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- DMPC-Nanotubes - Untersuchungen einer neuartigen Vesikelstruktur in
Dispersionen aus 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät
der Friedrich-Schiller-Universität Jena
von Apothekerin Ulrike Lauf
geboren am 09.02.1973 in Magdeburg
Gutachter:
1. Professor Dr. Anne S. Ulrich
2. Professor Dr. Alfred Fahr
3. Professor Dr. Alfred Blume
Tag der Doktorprüfung: 6. Oktober 2003
Tag der öffentlichen Verteidigung: 27. Oktober 2003
Die vorliegende Arbeit ist am Lehrstuhl für pharmazeutische Technologie der
Friedrich-Schiller-Universität Jena auf Anregung von Frau Prof. Dr. K. Westesen ent-
standen.
Mein Dank gilt allen, die zum guten Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben:
Frau Prof. Dr. K. Westesen danke ich für die Aufnahme an Ihrem Lehrstuhl und die
persönliche Betreuung der Arbeit.
Herrn Prof. Dr. Dres. h. c. H. Oelschläger danke ich herzlich für seinen persönlichen
Einsatz nach dem Tod von Frau Prof. Dr. K. Westesen in der Weiterführung der
Arbeit.
Mein ganz besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Anne S. Ulrich und Herrn Prof. Dr.
Alfred Fahr für die bereitwillige Übernahme der Betreuung, die hilfreichen Diskus-
sionen und die unkomplizierte, freundliche und motivierende Unterstützung in der
Endphase der Arbeit.
Steffi Richter danke ich besonders für ihren engagierten Einsatz bei der Gefrier-
bruch-Präparation, Markus Drechsler für seine geduldige Einweisung und Unterstüt-
zung in der Elektronenmikroskopie und Alexander Mohn für seine verläßliche Hilfe
bei den Röntgenmessungen.
Gerald Gellermann und Thomas Appel vom IMB Jena möchte ich für ihre Einweisung
und Unterstützung sowie die Bereitstellung der Gerätschaften für die Dünnschicht-
chromatographie danken.
Für die großzügige Überlassung größerer Mengen Phospholipid danke ich den Fir-
men Astra Arcus (S-Södertälje) und der Lipoid GmbH (D-Ludwigshafen).
Weiterhin möchte ich Heike Bunjes danken für ihre hilfreichen Diskussionen und An-
regungen, in besonderer Weise Tobias Unruh für die vielen wertvollen Gespräche
und Hilfestellungen und außerdem allen derzeitigen und ehemaligen Mitarbeitern des
Lehrstuhls für Pharmazeutische Technologie für das freundschaftliche Betriebsklima.
Abschließend danke ich allen, die mich durch die manchmal turbulenten Zeiten der
Promotion auf verschiedenste Weise helfend begleitet haben - meinen Freunden,
Oliver und meiner Familie.
I
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1.1. Chemische und physikalische Eigenschaften von Phospho- lipiden 1.1.1. Das Phasenverhalten von Phosphatidylcholinen in Wasser- überschuss: DPPC und DMPC 1.1.1.1. Der Einfluss von Zusätzen auf das Phasenverhalten von Phosphatidylcholin-Bilayern 1.1.1.2. Der Einsatz der Transmissionselektronenmikroskopie zur Strukturaufklärung von Phospholipid-Wasser-Systemen 1.2. Liposomen - Phospholipide als Arzneistoffträger 1.3. Andere Phospholipid - Strukturen 1.4. Problemstellung und Ziel der vorliegenden Arbeit 2. Material und Methoden 2.1. Materialien 2.1.1. Phospholipide zur Herstellung der Liposomen 2.1.2. Wässrige Phase 2.1.3. Lösungsmittel, Sprühreagenzien und Referenzsubstanzen für die Dünnschichtchromatographie 2.1.4. Weitere Substanzen
2.2. Methoden 2.2.1. Herstellung der Dispersionen 2.2.1.1. Quellung der Phospholipide 2.2.1.2. Hochdruckhomogenisation 2.2.1.3. Extrusion 2.2.1.4. Ultraschall 2.2.1.5. Probenlagerung 2.2.2. Untersuchungsmethoden 2.2.2.1. Hochauflösende Dünnschichtchromatographie (HPTLC) 2.2.2.2. Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) 2.2.2.3. Visuelle Prüfung / Makroskopisches Erscheinungsbild 2.2.2.4. Teilchengrößenanalyse 2.2.2.4.1. Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) 2.2.2.4.2. Laserdiffraktrometrie, gekoppelt mit Polarization Intensity Differential Scattering Technology (LD / PIDS) 2.2.2.5. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
1 1 3 6 7 9 12 14 15 15 15 15 16 16
16 16 16 17 17 18 18 18 18 19 20 20 21 22 23
II 2.2.2.5.1. Gefrierbruch 2.2.2.5.2. Kryo-TEM 2.2.2.5.3. Negative Staining mit Uranylacetat (2%ig) 2.2.2.6. Röntgenstrukturanalyse 2.2.2.7. pH-Wert-Bestimmung 3. Ergebnisse 3.1 Lagerstabilität von DMPC-Dispersionen 3.1.1. Charakterisierung der Liposomen direkt nach der Her- stellung 3.1.2. Stabilität der Dispersionen in Abhänigkeit von der Lagerungstemperatur und der Phospholipidkonzentration 3.2. Das Gelierungsphänomen 3.2.1. Makroskopische Beschreibung der Geleingenschaften 3.2.2. Elektronenmikroskopische Beschreibung der halbfesten Systeme 3.2.2.1. Elektronenmikroskopische Charakterisierung der Nano- tubes 3.2.2.1.1. Gefrierbruch - TEM 3.2.2.1.2. Negative Staining Präparation (Negativkontrastierung) 3.2.2.1.3. Kryo-Präparation 3.2.2.2. Lagerstabilität der Nanotubes 3.2.2.3. Temperaturstabilität der Nanotubes 3.2.3. Einfluss der Herstellungsmethode auf die Gelbildung und Nanotube-Entstehung 3.2.3.1. Eigenschaften der Dispersionen nach Extrusion mit dem EmulsiFlex C5 im Vergleich zur Hochdruckhomogenisation 3.2.3.2. Beeinflussung der Gelbildungsneigung durch Variation der Herstellungsparameter 3.2.3.2.1. Extrusion 3.2.3.2.2. Hochdruckhomogenisation 3.2.3.2.3. Ultraschall 3.2.3.2.4. Zusammenfassung 3.2.4. Einfluss verschiedener DMPC-Chargen auf die Gel- bildungstendenz 3.2.5. Einfluss von Konservierungsmitteln auf die Eigenschaften 10%iger DMPC-Dispersionen 3.2.5.1. DMPC-Dispersionen ohne Konservierungsmittel 3.2.5.2. Konservierung mit einem Gemisch aus Propyl-4-hydroxy- benzoat und Methyl-4-hydroxybenzoat im Verhältnis 1:3
23 25 25 26 26 27 27 27 27 30 30 31 33 33 35 38 39 39 42 43 48 48 49 51 53 54 55 56
III (m/m) 3.2.5.3. Konservierung mit 0,05% (m/m) Natriumazid 3.2.5.4. Konservierung mit 0,1% Thiomersal 3.2.5.5. Zusammenfassung 3.2.6. Einfluss des Zusatzes von Lipiden auf Lagerstabilität und Ultrastruktur von 10%igen DMPC-Dispersionen 3.2.6.1. Die Referenz-Dispersion aus reinem DMPC 3.2.6.2. Einfluss der Verunreinigungen auf das Phasenverhalten von DMPC 3.2.6.3. Eigenschaften der Dispersion 3.3. Untersuchungen zur Reinheit von DMPC 3.3.1. Makroskopisches Quellungsverhalten 3.3.2. Thermoanalytische Untersuchungen 3.3.3. Ergebnisse der Röntgenkleinwinkeluntersuchungen 3.3.4. Hochauflösende Dünnschichtchromatographie 3.3.5. Einfluss der Lipidvorbehandlung 3.3.6. Zweiwertige Kationen 3.4. Dispersionen aus einer Mischung von DMPC und DPPC im Verhältnis 4:1 (m/m) 3.5. Dispersionen aus DPPC 4. Diskussion 4.1. Vorstellungen zur Morphologie der Nanotubes im Vergleich zu bekannten tubulären Strukturen 4.2. Überlegungen zum Entstehungsmechanismus der Nano- tubes 4.3. Der Einfluss von Zusätzen auf die Nanotubebildung 4.4. Einfluss von zweiwertigen Kationen auf die Hydratations- und Dispersionseigenschaften von DMPC 4.5. Fazit und Ausblick 5. Zusammenfassung
6. Literaturverzeichnis
Anhang A.1. Abkürzungsverzeichnis A.2. Anmerkungen zu den verwendeten Teilchengrößenbestim- mungsmethoden
58 59 61 62 63 63 64 65 69 70 71 72 73 78 78 82 84 89 89 92 100 104 108 110
112
i ii
Einleitung
_________________________________________________________________________________
1
1. Einleitung
1.1. Chemische und physikalische Eigenschaften von Phospholipiden
Phospholipide sind ubiquitär in der Natur vorkommende Lipide, die Phosphorsäure
als Mono- bzw. Diester enthalten. Phospholipide sind amphiphile Verbindungen: Die
Moleküle sind vereinfacht aus einer hydrophilen Kopfgruppe und einem lipophilen
Kohlenwasserstoffrest aufgebaut, die über das Rückgrat miteinander verbunden sind.
Sie stellen eine sehr heterogene Verbindungsgruppe dar und können, je nach der
das Rückgrat darstellenden Alkoholkomponente, in Sphingophospholipide und Gly-
cerophospholipide (Alkoholkomponente Sphingosin bzw. Glycerol) unterteilt werden.
Die Glycerophospholipide lassen sich aufgrund der Struktur der hydrophilen Kopf-
gruppe in Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phospha-
tidylinositol, Phosphatidylglycerol und Phosphatidsäure unterteilen. Alle Glycerophos-
pholipide tragen eine oder zwei Acyl- oder Alkyl-Ketten. Eine Übersicht der verschie-
denen Phospholipidklassen ist in Abb. 1 gegeben.
