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Weitere Untersuchungen tiber die lsomensierung des Ergosterins und seiner Derivate;

von A. Windaus, K. Dithmar, I€, Murke und 3. Suchfiill. [Aus dem Allgem. Chemischen Universitats -Laboratorium GSttingeu.]

(Eingelaufen am 8. Juni 1931.)

Seitdem die physiologisch wichtigen Bestrahlungs- produkte des Ergosterins sich als Isomem dieses Sterins erwiesen haben, sind Untersuchungen iiber die Isomerisie- rung des Ergosterins und seiner Derivate zu einer wichtigen Forschungsaufgabe geworden.

Als eine Methode zur Uurchfuhrung dieser Isomerisie- rung haben R e i n d e l und seine Mitarbeiter als erste die Zinwirhung von Chlorwasserstoff auf Ergo s t erylacetat st,udiert und dabei das ,,Isoergosterin" erhalten.')

Eine zweite Methode zur Gewinnung isomerer Ergo- sterine besteht in der Anlagerung von zwei Atornen Wasser- stoff an Ergosterin und in der Wiederabspaltung an anderer Stelle, oder auch i n der Durchfuhrung dieser Reaktion in umgekehrter Reihenfolge. So ist im hiesigen Laboratorium das Ergosterin m i t Natrium und Athylalkohol in Uihydro- ergosterin 2, verwandelt und letzteres mit Mercnriacetat 3,

oder Benzopersaure*) dehydriert worden. Bei dieser De- hydrierung entsteht zwai ein Gemisch von Isomeren, doch la& sich aus diesem ein einheitliches Sterin gewinnen, das als Ergosteriw D bezeichnet worden ist. Zu einem underen Isomeren gelangt man, wenn man das Ergosterin zuerst mit Mercuriacetat zum Dehydro-ergosterin dehydriert 6, und dieses mit Natrium und Athylalkohol hydriert. Das neue Isomere, das als Ergosterin F bezeichnet worden ist, scheint einlieitlicher Natur zu s e h 6 )

I) A. 462, 134 (1927). ') A. 472, 192 (1929). 3 A. 465, 157 (1928).

9 , A. M O , 232 (1928). 4, A. 481, 126 (1930). 6, A. 477, 272 (1930).

92 W i n d a u s , D i t h m a r , M u r k e und S u c k f u l l ,

Zu einem weiteren lsomeren des Ergosterins glaubt H e i l b ron mit seinen Mitarbeitern dadurch gekommen zu sein, daD er die Methode der Hydrierung und Dehydrierung rnit der Isomerisierung durch Nineralsauren kombiniert hat. Er hat das Dihydro-ergosterin in Form seines Acetats zum p-Uihydro-ergosterin isomerisiert und hat letzteres rnit Ner- curiacetat zu einem Sterin dehydriert, das er a1s Xrgosterin E bezeichnet hat.l) E s bedarf noch der Nachpriifung, ob das Ergosterin E ein besonderes chemisches Individuum darstellt.

Eine dritte Methode zur Isomerisierung besteht darin, daB man Ergosterin odes seine Derivate mit fein verteiltem Nickel auf 220' erhitzt. Uurch Kombination dieses Ver- fahrens rnit der Uehydrierung und Hydrierung kann man zu neuen Isomeren des Ergosterins gelangen, So haben W i n d a u s und Auhagen das Dehydro-ergosterin mit fein verteiltem Nickel auf 220" erhitzt und sind auf diesem Wege zu zwei Ketonen gelangt, dem Ergosta-trienon D und dem u-Ergosta-trienon. Das Ergosta-trienon L) liefert mit Satrium und Athylalkohol das oben schon erwahnte Xrgo- sterin D, wahrend das u-Ergosta-trienon unter denselben Bedingungen in das u-Ergosta-trienol iibergeht.2)

Eine wierte Methode zur Uarstellung von Isomeren des Ergosterins besteht in der Ultraviolettbestrahlung. Von den hierbei entstehenden Umwandlungsprodukten sind bisher auBer dem Vitamin selbst zwei, das Suprasterin 1 und 11 in reinem Zustande dargestellt ~ o r d e n . ~ )

Eine fiinfte Methode, die in einigen Fallen die Dar- stellung von Isomeren des Ergosterins gestattet, ist die Behandlung gewisser Sterine 4, rnit einer alkoholischen NatriumLthylat16sung bei 200O. Eine secAste ist die Ab- spaltung von Wasser aus Ergosterin und die Wiederanlage- rnng an den gebildeten Kohlenwasserstoff. Diese Methode ist noch nicht griindlich durchgearbeitet worden.

Die nach diesen Methoden dargestellten isomeren Ergo- sterine lassen sich in verschiedene Gruppen einteilen.

l) SOC. 1929, 2253. e, A. 472, 185 (1929). 4, A. 483, 107 (1927). A. 488, 17 (1930).

Isonzerisierung des Ergosterins und seiner Derivate. 93

I n eine erste Gruppe setzen wir diejenigen ,J?xgosteriiie", die, wie das Ergosterin selbst, noch mit Digitonin unlosliche Additionsprodukte liefern. Alle bisher bekannten Vertreter dieser Gruppe enthalten noch drei Uoppelbindungen und gehen bei der katalytischen Perhydrierung in denselben gesattigten Alkohol, das Ergostanol C,,H,,O, iiber. I n dieser Gruppe finden sich auBer dem Ergosterin die Isoergosterine und ferner Ergosterin D, E und F; bei ihnen ist vor allem die Frage nach der Lage der Doppelbindungen zu klaren.

Zn einer zweiten Gruppe gehoren solche Isomere, die zwar selbst durch Digitonin nicht mehr gefallt werden, aber durch Erhitzen mit Natrium-athylat in einem mehr oder minder grofien Betrage in die fallbaren Isomeren der ersten Gruppe iibergehen. Diese Isomeren geben bei der kata- lytischen Perhydriernng einen gesattigten Alkohol, das Epi- ergostanol, das dem Ergostanol nahe verwandt ist.') Beide Alkohole werden durch Chromsaureanhydrid ZII demselben Ketoneu oxydiert nnd unterscheiden sich daher nur durch die sterische Lagerung von Wasserstoff und Hydroxyl an der sekundaren Alkoholgruppe voneinander; und derselbe Unterschied besteht demgemab zwischen den Isomeren der ersten und der zweiten Gruppe.

