ElektrophoreseTeil 1
Skript zur Vorlesung „Grundlagen der Analytik I“im MSc-Studiengang Analytik
Prof. C. Vogt, Leibniz Universität Hannover 11.1.2007
Literatur
„Analytical Isotachophoresis“P. Bocek, M. Deml, P. Gebauer, V. Dolnik, VCH, Weinheim, 1988
„Gelelektrophorese“R. Westermeier, In Analytiker Taschenbuch, Bd. 7, Springer-Verlag, Berlin
„Isoelektrische Fokussierung“R. Westermeier, In Analytiker Taschenbuch, Bd. 7, Springer-Verlag, Berlin
„Capillary Electrophoresis: Principle and Practice“R. Kuhn, S. Hoffstetter-Kuhn, Springer Laboratory, Berlin, 1993
„Handbook of Capillary Electrophoresis“Ed. J. P. Landers, CRC Press, Boca Raton, 1997
“Advances in Electrophoresis”, Serie, Band 1, 2 und 6Eds. A. Chrambach, M. J. Dunn, B. J. Radola, VCH, Weinheim, 1987-1993
Gliederung
Grundlagengeschichtlicher Überblickwichtige GrößenTrennprinzipien
Zonenelektrophorese (ZE)Isotachophorese (ITP)Isoelektrische Fokussierung (IEF)
technische Realisierungen
KapillarelektrophoreseAufbau, apparative KomponentenPuffersysteme und AdditiveMizellare Elektrokinetische Kapillarchromatographie (MEKC)
Gelelektrophorese
Historische Entwicklung1791 Faraday Elektrolysegesetze
1853 Hittorf Überführungszahlen
1877 Helmholtz Elektroosmose
1887 Arrhenius Dissoziationstheorie
1897 Kohlrausch Regulierungsfunktion
1930 Tiselius Versuche zur Elektrophorese der wandernden Grenzflächen / erste reproduzierbar arbeitende Apparatur durch Kühleinheit / 1948 Nobelpreis
1960 Hjerten Elektrophorese der wandernden Grenzflächen erstmals in Kapillaren (i.D. 0,3 cm)
1967 Hjerten Theorie der trägerfreien Zonenelektrophorese
1968 Everaerts erste kommerzielle Isotachophoreseapparatur
1979 Mikkers Kapillarzonenelektrophorese
1987 Fa. Beckman erste kommerzielle Kapillarzonenelektrophorese-apparatur
Elektrophoretische Trennverfahren
Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld
Mobilität eines Teilchens hängt von Ladung und Radius ab
Analyten mit unterschiedlichen Mobilitäten im Feld wandernunterschiedlich schnell und werden dadurch getrennt
Trenneffekte sind vom Medium (Trennpuffer) abhängig
Möglichkeit der Analyse neutraler Verbindungen durch WWmit geladenen Pufferzusätzen
Einteilung elektrophoretischer Verfahren
Einteilungskriterium
Getrennte Stoffmenge analytisch, mikropreparativ, preparativ
Trennprozess kontinuierlich, Stufenweise
Stabilisierungsmethoden tragerfrei, mit Trägermedium, Kapillare,Gele
Trennprinzip nur MigrationMigration und WW mit TrägermediumMigration, WW mit Trägermedium undDiffusionMigration und Verteilung
Potentialgradient Hochspannung, Niederspannung
Trenntechnik Zonenwandernde GrenzflächenIsotachophoreseFokussierung
Einteilung elektrophoretischer Verfahren
Zonenelektrophorese
Methode der wandernden Grenzflächen / Isotachophorese
Isoelektrische Fokussierung
Kombinationen mit weiteren TrenneffektenMizellare Elektrokinetische KapillarchromatographieGelelektrophorese
Trennprinzipien
IEF