Abb. 1 : Übersicht über die Strukturen verschiedener Phospholipid-Klassen.
lipophiler Kohlenwasserstoffrest
Rückgrat hydrophile Kopfgruppe
Phospholipidklasse
Phosphatidylcholin (PC)
Phosphatidylethanolamin (PE)
Phosphatidylserin (PS)
Phosphatidylglycerol (PG)
Phosphatidsäure (PA)
Phosphatidylinositol (PI)
Sphingomyelin (SM)
Einleitung
_________________________________________________________________________________
2
Phospholipide sind molekular praktisch unlöslich in Wasser (die Löslichkeit von Di-
palmitoylphosphatidylcholin beträgt z.B. 4,7 ·10-10 M; Tanford, 1980), aber ein kom-
pakter Lipidblock kann durch Penetration von Wassermolekülen zwischen die hydro-
philen Kopfgruppen quellen. Durch den hydrophoben Effekt, der die Zusammenlage-
rung der unpolaren Kohlenwasserstoffketten begünstigt, bilden die Amphiphile in
Wasser bei Überschreitung einer kritischen Konzentration, der so genannten critical
micelle concentration (CMC), größere Molekülaggregate. Dabei hängt die Gestalt der
Aggregate entscheidend davon ab, wie groß der Platzbedarf des hydrophilen und
des hydrophoben Molekülteils ist.
Israelachvili stellte erstmals solche geometrischen Überlegungen an und führte den
dimensionslosen Packungsparameter P = V / Ao · l zur Beschreibung von Mizellfor-
men ein. Dabei ist V das Volumen des hydrophoben Molekülteils, Ao die Quer-
schnittsfläche der hydrophoben Kopfgruppe und l die kritische Kettenlänge der Alkyl-
ketten. Israelachvili bestimmte kritische Werte für den Packungsparameter und ord-
nete diesen Werten bestimmte Assoziatformen zu. So ergibt zum Beispiel ein
Packungsparameter von P< 1/3 höchstwahrscheinlich Mizellen (Israelachvili et al.,
1977, 1980). Eine Übersicht über den Zusammenhang zwischen Packungsparameter
und entstehender Assoziatform ist in Abb. 2 dargestellt.
Phospholipide, die einen Packungsparameter zwischen ½ und 1 aufweisen, bilden
planare Doppelschichten, auch "Bilayer" genannt, aus. Kommt es zu einer Verkleine-
rung des Packungsparameters, beispielsweise durch Vergrößerung der Kopfgruppe
durch Ladung und verstärkte Hydratation oder zu einer Verkleinerung des Volumens
der lipophilen Ketten durch Hydrolyse einer der beiden Ketten, kann das zu einer
Umwandlung der lamellaren in eine mizellare Phase führen. Im Gegensatz dazu
kann eine Erniedrigung der Nettoladung der Kopfgruppe (zum Beispiel durch Wech-
selwirkungen mit mehrwertigen Kationen) oder eine Erhöhung des Platzbedarfs der
hydrophoben Ketten infolge Temperaturerhöhung zu einer Vergrößerung des
Packungsparameters und damit zu einer Umwandlung einer lamellaren in eine
hexagonale Phase führen (Lichtenberg & Barenholz, 1988).
Einleitung
_________________________________________________________________________________
3
Molekül-geometrie
Packungs-parameter
Molekülassoziat bzw. Phase
Beispielsubstanzen
P < 1/3
Mizelle
• Lysophospholipide • Tenside
Invers konisch P < 1
Hexagonale Phase HI
• Lysophospholipide
Zylindrisch
P ~ 1 Lamellare Phase • Phosphatidylcholin • Phosphatidylserin • Phosphatidylinositol • Sphingomyelin
P > 1 Hexagonale Phase HII
• Ungesättigtes
Phosphatidylethanolamin • Kalziumsalze der
Phosphatidsäure (pH< 6)
Konisch
P » 1
Inverse Mizelle • Natrium-bis(2-ethylhexyl)-
sulfosuccinat (AOT) in Heptan
Abb. 2 : Zusammenhang zwischen dem dimensionslosen Packungsparameter P und der daraus resul-tierenden Form von Molekülassoziaten. P = V / Ao · l (modifiziert nach Lichtenberg & Barenholz, 1988).
Von allen Phospholipiden stellen die Phosphatidylcholine die am häufigsten vor-
kommende Lipidklasse dar. Von großem Interesse ist das Phasenverhalten von
Phospholipid-Wasser-Systemen zum einen wegen der möglichen biologischen Rele-
vanz der verschiedenen Phasen und Phasenumwandlungen. Außerdem ermöglichen
erst umfassende Kenntnisse des Phasenverhaltens der Phospholipide ein rationales
Design phospholipidbasierter Arzneistoffträgersysteme.
1.1.1. Das Phasenverhalten von Phosphatidylcholinen in Wasserüberschuss: DPPC und DMPC
1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DMPC) und 1,2-Dipalmitoyl-sn-
glycero-3-phosphatidylcholin (DPPC) gehören zu den meist untersuchten Phos-
Bilayer
Einleitung
_________________________________________________________________________________
4
phatidylcholinen (Koynova & Caffrey, 1998). Die chemische Struktur von DMPC ist in
Abb. 3 abgebildet, im DPPC sind beide Fettsäureketten um je 2 CH2-Gruppen verlän-
gert.
Abb. 3 : Strukturformel von 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phos-phatidylcholin (DMPC).
DMPC und DPPC bilden im Überschuss von Wasser eine Lamellarphase aus, die in
Abhängigkeit von der Temperatur einen ausgeprägten Polymorphismus zeigt.
In Abb. 4 sind die verschiedenen lamellaren Phasen von Phosphatidylcholinen stark
vereinfacht dargestellt, deren Phasenübergänge z.B. mittels Dynamischer Differenz-
kalorimetrie (DSC) detektiert werden können.
Abb. 4 : Schematische Übersicht über die lamellaren Phasen von Phosphatidylcholinen. Erklärungen siehe Text.
Nach Langzeitäquilibrierung bei niedrigen Temperaturen (bei DPPC sind mehrere
Stunden unterhalb 8°C notwendig; Nagle & Tristram-Nagle, 2000) bildet sich die
lamellar kristalline Phase (Subgelphase, Lc). Die Fettsäureketten liegen hier in einer
all-trans-Konformation vor und sind bezüglich der Bilayernormalen in einem Winkel
von 30 35° (DPPC: 34,5°; Katsaras et al., 1995) geneigt. Die Lipidmoleküle ord-
nen sich in einem orthorhombischen Gitter an, sie sind ausgestreckt und besitzen
keine Rotationsfreiheitsgrade. Der Bilayer ist planar.
Eine Temperaturerhöhung über die Subübergangstemperatur (TS) bewirkt die Auf-
weitung der Kettenpackung und eine Abnahme der kristallinen Ordnung durch eine
zunehmende Rotationsfreiheit der Ketten. Diese Phase wird als Lβ`-Phase (tilted gel)
bezeichnet. Der Neigungswinkel von vollständig hydratisiertem DMPC in der Lβ`-Pha-
se beträgt 32,3° (Tristam-Nagle et al., 2002). Die Temperatur dieser Phasenum-
1
2
3
+ -
Lα-Phase Lc-Phase Lβ`-Phase P β`-Phase
TS TP TM
Einleitung
_________________________________________________________________________________
5
wandlung hängt stark von den Äquilibrierungsbedingungen ab und liegt für DPPC
unter Gleichgewichtsbedingungen bei 14,5°C (Nagle & Wilkinson, 1982).
Bei weiterer Temperaturerhöhung findet ein nächster Übergang in eine zweite Gel-
phase, die so genannte Ripple Phase (Pβ`-Phase), statt (Vorübergang, TP; TP (DMPC):
13,7°C; TP (DPPC): 34,4°C; Koynova & Caffrey, 1998). In der Ripple Phase nimmt die
Kettenrotationsfreiheit weiter zu, die Kopfgruppen besitzen eine stärkere Mobilität
und der dadurch verstärkte Platzbedarf der Kopfgruppen wird durch die Bildung eines
periodisch modulierten Bilayers ausgeglichen. Es sind symmetrische und asymme-
trische (sägezahnförmige) Rippel beschrieben. Nach der Hydratation des Lipids bei
einer Temperatur innerhalb des Existenzbereiches der Ripple Phase bildet sich aus-
schließlich der asymmetrische Typ mit einer Periodizität von 13 - 15 nm. Dieser Typ
entsteht außerdem nach dem Erwärmen ausgehend von der Lβ`-Phase. Nach Abküh-
len aus der Lα-Phase wird dagegen hauptsächlich der symmetrische Typ mit einer
Periodizität von 25 - 30 nm beobachtet (Meyer & Richter, 2001).
Bei weiterer Temperaturerhöhung findet das eigentliche Kettenschmelzen statt
(Hauptübergangs- oder Kettenschmelztemperatur Tm; Tm(DMPC): 23,6°C; Tm(DPPC):
41,3°C; Koynova & Caffrey, 1998), es bildet sich die flüssig-kristalline Lα-Phase. Die
steife Kettenordnung geht in einem hochkooperativen Schmelzvorgang vollständig
verloren, und die gauche-Isomere der Fettsäureketten führen zu einer hohen Konfor-
mationsunordnung innerhalb des hydrophoben Teils des Bilayers. Der Bilayer ist wie-
der planar und die Lipide können lateral frei diffundieren.
Beim DPPC sind all diese Phasenübergänge reversibel. DMPC weist die Besonder-
heit auf, dass ausgehend von der Subgelphase Lc bei Temperaturerhöhung direkt die
Ripple Phase Pβ` gebildet wird. Dieser Übergang ist jedoch irreversibel, d.h., dass
sich ausgehend von der Ripple Phase bei Temperaturerniedrigung zunächst die
Gelphase Lβ` ausbildet. Diese ist metastabil und geht langsam in die Subgelphase Lc
über. Der Übergang Lβ` → Pβ` ist reversibel.
Die Kinetiken der Phasenumwandlungen sind sehr unterschiedlich: Während die
Hauptumwandlung weniger als 2 Sekunden benötigt, findet die Vorumwandlung
innerhalb von Minuten statt, der Subübergang benötigt hingegen Stunden bis Tage
(Cevc, 1993).
