Erwin R. Schmidt

Institut für Molekulargenetik Vorlesung #2

06. 05. 2014

Thema Gentechnologie

Restriktionsenzyme (http://rebase.neb.com)

• Statistik:Enzymes: Total: 15093

• Restriction Enzymes 3945

• Type I 92

• Type II 3834

• Type III 11

• Type IV 5

• Weirdo REs 1

• Putative REs 4990

• Kommerziell erhältlich 641

Nucl. Acids Res. (2010) 38 (suppl 1): D234-D236. doi: 10.1093/nar/gkp874

Struktur R-Enzym HincII

Struktur der R-Endonuklease Bam HI

Erkennungssequenz

Hochmolekulare DNA

Typ II-Restriktionsenzyme erkennen und schneiden die

DNA an palindromischen Sequenzen

z. B. 5´-GGAATTCC-3´

Restriktionsenzyme

• Sternaktivität? R-Enzyme können bei suboptimalen Bedingungen eine reduzierte Spezifität bezüglich der Erkennungssequenz aufweisen

Restriktionsenzyme

Alles über R-Enzyme: http://rebase.neb.com

• http://www.neb.com/nebecomm/products/category1.asp

REBASE—a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes Richard J. Roberts*, Tamas Vincze, Janos Posfai and Dana Macelis Nucleic Acids Research, 2010, Vol. 38, D234-236

http://rebase.neb.com

Komplementäre

überhängende

Enden

(„Sticky ends“)

erleichtern das

Wiederverknüpfen

von DNA-

Molekülen

Die DNA-Ligase verknüpft zwei DNA-Moleküle

Die DNA-Ligasen sind in der Lage, Phospho-

diesterbindungen zu knüpfen. Sie brauchen

dafür Energie, die entweder durch ATP oder

NAD+ geliefert wird

T4-DNA-Ligase

E. coli DNA-Ligase

Ligase AMP

Ligase

AMP

Oder verbindet „glatte“ Enden miteinander

Die DNA-Ligase schleißt typischerweise „nicks“

In der Gentechnologie

ist die Neukombination

unterschiedlicher DNA-

Moleküle wichtig.

Das Verknüpfen von DNA-

Molekülen erledigt das

Enzym „DNA-Ligase“

Wie kann man die Ligationsreaktion in Richtung der „bimolekularen“ Reaktion treiben?

Asymmetrische Restriktion von Vektor und Integrat-DNA

AATT GGCC

CCGG AATT

Eine weitere Möglichkeit, nachträglich rekombinante

Klone zu identifizieren, ist die Doppelselektion,

dazu sind spezielle Vektoren notwendig

Die Voraussetzungen für Gentechnologie

Funktionen der Vektor DNA

• Sorgt für Replikation in der Wirtszelle

• Stellt selektierbare Markergene bereit

• Hat Vielzweck-Klonierungsstelle

• Trägt Signalsequenzen für Genexpression

• Verschiedenste Modifikationen für spezielle Anwendungen (z. B. „Shuttle“ zwischen Pro- und Eukaryoten; Elemente für künstl. Chromosomen)

Typen von Klonierungsvektoren

- Plasmide - Phagen (M13, Lambda, P1) - Phasmide; Phagemide - Cosmide - künstl. P1_Phagenchromosomen (PAC) - künstl. Bakterienchromosomen (BAC) - künstl. Hefechromosomen (YAC) - künstl. Humanchromosomen (HAC)

Typische Vektoren

besitzen mindestens

einen Replikationsursprung (ori),

selektierbare Marker-Gene

und eine multiple Klonierungsstelle

Typische Vektoren besitzen einen Replikationsursprung (Origin),

selektierbare Marker-Gene und eine multiple Klonierungsstelle

Inzwischen gibt es die verschiedensten Farbvariationen als Marker oder Reportergene

Plasmide als Vektoren

Plasmide sind extrachromosomale, autonom replizierende, meist zirkuläre DNA-Moleküle, die natürlicherweise in vielen Bakterien vorkommen

Plasmid-DNA

E. coli DNA

Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Plasmids in der Zustandsform „supercoiled“(rechts) bzw. „relaxed circle“

(links)

http://www.gen.cam.ac.uk/Images/summers/plasmids.jpg

aus Weaver/Hedrick

z.B. Resistenzplasmide

Blau-weiß-Selektion mit pUC-Vektoren