- 1. Methoden der Gentechnologie im berblick:Inhaltsverzeichnis
1.Stempeltechnik
(Replica-Plating).................................................................................2
2.Genom-Bibliotheken...................................................................................................3
3.cDNA-Bibliotheken......................................................................................................4
4.Auffinden von DNA-Fragmenten durch
Gelelektrophorese.............................................6
5.Sequenzieren von DNA mit der didesoxy-Methode nach
Sanger....................................7
6.In-situ-Hybridisierung.................................................................................................9
7.Blot-Techniken.........................................................................................................10
8.ELISA......................................................................................................................11
9.Vervielfltigung von DNA-Sequenzen durch
PCR.........................................................12
10.Synthese knstlicher
DNA(-Sonden).........................................................................13
11.Genetischer
Fingerabdruck......................................................................................14
12.Gendiagnostik........................................................................................................15
13.Gentherapie...........................................................................................................16
14.Grne
Gentechnik...................................................................................................18
2. 1. Stempeltechnik (Replica-Plating) Die Stempeltechnik
(replica plating) dient dazu, die Mangelmutanten eines
Bakterienstammes zu identifizieren und anschlieend isolieren zu
knnen. Auerdem kann man so auch transfizierte Bakterien isolieren.
Will man die Mangelmutanten einer Bakterienkolonie isolieren, so
gibt man zu einem Flssigmedium mit Bakterien ein Mutagen hinzu, wie
zum Beispiel Histidin. Nun gibt man dieses Flssigmedium auf einen
Nhrboden, auf die replica plate und lsst die Kolonien dort wachsen.
Mit einem Samtstempel kopiert man die master plate auf die replica
plate, auf der kein Histidin vorhanden ist. Die Kolonien, die auf
der master plate, jedoch nicht auf der replica plate wachsen sind
Mangelmutanten. Bei der Selektion von transfizierten Bakterien
nutzt man das gleiche Verfahren. Man hat ein Flssigmedium mit
transfizierten Bakterien, ohne Plasmid und Bakterien mit Plasmid.
Dieses gibt man anschlieend auf die master plate mit Tetracyclin,
auf welcher die Bakterien ohne Plasmid nicht wachsen. Nun bertrgt
man die Kolonien mit Hilfe der Stempeltechnik auf ein Medium mit
Ampicilin, die replica plate. Im Rckschluverfahren kann man somit
die transfizierten Bakterien herausfinden. Denn an den Stellen, an
denen zuvor auf der master plate Kolonien gewachsen sind, wachsen
nun auf Grund der fehlenden Amp- Resistenz, auf der replica plate
nicht mehr. 3. 2. Genom-Bibliotheken Genbibliotheken
Genbibliotheken sind ein unverzichtbares Werkzeug in der
Molekularbiologie. Firmen sind entstanden, die eine Vielzahl von
speziellen Genbibliotheken anbieten von Mikroorganismen, Pflanzen,
Tiere, also von Organismen und bestimmten Organen (z.B. Leber,
Gehirn). Somit entfllt die oftmals schwierige Selbstherstellung.
Genbibliotheken lassen sich auf zwei verschiedenen Arten herstellen
(siehe auch Genombibliothek und cDNA-Bibliothek). Genom-Bibliothek
Um eine Genom-Bibliothek zu erhalten, muss man zunchst chromosomale
DNA aus dem Gewebe z.B. eines Organes isolieren. Die DNA wird dann
mit einem Restriktionsenzym (ECoRI) zerlegt. Die daraus
resultierenden Fragmente reprsentieren das gesamte Genom, also mit
Exons und Introns. Da die Fragmente beim bertragen in Bakterien zu
schnell von diesen abgebaut und somit verloren gehen wrden, mssen
die DNA-Fragmente zuerst in Vektoren eingebaut werden. Die DNA
eines Vektors, z.B. eines Plasmids, wird ebenfalls mit
Restriktionsendonuclease 'verdaut' (wiederum ECoRI): Es kommt zu
einer Extraktion und einer Spaltung der DNA. Jetzt passen die
DNA-Fragmente in die DNA des Vektors und durch DNA-Ligase wird das
Zucker-Phosphat-Rckgrat wieder kovalent geschlossen. Diese
rekombinanten Vektoren werden nun in die Wirtszelle, Bakterien,
eingeschleust (Transformation). Durch Selektion der transfizierten
Bakterien werden die DNA-Fragmente in den rekombinaten Vektoren in
einzelnen Komponente aufgeteilt: Die Bakterien einer Kolonie
beinhalten jeweils ein bestimmtes Genombruchstck, wie ein Buchtitel
einer Bibliothek kann man 'nachschlagen'. Nachteil dieser Methode
ist, dass die Bibliothek smtliche nichtcodierende DNA-Abschnitte
wie die Introns des Genoms oder repetitive Sequenzen beinhaltet.
