Restriktionsenzyme (http://rebase.neb.com)
• Statistik:Enzymes: Total: 15093
• Restriction Enzymes 3945
• Type I 92
• Type II 3834
• Type III 11
• Type IV 5
• Weirdo REs 1
• Putative REs 4990
• Kommerziell erhältlich 641
Nucl. Acids Res. (2010) 38 (suppl 1): D234-D236. doi: 10.1093/nar/gkp874
Typ II-Restriktionsenzyme erkennen und schneiden die
DNA an palindromischen Sequenzen
z. B. 5´-GGAATTCC-3´
Restriktionsenzyme
• Sternaktivität? R-Enzyme können bei suboptimalen Bedingungen eine reduzierte Spezifität bezüglich der Erkennungssequenz aufweisen
Restriktionsenzyme
Alles über R-Enzyme: http://rebase.neb.com
• http://www.neb.com/nebecomm/products/category1.asp
REBASE—a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes Richard J. Roberts*, Tamas Vincze, Janos Posfai and Dana Macelis Nucleic Acids Research, 2010, Vol. 38, D234-236
http://rebase.neb.com
Komplementäre
überhängende
Enden
(„Sticky ends“)
erleichtern das
Wiederverknüpfen
von DNA-
Molekülen
Die DNA-Ligasen sind in der Lage, Phospho-
diesterbindungen zu knüpfen. Sie brauchen
dafür Energie, die entweder durch ATP oder
NAD+ geliefert wird
T4-DNA-Ligase
E. coli DNA-Ligase
Ligase AMP
Ligase
AMP
In der Gentechnologie
ist die Neukombination
unterschiedlicher DNA-
Moleküle wichtig.
Das Verknüpfen von DNA-
Molekülen erledigt das
Enzym „DNA-Ligase“
Eine weitere Möglichkeit, nachträglich rekombinante
Klone zu identifizieren, ist die Doppelselektion,
dazu sind spezielle Vektoren notwendig
Funktionen der Vektor DNA
• Sorgt für Replikation in der Wirtszelle
• Stellt selektierbare Markergene bereit
• Hat Vielzweck-Klonierungsstelle
• Trägt Signalsequenzen für Genexpression
• Verschiedenste Modifikationen für spezielle Anwendungen (z. B. „Shuttle“ zwischen Pro- und Eukaryoten; Elemente für künstl. Chromosomen)
Typen von Klonierungsvektoren
- Plasmide - Phagen (M13, Lambda, P1) - Phasmide; Phagemide - Cosmide - künstl. P1_Phagenchromosomen (PAC) - künstl. Bakterienchromosomen (BAC) - künstl. Hefechromosomen (YAC) - künstl. Humanchromosomen (HAC)
Typische Vektoren
besitzen mindestens
einen Replikationsursprung (ori),
selektierbare Marker-Gene
und eine multiple Klonierungsstelle
Typische Vektoren besitzen einen Replikationsursprung (Origin),
selektierbare Marker-Gene und eine multiple Klonierungsstelle
Plasmide als Vektoren
Plasmide sind extrachromosomale, autonom replizierende, meist zirkuläre DNA-Moleküle, die natürlicherweise in vielen Bakterien vorkommen
Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Plasmids in der Zustandsform „supercoiled“(rechts) bzw. „relaxed circle“
(links)
http://www.gen.cam.ac.uk/Images/summers/plasmids.jpg