Zonenelektrophorese IsotachophoreseIsoelektrischeFokussierung(C)ZE ITP
Puffer homogene ZSS Gemisch von Ampholyten
Zwei Elektrolyte
E / pH homogen KontinuierlicherGradient
StufenförmigerGradient
Probe Keine BegrenzungFür Molekular-gewichtKationen, Anionen,Neutralverbindungen
Ampholyte, pI µT < µS < µL
nur eine Ionenart
Wichtige Verfahren in kapillaren Trennsystemen:Kapillarzonenelektrophorese (CZE), Micellare Elektrophoretische Kapillarchromatographie (MEKC), Kapillargelelektrophorese (CGE)
Zonenelektrophorese
Trägermaterial → Papier oder Dünnschicht Celluloseacetat (Filterpapier)NitrocelluloseIonenaustauscherAluminiumoxid, Titaniumoxid
Trägerfrei → Kapillare
eindimensional / zweidimensional
vom Trägermaterial verursachte EffekteJoul´sche WärmeElektroosmoseAdsorptionDiffusion
Trägermaterialien für die ZonenelektrophoresePapier
Papier- und Dünnschichtelektrophoreseheute kaum noch gebräuchlich (bessere Trennung und höhere Beladbarkeitvon Agarose- und PAA-Gelen)Silikagel-Platten in Puffertanks
FilmeCelluloseacetatmembran (große Poren, daher schlechte Auftrennung für Proteine) – Trenneffekt basiert vollständig auf Ladungsdichte; aber einfaches Handling
GeleIdeal – einstellbare, regelmäßige Porengröße, chemische Inertheit, keine ElektroosmoseStärke (seit 1955) – 5-10 mm dick, geringe Reproduzierbarkeit, unpraktisches Handling der GeleAgarose – charakterisiert durch Schmelzpunkt und Ausmaß der auftretenden Elektroosmose, Porengröße abhängig von Konzentration (150-500 nm)Polyacrylamid – seit 1959, chemisch inert, mechanisch stabil, wenig ElektroosmoseKontrolle der Porengröße bei Synthese möglich
Zonenelektrophorese
Trennprinzip für Trägersysteme (schematisch)
Euv ii ⋅=
Zonenelektrophorese
Trennprinzip für trägerfreie Systeme (Kapillare)
Euv ii ⋅=
Isotachophorese
zwei Puffer - Leitelektrolyt (L) / Terminator (T)
µL,eff > µi,eff > µT,eff
L
GL
Gx
xLx cc
µµ−µ
⋅µ−µ
µ⋅=Gesetz von Kohlrausch
X … Probeion, G … Gegenion, L … Leition
je geringer die Mobilität von x, desto geringer ist auch seine Konzentration in der entsprechenden Zone
die Konzentration des Probeions in seiner Zone richtet sich nach der Konzentration des Leitions
das Gegenion G ist in jeder Zone in entsprechender Menge vorhanden
.konst1c1c1cT,T
T,GT,G
X,X
X,GX,G
L,L
L,GL,G =⎟
⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛
µ
µ−⋅=⎟
⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛
µ
µ−⋅=⎟
⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛
µ
µ−⋅
Isotachophorese
Löslichkeit und Stabilität1-10 mM (wasserlöslich), alternativ Zugabe organischer LMAuswahl Gegenion – Redoxprozesse, Fällung vermeiden
Auswahl der Elektrolytlösungen
Ionisierung und PufferungDissoziationsgrad ≥ 10 % notwendig für ausreichenden µeff-Effektsinnvolle Grenze pHLE ≈ pKA±1 und pKB±1
Isotachophorese
Euv ii ⋅=
Isotachophorese
Trennung der Lanthaniden
Elektrolytsystem:Leitelektrolyt: 2.7 mM KOH + 1.5 mM α-Hydroxyisobuttersäure + Essigsäure (pH 4.92) + 0.0025 % PVATerminator: β-Alanin