Somit ist es schwierig, ein bestimmtes Gen zu finden, hnlich wie
die berhmte Nadel im Heuhaufen. 4. 3. cDNA-Bibliotheken Um eine
cDNA-Bibliothek zu erhalten, muss man zunchst die mRNA aus einem
Organ oder bestimmten Gewebe isolieren. Dieser Vorgang ist
technisch wesentlich anspruchsvoller als die Gewinnung genomischer
DNA. Die so gewonnene mRNA kannjedochnicht sofort mit
Restriktionsenzymen verdaut werden. Ein Primer wird mit dem
Poly-A'-Schwanz hybridisiert und stellt ein freies 3'-OH-Ende
bereit. Die reverse Transkriptase, ein Enzym, welches in Retroviren
wie z.B. HIV enthalten ist, benutzt dieses Ende, um die Synthese
einer einzelstrngigen DNA anhand dieser mRNA zu katalysieren.
Charakteristisch fr die reverse Transkriptase ist nmlich, dass sie
"rcktranskribiert". So erhlt man eine komplementre DNA, auch cDNA
(complementary DNA/copy DNA) genannt. Nun wird die mRNA mit
Ribonucleasen oder Natronlauge zerstrt, bzw. abgebaut. Nun ist die
cDNA-Kette frei. Die DNA- Polymerase ergnzt nun den
DNA-Einzelstrang mithilfe von kurzen Zufallssequenzen, die als
Primer dienen, zu einemDoppelstrang.Da die Schnittstellen fr die
Restriktionsendonuclease nicht zwingend enthalten sind, werden nun
kurze Linker (Verbindungsstcke), diedie Restriktionsschnittstellen
enthalten, durch die DNA- Ligase angefgt. Die cDNA wird
hydrolysiert (gespaltet), cDNA und Plasmidvektoren werden
enzymatisch zusammengefgt (durch gleiche
Restriktionsschnittstellen). Wie bei der Genom- Bibliothek werden
cDNA und Plasmide nach der Hybridisierung durch DNA-Ligase
geschlossen. So erhlt man rekombinante DNA-Molekle. Jetzt werden
die Plasmide in Bakterien (E.coli) eingeschleust, was man auch als
Transformation bezeichnen kann. Nun wird E.coli auf Nhrbden
vermehrt und anschlieend werden die Bakterien selektiert, die
Fremd-DNA-Stcke enthalten. Ein Vorteil der cDNA-Bibliothek ist,
dass sie eine Sammlung von den Genen ist, die tatschlich zur
Expression kommen, das heit, dass z.B. keine Introns enthalten sind
(bei mRNA-Spleien schon entfernt). Damit kommt es zu einer
Verringerung der klonierenden DNA-Menge. Wenn man ein spezielles
Gen sucht, bevorzugt man daher die cDNA-Bibliothek gegenber der
Genom-Bibliothek. Fr Genidentifizierung und -charakterisierung
unentbehrlich, da RNA allein zu instabil fr die meisten
Analysemethoden ist. Ein Nachteil dieser Bibliothek ist jedoch,
dass es schwierig ist, sie in ausreichender Gte herzustellen.
Jedoch kann die Polymerasekettenreaktion (PCR) dieses Problem
bereits berwinden. 5. Allgemeine Anwendung/Perspektive Erhaltung
und Schutz der genetischen Vielfalt Medizin (Herstellung Antikrper,
Impfstoff) Untersuchung des Genaufbaus gezielte Mutation des Gens
Untersuchung der Funktion des Proteins Eigenschaften von Proteinen
verbessern (Screening) Herstellung gentechnisch vernderter
Mikroorganismen, Tiere, Pflanzen mit vielfltigen Anwendungen
(Mllbeseitigung, krankheitsresistente Nutzpflanzen und Tiere)
Diagnose Erbkrankheiten --> Heilung Erbkrankheiten? 6. 4.
