalaktame und Tetracycline - Antigen ( Antibiotikum ) / Antikörper Reaktion - Chloramphenicol
Screeningtests sind auf mikrobiologischer Basis
Meistverbreitete Tests BR/Delvo
Charm ROSA Technologie
Nachweis von Hemmstoffen in Sammelmilch; Agar-Diffusions-Verfahren ( z.B. Antibiotika, Immunglobuline, Lysozym ) (Brillantschwarz - Reduktionstest) § 35 LMBG 01.00-5
Begriffsdefinition:
Eine Probe enthält Hemmstoffe, wenn sie nach dem festgelegten Verfahren das Wachstum des Testkeims und somit die Reduktion des dem Medium zugesetzten blauen Redoxindikators mindestens in gleicher Weise hemmt wie die Kontrolle mit 4 µg/kg Benzylpenicillin.
Milchgüteverordnung
Problem: Unterschiedliche MHK-Werte 4ppb Penicillin
200ppb Cefquinom ( MRL 20ppb )
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Charm ROSA Technologie
Wachstum Indikator nach gelb Hemmstoffe nicht nachweisbar
Kein Wachstum Indikator ändert nicht Hemmstoffe nachweisbar
Ergebnis mikrobiologische Screeningtests
Positive Ergebnisse mikrob. Screening Tests u.a. durch:
Antibiotika Immunologische Faktoren Erhöhte somatische Zellzahl Fettgehalt > 6% Interferenz durch natürliche Hemmstoffe
Lysozym Lactoferrin
Positive Ergebnisse nicht nur durch Antibiotika!
Charm ROSA Technologie
Betalaktam EU/ Codex MRL (ppb) Charm ROSA ( ppb ) BR ( ppb ) Amoxicillin 4 3 – 4 2 – 3 Ampicillin 4 3 – 4 2 – 3 Cefacetril 125 8 – 18 N.D. Cefalexin 100 30 – 60 200 – 300 Cephalonium 20 3 – 5 10 – 20 Cefazolin 50 12 – 20 10 – 25 Cefoperazon 50 5 – 9 25 –50 Cefquinom 20 15 – 20 100 – 200 Ceftiofur und Metaboliten 100 / 100 10 – 20 50 – 100 * Cefuroxim 50 3 – 5 200 – 300 Cephapirin 60 6 – 10 4 – 5 Cloxacillin 30 25 – 30 20 – 30 Dicloxacillin 30 20 – 30 10 – 20 Oxacillin 30 25 – 40 10 – 20 Nafcillin 30 30 – 50 10 – 15 Penicillin G 4 2 - 3 2 - 3
* Keine Metaboliten ( Reybroeck ILVO)
Nachweisgrenzen Charm ROSA und BR Test
Charm ROSA Technologie
Falsch negative Ergebnisse mikrob. Screening Tests u.a. durch:
Nachweisgrenze für Antibiotika nicht ausreichend Synthetische Betalaktame u.a. Ceftiofur Metaboliten Cefquinom Cefalexin Cefuroxim
Charm ROSA Technologie
Falsch positive oder falsch negative Charm ROSA Ergebnisse?
Falsch negative Ergebnisse nicht möglich wenn Antibiotikakonzentration >= Grenzwert ( limit of detection )
Falsch positive Ergebnisse können auftreten: Streifen ohne Deckel gelagert – Luftfeuchtigkeit! Erhöhter Fettgehalt > 7%
Charm ROSA Technologie
Übereinstimmung von Hemmstoff positiven Milchproben
Allgemein gute Übereinstimmung circa 97%
Abweichung kann auftreten bei: Synthetische Betalaktam Antibiotika Nicht-Betalaktam Antibiotika Sonstige Hemmstoffe
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