Detektion: PotentialgradientProbe: 5 nmol je Element
t /min
T
L1 2
3
7
10 1112
1314
15
98
65
4
E
Methode des komplexie-renden Gegenions L K+
1 Na+
2 La3+
3 Ce3+
4 Pr3+
5 Nd3+
6 Sm3+
7 Eu3+
8 Gd3+
9 Tb3+
10 Dy3+
11 Ho3+
12 Er3+
13 Tm3+
14 Yb3+
15 Lu3+
T β-Alanin
Elektrolytsysteme
Kontinuierlich Diskontinuierlich
v = µ . E
LT
E1E2
Isoelektrische Fokussierung
Trägermaterial : Polyacrylamid (PAGE), Sephadex
Kovalente Bindung der Ampholyte an die GelmatrixpH bleibt über gesamte Trennung konstantGradient vorausberechenbar - damit anpassbar an Analysenproblemextrem hohe Auflösung erreichbar (bis 0,01 pH/cm)
Trägerfrei : Dichtegradienten (Sucrose), Freie Lösung
Ampholyte mit Isoelektrischem PunktImmobilisiert oder frei
( )BS pKpK21pH +⋅=
Isoelektrische Fokussierung
bei niedrigem pH R-COO- + H+ → R-COOHR-NH2 + H+ → R-NH3
+
bei hohem pH R-COOH → R-COO- + H+R-NH3
+ → R-NH2 + H+
pH = pIB
pH = pIA
Isoelektrische Fokussierung
Entwicklung des pH-Gradienten für die IEF
Isoelektrische Fokussierung
Grundstrukturen von Trägerampholyten
N N
NR2 COOH
Polyamino-Polycarbonsäuren
x = 2 oder 3
COOH
freie Trägerampholyte
CH2NH
O R
Acrylamid-Derivateimmobilisierte Ampholyte
3
CH3
CH3
SO H
COOH
NO
N+ C2H5
C2H5H5C2
R = R =
R = H
x
basischsauer
Isoelektrische Fokussierung
Agarose-IEF mit Elektroden- und Probeaufgabe-Streifen
Struktur der Agaroseund des bei derPolymerisation gebildeten Gels
Isoelektrische Fokussierung
IEF von Isoformen des α-Antitrypsin (Protease-Inhibitor) in immobilisiertem pH-GradientpH 4.0 – 5.0
IEF von Kartoffelsaft unterschiedlicher Kartoffelarten in einem Polyacrylamidgel(angefärbt mit CoomassieBrilliant Blue)
Kombinierte Prinzipien - 2D
Erste Dimension → IEF mit immobilisiertem pH-GradientenpH 3-12 in 24 cm langem Gelstreifen
Zweite Dimension →SDS-PAGEIn 13%igem Gel
Detektion durch Silberfärbung
Erste Dimension
Zwei
te D
imen
sion
SDS-PAGE
Sodium docecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresisPolyacrylamid-Gelelektrophorese nach SDS-Zusatz
SDS überdeckt Eigenladung des Proteinsje Gramm Protein binden ca. 1.4 g SDS → Proteine im Gemisch mit konstanter LadungsverteilungSekundär- und Tertiärstrukturen werden in Vorbehandlung durch Brechen derWasserstoffbrücken und Streckung des Moleküls aufgebrochenDisulfidbrücken werden durch Reduktion gespaltenIn anschließender Trennung spielt nur noch Größe eine Rolle
Trennprinzipien
IEF
Zonenelektrophorese IsotachophoreseIsoelektrischeFokussierung(C)ZE ITP
Puffer homogene ZSS Gemisch von Ampholyten
Zwei Elektrolyte
E / pH homogen KontinuierlicherGradient
StufenförmigerGradient
Probe Keine BegrenzungFür Molekular-gewichtKationen, Anionen,Neutralverbindungen
Ampholyte, pI µT < µS < µL
nur eine Ionenart
Wichtige Verfahren in kapillaren Trennsystemen:Kapillarzonenelektrophorese (CZE), Micellare Elektrophoretische Kapillarchromatographie (MEKC), Kapillargelelektrophorese (CGE)