Auffinden von DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese Die
Gelelektrophorese ist eine Technik zur Trennung von Markomoleklen
nach ihrer Gre, bzw. Lnge. In der Regel wird sie fr DNA aber auch
fr Proteine angewendet.Das Prinzip beruht darauf, dass sich
geladene Molekle entlang eines elektrischen Feldes durch ein Gel
bewegen mssen. Vereinfacht kann man sich das Gel als schwammartige
Struktur oder dreidimensionales Geflecht vorstellen, das die
Molekle bei ihrer Wanderung behindert. Je kleiner ein Abbildung 1
Molekl, um so leichter kann es durch die Poren des Gels wandern, um
so schneller bewegt es sich vorwrts. Je nachdem, wie klein die
Poren sind, brauchen die Molekle lnger, dafr ist auch die
Autrennung feiner. So kann man mit Agarosegelen (grere Poren) DNA
Fragmente grob trennen, mit Acrylamid Gelen DNA Fragmente bis auf
eine Base Lngenunterschied.Abbildung 1 zeigt den Aufbau einer
typischen (horizontalen) Gelkammer mit der Spannungsquelle links.
Das Gel liegt in einer Pufferlsung, die den Widerstand herabsetzt
und das Gel vor Austrocknung schtzt. Am Minuspol liegen die
Taschen, in die die Proben pipettiert werden.Abbildung zwei zeigt
ein Agarosegel mit eingearbeitetem Fluoreszensfarbstoff, nachdem
die Proben 90 Minuten gelaufen sind. Nach der Auftrennung werden
die Proben aus dem Gel geschnitten (Picking) oder per Abklatsch
(Blotting) fixiert. S.Blattmann 7. 5. Sequenzieren von DNA mit der
didesoxy-Methode nach Sanger In vierVersuchsanstzen wird die
DNA-Doppelhelix zunchst durch Hitzedenaturiert und somit
entstehenEinzelstrnge, die zur weiterenVorgehensweise bentigt
werden. DieEinzelstrnge werden am 3' Ende miteinem Primer markiert.
Durch dieZugabe von DNA-Polymerase wird derkomplementre Strang
synthetisiert. Danach werden parallel vierReaktionen durchgefhrt,
bei denenjeweils eines der
vierKettenabbruchnukleotide(Didesoxynukleosidtriphosphat,
ddATP,ddCTP, ddGTP, ddTTP) hinzugefgtwird.Diesen Nucleotiden fehlt
die OH-Gruppe am 3' Ende wodurch eineVerbindung des Phosphats und
derDesoxyribose nicht mglich ist.Dadurch kann
keineKettenverlngerung deskomplementren Stranges stattindenund es
kommt zufllig zum Abbruch,wodurch unterschiedlich lange
DNA-Fragmente entstehen, die jeweils mitdem
zugegebenenDidesoxynucleosidtriphosphat enden. 8. Um die
DNA-Fragmente zu analysierenwerden sie mit Hilfe
derGelelektrophorese getrennt.Hierbei werden die 4
Versuchsanstzejeweils auf ein Polyacrylamidgelgegeben und Spannung
angelegt. Diekurzen DNA-Abschnitte wandern imGel schneller und
weiter RichtungAnode (+) als die langen Abschnitte.Durch diese
Methode erhlt man denkomplementren DNA-Strang(ausgehend von der
Anode abgelesen)und somit die gesuchte Basenabfolgedes
Einzelstranges. Anwendungsgebiet: Die DNA-Sequenzanalyse dient zur
Untersuchung von genetischem Material. Perspektiven: Heute werden
nicht mehr vier Anstze, sondern nur noch einer bentigt. Die
Kettenabbruch-Nukleotide werden mit unterschiedlichen Fluoreszenz-
Farbstoffen markiert, so knnen sie in einem Durchlauf von einem
Detektor erkannt werden. Die Abfolge der Farbsignale, die am
Detektor erscheinen (Chromatogramm) geben dann die Sequenzabfolge
der Basen des sequenzierten DNA-Stranges wieder. Whrend frher der
Primer radioaktiv markiert wurde, wir auch er seit Anfang der 90er
Jahre mit Fluoreszenz-Farbstoffen gekennzeichnet. Erika Hilbold,
Maike Schrader, Simone Lehmann 9. 6.