Zu einer dritten Gruppe von Isomeren des Ergosterins zahlen wir schlieBlich diejenigen, die weder durch Digitonin gefallt werden, noch durch Erhitzen mit Natriumathylat in fallbare Isomere iibergehen. Zu dieser Gruppe gehoren das durch Umlagerung mittels Nickel gewonnene u-Ergosterin und ferner alle Bestrahlungsprodukte des Ergosterins, auch die in reinem Zustande isolierten Suprasterine; sie enthalten noch drei Doppelbindungen und geben bei der katalytischen Perhydrierung weder Ergostanol noch Epi-ergostanol. Es hat sich bisher nicht entscheiden lassen, ob es sich bei der Bildung der Isomeren der dritten Gruppe am eine aterische oder um eine strukturelle Umlagerung innerhalb des Kohlen- stoffgeriistes handelt. Die Losung dieser Frage ware be-

I) Be indel , A. 466, 143 (1928); Reindel u. Detze l , A. 475, 83 (1929); Windaus, Auhagen, Bergmann u. Butte , A. 477, 277 (1930).

94 W i n d a u s , B i t h m a r , Murhe und Suckfu l l ,

sonders wichtig, weil sie endgiiltig beweisen wiirde, was eigentlich bei der Bestrahlung mit dem Ergosterin vor sich geht und weil sie vielleicht gestatten wiirde, die physio- logisch wichtigen Isomeren des Ergosterins auf rein chemi- schem Wege zu bereiten.

Ans den oben angefiihrten Griinden haben wir uns ent- schlossen, die Versuche iiber die Isomerisierung des Ergo- sterins wieder aufzunehmen und berichten zunlchst in der vorliegenden Arbeit uber das Verhalten einiger Ergosterin- derivate gegeniiber Chlorwasserstoff und Natriumathylat.

I. U b e r d i e E i n w i r k u n g von C h l o r w a s s e r s t o f f a u f E r g o s t e ri n d e ri v a t e.

Als wichtiges Ergebnis hat sich bei dieser Untersuchung ergeben, daD beim Behandeln mit Chlorwasserstoff die fall- baren Isomeren wieder nur fallbare und die mit Digitonin nichtfiillbaren Isomeren wieder nur nichtfallbare liefern. Ein Ubergang von einer Gruppe in einc andere findet also nicht statt; auch die Zahl der Doppelbindungen bleibt bei der Einwirkung von Chlorwasserstoff unverandert, und end- lich geben die durch SalzsLure entstandenen Isomeren stets dieselben Perhydroderivate wie ihre Muttersubstanzen. Die durch Chlor wasserstoff hervorgerufenen Veranderungen lassen also das Kohlenstoffskelett unverandert und beschranken sich auf eine F'erschiebung von Boppelhindungen, oder auf eine sterische Umlagerung einer in der Seitenkette befindlichen Boppelbindung von der cis- in die trans-laye oder umgekehrt.

1. Einwirkung von CMorioassersloff auf Brgosterylacetat. Mit dieser Reaktion haben sich auDer Re inde l , T a l t e r

und R a u c h l ) auch H e i l b r o n und Spr ing2) , Bil ls und seine MitarbeiteP), ferner H a u s s l e r und B rauchl i" ) nnd endlich de Boe5) beschaftigt. Leider widersprechen sich die Ergebnisse der einzelnen Forscher sehr weitgehend,

l) A. a. 0. 'J Journ. Biol. Chem. 84, 455 [1929]; 88, 1 und 342 (1930). 4, Helv. Chim. Acts 12, 187 (1929).

e, Soc. 1929, 2806.

Bull. Acad. roy. Med. Belg. Juni 1930.

lsomarisierung des Ergosterins und seiner Betivate. 95

und niir die Tatsache, da8 das Reaktionsprodukt nicht rnehr bei 270-280 m p wie das Ergosterin, sondern bei 248 mp sein Absorptionsmaximum besitzt, ist widerspruchslos an- erkannt.

Unsere Ergebnisse sind die folgenden: Verfahrt man genau nach der Vorschrift von Re in d el, W a1 t e r und R a u c h, bildet sich ein Gemisch von drei Isomeren, die wir als Acetate von Zrgosterin B,, B, und B, bezeichnen.

Aus dem am schwersten loslichen Anteil erhalt man ein Acetat B,, das aus Benzol-Alkohol in langen Nadeln krystallisiert, bei 142O schmilzt und fur [.]Ag die Drehung - 53,6O zeigt. Schmelzpunkt und Drehung andern sich auch bei liaufigem Umkrystallisieren nicht mehr. Der durch Verseifung gebildete AIRohoZ, das Ergosterin B, schmilzt bei 148O und zeigt fur [.ID die Drehung - 40,3O.

Es ist schwierig, aus den Mutterlaugen einen weiteren einheitlichen Stoff zu isolieren; man gelangt aber leichter zum Ziel, wenn man nach Abscheidung von Ergosterin B, das ubrigbleibende Isomerengemisch mi t Maleinsaureanhydrid behandelt und nach der kurzlich beschriebenen Methodel) den m i t Maleinsaureanhydrid in Reaktion getretenen Anteil quantitativ von dem unverandert gebliebenen Material ab- trennt. Bus dem letzteren konnten wir ein Ergosterin BB isolieren, das als freier Alkohol bei 126O schmolz und fur [.ID bei - 88,4O drehte, w2hrend das Acetat den Schmelz- punkt 100' und fur [.ID die Drehung - 80,4O zeigte. Von dem dritten Isomeren konnten wir zunachst nur das JIaZein- saureanhydrid-Additionsprodukt in reinem Zustand isolieren, doch ist es uns spater gelungen, auch das Ergosterin B3 selbs t darzus tellen.

In dem nach R e i n d e l dargestellten Isomerengemisch sind ungefiihr 45 Proc. Ergosterin B,, 45 Proc. Ergosterin B, und 10 Proc. Ergosterin B, vorhanden. Nach R e i n d e l s Vorschrift ist das Ergosterylacetat eine Stunde mit Chlor- wasserstofgas behandelt und die mit Chlorwasserstoff ge- sattigte Chloroformlosung auf dem Wasserbad eingedampft

I) B. 64, 850 (1931).