Einleitung
_________________________________________________________________________________
6
Mit Hilfe der Röntgenkleinwinkelstreuung werden Bragg-Reflexe der periodischen
Lipid-Wasser-Strukturen erfasst (Abb. 5). Anhand der Lage der Maxima ist über die
Braggsche Gleichung der so genannte d-Wert (räumliche Ausdehnung einer Wieder-
holungseinheit in Richtung der beobachteten Wiederholung, entspricht bei der La-
mellarphase der Dicke eines Bilayers zuzüglich dem Abstand zweier Bilayer), bere-
chenbar.
2d sinθ = n λ (Braggsche Gleichung)
d: d-Wert, lamellarer Wiederholungsabstand [nm] θ: halber Streuwinkel [°] n: ganze Zahl (Ordnung) λ: Wellenlänge der Röntgenstrahlung [nm]
Mit s = 2 sin θ / λ (s: reziproker Gittervektor [nm-1]) kann bei s = n/d der lamellare
Wiederholungsabstand bestimmt werden.
Abb. 5 : Schematische Darstellung der lamellaren Wiederholungseinheit und eines daraus resultierenden typischen Röntgenkleinwinkeldiffraktogramms. Der d-Wert errechnet sich aus d = n/s.
Die Werte für den Abstand der lamellaren Wiederholungseinheit sind bei voll-
ständiger Hydratation abhängig von der Struktur des Lipids und der Temperatur. So
wurde beispielsweise für DPPC in der Lα-Phase (50°C) ein d-Wert von 67 Å ermittelt
(Nagle et al., 1996), während in der Lβ`-Phase (20°C) ein d-Wert von 63,5 Å resultiert.
DMPC hat in der Lα-Phase (30°C) einen d-Wert von 62,7 Å (Nagle & Tristram-Nagle,
2000).
1.1.1.1. Der Einfluss von Zusätzen auf das Phasenverhalten von Phosphatidyl-cholin-Bilayern
Das Phasenverhalten der Phospholipide wird durch Fremdmoleküle beeinflusst.
Dabei hängt der Effekt der Zusätze von der Polarität der zugegebenen Moleküle ab
d
0,00 0,02 0,04
0
20
40
60
80
100
Inte
nsitä
t
s (nm-1)
Peak 1. Ordnung(n=1)
Peak 2. Ordnung(n=2)
Einleitung
_________________________________________________________________________________
7
(Seddon & Cevc, 1993). So werden amphiphile Moleküle (z.B. andere Lipide, Chole-
sterol) in die Membran eingebaut und wechselwirken sowohl mit den Kopfgruppen
als auch den Ketten der Phospholipide. Cholesterol führt beispielsweise in Konzen-
trationen über 5 mol% zu einer Unterdrückung der Vorumwandlung sowie zu einer
Verbreiterung und schließlich dem Verschwinden des Hauptübergangs (McMullen &
McElhaney, 1995). Es erniedrigt die Ordnung in der Gelphase und erhöht die Ord-
nung in der fluiden Phase.
Auch der Zusatz von Fettsäuren beeinflusst das Phasenverhalten von DMPC und
DPPC in Form einer deutlichen Erhöhung der Übergangstemperaturen (Mabrey &
Sturtevant, 1977; Inoue et al., 2001; Koynova et al., 1997).
Neben organischen Molekülen beeinflussen aber auch Ionen, vor allem mehrwertige
Kationen, über Wechselwirkungen mit den Kopfgruppen das Phasenverhalten von
Phospholipiden. Über eine Dehydratation der Kopfgruppe und die Bildung von Ionen-
Brücken zwischen benachbarten Molekülen können sie zu einer Erhöhung der Ord-
nung und damit zu einer Erhöhung der Kettenschmelztemperatur führen (Arnold et
al., 1975; Arnold, 1976; Hauser & Shipley, 1984). Lis et al. haben gezeigt, dass der
Zusatz von Calciumionen eine starke Quellung von DPPC-Bilayern bewirkt. Dabei
vergrößert sich bei Raumtemperatur die interlamellare Wasserschicht von 19 Å in
reinem Wasser auf über 90 Å in 1mM CaCl2 (Lis et al., 1981).
1.1.1.2. Der Einsatz der Transmissionselektronenmikroskopie zur Strukturauf-klärung von Phospholipid-Wasser-Systemen
Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) hat sich seit vielen Jahren zur
Charakterisierung von Lipid-Wasser-Systemen etabliert. Eine Darstellung einzelner
Lipidmoleküle ist zwar wegen der begrenzten Auflösung im Transmissionselektronen-
mikroskop nicht möglich, dennoch leistet sie große Dienste zur Visualisierung der
verschiedensten Phospholipid-Überstrukturen (z.B. Liposomen, planare Bilayer, tubu-
läre Vesikel) und macht diese einer strukturellen Analyse zugänglich (Meyer & Rich-
ter, 2001).
Die Vorbereitung der Probe kann auf verschiedenen Wegen erfolgen. Die einfachste
und daher auch gebräuchlichste Methode ist die Negativkontrastierung (Negative
Staining; Robenek, 1995; Harris, 1997), die bereits Ende der 50er Jahre entwickelt
wurde. Sie ist besonders hilfreich bei der Aufklärung der Lamellarität von Phos-
pholipid-Vesikeln. Hierbei werden die zu untersuchenden Strukturen in wässriger
Suspension zunächst auf einen Trägerfilm aufgebracht. Anschließend erfolgt die
Einleitung
_________________________________________________________________________________
8
Kontrastierung mittels einer Lösung von Schwermetallionen, die sich an die Kopf-
gruppen der Phospholipide anlagern. Nach Absaugen der überschüssigen Flüssigkeit
kann das Präparat im Elektronenmikroskop untersucht werden. Die Membranen und
Partikelstrukturen erscheinen hell auf dunklem Hintergrund. Aufgrund der not-
wendigen Trocknung kann es zur Bildung von Trocknungsartefakten kommen: Der
Kollaps von Vesikeln lässt diese oft als faltige und unförmige Strukturen erscheinen.
Aus diesem Grund ist Vorsicht bei der Bestimmung von Liposomendurchmessern
geboten. Für eine korrekte Interpretation ist es daher notwendig, neben der Negativ-
kontrastierung andere Präparationsmethoden anzuwenden.
Eine grundsätzlich andere Methode, die diese Trocknungseffekte umgeht, ist die
Kryofixierung. Dabei wird die Probe durch schnelles Eintauchen in eine Kühlflüssig-
keit (geeignet sind Propan oder Ethan) eingefroren und so in ihrem hydratisierten Ur-
sprungszustand fixiert. Problematisch bei der Kryofixierung ist allerdings die Möglich-
keit der Entstehung von Strukturschäden durch das Wachstum von Eiskristallen und
die Aufkonzentrierung von Elektrolyten, die nicht in das Kristallgitter des Eises mit
eingebaut werden. Idealerweise soll deshalb das Wasser amorph erstarren (Vitrifizie-
rung), die Abkühlung muss also schneller erfolgen als die Kinetik der Eiskristall-
bildung (Angell & Choi, 1986; Uhlmann, 1972). Zur Gewährleistung eines vollständi-
gen und sehr schnellen Erstarrens des Wassers müssen die Proben sehr dünn (eini-
ge µm) sein.
Die klassische Methode zur Erzielung eines TEM-Bildes nach Kryofixierung ist die
Gefrierbruch-Replika-Technik (Gefrierbruch-TEM). Die Methode beruht auf der An-
fertigung eines Metall-Abdruckes der Bruchfläche der gefrorenen Probe (Moor, 1964;
Winkelmann & Meyer, 1968). Der Bruch durch die Probe verläuft bevorzugt an den
Orten schwächster Wechselwirkungen. Bei Phospholipid-Bilayern sind das die Kon-
taktstellen der einander gegenüberliegenden lipophilen Fettsäureketten, so dass
hauptsächlich die hydrophoben Innenflächen der Bilayer freigelegt werden. Die an-
schließende Schwermetall-Schrägbeschattung führt in Abhängigkeit vom Relief der
Bruchfläche zur Bildung einer unterschiedlich dicken Metallschicht, die anschließend
durch senkrechtes Aufdampfen von Kohlenstoff stabilisiert wird. So entsteht die Re-
plika, die nach Abschwämmen und Reinigen im TEM untersucht werden kann. Im
TEM erscheinen die dicken Metallschichten dunkel, während Stellen, die nicht oder
nur dünn mit Metall bedeckt sind, hell erscheinen. Auch bei dieser Methode sind Ar-
tefakte nicht ausgeschlossen (Sleytr & Robards, 1982): So kann die Anlagerung von
Einleitung
_________________________________________________________________________________
9
Schwermetallclustern an Orten mit besonders hoher Bindungsaffinität zu so ge-
nannten Dekorationseffekten führen, die den Schatteneffekt überlagern und das Bild
verfälschen können. Weiterhin können Restgase, insbesondere Wasserdampf, im
Vakuum auf der kalten Bruchfläche kondensieren und kleine Partikel vortäuschen.
Während des Bruchprozesses sind plastische Deformationen möglich.
Bei der Kryo-Elektronenmikroskopie wird die Probe nach der Kryofixierung direkt in
das TEM eingebracht und untersucht (Taylor & Glaeser, 1976; Dubochet, 1982), wo-
durch Interaktionen mit Metallen (Gefrierbruch-TEM) oder Kontrastierungsreagenzien
(Negative Staining) umgangen werden. Als Probenträger dient ein engmaschiges
Netzchen, welches in die Probe getaucht wird. Nach Entfernen der überschüssigen
Flüssigkeit bildet sich in den Maschen des Netzchens ein maximal 1 µm dicker
Flüssigkeitsfilm aus, der die dispergierten Untersuchungsobjekte enthält. Innerhalb
dieser Flüssigkeitslamelle kommt es zu einer Größenseparierung: kleine Objekte
können in der etwa 100 nm dicken Mitte der Flüssigkeitslamelle beobachtet werden,
während größere Objekte an den dickeren Rand gedrängt werden. Die Entstehung
von Eiskristallen ist auch hier problematisch. Außerdem ist die Gefahr von
Strahlenschäden (strukturelle Veränderungen, Verkochen) sehr hoch, was ein Ar-
beiten mit möglichst geringer Strahlendosis notwendig macht.