In-situ-HybridisierungAnwendungsbereich allgemein: Die
In-Situ-Hybritisierung (ISH) ermglicht das Auffinden spezifischer
DNA Sequenzen in einem Prparat. So wird die ISH beispielsweise fr
die Diagnose verwende, wie zB den Nachweis vom Epstein Barr Virus.
Funktionsweise Zuerst brauchen wir eine Sonde aus einer DNA Probe
oder knstlicher DNA, die komplementr zu dem DNA Abschnitt ist, den
wir suchen. Ein Fluoreszensfarbstoff (zB mit Haptenen wie
Digoxigenin, Biotin, Dinitrophenol) wird dann an die Sonde
gekoppelt, oder sie wird radioaktiv markiert mithilfe Radioaktiver
Nukleotide (zB Trizium oder Schwefel) Die DNA (oder RNA) wird dann
bei 95C denaturiert. Die Sonde wird hinzugegeben und die
Hybritisierungstemperatur wird runter gesetzt. Die Sonde koppelt
sich an die komplementre Stelle, das Zielgen Zielgen ist sichtbar
Svenja Uhrig 10. 7. Blot-Techniken Southern-Blotting wird dazu
verwendet, um in einem Gemisch von DNA- Fragmenten das
Vorhandensein einer bestimmten Sequenz nachzuweisen. Entsprechendes
gilt fr das Northern-Blotting fr RNA-Sequenzen und das
Western-Blotting fr Proteine. Fr den Transfer vom Gel auf eine
Membran (z.B. Nitrocellulose), das Blotting, stehen mehrere
Verfahren zur Verfgung: Kapillar-Blot: Eine Flssigkeit zieht die
DNA mit, meist eine Salzlsung. Diese luftvon unten ber das Gel auf
die Membran, da sich darber saugfhiges Materialbefindet. Die DNA
bleibt dabei in den Maschen der Membran hngen. Wie der Nameschon
sagt, funktioniert der Kapillar-Blot durch die Kapillarkrfte. Es
darf allerdingskeine Luft eindringen, da an diesen Stellen kein
Transfer der DNA stattfinden kann.Der Nachteil dieses Verfahrens
ist, dass die Flssigkeit 10 bis 12 Stunden laufen mussund ein hoher
Verbrauch der Salzlsung einhergeht. Vakuum-Blot: Die Flssigkeit
wird, hnlich dem Kapillar-Blot durch die Membrangezogen, nur dass
die Flssigkeit von einem Vakuum durch Gel und Membrangezogen wird.
Der Vorteil hier gegenber dem Kapillar-Blot besteht darin, dass
ersparsamer und schneller ist. Elektro-Blot: Hierbei wird die
negative Ladung der DNA ausgenutzt. Das Gel liegtnahe der negativ
geladenen Kathodenplatte, ber der Membran befindet sich diepositiv
geladene Anodenplatte. Am besten man verwendet eine Salzlsung,
denndurch sie kann der Strom flieen. Wird nun eine Sannung
angelegt, bewegt sich dieDNA Richtung Anode und bleibt in der
Membran hngen.Ramona 11. 8. ELISA = (enzyme-linked immunosorbent
assay, dt. Enzym gekoppelter Immunbindungs) ELISA gehrt im engeren
Sinne eigentlich nicht zu den gentechnologischen Verfahrenm, ist
aber ein inzwischen verbreitetes Verfahren, um einzelne Proteine
nachweisen zu knnen. Dabei nutzt man die Mechanismen des
Immunsystems: Wird eine Substanz vom Immunsystem als fremd erkannt,
bildet es "Antikrper", die an das fremde Molekl andocken und es so
markieren. Diese so genannte Antikrper-Antigen-Reaktion wird fr den
ELISA-Test genutzt. Soll ein bestimmtes Protein nachgewiesen
werden, mssen die dazu passenden Antikrper bekannt sein und zuvor
mit verschiedenen gentechnischen oder zellbiologischen Verfahren
hergestellt worden sein. Ist dann in einer Probe das gesuchte
Protein vorhanden, fischen es die auf ein Trgermedium aufgebrachten
Antikrper heraus. Dabei wird eine von Enzymen gesteuerte Reaktion
ausgelst, die zu einem sichtbaren Farbniederschlag fhrt. Umgekehrt
kann man, z.B. beim AIDS-Test, die Platte auch mit dem Antigen
(HIV- Oberflchenmolekle) beschichten und dann im Serum Antikper
nachweisen. ELISA-Tests sind heute in der medizinischen Diagnostik
weit verbreitet. Speziell Doping- Kontrollen verwenden sie. Sie
werden aber auch in vielen anderen Bereichen genutzt, wenn einzelne
Proteine nachzuweisen sind. Davon zu unterscheiden sind Verfahren,
mit denen DNA oder DNA-Sequenzen nachgewiesen werden knnen.