96

worden. T i r haben erkannt, da8 fur das schlieBliche Er- gebnis das Erwarmen des Reaktionsgemisches anf dem Wasserbad, also die Anwendung hoherer Temperutur von besonderer Bedeutung ist und dafl ferner die Zeitdauer des Einleitens von Chlorwasserstoff eine Rolle spielt.

Behandelt man Ergosterylacetat in chloroformischer Losung mit Chlorwasserstoff bei Oo, so reichert sich das Ergosteryl-B,-aeet a t unter den Reaktionsprodukten allm~hlich an; hiermit stimmt es uberein, dafl auch Er~osteryl-B,-ucefat und .Ergosteryl-B,-ucetat unler diesen Bedingunyen langsam in Ergoeteryl-B3-acelat iibergehen. Eriiitzt man dagegen die a n Ergosteryl-B,-acetat reiche CRlol.oform-~~i~orwassel.stoff-liisun~ zum Sieden, so geht das Ergosteryl-B,-ncetat wieder um'tgehead in 3ryosteryl-Bl und B2-acelat uber. Zur Darstellung eines an B, reichen Gemisches mufl man also entgegen der R e i n delschen Vorschrift die ChloroformlGsung, so Iange sie noch Chlorwasserstoff enthalt, nicht iiber 0' erwarmen; dann gelingt es verhaltnismaflig leicht, das Ergosteryl-B,- acetat zu isolieren. Das Ergosterin B, besitzt den Schmelz- punkt 135-136' und f ir [u], die Urehnng - 190°, wahrend das Acetat bei 132' schmilzt und fiir [u],, bei -182,9* dreht.

Die Ergosterine B,, B2 und B3 zeigen alle ungefahr dasselbe Absorptionsspektrum rnit einem Maximum bei 248 mp, B, und B, reagieren mit Maleinsaureanhydrid auch bei 100O nicht, wahrend B, Maleinsaureanhydrid sehr leiciit addiert. Von Natrinm und ~thyla lkohol werden die drei Sterine nicht hydriert. Beim Erhitzen mit Natriumathylat gehen sie in geringem Prozentsatz in Epiderivate uber, die sich in hohem Prozentsatz in die mit Digitonin fallbaren Ausgangssterine zuriickverwandeln lassen. 1)urch Erhitzen mit Nickel auf 200' wird Ergosterin B, nicht verandert, an den beiden andern Isomeren haben wir den Versuch noch nicht ausgefiihrt.

Nachdem wir, wie wir glauben, die drei mit Chlor- wasserstoff entstehenden Isomeren rein dargestellt haben, konnen wir auch die Arbeiten, die sich mit der Einwirkung von Sauren auf Ergosterin beschaftigt haben, besser be- nrteilen als friiher.

W i n d a u s , D i t h m a r , MurRe und Suckf i i l l ,

.lsomerisieniny des 3rgosterin.T und seiner Derivate. 97

H e i l b r o n und S p r i n g erkannten zuerst, daD das Iso- ergosterin yon Re inde l , W a l t e r und R a u c h ein Gemisch sei und beobachteten auch, dab ein in dem Gemisch vor- handenes ,,Isoergosterin" imstande war, Maleinslureanhydrid zu addieren. Dagegen waren die von ihnen isolierten Be- standteile des Gemisches, das a- und p-Isoergosterin durch- ans keine reinen Btoffe, wie sich aus den ihnen zugeschriebenen Drehwerten und Schmelzpunkten ergibt. Auch die Behaup- tung, dab die beiden Isomeren durch Natrium und Athyl- alkohol bzw. Amylalkohol zu Bihydroderivnten hydrierbar seien, beruht auf einem Versehen.

H t ius s l e r Und B r a u c h l i haben einmal zufallig statt des Reindelschen Isoergosterins ein fast reines Ergosterin B, in die Hand bekommen, ohne sich uber die Bildungsbedin- gungen dieses Isomeren klar zu werden. Was die Arbeit von d e B o e angeht, so entspricht der von ihr als Ergosterin B bezeichnete Stoff vielleicht im wesentlichen unserem Ergo- sterin B,, wenn auch diese Annahme wegen der fehlenden Angabe uber die optische Drehung nicht sicher ist. Das ,,Iso-ergosterin B" von de B oe konnen wir mit keinem unserer Stoffe identifizieren und halten es fur ein Gemisch. Mit Natrium und Amylalkohol erhalt d e Boe einige hki- den'uate, ohne die hierbei vorgehende Reaktion richtig zu deuten. Die Notiz von L e t t r 6 hat d e B o e noch nicht ge- kannt.') Was die Arbeiten von B i l l s angeht, so hat er beim Nacharbeiten der Vorschrift von Re inde l , W a l t e r und R a u c h wohl das Ergosterin B, in Handen gehabt und auch hlufig Mischungen von Ergosterin B,-B, unter- sucht. Indessen hat B i l l s die Isomerisierung meist auf anderem Wege vorgenommen wie Re inde l , so daO wir iiber die hierbei entstehenden Isomeren keine Aussage zu machen vermogen; wir wollen nur hervorheben, daO beim Erhitzen von Zrgosterin mit Benzoylchlorid und c h n a m o y k h ~ o ~ i d *) ein Gemisch entsteht, das noch ein weiteres Isomeres enthalten muS, denn das Rohprodukt der Umsetzung dreht schwiiclm neyatiu als Ergosterin oder eins der Ergosterine B,, 8 , ,.

') H. 189, 1 (1930). *) Nechr. Ges. Wiss. Giittingen 1928, 212. Annalen der Chemie 488. Band. 7

98 Windaus, Bi thmur, Murke uncl Suckfull,

Windaus und Rygh haben dieses Isomere, das noch nicht genau untersucht ist, vorliiufig als Brgosterin C bezeichnet.

2. EinwiTkung von Chlorwasserstoff auf Ergosteryl-D-acetat. Ergosterylacetat D scheint sich gegen Chlorwasserstoff

ganz so zu verhalten wie Ergosteryl-acetat selbst. Wird Ergosteryl-D-acetat bei 0 O mit Chlorwasserstoff

mehrere Stunden behandelt und vermeidet man, solange noch Chlorwasserstoff zugegen ist, jede Erwiirmung iiber 0 O,

so bekommt man ein bei - 1690 fur [a],, drehendes Roh- produkt, aus dem man leicht das ErgosteryZ-B,-acelat in reinem Zustand mit den richtigen physikalischen Konstanten isolieren kann. Dieses Ergosteryl-B,-acetat verbindet sich zu 100 Proc. mit Maleinsiiureanhydrid und geht beim Er- warmen mit Chloroform und Chlorwasserstoff grol3tenteils in Ergosteryl-B,- und B,-acetat iiber.