1.2. Liposomen - Phospholipide als Arzneistoffträger
Bangham zeigte 1965 erstmals im Elektronenmikroskop, dass in Wasser dispergierte
Phospholipide Vesikel ausbilden, die aus konzentrisch angeordneten Lamellen auf-
gebaut sind (Bangham, 1965).
Liposomen werden definiert als kugelförmige Vesikel, die einen wässrigen Kern
mittels einer oder mehrerer konzentrischer Phospholipid-Doppelschichten umschlie-
ßen. Die Größe der Liposomen ist sehr variabel. 1977 definierte die New York
Academy of Science folgende Liposomen-Typen:
SUV`s (Small Unilamellar Vesicles) sind Liposomen mit einem Durchmesser von
etwa 25 - 50 nm. Sie werden von einer einzigen Bilayerschicht gebildet. Die starke
Membrankrümmung verursacht einen hohen Krümmungsdruck, weshalb die Fusions-
tendenz der SUV`s sehr hoch und damit ihre Stabilität niedrig ist. Die Beladungska-
pazität mit hydrophilen Arzneistoffen ist auf Grund des geringen Einschlussvolumens
verhältnismäßig gering, außerdem ist die Membranpermeabilität wegen der hohen
Einleitung
_________________________________________________________________________________
10
Membranspannung sehr hoch. LUV`s (Large Unilamellar Vesicles) haben einen
Durchmesser von etwa 50 - 1000 nm. Wie die SUV`s bestehen sie aus nur einer
Lipid-Doppelschicht. Wegen ihrer Größe und dem damit verbundenen geringen
Krümmungsdruck ist die Membran nahezu spannungsfrei. MLV`s (Multilamellar
Vesicles) sind aus einer Vielzahl konzentrisch angeordneter Bilayer aufgebaut. Ist die
Bilayeranzahl gering, werden die Vesikel auch als OLV`s (Oligolamellar Vesicles)
bezeichnet. Die Größe der MLV`s kann zwischen 100 nm und mehreren Mikrometern
variieren. MVV`s (Multivesicular Vesicles) sind Vesikel, die in ihrem Inneren kleinere
Vesikel eingeschlossen haben.
Welche Art von Liposomen entsteht, hängt stark von der Herstellungsmethode ab.
Eine detaillierte Darstellung der verschiedenen Herstellungsverfahren ist bei Lasic
bzw. New gegeben (Lasic, 1993; New, 1990). An dieser Stelle sollen nur die Metho-
den Erwähnung finden, die im Laufe der eigenen Arbeiten verwendet wurden.
Eine mehrfache Extrusion durch isopore Polycarbonatmembranen führt zur Bildung
von LUV`s mit relativ enger und gut reproduzierbarer Teilchengrößenverteilung
(Olson et al., 1979, Mayer et al., 1986). 1994 wurde auf Basis dieses Herstellungs-
prinzips die Herstellung großer Chargen (im Litermaßstab) mittels kontinuierlicher
Hochdruck-Extrusion beschrieben, die einen Fortschritt in Richtung des Einsatzes
der Methode im Industriemaßstab darstellt (Schneider et al., 1994). Die Herstellung
von Liposomen mittels Hochdruckhomogenisation und Möglichkeiten des Scaling Up
wurden von Brandl und Mitarbeitern untersucht (Brandl, 1990; Brandl et al.,
1990, 1993). Die resultierende Liposomen sind sehr klein (SUV`s), und es handelt
sich dabei meist um vergleichsweise heterogene Liposomenkollektive mit bi- oder
trimodalen Teilchengrößenverteilungen (Lasic, 1993). Auch die Dispergierung mittels
Ultraschall produziert hauptsächlich SUV`s (Huang, 1969), diese Methode wird
allerdings nur für die Liposomenherstellung im Labormaßstab genutzt. Besonders
kritisch zu bemerken ist hier der starke Energieeintrag, der zum Erhitzen der Probe
führt und damit die Oxidation ungesättigter Lipide und die Esterhydrolyse forciert.
Außerdem ist anschließend häufig Metallabrieb der Ultraschallsonde mittels Filtration
oder Zentrifugation zu entfernen.
Seit etwa 30 Jahren werden Liposomen intensiv auf ihre Eignung als Arzneistoff-
träger untersucht. Da Phospholipide physiologisch vorkommende Substanzen sind
werden Liposomen als in der Regel physiologisch gut verträglich eingestuft. Die beim
Abbau der Phospholipide entstehenden Produkte sind untoxisch, und Liposomen
Einleitung
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11
gelten als nicht immunogen. Aufgrund ihres Aufbaus können Liposomen sowohl zum
Einbau hydrophiler (im wässrigen Kern) als auch lipophiler Substanzen (in den
lipophilen Teil der Phospholipid-Doppelschicht) genutzt werden. Dem gegenüber
stehen eine Reihe von Nachteilen bzw. noch ungeklärten Problemen, zu denen vor
allem Stabilitätsprobleme gehören. Schwierigkeiten bereitet auch die Herstellung
steriler Liposomendispersionen und häufig das Scaling Up von im Labormaßstab
erfolgreichen Herstellungsverfahren (Lasic, 1993; Zuidam et al., 1996). Diese Gründe
mögen dazu beitragen, dass bis heute trotz intensiver Forschung erst verhält-
nismäßig wenige liposomenbasierte Fertigarzneimittel auf dem Markt sind.
Tab. 1 gibt einen Überblick über einige parenteral zu verabreichende Fertigarznei-
mittel auf Liposomenbasis. Bei AmBisome® umgeht man Probleme der Lagerstabili-
tät, in dem die frisch hergestellte Zubereitung einer Gefriertrocknung unterzogen und
als Lyophilisat in den Handel gebracht wird. Der unbeabsichtigte Verlust von Arznei-
stoffen aus dem Trägervehikel (drug leakage) im Blutkreislauf, der durch HDL (high
density lipoprotein) verursacht wird (Scherphof, 1978), kann durch die Nutzung relativ
dicht gepackter Bilayer (z.B. äquimolare Mengen DSPC + Cholesterol; Senior & Gre-
goriadis, 1982) minimiert werden. Ein weiteres Problem stellte die kurze Verweilzeit
von Liposomen im Blutkreislauf durch die Erkennung und Entfernung von Liposomen
durch das RES (Retikuloendotheliales System) dar. Die Verwendung von SUV`s mit
dicht gepackten Bilayern kann diesen Prozess verlangsamen (Senior & Gregori-
adis, 1982). Daneben konnten auch durch die Kopplung von Polyethylenglycol-
Resten an die Liposomenoberfläche lang zirkulierende, so genannte Stealth®-Lipo-
somen, hergestellt werden (Gregoriadis & McCormack, 1998), was beispielsweise in
Doxil® oder Caelyx® verwirklicht wurde (Tab. 1).
Handelsname Hersteller Arzneistoff Verwendete Lipide
AmBisome ® NeXstar Amphothericin B Hydriertes Soja-PC, DSPG, Cholesterol
DaunoXome ® NeXstar Daunorubicin DSPC, Cholesterol
Doxil ® Sequus Doxorubicin MPEG-DSPC, Hydriertes Soja-PC, Cholesterol
Caelyx ® Essex Pharma Doxorubicin MPEG-DSPC, Hydriertes Soja-PC, Cholesterol
Visudyne ® Novartis Pharma Verteporfin Ei-PC; DMPC
Tab. 1 : Überblick über einige liposomenbasierte Handelspräparate für die parenterale Applikation (Müller & Hildebrand, 1997; Rote Liste 2003). PC: Phosphatidylcholin; DSPG: Distearoylphosphatidyl-glycerol; DSPC: Distearoylphosphatidylcholin; MPEG-DSPC: Methoxypolyethylenglycol-Distearoyl-phosphatidylcholin; DMPC: Dimyristoylphosphatidylcholin.
Einleitung
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12
1.3. Andere Phospholipid-Strukturen
Da sich die vorliegende Arbeit ausgehend von Liposomen hauptsächlich mit einer
neuen morphologischen Spezies von Nanotubes beschäftigen wird, soll an dieser
Stelle kurz auf bislang bekannte phospholipidbasierte tubuläre Strukturen eingegan-
gen werden.
Abb. 6 : Schematische Übersicht über phospholipidbasierte tubuläre Strukturen. Erklärungen im Text.
SUV´s aus Phosphatidylserin bilden nach der Zugabe von Calciumionen und
einstündiger Inkubation bei 37°C so genannte Cochleate Lipidzylinder (Papahadjo-
poulos, 1975). Diese Cochleate haben einen Durchmesser von 200 bis 1000 nm und
sind multilamellar, die Enden sind offen (Abb. 6, Mitte). Die Vorstellungen über die
Bildung der Cochleate beinhalten zunächst ein Aufbrechen der SUV`s nach Calcium-
zugabe. Die so gebildeten flachen Bilayer-Scheiben fusionieren zu großen Bilayern,
die sich anschließend spiralig zu Cochleaten aufwickeln. Durch Entzug der
Calciumionen mittels Natrium-EDTA werden die Cochleate zerstört, es entstehen
LUV`s.
Polymerisierbare Phospholipide, wie 1,2-bis(10,12-tricosadinoyl)-sn-glycero-3-phos-
phatidylcholin (DC23PC oder DC8,9PC, siehe Abb. 7), wurden intensiv wegen ihrer
Fähigkeiten zur Bildung von so genannten Microtubes untersucht (Yager et al., 1985,
1986; Schoen et al., 1987; Burke et al., 1988; Schnur et al., 1987 ). Die Microtubes
haben einen Durchmesser von 0,4 bis 1 µm und eine Länge von 1 bis 200 µm. Sie
besitzen im Gegensatz zu Cochleaten einen flüssigkeitsgefüllten Innenraum, die
Enden sind stets offen und die Wand wird aus 1 bis 10 Bilayerschichten gebildet
(Abb. 6, links). Die Microtubes bilden sich spontan, wenn wässrige Dispersionen von
MLV`s aus der flüssig-kristallinen Phase unter die Kettenschmelztemperatur abge-
Microtube (d ~ 600 nm)
Cochleate (d ~ 400 nm)
Nanotube (d ~ 60 nm)
1 µm
Einleitung
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13
kühlt werden. Auch hier wird eine den Cochleaten ähnliche Bildung über das Zu-
sammenrollen von Bilayern, ausgelöst durch das Durchlaufen des Phasenüber-
ganges infolge Temperaturerniedrigung, vorgeschlagen.