(Quelle: http://www.biosicherheit.de/de/lexikon/33.elisa.html)
(Quelle:
http://www.doping.chuv.ch/en/lad_home/lad-recherche-developpement/lad-recherche-
developpement-projets-actuels/lad-recherche-developpement-projets-actuels-cera.htm)
12. 9. Vervielfltigung von DNA-Sequenzen durch PCR Definition: PCR
(Polymerase Chain Reaction)Die Polymerase-Ketten-Reaktion ermglicht
es, Nukleotidsequenzen im Reagenzglas zu verfielfltigen. Dies ist
vor allem dann notwendig, wenn zu geringe Mengen fr eine
ausfhrliche Untersuchung zur Verfgung stehen. Es werden in stndiger
Wiederholung 3 Schritte durchgefhrt.1.Schritt: (Denaturierung)
Erhitzen auf 95 C und damit Auftrennung des DNA -Doppelstrangs in
zwei Einzelstrnge2.Schritt:(Primerhybridisierung) Abkhlen des
Versuchsansatzes auf 50 C und Anlagerung der Primer an den Anfngen
beider DNA-Einzelstrnge.3.Schritt: (Elongation) Erwrmung auf 72 C
und Einleitung der DNA-Replikation der beiden Einzelstrnge durch
eine hitzestabile Taq-Polymerase1 (Enzym)Diese drei Schritte werden
zigfach wiederholt, bis Milliarden von identischen Kopien der
Nukleotidsequenz vorliegen.Anwendungsbereiche: -Untersuchungen an
Tatorten -Vaterschaftstest -Erkennung von Krankheiten -Klonierung
von Genen -Mutagenese -Analyse alter (fossiler) DNA
-Geschlechtsbestimmung -genetischer Fingerabdruck -Nachweis von
genetisch vernderten Bestandteilen in Lebensmitteln 1
DNA-Polymerase des hitzeliebenden Bakteriums Tthermophilus
aquaticus, das in heien Quellen vorkommt. 13. 10. Synthese
knstlicher DNA(-Sonden)Knstliche DNA: Dabei handelt es sich weder
um menschliches noch um tierisches Erbmaterial, sondern um eine
synthetische Moleklkette aus den gleichen Bausteinen Die knstliche
DNA wird heute durch sogenannte DNA-Syntheseautomaten hergestellt.
Diese Maschinen, die durch Mikroprozessoren gesteuert weden, knnen
automatisch und sehr schnell Sequenzen einzelstrngiger DNA
synthetisieren. 1. Gewnschte Sequenz wird in denAutomaten
eingegeben2. Mikroprozessoren sorgen dafr, dassNucleotide,
Reagenzien und Lsungsmittel frjeden einzelnen Schritt durch
dieSynthesizersule gepumpt werden3. In der Syntesizersule befindet
sichKieselerde, in Form von feinem Sand;jedes Kgelchen gibt der an
ihr entstehendenDNA-Kette einen festen Halt.Beispiel: Sequenz TACG
man geht von einer Sule aus, an deren Kgelchen bereits das erste
Nucleotid(hier Thymin) fixiert ist und zwar mit dem 3 Ende durch
Mikroprozessoren gesteuert werden Millionen von Moleklen vom
nchsten Nucleotid (hier Adenin) durch die Sule gepumpt um eine
Bindung zwischen Thymin und Adenin zu erreichen, muss sich das
5Ende von Adenin mit dem 3Ende von Thymin verkpfen sobald die
Schutzgruppe entfernt wird, kann sich das Cytosin anlagern der
Vorgang wird bei Guanin wiederholt ----> Durch diese neue
moderne Technik knnen kurze Ketten bis zu etwa 50 Nucleotiden
hergestellt werden. Die fertigen Ketten werden dann aus der Sule
gewaschen.Verwendung knstlicher DNA: 1. Oligonucleotide knnen zu
greren vollstndig synthetischen Genen zusammengebaut
werden(beispielsweise wie beim Insulin). 2. Sie knnen als
DNA-Sonden benutzt werden. 3. Sie werden als Primer fr die
Polymerase-Kettenreaktion(PCR) und Sequenzierung bentigt. 4. Die
knstlich hergestellte DNA wird in der Kriminologie verwendet, um
Verbrecher besser zu identifizieren und gestohlene Gegenstnde knnen
leichter ihren Besitzern zugeordnet werden 14. 11. Genetischer
Fingerabdruck 15. 12. GendiagnostikDie Gendiagnostik ist ein
jngerer Zweig der medizinischen Diagnostik. Man versucht dabei,
genetisch bedingte Ursachen oder Veranlagungen zu Krankheiten
bereits lange vor Ausbruch der eigentlichen Krankheit zu bestimmen.