S c hl uD f o 1 ge r u nge n. Der Umstand, daa das EuJOSteTh B, leicht Maleinsiiure-

anhydrid addiert, spricht dafiir, daD es ein System kon- jugierter Doppelbindungen enthalt. Seine Hauptabsorption bei 248 mp ist allerdings gegeniiber derjenigen des Ergo- sterins um etwa 30 m p in das kurzwellige Gebiet verschoben, doch absorbieren viele Stoffe mitkonjugiertenUoppelbindungen im Bereich von etwa 250 mp.

Auch der Umstand, daD Ergosterin B, von Natrium und Athylalkohol nicht hydriert wird, ist noch kein Beweis gegen das Vorhandensein von konjugierten Doppelbindungen, da es von der Regel, daD Stoffe mit konjugierten Doppel- bindungen durch Natrium nnd Alkohol hydrierbar seien, Aus- nahmen gibt.’)

Wegen des gleichartigen Spektrums glaube ich, daD anch Ergosterin B, und B, konjugierte Doppelbindungen enthalten, obwohl sie kein Maleinshreanhydrid addieren. Aus Betrachtungen am Model1 erkennt man namlich, da8 konjugierte Doppelbindungen, wenn sie sich auf zwei kon-

l) B. 41, 1752 (1908); 43, 3116 (1910).

lsornerisieriinq des 3rgosterins uitd seiner Berivate. 99

densierte hydroaromatische Ringsysteme verteilen, vermutlich nicht zur Addition von Maleinsaureanhydrid befahigt sein werden.

Beschreibung der Versuche. D a r s t e l l u n g d e s ,,Is o - e r g o s t e r i n s (‘ n a c h Re inde l , W a l t e r u n d Rauch .

20 g Ergosterylacetat wurden in 400 ccm trocknem Chloroform gelost; in die auf O o gekiihlte Losung wurde wahrend einer Stunde trockner Chlorwasserstoff eingeleitet; dann wurde die violett gefarbte Losung auf dem Wasserbad einqedampfl und der Ruckstand aus 50 ccm Essigester und 200 ccm Methylalkohol umkrystallisiert. Als Fraktion I fielen 12 g Material vom Schmelzp. 132-135O aus. Die Untersuchung der Mutterlaugen der Fraktion I wird weiter unten beschrieben. Fraktion I wurde in 80 ccm Benzol und 160ccm Alkohol geltist und uber Nacht bei O o stehen ge- lassen. Es fie1 dabei eine Substanz in langen Nadeln aus, die sich als fast reines Eryosteryl B,-Acetat erwies. Nach mehrmaligem Umkrystallisieren zeigt es den Schmelzp. 142 O

und fur [a]’S die Drehung - 53,6O in Chloroform. 23,l mg Subst.: 2 ccrn Chloroform, 1 = 1 dm.

a = - 0,62O.

Es ist in Chloroform, Benzol und Ather leicht loslich, schwerer in Methyl- und Athylalkohol.

Durch einstundiges Erwarmen mit methylalkoholischer Kalilauge wurde das Acetat verseift und der gebildete AlkohoE, das Eryosterin Bl, aus Ather-Methylalkohol um- krystallisiert ; es bildet zu Biischeln vereinigte Nadeln vom Schmelzp. 148’.

14,9 mg Subst.: 2 ccrn Chloroform, 1 = 1 dm, a = - 0,309 [ a ] g = - 40,3O.

Der Alkohol zeigt etwa dieselben Lljslichkeitsverhaltnisse wie das Acetat, mit Digitonin gibt e r ein in Alkohol fast unlosliches Additionsprodukt, das Absorptionsspektrum hat ein Maximum bei 248 mp mit einem Absorptionskoeffizienten von 2,l fur die 0,02-proc. Losung in Ather. Im Hochvakuum

7.

100 Windaus, Ditlimar, Murke und S u c k f u l l ,

llDt sich das Ergosterin B, unzersetzt destillieren. Mit Maleinsaureanhydrid liefert es auch bei 100 O keine Addi- tionsverbindung. Von feinverteiltem Nickel wird es selbst bei 200' nicht verandert; durch Natrium and Athylalkohol wird es nicht hydriert. Beim Behandeln rnit Nat.rium und Amylalkohol oder rnit Natriumathylat bei 180° entsteht eine kleine Menge Epiderivat, wllhrend die Hauptmenge unvergndert bleibt. Uber diese Isomerisierung wird i m zweiten Teil der Arbeit berichtet.

Mutterlaugen van Fraktion I . Zur weiteren Zerlegung des Gemisches haben wir das

Maleinsgureanhydridverfahren in der Form angewendet, wie es nenlich in den Berichtenl) beschrieben worden ist. Wir liaben das Rohprodukt in etwa 15 Teilen Benzol gelbst und die benzolische Lbsung 7 Stunden rnit uberschussigem Malein- saureanhydrid zum Sieden erhitzt. Nach der Aufarbeitnng stellten wir fest, daD 15 Proc. des Materials sich rnit Malein- saureanhydrid verbunden hatten, wahrend 85 Proc. als neu- traler Anteil zuruckgewonnen wurden. Dieser Anteil wurde acetyliert und gab ein Acetat, das zunachst bei 83-89" schmolz und durch hlufiges Umkrystallisieren den Schmdz- punkt looe erreichte; die Drehung betrug fur [oe]3 = - 80,49

Der entsprechende A41kohol, das Ergosterin B,, schmolz 11,2 mg Subst.: 2 ccm Chloroform, I = 1 dm, a = - 0,45O.

bei 126O und gab eine Drehung von - 88,4O fur 10,2 mg Subst.: 2 ccm Chloroform, 1 = 1 dm.

a = - 0,45O.

Sein Spektrum entsprach dem des Ergosterin B, rnit dem Maximum bei 248 mp. Es krystallisierte aus Methanol in kleinen, zu Buscheln vereinigten Nadeln und zeigte eine etwas grbSere Loslichkeit als sein Isomeres. Mit Digitonin gab es ein sehr schwer losliches Additionsprodukt. Mit Natrium und Alkohol wurde es nicht hydriert, rnit Malein- saureanhydrid gab es keine Additionsverbindung.