Wird eine Dispersion einer 1:1 Mischung des oben erwähnten DC8,9PC mit dem
kurzkettigen gesättigten 1,2-bis(dinonanoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DNPC,
siehe Abb. 7) einige Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, bilden sich so genannte
Nanotubes (Markowitz et al., 1994; Svenson & Messersmith, 1999). Sie haben einen
Durchmesser zwischen 50 und 60 nm und eine Länge zwischen 10 und 100 µm. Wie
bei den Microtubes existiert ein wässriger Innenraum, die Enden der Nanotubes sind
offen. Die Wand wird von 2 bis 4 Bilayern gebildet und zeigt nicht die typischen
helikalen Windungen, wie sie teilweise für die Microtubes aus reinem DC8,9PC
charakteristisch sind (Abb. 6, rechts). Die weitere Inkubation bei Raumtemperatur
führt zu einer teilweisen Transformation der Nanotubes in helikal gewundene Bänder
mit einer Breite von etwa 25 bis 30 nm. Die Bänder sind netzartig verwoben, an
Kontaktstellen fusioniert und bilden so ein dreidimensionales Gelgerüst.
Abb. 7 : Chemische Struktur von 1,2-bis(10,12-tricosadinoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DC23PC oder DC8,9PC) und 1,2-bis(dinonanoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DNPC).
Tubuläre und helikale Strukturen sind auch von anderen Amphiphilen, abgeleitet von
Gluconamiden (Fuhrhop et al., 1988, 1991) oder Glutaminsäure (Yamada et al.,
1984), bekannt. In der Klasse der Phospholipide gelten die oben genannten
Substanzen jedoch bisher als einzigartig in ihrer Fähigkeit, tubuläre bzw. helikale
Strukturen zu bilden (Singh & Schnur, 1993).
1,2-bis(10,12-tricosadinoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DC8,9PC)
1,2-bis(dinonanoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DNPC)
Einleitung
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1.4. Problemstellung und Ziel der vorliegenden Arbeit
Ausgangspunkt der Arbeit war die Frage nach der Lagerstabilität von Liposomen aus
reinen gesättigten Phosphatidylcholinen in der Gelphase. Erstmals wird ein
spezielles Instabilitätsphänomen beschrieben, welches bei der Lagerung von Disper-
sionen des gesättigten Phospholipids 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin
(DMPC) auftritt: 10%ige DMPC-Dispersionen gelieren nach etwa 4 Wochen, wenn
sie bei 13°C gelagert werden.
Das Ziel der Untersuchungen war die Aufklärung der Ultrastruktur der entstandenen
halbfesten Systeme mittels Transmissionselektronenmikroskopie. Die dabei ent-
deckten für gesättigte Phosphatidylcholine neuartigen tubulären Vesikelstrukturen
stehen im Vordergrund der Arbeit. Ein wichtiger Aspekt war die Frage, welchen Ein-
fluss die Herstellungsmethode auf die Entstehung der Nanotubes und damit die
Gelierung der DMPC-Dispersionen hat. Es sollten die Auswirkungen von Langzeitla-
gerung und Temperaturveränderungen auf die Morphologie der Nanotubes unter-
sucht und die Frage geklärt werden, ob die Wahl des Konservierungsmittels sowie
das Vorhandensein lipidischer Verunreinigungen Einfluss auf die Entstehung bzw.
Morphologie der Nanotubes hat.
Im Hinblick auf eine reproduzierbare Herstellung der Nanotubes war von Interesse,
ob ein Austausch der DMPC-Charge möglich ist. In diesem Zusammenhang wurden
Untersuchungen zur Reinheit verschiedener verwendeter DMPC-Chargen durchge-
führt. Abschließend wurde untersucht, ob die Nanotubes auch in Dispersionen, die
neben DMPC zusätzlich DPPC enthalten, gebildet werden und ob auch in reinen
DPPC-Dispersionen unter vergleichbaren Bedingungen Nanotubes gebildet werden
können.
Material und Methoden 15
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2. Material und Methoden 2.1. Materialien
2.1.1. Phospholipide zur Herstellung der Liposomen
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DMPC) wurde bereitgestellt von
ASTRA ARCUS AB (S-Södertälje) und von Lipoid GmbH (D-Ludwigshafen). Im Lauf
der Arbeit wurden verschiedene Chargen verwendet (siehe Tab. 2). 1,2-dipalmitoyl-
sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DPPC) wurde ebenfalls von ASTRA ARCUS AB (S-
Södertalje) bereitgestellt. Die Phospholipide wurden ohne weitere Aufreinigung ver-
wendet. Untersuchungen zur Reinheit sind in Kapitel 3.2. dargestellt.
Lipid Nr. Chargen-Bezeichnung Hersteller
DMPC 1 100 / 93 Astra Arcus AB
DMPC 2 562191-1 Lipoid GmbH
DMPC 3 201 / 92 Astra Arcus AB
DMPC 4 200 / 92 Astra Arcus AB
DMPC 5 MA 404 722 Astra Arcus AB
Tab. 2 : Übersicht über die verwendeten DMPC-Chargen.
Zur Liposomenherstellung wurden außerdem folgende Substanzen eingesetzt:
Myristinsäure (technische Qualität, 98-100%, Cognis GmbH, D-Düsseldorf); Lyso-
Phosphatidylcholin, ca. 99% (aus Soja-Phosphatidylcholin, Sigma, D-Deisenhofen)
und hydriertes Soja-Lecithin S75-3 (Lipoid, D-Ludwigshafen).
2.1.2. Wässrige Phase
Zur Herstellung der wässrigen Phase wurde Aqua purificata verwendet. Dazu wurde
Leitungswasser über Umkehrosmose (Alpha Q Purification Pack, Millipore, D-
Schwalbach) von Ionen, Partikeln und organischem Material befreit. Der spezifische
Widerstand des aufbereiteten Wasser betrug 18,2 MΩcm (das entspricht einer elek-
trischen Leitfähigkeit von 0,06 µS/cm). Vor der Dispersionsherstellung erfolgte eine
Filtration durch einen 0,2 µm Sterilfilter (Sterifix®, Braun, D-Melsungen). Zur Kon-
servierung wurde standardmäßig 0,01% (m/V) Thiomersal (Synopharm, D-Bars-
büttel) verwendet. Zur Untersuchung des Einflusses von Konservierungsmitteln
kamen außerdem Propyl-4-hydroxybenzoat und Methyl-4-hydroxybenzoat (Fluka
Chemie AG, CH-Buchs) sowie Natriumazid (Sigma, D-Deisenhofen) zum Einsatz.
Material und Methoden 16
_________________________________________________________________________________
2.1.3. Lösungsmittel, Sprühreagenzien und Referenzsubstanzen für die Dünn- schichtchromatographie
Die folgenden Lösungsmittel und Chemikalien wurden für die Dünnschicht-
chromatographie verwendet:
Chloroform, HPLC-Qualität ( ACROS, USA-New Jersey); Methanol, HPLC-Qualität
(Merck, D-Darmstadt); Methanol >99,8% pro Analysi (Roth, D-Karlsruhe); Methyl-
acetat 99% (Sigma-Aldrich, D-Steinheim); Essigsäure 100% pro Analysi (Merck, D-
Darmstadt); n-Hexan (Roth, D-Karlsruhe); 1-Propanol >99,5% pro Analysi (Roth, D-
Karlsruhe); Molybdäntrioxid (ChemPur (D-Karlsruhe), Molybdän (Quelle unbekannt);
Schwefelsäure 95-97% zur Analyse (Riedel-de Haen, D-Hannover); Kupfersulfat-
Pentahydrat (Merck, D-Darmstadt); Phosphorsäure 85% (Merck, D-Darmstadt).
Als Referenz diente eine Mischung folgender Lipide: Sphingomyelin, Phosphatidyl-
cholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylglycerol, Phosphatidyl-
ethanolamin, Sulfatide, Galactocerebroside und Cholesterol (alle Lipide von Sigma
Chemie GmbH, D-München). Die Konzentration jedes Lipids betrug 1 µg/µl in einer
Mischung aus Chloroform und Methanol im Verhältnis 2:1 (V/V).
2.1.4. Weitere Substanzen
Zur Herstellung einer 2%igen Natrium-EDTA-Lösung zum Entfernen von zwei-
wertigen Kationen wurde Natrium-EDTA-Dihydrat (Merck, D-Darmstadt) verwendet.
Calciumchlorid-Dihydrat (Merck, D-Darmstadt) wurde zur Herstellung verschieden
konzentrierter Calciumchlorid-Lösungen verwendet.
2.2. Methoden
2.2.1. Herstellung der Dispersionen
2.2.1.1. Quellung der Phospholipide
Das pulverförmige Phospholipid (typischerweise 0,4 - 4 g) wurde bei Raumtempera-
tur mit der wässrigen Phase, gefiltert durch einen 0,2 µm Sterilfilter (Sterifix®, Braun,
D-Melsungen), versetzt. Wenn nicht anders beschrieben, wurde auf die Herstellung
eines Lipidfilms verzichtet, da durch die großen Mengen an Lipid (s.o.) dünne Filme
und damit Vorteile für die Hydratation der Lipide nicht zu erwarten waren. Es wurden
Phospholipidkonzentrationen zwischen 1 und 10% (m/m) eingesetzt. Zur vollständi-
gen Quellung wurde der Ansatz verschlossen und, wenn nicht anders beschrieben, 2
Tage bei einer Temperatur, die ca. 20 K oberhalb der Kettenschmelztemperatur
Material und Methoden 17
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(Hauptübergangstemperatur, Tm) des Phospholipids lag, in einem Wasserbad oder
im Trockenschrank stehen gelassen.
Während dieser Quellungszeit und vor der Dispergierung wurden die Ansätze per
Hand kurz kräftig geschüttelt.
2.2.1.2. Hochdruckhomogenisation
Eine Möglichkeit, Liposomen herzustellen, bietet die Hochdruckhomogenisation
mittels eines Kolben-Spalt-Homogenisators. In der vorliegenden Arbeit wurde in An-
lehnung an die Arbeiten von Brandl (Brandl, 1990; Brandl et al., 1990, 1993) der
diskontinuierlich arbeitende Micron Lab 40 (APV Gaulin GmbH, D-Berlin) verwendet.