Hierbei wird zwischen diagnostischen Tests (zur Feststellung einer
konkreten Erkrankung) und prdiktiven Tests (zur Prognose eines
Krankheitsrisikos) unterschieden. Die Gendiagnostik gehrt zur
genetischen Beratung, die es schon lnger gibt. Unter Gendiagnostik
i.e.S. sind die unter c) genannten Methoden zu verstehen:
Karyogramm eines Menschena) Familienanamnese Stammbaumanalyse b)
Lichtmikroskopische Untersuchung der Chromosomen auf Aneuploidien
(Gesamtkaryogramm) oder Chromosomenaberrationen c) biochemische/
molekulargenetische Methoden: RFLP (wenn Mutationen des Gens
Restriktionsschnittstellen betreffen verndert sich das
Fragmentmuster) Gensonden (In situ Hybridisierung in Gewebe- oder
Zellproben) Nachweis mit PCR (Da betroffene Gene i.d.R. Bekannt
sind, lassen sich Primer synthetisieren, die jeweils die Enden der
Gene markieren. Mittels PCR kann man dann aus einer Speichel- oder
Haarwurzelprobe die Sequenz vervielfltigen. Die amplifizierte
Sequenz wird dann in einem Sequenzierautomaten analysiert. Das
Ergebnis wird dann interpretiert, d.h. mit Sequenzen verglichen,
von denen bekannt ist, dass sie z.B. mit einer Neigung zu
Dickdarmkrebs oder Multipler Sklerose in Verbindung stehen.)
Eingesetzt wird sie vor allem in der PID
(Primplantationsdiagnostik), der Prnataldiagnostik und bei der
genetischen Beratung von Eltern mit Kinderwunsch, in deren Familien
jedoch bekanntermaen genetische Krankheiten auftreten. Generell
besteht dabei eine Diskrepanz zwischen der Fhigkeit, Gene oder
Genvarianten innerhalb des Erbguts zu finden und zu identifizieren
und der Fhigkeit zu therapieren. Zudem ist die PID in Deutschland
verboten, so dass auch dieser Anwendungsbereich wegfllt. 16. 13.
Gentherapie Definition: Unter Gentherapie versteht man die gezielte
Einfhrung von Genen mit Hilfe geeigneter bertragungsmethoden in
Zellen von Kranken mit dem Ziel der Heilung oder therapeutischen
Besserung engster Begriff = Genkorrektur ( Reparatur eines defekten
Genabschnittes in der Zelle ) oder = Ersatz defekter Gene durch
funktionell intakte Kopien ("Genaddition") oder = die Inaktivierung
pathogener Genprodukte ("Anti-Gen-Therapie", "Antisense-Therapie")
oder = die indirekte Heilung von Krankheiten durch therapeutische
Gene. Keimbahntherapie = Vernderungen der menschlichen Keimbahn
Somatische Gentherapie = Korrektur von Gendefekten in Krperzellen
invivo = Therapie der Zelle im Krper ex vivo = Therapie durch
Zellen, die auerhalb des Krpers verndert wurden (z.B.