Das Maleinsaureanhydrid-Additionsprodukt des dritten

a. a. 0.

Isomerisieriing des Ergosterins und seiner Derivatc. 101

Isomeren, des Ergosteryl B,-Acetats, krystallisierte aus Essig- siiure in Nadeln vom Schmelzp. 207 O. Die Analysenzahlen zeigen, da0 der Stoff die erwartete Zusammensetzung besitzt.

3,128, 3,269 mg Subet: 8,670, 9,070 mg CO,, 2,535, 2,665 mg H,O. C,,H,,O, Ber. C 75,81 H 488

Gef. ,, 75,71, 75,61 ,, 9,08, 9,12.

Einwirkung von Chlorwasserstoff auf Brgosteryl-acetat und Ergo- steryl B,- und B,-Acetat unter wechselnden Bedingunyen.

1. In eine Losung von 1 g Ergosteryl-acetat in 20 ccm Chloroform wurde 4 Stnnden lang trockner Chlorwasserstoff eingeleitet. Die rnit Chlorwasserstoff gesattigte Losung wurde auf dem Wasserbad eingedampft und der Ruckstand auf sein Verhalten zu Maleinsaureanhydrid untersucht: 17,2 Proc. des Materials verbanden sich rnit Maleinsaure- anhydrid.

2. Der Versuch wurde ebenso angestellt, nur wurde die rnit Chlorwasserstoff gesattigte Chloroformlosung nicht sofort auf dem Wasserbad eingedampft, sondern zunachst rnit kalter Natriumbicarbonatlosung ausgeschiittelt. Der Riickstand, der auffallend stark negativ drehte, wurde auf sein Verhalten zu Maleinsaureanhydrid untersucht: 68,l Proc. des Materials verbanden sich rnit Maleinsaureanhydrid.

3. Der Versuch wurde wiederholt ; nur ~ u r d e 5 ~ / , Stunden trockner Chlorwasserstoff eingeleitet. Aus der rnit Natrium- bicarbonat behandelten Losung wurde ein Rohprodukt er- halten, das fur [aID die Drehung - 132,4O zeigte. Dieses Acetat wurde noch eine weitere Stunde rnit Chlorwasser- stoff behandelt und drehte nunmehr fur [.ID bei - 151O.

4. Auch das Ergosteryl B,- und B,-acetat wurden in chloroformischer Losung 1 Stunde rnit trocknem Chlor- wasserstoff behandelt und die Chloroformlosung, ohne sie zu erwarmen, rnit Natriumbicarbonat von der Salzsaure befreit. Die aus den Chloroformlosungen erhaltenen Acetate drehten fur [aID bei - 150° und - 128,4O und gaben bei weiterem UmkrystaUisieren aus Ather-Methylalkohol noch starker negativ drehende Acetate.

102 W i n d a u s , B i t h m a r , MurRc uud Suckfu l l ,

5. Endlich wurde gezeigt, dal3 das stark negativ drehende Acetat wieder in die schwacher negativ drehenden Acetate zuruckverwandelt wurde, wenn seine mit Chlorwasserstoff ge- sattigte Losung auf dem Wasserbad erhitzt wurde: 100 mg Acetat von der Urehung [a], =- 177,2O wurden in 6 ccm Chloroform gelost ; in diese Losung wurde bei 0 O wahrend einer Stunde trockner Chlorwasserstoff eingeleitet; darauf wurde die Losung zum Sieden erhitzt, bis kein Chlorwasserstoff mehr entwich und dann eingedampft. Der Ruckstand zeigte fur [aID nur noch die Drehung - 88,4O.

Auf Grund dieser Vorversuche gelang es nunmehr ohne Schwierigheiten, auch das Ergosterin B3 rein darzustellen.

Eine Losung von 2 g Ergosterylacetat in 40 ccm Chloroform wurde bei O o 4 Stunden rnit trocknem Chlor- wasserstoff behandelt. Die Lbsung wurde rnit kalter Natrium- bicarbonatlosung durchgeschut telt und dann eingedampft. Das Rohprodukt schmolz bei 119-122O und zeigte fur [a33 die Drehung - 144,2O. Das Acetat wurde mehrmals, zunachst &us Ather-Methylalkohol und dann aus Eisessig umkrystallisiert, bis Drehung und Schmelzpunkt konstant waren. Es bildete dann derbe Nadeln, die bei 132 O schmolzen und fur [u]V die Drehung - 182,9O zeigten.

11,7 mg Subst.: 2 ccm Chloroform, 1 = 1 dm. a = - 1,07 O.

Beim Erwarmen rnit Maleinsaureanhydrid verband es sich zu 100 Proc. mit diesem.

Der beim Verseifen des Acetats rnit methylalkoholischer Kalilauge erhaltene Alkohol, das Ergosterin B3, krystallisierte in langen, biegsamen Nadeln, schmolz bei 136O und zeigte fur [a]Y die Drehung - 190°, (10 mg Subst., 2 ccm Chloro- form, I = 1 dm, a = - 0,95O). Er besaD ein Spektrum, das dernjenigen des ErgosterinsB,und B, auDerst ahnlich war und wurde ebenfalls von Natrium und Athylalkohol nicht hydriert.

11. Uber die E i n w i r k u n g von Na t r iumt l thy la t auf E r g o s t e r in d e riv a t e.

Beim Erhitzen eines Sterins mit Natriumathylat auf etwa 200° konnen sich eine Anzahl verschiedener Reaktionen abspielen.

Jsomerisierung des Ergosterins und seiner Derivnte. 103

1. Es erfolgt eine mehr oder minder weitgehende Um- lagerung an der sekundaren Alkoholgruppe, und es bildet sich ein Gleichgewicht zwischen zwei Alkoholen, die sich nur dnrch die Anordnung von Wasserstoff und Hydroxyl an der sekundaren Alkoholgruppe unterscheiden und daher beide dasselbe Keton liefern. Die neugebildeten Alkohole bezeichnen wir als Epi-dmiuate ihrer Muttersubstanzen; sie sind dadurch ausgezeichnet, da8 sie im Gegensatz zu diesen nicht von Digitonin ausgefallt werden. Diese Nichtfallbar- keit durch Digitonin teilen die Epiderivate m i t den Bestrah- lnngsprodukten des Ergosterins, und wir haben darum friiher an die Moglichkeit gedacht, da8 die Bestrahlungs- produkte zu den Epiderivaten gehoren. Dies ist aber nicht der Fall; denn wahrend samtliche Epiderivate beim Erhitzen rnit Natriumathylat in einem meht oder minder hohen Prozent- satz in die fallbaren Isomeren zuriickverwandelt werden, ist dies bei den Bestrahlungsprodukten durchaus nicht der Pall.