Die Probe wird hierbei mittels hohen Druckes durch einen Ringspalt gepresst,
dessen Spaltbreite hydraulisch eingestellt wird. Durch elektronische Regelung wird
für ein konstantes Druckgefälle am Spalt während des gesamten Homogenisiervor-
gangs gesorgt.
Alle produktberührenden Edelstahlteile wurden zuvor im Trockenschrank mindestens
2 Stunden auf dieselbe Temperatur erwärmt, bei der auch die Quellung der Ansätze
erfolgte (ca. 20 K oberhalb Tm). Wenn nicht anders beschrieben, wurden die Proben
8 Homogenisierzyklen bei einem Druck von 500 bar unterworfen. In einem Arbeits-
gang wird eine Chargengröße von 30 - 40 ml erhalten.
2.2.1.3. Extrusion
Neben der Hochdruckhomogenisation wurde auch die Extrusion zur Herstellung von
Liposomen angewendet. Hierfür wurde das Gerät EmulsiFlex™ C5 (Avestin, CA-
Ottawa) eingesetzt. Die Dispergierung erfolgt durch Pressen der Probe durch isopore
Polycarbonatmembranen mit Porenweiten von 800 nm, 200 nm oder 50 nm (Avestin,
CA-Ottawa).
Der gesamte Extruder wurde zuvor im Trockenschrank für mindestens 2 Stunden auf
eine Temperatur von ca. 20 K > Tm des Phospholipids temperiert. Eine kontinuier-
liche Temperierung der Apparatur während des gesamten Herstellungsprozesses
war nicht möglich. Die Liposomenherstellung erfolgte nicht über eine stufenweise
Zerkleinerung, da der Wechsel der Membranen zeitaufwendig ist und eine Abkühlung
von Apparatur und Dispersion unter Tm sowie eine zusätzliche Verdunstung von
Wasser durch zwischenzeitliches Wiederaufwärmen zu befürchten war. Ein Reißen
oder Verstopfen der Membranen wurde nicht beobachtet. Die Proben wurden 8 - 10
Material und Methoden 18
_________________________________________________________________________________
Dispergierzyklen unterworfen. Die Chargengröße betrug in Anlehnung an die Hoch-
druckhomogenisation ebenfalls 40 ml.
2.2.1.4. Ultraschall
Die Liposomenherstellung mittels Ultraschall erfolgte unter Verwendung des SONO-
PULS-Ultraschall-Homogenisators HD 200 (Bandelin, D-Berlin). Das Gerät ist mit
einem Hochfrequenzgenerator GM 200 (Leistung 200 W, Frequenz 20 kHz) und
einem Ultraschallwandler UW 200 ausgestattet. Verwendet wurde eine Titan-Sono-
trode mit einem Durchmesser von 12,7 mm. Es wurde mit einer Amplitudenbegren-
zung von 20% gearbeitet. Zur Schonung der Proben wurde die Beschallung gepulst
durchgeführt (30% von 1s) und die Proben in einem temperierbaren Dispergiergefäß
behandelt, um ein zu starkes Erhitzen zu verhindern. Als Beschallungszeiten wurden
10 bzw. 30 Minuten gewählt.
2.2.1.5. Probenlagerung
Nach Aliquotierung wurden die Dispersionen bei unterschiedlichen Temperaturen
gelagert. Die Lagerung bei 13°C, 28°C oder 38°C wurde im Thermostat (Julabo, D-
Tuttlingen), bei 23°C im Klimaschrank (Binder, D-Seelbach) und für 2-8°C im Kühl-
schrank durchgeführt. Die jeweils ausgewählten Lagerungstemperaturen sind in den
entsprechenden Kapiteln vermerkt.
2.2.2. Untersuchungsmethoden
2.2.2.1. Hochauflösende Dünnschichtchromatographie (HPTLC)
Für die vergleichende Untersuchung der verschiedenen DMPC-Chargen hinsichtlich
möglicher lipidartiger Verunreinigungen wurde die hochauflösende Dünnschicht-
chromatographie angewendet: Dazu wurden die Lipide über Phosphorpentoxid
getrocknet, genau gewogen und in einer Mischung von 2 Teilen Chloroform und 1
Teil Methanol (V/V) gelöst. Als stationäre Phase wurden Nano Silgur-20 Platten mit
einer Kombinationsschicht aus Kieselgur (Auftrags- bzw. Vorkonzentrierungszone)
und Nanokieselgel 60 (Trennschicht), Größe 10x10 cm und 10x20 cm (Macherey-
Nagel GmbH, D-Düren), verwendet. Die Platten wurden zur Entfernung möglicher
Verunreinigungen und zur Erhöhung des Trennvermögens mit Methanol und weiter-
hin mit Laufmittel 1 vorentwickelt und anschließend bei 110°C für 10 min im Ofen
ausgeheizt. Die Auftragung der gelösten Lipide erfolgte mit Hamiltonspritzen (0,5; 1;
Material und Methoden 19
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2; 5 µl) unter Zuhilfenahme einer Auftragsschablone aus Acryl. Die Entwicklung er-
folgte bei Kammersättigung über drei Stufen: Mit Laufmittel 1 wurde auf die Höhe von
4,8 cm der Trennschicht entwickelt, gefolgt von einer Entwicklung mit Laufmittel 2
und Laufmittel 3 über die gesamte Länge. Laufmittel 1 besteht aus einem Gemisch
aus Essigsäuremethylester/ 1-Propanol/ Chloroform/ Methanol/ 0,25% KCl im Ver-
hältnis 25:25:25:25:9 (V/V), Laufmittel 2 aus einem Gemisch von n-Hexan/ Diethyl-
ether/ Eisessig im Verhältnis 75:23:2 (V/V) und Laufmittel 3 aus n-Hexan.
Für die Detektion wurden zwei verschieden Reagenzien verwendet:
Kupfersulfat/ Phosphorsäure-Tauchbad: Die Lösung besteht aus 10% (m/V) Kupfer-
sulfat-Pentahydrat in 8 % (m/V) Phosphorsäure. Die Platte wird kurz in die Lösung
getaucht und anschließend ca. 7 - 9 min bei 160°C ausgeheizt. Ungesättigte Lipide
und Cholesterol werden als schwarze Flecken auf gelblich-hellbraunem Hintergrund
sichtbar, Lipide mit ausschließlich gesättigten Fettsäureketten werden nicht detek-
tiert.
Dittmer-Lester-Reagenz (Dittmer & Lester, 1964): 4,011 g Molybdän-VI-oxid wird in
100 ml Schwefelsäure (c= 25 mol/l) unter Kochen gelöst (Lsg. A).
0,178 g Molybdän wird zu 50 ml Lsg. A geben und 15 min gekocht, ggf. muss
anschließend dekantiert werden (Lsg. B). Gleiche Volumina Lsg. A und Lsg. B
werden gemischt und mit dem zweifachen Volumen Wasser verdünnt. Nach dem
Aufsprühen erscheinen Phosphatidylcholin, -ethanolamin, -serin, -inositol und
-glycerol sowie Phospatidsäure und Sphingomyelin als blaue, schnell verblassende
Flecken auf hellem Hintergrund. Fettsäuren, Cholesterol, Cerebroside und Triglyceri-
de werden nicht detektiert.
2.2.2.2. Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC)
Für vergleichende Reinheitsuntersuchung der verwendeten Phospholipid-Chargen
sowie die Untersuchung des Einflusses von Konservierungsmitteln bzw. Verunreini-
gungen auf das Phasenverhalten von DMPC wurde mit Hilfe der Differenzkalori-
metrie die Lage und Form der Phasenübergänge der vollständig hydratisierten Lipide
bestimmt.
Als Leistungskompensations-Differenz-Kalorimeter wurde das Gerät Pyris 1 DSC
(Perkin Elmer, D-Überlingen) verwendet. Das Gerät ist mit einer Thermostat-Kühl-
möglichkeit und einem PC-gestützten Auswertesystem ausgestattet. Die Temperatur
des Thermostaten lag zwischen -46 und -50°C. Die Proben wurden in kalt ver-
Material und Methoden 20
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schweißten Aluminiumtiegeln (Perkin Elmer, D-Überlingen) gegen einen Leertiegel
als Referenz vermessen, dazu wurden etwa 10 mg Probe genau eingewogen. Soweit
nicht anders angegeben, betrugen die Heiz- und Kühlraten 5°C/min. Wenn nicht
anders erwähnt, wurde folgendes Temperaturprogramm angewendet: Die Proben
wurden zunächst von 20°C auf 2°C abgekühlt und bei dieser Temperatur mindestens
30 min gehalten. Anschließend erfolgte ein Aufheizen auf 40°C im Falle von DMPC
bzw. auf 60°C bei DPPC. Diese Temperatur wurde für 2 min gehalten und die Proben
danach wieder auf 2°C abgekühlt. Das Gerät wurde mit Wasser und Indium für die
verwendeten Heizraten kalibriert und die Kalibrierungen durch Messungen mit reinem
Indium überprüft.
2.2.2.3. Visuelle Prüfung/ makroskopisches Erscheinungsbild
Als einfachste Kontrolle der Stabilität der Dispersionen wurde eine regelmäßige
Sichtkontrolle durchgeführt, um Inhomogenitäten wie Agglomeratbildung, Sedimen-
tation und Bodensatzbildung sowie Viskositätsveränderungen zu beurteilen.
2.2.2.4. Teilchengrößenanalyse
Die Messung von Partikelgrößen und Partikelgrößenverteilungen ist eine wichtige
Voraussetzung zur Beurteilung der physikalischen Stabilität von Liposomen. Aller-
dings ist es oft nicht möglich, mit Hilfe einer einzigen Methode die gesamte Partikel-
größenverteilung zu beschreiben. Die Anwendung unterschiedlicher mathematischer
und physikalischer Grundlagen bei der Auswertung macht es zudem schwierig, die
erhaltenen Ergebnisse verschiedener Methoden miteinander zu vergleichen (Groves,
1984). Prinzipiell eignen sich Licht- und Elektronenmikroskopie zur Bestimmung der
Teilchengrößenverteilung disperser Systeme, jedoch erlaubt erstere Methode ledig-
lich die Bestimmung von Teilchen > 1 µm und die Elektronenmikroskopie kann immer
nur einen sehr kleinen Ausschnitt der Probe repräsentieren, was besonders bei in-
homogenen Proben problematisch ist. Beide Methoden erfordern zudem ein aufwen-
diges Ausmessen einer sehr großen Anzahl von Partikeln, um eine signifikante Aus-
sage zu erhalten (Groves, 1984) und eignen sich daher nicht für Routinekontrollen.