Blutstammzellen)Prinzip der somatischen Gentherapie: Damit die
Gentherapie dauerhaften Erfolg hat, nimmt man Knochenmarkzellen, da
die sich das ganze Leben lang teilen und das neue Allel an all ihre
mitotischen Nachkommen weitergeben. = Problem: kein Genersatz
sondern nur Genaddition, mit begrenzter Genexpression mglichEx
vivo: 1.Das gesunde/fehlende Allel in RNA-Form wird in einen Vektor
Retrovirus eingebaut 2. Knochenmarkzellen (knnten aber auch
Lymphocyten, etc. sein), die wir zuvor dePatienten entnommen haben,
werden mit dem Retrovirus infiziert 3. Ziel ist es, dass der
Retrovirus eine Kopie seines Genoms, in DNA-Form, in dasGenom der
Wirtszelle einbaut 4. Daraufhin werden die genetisch-vernderten
Zellen dem Patienten wieder insKnochenmark injiziert 5. Bei
erfolgreicher Gentherapie, wrden sich die Zellen ein Leben lang
vermehren unddas neue Gen exprimieren In vivo: VIRALE VEKTOREN
Einem zuvor abgeschwchtem Virus, wird das gewnschte Genmaterial
eingepflanzt. Sie dienen als Genfhren und werden dem Patienten
direkt injiziert. (Transduktion) Vorteil: Hohe Rate von
Transduktionsereignissen Nachteile: Immunreaktion, hufig nicht
stabil, zu geringe Expressionsrate, Krebsrisiko 17. LIPOSOMEN: DNA
wird in kleine Lipidtrpfchen verpackt, die dann auf Schleimhute
(z.B. als Aerosol-Spray) aufgebracht werden. Vorteil: Keine
Immunantwort, kein bekanntes Krebsrisiko Nachteil: sehr geringe
Transduktionsrate, erreicht nur SchleimhauszellenRisiken von
Gentherapie: Erhhtes Krebsrisiko Ungewollte Aktivierung oder
Vernderung anderer Gene mglich Unabsehbare Risiken Ethische
Problematik (Eugenie, Evolution) Wrde des Menschen noch unantastbar
? Welche spteren Folgen knnte der Verlust von genetischer
Variabilitt haben?Anwendungsbereiche monogene Krankheiten (CF,
Bluterkrankheit, ADA[Adenosin-Desaminase]-Syndrom, septische
Granulomatose) Krebsbekmpfung Bekmpfung viraler Infekte
Vektorenproblem: gute Erfolge nur exvivo, invivo zu geringe
Transfektionsrate, bzw. zu hohe Risiken bei Versuch der Erreichung
einer hohen Rate in Vivo v.a. Virale Vektoren, knstliche V und
physikalische Methoden Virale Vektoren knne a) eine Immunantwort
hervorrufen und b) ist es nicht sicher, wo im Genom sie inserieren.
Hufig sind es Stellen, die stark exprimiert werden. Neu: mit
homologer Rekombination oder Zinkfinger-Nukleasen 18. 14. Grne
Gentechnik Ziele: Ertragssteigerung, Verringerung der
Produktionskosten durch Resistenz gegen Insekten/ Wrmer/ Pilze/
Viren, Vernderung des Stoffwechsels (Zusammensetzung der sekundren
Pflanzenstoffe, Produktions bestimmter Molekle, Erhhung der
Produktion einzelner Stoffe) Werkzeuge: bei Dikotylen
(Zweikeimblttrigen, Gemseplfanzen, Tabak, Obstbume):Plasmide des
Agrobakteriums tumefaciens als Vektoren (steuert den Zellzyklusund
Zellstoffwechsel der infizierten Zelle um)Mikroinjektion von DNA
bei Monokotylen (Einkeimblttrige, alle Getreide):Partikel-Beschuss
spontane Aufnahme von DNA nach Behandlung der Zellwand und membran
mitEnzymen Transgene Zellen knnen dann ber Kalluskulturen wieder zu
vollstndigen Pflanzen herangezogen werden. Probleme:
VerndertesVerhalten der Pflanzen im Freiland
Freisetzunggentechnisch vernderten Erbguts, die nicht rckgngig
gemacht werden kann. Nachweisder Gesundheitsvertrglichkeit
schwierig, Kontrollen erfolgen teilweise nach Magaben der Konzerne
(USA) ffentlicher Widerstand