2. AuBer der Epimerisierung an der sekundaren Alkohol- gruppe kann beim Erhitzen mit Natriumathylat auch die Hydrierung an einer Doppelbindung erfolgen. Wtthrschein- lich ist hierbei das durch Umlagerung gebildete Dihydro- keton das Zwischenprodukt, das nachher durch Natrium- athylat hydriert wird.

3. Endlich kann gleichzeitig mit der Epimerisierung und Hydrierung auch noch eine sterische Umlagerung im Xohlenstoffskelett des Sterins vonstatten gehen. Das ist in geringem MaOe beim Cholesterin der Fall.

In die erste Gruppe, bei welcher nur eine Epimerisierung an der sekundaren Alkoholgruppe erfolgt, gehoren Dihydro- ergosterin I, Ergosterin B, und B, und Ergosterin D.’)

In die zweite Gruppe, in welcher aul3erdem Hydrierung stattfindet, gehbren Ergosterin, Dehydro-ergosterin und auch Cholesterin. Es ist sehr bemerkenswert, daD das einfach ungesattigte Cholesterin beim Erhitzen mit Natriumathylat leicht hydriert wird, wahrend das doppelt ungesattigte Di- hydro-ergosterin und die dreifach ungesattigten Ergosterine B

A. 477, 276 (1930).

104 Wz'ndaus, D i t h m a r , N u r k e und Suckf i i l l ,

nicht hydriert werden. Augenscheinlich hangt der Eintritt der Reaktion rnit der gegenseitigen Lage von Doppelbindung und sekundarer Alkoholgruppe zusammen.

1. Binwirkung von Natriumiithylut uuf Ergosterin B,. In einem Bombenrohr wurden 0,5 g Natrium in 10 ccm

absol. Alkohol gelijst; zu der Losung wurde 1 g Ergosterin B, gegeben, dann wurde das Rohr rnit Stickstoff gefullt und 7 Stunden auf 200° erhitet. Nach dem dffnen des Rohres wurde der lnhalt rnit Wasser und Ather behandelt; der Ruckstand der atherischen Losung schmolz unscharf von 140-160 O. Das Gemisch wurde nach der Digitonin-Methode getrennt. Fallbar waren 90 Proc.; der aus dem Digitonid mit siedendem Xylol extrahierte Alkohol erwies sich als unverandertes Ergosterin B,; der nicht fallbare Alkohol, der als Epi-ergosterin B, bezeichuet werden soll, machte uur 10 Proc. des Gesamtmaterials aus; er schmolz nach mehrfachem Umkrystallisieren bei 182-183 O; er gab ein Absorptionsspektrum rnit einem Maximum bei 248 mp. Beim Erhitzen rnit Natriumathylat auf 200 O lieferte das Epi-ergosterin B, in einer Ausbeute von etwa 90 Proe. einen rnit Digitonin fallbaren Alkohol zuruck, der sich als das Ergosterin B, erwies.

Epi-ergosterin B, la& sich in ein schon krystallisiertes Acetylderiuut uberfiihren, das nacli deu Umkrystallisieren aus Methylalkohol bei 136O schmilzt. 3,336, 3,158 mg Subst.: 10,030, 9,500 mg CO,, 3,220, 3,015 mg H,O.

C2@H,,O, Ber. C 82,Ol H 10,45 Gef. ,, 82,00, 82,04 ,, 10,80, 10,RS.

Heim Verseifen des Acetats wurde der Alkohol vom Schrnelzp. 182-183 O xuruckgebildet.

2. EinzuirRung von Nati-iumathylat auf h'rgosteiin BB. Die Einwirkung wurde genau so vorgenommen wie in1

Falle des Ergosterins B,. Der aus dem Digitonid extrahierte Anteil war unverandertes Ergosterin B, vom Schmelzp. 1264 Der unfallbare Anteil schmolz nach mehrfachem Umkrystal-

Isomerisierung des Ergosterins und seiner Berivate. 105

lisieren bei 163O, er zeigte ein Spektrum rnit einem Maxi- mum bei 248 mp.

Sein Acetylderivut schmolz nach dem Umkrystallisieren aus Methylalkohol bei 127 O nnd krystallisierte in zu Buscheln vereinigten Nadeln.

C,,H,,O Ber. C 82,Ol H 10,45 Gef. C 82,21 H 10,41.

Schmelzp. 163q das Epi-ergosterin Be, zuriickgebildet.

4,731 mg Subet.: 14,260 CO,, 4,40 mg H,O.

Beim Verseifen des Acetats wurde der Alkohol vom

3. Zinwirkimg von Nutriumathylat auf Ergosterin D. 0,8 g Ergosierin D warden mit einer mittels 0,5 g Natrium

und 10 ccm absol. Alkohol bereiteten Natriumathylatlosnng 7 Stunden im Bombenrohr auf 215O erhitzt. Das Reaktions- gemisch wurde rnit Wasser versetzt, das Ganze rnit Ather extrahiert und der Atherextrakt eingedampft. Der Riick- stand, der unveriindertes Ergosterin D neben seinem Epi- derivat enthielt, wurde rnit einer alkoholischen Digitonin- losung versetzt. Das Digitonid war dasjenige des Ergo- sterins D und liefert dieseR Sterin bei der Extraktion mit Xylol. Das nicht fallbare Isomere wurde aus der alko- holischen Losung extrahiert, es krystallisierte aus &her- Methylalkohol in schonen seidenglanzenden Nadeln und schmolz bei 203--2044 EY loste sich leicht in Chloroform und Ather, schwerer in Methylalkohol. Ausbeute 20 Proc.

4,973 mg Subst.: 15,450 mg CO,, 4,92 mg H,O. Cs,H4& Ber. C 84,73 H 11,lO Gef. C 84,74 H 11,07.

0,0163 g Subst., 2 ccm Chloroform, 1 = 1 dm, (I = + 0,290, 0,299 [a&' = + 36,2O.