Allerdings kann die Elektronenmikroskopie ein hilfreiches Mittel zur Überprüfung der
Messergebnisse anderer Messverfahren darstellen (Westesen & Wehler, 1993).
Aufgrund einfacher Probenaufbereitung und relativ guter Reproduzierbarkeit haben
sich Laserstreulichtverfahren als Routinemessverfahren etabliert (Schreiber, 1995).
Material und Methoden 21
_________________________________________________________________________________
2.2.2.4.1. Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS)
Die Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) ist ein dynamisches Streulicht-
verfahren, mit dem sich Partikel in einem Größenbereich zwischen etwa 5 nm und
3 µm bestimmen lassen (Müller & Schuhmann, 1996).
Das Verfahren beruht auf der Auswertung der Fluktuation der Streulichtintensität von
Laserlicht infolge Brownscher Molekularbewegung der Teilchen, die in einem be-
stimmten Winkel zum einfallenden Licht gemessen wird. Kleine Partikel diffundieren
schneller und ergeben daher eine schnellere Fluktuation der Streulichtintensität als
große Partikel. Das Streulicht wird von einem Photomultiplier erfasst, die Daten an
einen Korrelator weiterleitet und dieser berechnet eine Autokorrelationsfunktion. An
diese gemessene Autokorrelationsfunktion wird eine theoretische Korrelations-
funktion g(τ) angepasst. Zwischen der Partikelgröße und der Korrelationsfunktion
besteht für verdünnte, monodisperse Systeme mit Partikeln, die kleiner als die
Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes sind, folgender Zusammenhang:
τ: Verzögerungszeit
K: Betrag des Streulichtvektors
D: Diffusionskonstante
Der Betrag des Streulichtvektors K und die Verzögerungszeit τ sind abhängig von
den Messbedingungen und aus bekannten Größen während einer Messung rech-
nerisch zugänglich. Als einzig variable Größe verbleibt der Diffusionskoeffizient D der
dispergierten Teilchen, mit dessen Hilfe unter der Annahme kugelförmiger Teilchen
nach der Stokes-Einstein-Gleichung der Teilchendurchmesser berechnet werden
kann:
d: Teilchendurchmesser
k: Boltzmann Konstante
T: absolute Temperatur
η: dynamische Viskosität
Die Auswertung der Autokorrelationsfunktion erfolgte mit Hilfe der Kumulanten-
analyse. Als Ausdruck der mittleren Teilchengröße erhält man den so genannten z-
DTkd ⋅⋅⋅⋅= ηπ3
( )g e DKτ τ= −2 2
Material und Methoden 22
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Average Wert unter der Annahme, dass es sich um ein monodisperses System aus
kugelförmigen Partikeln handelt. Daneben wird der Polydispersitätsindex, ein
dimensionsloser Zahlenwert als Ausdruck der Breite der Partikelgrößenverteilung,
angegeben. Er liegt zwischen 0 (für ideal monodisperse Systeme) und 1 (Müller &
Schuhmann, 1996). Anhand des mittleren Teilchendurchmessers und des Poly-
dispersitätsindexes ist keine Unterscheidung zwischen einer sehr breiten und einer
bi- oder multimodalen Verteilung möglich. Aufgrund der Einflüsse der Polydispersität
und der Teilchenanisometrie müssen die PCS-Partikelgrößenangaben mit Vorsicht
interpretiert werden. Für komplexe Teilchengrößenverteilungen ist zusätzlich eine
Auswertung der PCS-Daten mit der MSD-Analyse (MSD: Multi-Size-Distribution)
möglich, über die Aussagen über die Teilchengrößenverteilung zu erhalten sind.
Für die Untersuchungen wurde ein Zetaplus (Brookhaven Instruments, USA-
Holtsville,) mit einem Laser der Wellenlänge 677 nm eingesetzt. Die Detektion der
Streulichtintensität erfolgt unter einem festen Winkel von 90°. Für die Ermittlung der
Teilchengröße wurden 5 - 8 Einzelmessungen à 5 Minuten bei 25°C durchgeführt.
Zur Vermeidung von Streulichteffekten wurden die Proben, wenn notwendig, mit
filtriertem Aqua purificata so lange verdünnt, bis eine mittlere Zählrate von ca.
100000 Impulsen pro Sekunde resultierte.
2.2.2.4.2. Laserdiffraktometrie, gekoppelt mit Polarization Intensity Differential Scattering Technology (LD / PIDS)
Mit Hilfe der Laserdiffraktometrie (LD) können Partikelgrößenverteilungen im Bereich
zwischen 0,1 bis 3500 µm detektiert werden. Grundlage des Verfahrens ist die
Beugung des Lichtes an Teilchen, wobei das entstehende Beugungsmuster von
Form und Größe der Teilchen abhängig ist.
Bei dem verwendeten Laserdiffraktometer handelt es sich um ein LS 230 Small
Volume Module - Gerät (Coulter, USA-Miami). Als Lichtquelle dient ein 750 nm
Laser. 126 Fotodiodendetektoren, aufgeteilt in drei Sektionen, stehen für die Detek-
tion bei verschiedenen Winkeln zur Verfügung.
Für die Detektion von Teilchen kleiner 100 nm ist die Laserdiffraktometrie mit der so
genannten PIDS-Technologie (PIDS: Polarzation Intensity Differential Scattering) ge-
koppelt. Im Unterschied zur Laserdiffraktometrie wird die Streuung von polarisiertem
Licht ausgenutzt. Die Probe wird sowohl mit horizontal als auch vertikal polarisiertem
Licht dreier verschiedener Wellenlängen (450, 600 und 900 nm) bestrahlt. Als Licht-
Material und Methoden 23
_________________________________________________________________________________
quelle dient eine Wolfram-Halogenlampe. Die Detektion der Streulichtintensität er-
folgt über PIDS-Detektoren unter 6 verschiedenen Winkeln (60°, 75°, 90°, 105°, 120°
und 146°). Das sich ergebende Streulichtmuster stellt ein Maß für die Partikelgröße
dar. Durch die Kopplung der Laserdiffraktometrie mit der PIDS-Technologie ist eine
Teilchgrößenbestimmung ab einer Größe von 40 nm möglich.
Für jeden Versuch wurden 5 - 8 Läufe durchgeführt, wobei die Messdauer pro Lauf
120 Sekunden betrug. Zur Vermeidung von Mehrfachstreuung durch zu hohe Pro-
benkonzentrationen wurden die Proben, wenn möglich, so verdünnt, dass eine Be-
ladung von ca. 50% im PIDS-Bereich erreicht wurde. Es wurde bei einer Rührge-
schwindigkeit von 30% gemessen. Mit Hilfe des Coulter-Softwareprogramms wurde
die Volumenverteilung der Partikelgrößen unter Anwendung der Mie-Theorie und der
Annahme sphärischer Teilchen berechnet. In Anlehnung an die Herstellerempfehlun-
gen für das Vermessen von Emulsionen wurden für den Brechungsindex des Ver-
dünnungsmediums Wasser 1,332 und für die disperse Phase 1,45 angenommen.
Im Anhang wird kurz auf die Eignung der Methoden und entsprechenden Auswertun-
gen für die speziell in dieser Arbeit untersuchten Systeme eingegangen (A.2. Anmer-
kungen zu den verwendeten Teilchengrößenbestimmungsmethoden, S. ii).
2.2.2.5. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
Die Transmissionselektronenmikroskopie wurde zur Klärung der Ultrastruktur der
Lipid-Systeme eingesetzt. Für die Aufnahmen wurde ein CEM 902a (Zeiss, D-
Oberkochen) verwendet. Die Beschleunigungsspannung betrug 80 kV.
Die Proben wurden mit Hilfe von drei verschiedenen Präparationstechniken vorberei-
tet.
2.2.2.5.1. Gefrierbruch
Für den Gefrierbruch wurde ein Trägernetzchen mit der Dispersion benetzt bzw. ein
Gelklümpchen aufgebracht, zwischen 2 Kupferträger gelegt und die überschüssige
Substanz mit einem Filterpapier abgesaugt. Diese Sandwichprobe wurde mit Hilfe
von flüssigem Propan bei ca. -150°C eingefroren (Jet Freezer JFD 030, BAL-TEC,
Fl-Liechtenstein) und unter Flüssigstickstoffkühlung in die Gefrierbruchanlage (BAF
060, BAL-TEC, Fl-Liechtenstein) überführt. Dort wurde die Probe bei ca. -150°C und
10-10 bis 10-11 bar aufgebrochen. Die entstandenen Bruchflächen wurden unter einem
Material und Methoden 24
_________________________________________________________________________________
Winkel von 45° mit einem Gemisch aus Platin und Kohlenstoff (95/5% m/m)
bedampft (Schichtdicke: ca. 2 nm). Zur Fixierung dieses Schwermetallabdruckes
erfolgte anschließend das senkrechte Aufdampfen einer ca. 20 nm dicken Kohle-
Schicht.
Nach Entnahme aus der Anlage wurde der Abdruck mit demineralisiertem Wasser
abgeschwemmt, zur Entfernung von Lipidresten dreimal mit einer Mischung aus
Chloroform und Methanol (Volumenverhältnis 1:1) gewaschen und anschließend auf
ein Trägernetzchen aus Gold (200 mesh, Plano, W. Plannet GmbH, D-Wetzlar)
überführt. Es wurden elastische Hellfeldaufnahmen mit Fotonegativen (SO-163,
Kodak Eastman) gemacht.
Neben der Durchführung der oben beschriebenen Präparationsschritte (Herstellung
der Sandwichprobe mit nachfolgendem Einfrieren) bei Raumtemperatur wurde eine
selbstgebaute Einfriereinrichtung (Drechsler, 1990) verwendet, welche die Temperie-
rung der Umgebungsluft sowie aller probenberührenden Teile ermöglicht, so dass
eine Aufwärmung der Proben während der Präparationsphase verhindert und die
Probe von einer definierten Temperatur aus eingefroren werden kann. Die Apparatur
ist in Abb. 8 abgebildet.