Uas in der iiblichen Weise bereitete Aeetylderivat schmolz nach dem Umkrystallisieren aus Methylalkohol bei 150O. Es krystallisierte in kleinen Blittchen nnd lieferte bei der Verseifung den unveranderten Alkohol znriick.

4,857 mg Subst.: 14,635 mg CO,, 4,54 mg Q O .

0,0115 g Subat.: 2 cctn Chloroform, I = 1 dm, a = + 0,270, 0,27@. C,,H,,O, Ber. C 82,Ol H 1C,45 Gef. C 82,18 H 10,46

[ a ] ~ = + 40,69

106 WTindaus, Di thmar , Nurhe und S u c h f u l l ,

Zwischen dem Absorptionsspektrum des Ergosterins D und seines Epi-derivates ist kein wesentlicher Unterschied vorhanden.

4. Uber die Einwirhung von Natriumathylat auf Dihydro- ergosterin I.

3,2 g Dihydro-ergosterin (vom Schmelzp. 177 O und [m]b9 =- 18,5') wnrden 48 Stunden auf 220° erhitzt und das Reaktionsprodukt mittels Digitonin in einen fallbaren und einen nichtfallbaren Anteil zerlegt. Das Digitonid des fallbaren Anteils wnrde mit Xylol extrahiert und erwies sich als unverandertes Dihydro-ergo8terin I. Der unfallbare Anteil wog 0,70 g; er wurde in das Acetylderivat ver- wandelt und letzteres aus Benzol-Athylalkohol oder aus Aceton umkrystallisiert. Es schmolz bei 156 O.

34,9 mg Subst.: 2 ccm Chloroform, 2 = 1 dm, a = 0,079

3,184, 3,083 mg Subst.: 9,522, 9,192 mg Go,, 3,163, 3,025 mg H,O. [ab = + 4,Ol".

C*OH460, Ber. C 81,62 H 10,88 Gef. ,, 81,56, 81,37 ,, 11,11, 10,98.

Das aus dem Acetylderivat durch Verseifung gewon- nene Bpi-dihydro-ergosterin I schmolz bei 215-216 O.

3,071, 3,245 mg Subat.: 9,486, 10,015 mg COI, 3,143, 3,338 mg H,O. C27H,*O Ber. C 84,30 H 11,54

41,O mg Subst.: 2 ccm Chloroform, 1 = 1 dm, a = 0,09O. Gef. ,, 84,23, 84,17 ,, 10,45, 11,51.

[ U ] D = - 4,4'.

Um mit Sicherheit nachzuweisen, dal3 sich das Epi- dihydro-ergosterin I vom Dihydro-ergosterin I ableite, wurden 0,40 g desselben 17 Stunden mit Natriumathylat auf 190° erhitzt; das Reaktionsprodukt wurde wieder mi t Digitonin in. einen unfallbaren und einen fallbaren Anteil zerlegt; letzterer wog nach der Extraktion aus dem Digitonid 0,280 g und erwies sich nach dem Umkrystallisieren als Uihydro-ergosterin I, das dnrch seinen Schmelzp. 177 O und dnrch denjenigen seines Acetats 1 8 1 O sowie durch Misch- schmelzpunkt identifiziert wnrde. Der nicht fallbare Anteil war unverandertes Epi-dihydro-ergosterin I.

Isornei.isicrung des Ergosterins und seiner Derirate. 107

Einwirkung uon Mercuriacetat auf Epi-dihydro-ergosterin 1. Es sei nur kurz mitgeteilt, daO wir das Epi-dihydro-

ergosterin I rnit Mercuriacetat dehydriert haben. Es ent- stehen dabei zwei Stoffe, 1. das Epi-ergosterin 1). Es schmolz bei 204O und zeigte fur [ o c ] ~ ' den Wert + 30,3O. Sein Acetylderivat schmolz bei 152-153 O und besaD fur [n]b6 den Wert + 48,1°.

2,438 mg Subst.: 10,325 mg CO,, 3,28 mg H90. C,,H,,O, Ber. C 82,Ol H 10,45 Gef. C 81,92 H 10,68

Neben diesem Stoff entstand ein leichter loslicher Stoff vom Schmelzp. 160-161°, der fur [a],= - 34,4O drehte und ein Acetat vom Sehmelzp. 123-124O lieferte. Dieses Acetat gab rnit Maleinsaureanhydrid im Gegensatz zum Ergosterin D und seinem Epiderivat ein Additionsprodukt, das bei 212O schmolz und fur [0clD= - 56,7O drehte. Diese Stoffe sollen spiiter untersucht werden.

5. Einwirkung uon NatriumathyZat auf Ergosterin.1) 3 g Ergosterin wurden rnit einer Natriumathylatlosung

aus 0,7 g Natrium und 15 ccm absolutem Alkohol im eva- kuierten Bombenrohr 10 Stunden auf 180° erhitzt. Die Reaktionsmasse wurde rnit Wasser verdiinnt , das Ganze rnit Ather extrahiert, der Ather rnit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Riickstand wurde in 90-proc. siedendem Alkohol gelbst und rnit eiuer alkoho- lischen Digitoninlosung in geringen UberschuB versetzt. Das ausgefallte Digitonid wurde abfiltriert , ausgewaschen, getrocknet und rnit siedendem Xylol 20 Stunden extrahiert; dann wurde der Xylolextrakt im Vakuum eingedampft and der Ruckstand aus Essigester-Methanol umkrystallisiert. Das Rohprodukt schmolz bei 154O, zeigte fur [a]b6 den Wert -222,lO und enthielt noch etwas Ergosterin. Nun- mehr wurde die Behandlung rnit NatriumLthylat wiederholt, der Schmelzpunkt stieg auf 160° und die Drehung sank auf - 17 O fur [a],,. Die Farbenreaktion rnit Antimonchlorid

I) Vgl. auch A. 477, 276 (1930).

108 Windaus, Bi t l tmar, Hurhe und Suchfu l l ,

war negativ, wodurch bewiesen wird, daO nennenswerte Mengen Ergosterin nicht melir vorhanden waren.

Ans dem so gewonnenen Alkohol wurde das Acetyl- derivat bereitet, es krystallisierte aus Essigester in diinnen Blattchen, die bei 164-165O schmolzen.

26,O m g Subat., 2 ccm Chloroform, I = 1 dm. a = - 0,2 1 0.

[a];' = - 16,2O. 3,542 mg Subat.: 10,513 mg CO,, 3,56 mg H,O.

C,,H,,O, Bar. C 81,62 H 10,88 Gef. C 81,56 H 11,25. Der aus dem Acetat dnrch Verseifen zuriickgewonnene

AIRohoZ, dus Dihydro-ergosterin II, schmolz nunmehr bei 163 O

und bildete derbe Nadeln. 21,66 mg Subst., 2 ccm Chloroform, 2 = 1 dm , a = - 0,1go,

[fX]h@ = - 8,80.

Im Ultraviolettspektrum zeigte sich ab 265 mp eine schwache Allgemeinabsorption.

Der nicht mi t Digitonin reagierende Anteil enthalt das Ep*-dihydro-ergosterin II; die Menge betrug etwa 10 Proc. Nach 2maligem Umkrystallisieren aus Ather-Methylalkohol lag der Schmelzpunkt bei 205-208O und die Drehung fiir [.ID betrng -21,29

Znr weiteren Reinigung wurde das Acetyldtriuat be- reitet, das nach dem Umkrystallisieren aus Benzol-Athyl- alkohol bei 165-166O schmolz.

3,224 mg Subst.: 9,643 mg CO,, 3,225 mg H,O. C,,H,,O, Ber. C 81,62 H 10,88 Gef. C 81,57 H 11,lO.

46,4 m g Subst., 2 ccm Chloroform, I = 1 dm, n = + 0,09O, [aJbE =I t- 3,88 O.

Das Acetat wurde wieder verseift; der erhaltene $Ikohol schmolz nun bei 216'.

3,250, 3,237 m g Subst.: 10,052, 10,003 mg CO,, 3,940, 3,310 mgH,O. C,,H440 Ber. C 84,30 H 11,54

Gcf. ,, 84,35, 84,25 ,, 11,50, 11,44.

45,l mg Subat.) 2 ccm Chloroform, I = 1 dm, a = - 0,110, [a]bo =I - 4,92 O.

6. Einwirkung von Natriumathylat auf Bihydro-ergosterin IL 2 g Dihydro-ergosterin I1 wurden 8 Stnnden mi t Natrium-

iithylat-Li3sung auf 185 O erhitzt. Aus dem Reaktionsprodukt

Isomerisierung des Eryosteiinr un3 seher Derivate. 109

IieSen sich uber das Digitonid 1,75 g unverandertes Dihydro- ergosterin 11 und 0,20 g Epi-dihydro-ergosterin I1 gewinnen.') Das Epi- dihydro - ergosterin hatte genau dieselben Eigen- schaften wie das aus dem Ergosterin gewonnene. Der Schmelz- punkt des Acetylderivats lag bei 156O, [GI? = + 4,19O. Uer freie Alkohol schmolz bei 216O und gab fur [4b' den Wert -4,56 9 Die Ultraviolettabsorptionskurve war dieselbe wie fur das Dihydro-ergosterin 11.

Wird Epi- dihydro - ergosterin 11 mit NatriumLthylat 16 Stunden auf 200° erhitzt, lagert es sich zu etwa 60 Proc. wieder in Dihydro-ergosterin Il urn. Dieses Uihydro-ergo- sterin I1 schmolz bei 164' und zeigte fiir [@]b6 den Wert -8,5O; das Acetat schmolz bei 1564

Auf Grund dieser Tatsachen kann man mit Bestimmt- heit sagen, daS das Dihydro-ergosterin II, das aus Ergosterin gewonnen worden ist, kein reines Dihydro-ergosterin I dar- stellt. Trotz der vielen Versuche halten wir es noch fur ungewiB, ob es sich bei dem Dihydro-ergosterin I1 um ein chemisches Individunm handelt oder aber um ein Dihydro- ergosterin I, das rnit einer nicht entfernbaren, starker drehenden Verunreinigung vermischt ist.

7 . EiewirRung von Natriumiitly2at auf Behydro-ergosterin. 3 g Dehydro-ergosterin wurden mit Natriumathylat in

der fruher beschriebenen Weise 8 Stnnden auf 185O erhitzt. Das Rohprodukt wurde, wie ublich, rnit Uigitonin in einen ftillbaren und i n einen nicht ftillbaren Anteil zerlegt.

Der fAllbare Anteil bildete nach dem Umkrystallisieren aus Essigester-Methanol flache langgestreckte Nadeln, die bei 170° schmolzen und fur [@ID den Wert +17,8O zeigten. Das Ultraviolettspektrum war dasjenige des Ergosterins 1). Das Acetylderivat schmolz bei 173-174O und zeigte fur [.ID die Drehung +20,7O.

Wir wollen die sehr ausfuhrlich untersuchten physi- kalischen Daten nicht im einzelnen angeben und nur her-

') Erhitzt man auf 200° 20 Stunden, so steigt die Auabeute an Epiderivat auf das Doppelte.

110 W i n d a u s u. Mitard . , Isomerisierung des Ergosterins USUL

vorheben, daO es sich in dem Stoff urn Ergosterin D handelt, das mit etwas Dihydro-ergosterin I oder vielleicht I1 ver- nnreinigt ist. Eine vollsthdige Trennung ist nicht gelungen.

Auch der mi t Digitonin nicht fiillbare Anteil ist nicht einheitlich; in kleiner Menge wurde einmal ein Kohlen- wasserstoff vom Schmelzp. 121O und der Drehung -110,SO fur [.ID erhalten. Das Hauptprodukt war aber Epi-ergo- stesin B. Es schmolz bei 202O, zeigte fiir [.ID die Drehung +33,46O und gab ein Spektrum, das mit demjenigen des Epi-ergosterins D iibereinstimmte.

3,125 mg Subst.: 9,726 mg GO,, 3,122 mg H,O. C,H,,O Ber. C 84,74 H 11,07 Clef. C 84,87 H 11,18.

29,3 mg Subst., 2 ccm Chloroform, 2 = 1 dm, a = + 0,49O, [alp = + 33,45O.

Der I. G. Farbenindustrie-Aktieogesellschaft, Werk Elberfeld, und der Firma E.Merck, Darmstadt danken wir fur das uns zur Ver- fdgung gestellte Ergosterin.

Der Nolgemeinschaft d t r Dezctschen Wisselzschaft sprechen wir fiir die Unterstatzung unserer Arbeiten unsern Dank Bus.

(Abgeschlossen am 3. Juli 1931.)