Abb. 8 : Apparatur zur Immersion temperierter Proben in flüssige Kryogene („plunge device“). Links: Übersichtsaufnahme; Der obere Teil (A) trägt den Injektor, an dessen Ende das Präparat befestigt wird. Rechts: Detailaufnahme des Temperiermantels (B) mit Probenhalter (Pfeil a) und Thermofühler (Pfeil b). Das Dewargefäß wird mit flüssigem Stickstoff gefüllt und kühlt den inneren Kupferzylinder (Pfeil c), der das Kryogen (flüssiges Propan) enthält.
b a
c
Material und Methoden 25
_________________________________________________________________________________
Alle probenberührenden Teile wurden vor der Präparation ca. 1 Stunde im ge-
schlossenen Temperiermantel (Abb. 8 B) vortemperiert, danach erfolgte die Herstel-
lung der Sandwichprobe und das Einschießen in flüssiges Propan unter ständiger
Überwachung der Temperatur.
2.2.2.5.2. Kryo-TEM
Vor der Präparation wurden die Dispersionen mit filtriertem Aqua purificata so weit
verdünnt, bis eine Lipid-Konzentration von etwa 1% (m/V) resultierte. Gelklümpchen
wurden durch Schütteln dispergiert. Ein Tropfen der so vorbereiteten Probe wurde
auf ein unbefilmtes Trägernetzchen aus Kupfer (600 mesh, BAL-TEC, Fl-
Liechtenstein) aufgebracht, die überschüssige Flüssigkeit mit einem Filterpapier
abgesaugt und das Trägernetzchen sofort in flüssiges Ethan bei ca. -173°C
eingeschossen. Nachdem überschüssiges Ethan mit einem Filterpapier abgesaugt
wurde, konnte die kryofixierte Probe mit Hilfe einer Kryotransfereinrichtung in den auf
75 – 85 K gekühlten Tisch des Transmissionseletronenmikroskops eingeführt wer-
den. Die Proben wurden unter „Low-Dose“ Bedingungen angeschaut und elastische
Hellfeldaufnahmen digital mittels einer Videokamera (DAGE SIT Kamerasystem),
gekoppelt mit einem Bildverarbeitungssystem (IBAS, LEO, D-Oberkochen), gemacht.
2.2.2.5.3. Negative Staining mit Uranylacetat (2%ig)
Für die Negativkontrastierung wurden die Proben mit filtriertem Aqua purificata auf
eine Lipid-Konzentration von maximal 1% (m/V) verdünnt, Gelklümpchen wurden
durch Schütteln dispergiert. Als Probenträger wurden Trägernetzchen (200 mesh,
Plano, W. Plannet GmbH, D-Wetzlar) mit Formvar® befilmt oder kommerzielle,
kohlebefilmte Trägernetzchen (200 mesh, Plano, W. Plannet GmbH, D-Wetzlar)
verwendet. Ein Tropfen Probe wurde auf das befilmte Trägernetzchen aufgetropft
und nach 30 - 60 Sekunden Einwirkzeit mit einem Filterpapier abgesaugt. Danach
wurde ein Tropfen Uranylacetat-Lösung 2% (m/m) aufgetragen und ebenfalls nach
30 - 60 Sekunden mit einem Filterpapier abgesaugt. Nach dem Trocknen (frühestens
15 Minuten, spätestens 5 Tage nach der Präparation) wurden die Proben im
Transmissionselektronenmikroskop betrachtet und elastische Hellfeldaufnahmen mit
Hilfe von Fotonegativen (SO-163, Kodak Eastman) gemacht.
Material und Methoden 26
_________________________________________________________________________________
2.2.2.6. Röntgenstrukturanalyse
Zur Detektion der Lamellarphase vollständig hydratisierten DMPC`s im Rahmen von
Reinheitsuntersuchungen der DMPC-Chargen (siehe Kapitel 3.2) wurden Klein-
winkelmessungen an einem Generator ID 3003 (Seifert & Co., D-Ahrensburg)
durchgeführt. Die Generatorspannung betrug ca. 50 kV, der Röhrenstrom ca. 40 mA.
Die Detektion der Cu-Kα1α2-Strahlen erfolgte auf ortsempfindlichen Detektoren
(PSD 50 M, M. Braun, D-Garching) eines Kratky-Kollimator-Systems. Der Abstand
zwischen Probe und Detektor betrug ca. 270 mm. Die Proben wurden in einem
Probenträger zwischen zwei Folien (Polyethylenterephthalat) bei einer Temperatur
von 40°C vermessen, die Messdauer betrug, wenn nicht anders beschrieben,
1 Stunde. Für die Bestimmung der d-Werte aus den Peaklagen erfolgte eine
Kalibrierung mittels Silberbehenat (Gitterkonstante/ d-Wert: 58,373 Å; Huang et al.,
1993). Ein für die Lamellarphase typisches Röntgenkleinwinkeldiffraktogramm ist in
der Einleitung (Abb. 5) dargestellt.
2.2.2.7. pH-Wert-Bestimmung
Der pH-Wert der wässrigen Phasen wurde mit dem pH Meter 691 (Ω Metrohm
Ionenanalytik, CH-Herisau) bestimmt. Als Messsonde diente eine Glaselektrode. Die
Messtemperatur betrug 20°C. Die Kalibrierung erfolgte mit Pufferlösungen der Firma
Beckmann bei pH 4,00 (Ch.-Bez. M609077) und pH 7,02 (Ch.-Bez. M609174). Für
jede Probe wurden 3 Messungen durchgeführt.
Alle nicht näher beschriebenen Arbeiten wie beispielsweise das Herstellen von
Lösungen etc. wurden auf Grundlage annerkannter pharmazeutischer Regeln
durchgeführt.
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
27
3. Ergebnisse
3.1 . Lagerstabilität von DMPC-Dispersionen Ausgangspunkt der Untersuchungen war die Frage, ob und in welcher Form sich die
physikalische Lagerstabilität reiner DMPC-Liposomen in Abhängigkeit von der
Phasenlage des Lipids unterscheidet. Liposomen werden zum einen gezielt als
Arzneistoffträger hergestellt, entstehen andererseits auch als Nebenprodukt bei der
Herstellung von phospholipidstabilisierten Emulsionen. Daher ist die Kenntnis vom
Verhalten der Vesikel unter verschiedenen Lagerbedingungen sowohl für liposomale
Zubereitungen als auch für kolloidale Emulsionen von Bedeutung. Betrachtet wird in
der vorliegenden Arbeit nur der Aspekt der physikalischen Lagerstabilität.
Zur Herstellung der Liposomen wurde DMPC 5 (MA 404722 Astra Arcus, siehe
Kapitel 2.1.1.) verwendet. Die Lipidkonzentrationen in der wässrigen Phase betrugen
1%, 2%, und 10% (m/m). In Anlehnung an die Emulsionsherstellung wurde die Di-
spergierung mit Hilfe der Hochdruckhomogenisation durchgeführt. Vorversuche erga-
ben, dass über 8 Homogenisierzyklen bei 500 bar makroskopisch homogene Disper-
sionen mit Teilchengrößen unter 200 nm hergestellt werden können.
3.1.1 . Charakterisierung der Liposomen direkt nach der Herstellung
Nach der Dispergierung erschienen die Dispersionen makroskopisch homogen,
weißlich-trüb und durchscheinend. Die mit Hilfe der PCS ermittelten mittleren
Teilchengrößen sind in Tab. 3 aufgeführt.
DMPC Konzentration 1% (m/m) 2% (m/m) 10% (m/m)
Mittlere Teilchengröße (PCS, z-Average)
157 nm 147 nm 157 nm
Polydispersitätsindex 0,24 0,23 0,21
Tab. 3 : Mittlere Teilchengrößen und Polydispersitätsindices (PCS mit z-Average Auswertung) ver-schieden konzentrierter DMPC-Dispersionen direkt nach der Herstellung mittels Hochdruckhomo-genisation bei 8 x 500 bar/ 40°C. Die Auswertung über MSD-Analyse ergab trimodale Teilchen-größenverteilungen, wobei stets mehr als 95% der Teilchen zwischen 16 und 100 nm groß sind. Hinweis: Die gezeigten Werte sind Messdaten einer Versuchsreihe. Im Verlauf der Arbeit wurden bei Verwendung desselben Lipids und gleicher Herstellungsmethode schwankende mittlere Teilchengrößen (z-Average) zwischen 110 und 190 nm erhalten, es handelte sich immer um sehr breite trimodale Verteilungen.
Die großen Polydispersitätsindices (> 0,2) weisen bereits auf eine sehr breite
Teilchengrößenverteilung oder auf mehrere Teilchenpopulationen hin. Tatsächlich
zeigen elektronenmikroskopische Untersuchungen (Gefrierbruch-TEM, Abb. 9) von
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
28
frisch hergestellten Dispersionen eine sehr heterogene Größenverteilung: Der
zahlenmäßig überwiegende Teil der Liposomen ist deutlich kleiner als 100 nm.
Daneben sind größere Liposomen (100 300 nm) und wenige ausgedehnte Bilayer
bzw. große Lipidpartikel im µm-Bereich enthalten.
Abb. 9 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen einer 10%igen DMPC-Dispersion direkt nach der Herstellung durch Hochdruckhomogenisation (8x 500 nm/ 40°C). Neben Liposomen der Größenordnung 30 100 nm und kleinsten Lipidpartikeln (< 20 nm) enthält die Dispersion wenige Liposomen zwischen 100 und 300 nm (links) und ausgedehnte Bilayerbereiche, die eine Strukturierung der Ripple Phase aufweisen (rechts).
Da die durch Hochdruckhomogenisation hergestellten Dispersionen sehr heterogen
sind, repräsentieren die mittels PCS mit z-Average-Auswertung bestimmten mittleren
Partikelgrößen nur mangelhaft die tatsächlichen Teilchengrößenverhältnisse der
Dispersionen. Die zusätzliche MSD-Auswertung (MSD: Multi Size Distribution) der
PCS-Daten ergibt, dass nach der Hochdruckhomogenisation breite trimodale Ver-
teilungen entstehen. Aus den Verteilungen geht hervor, dass über 95% der Teilchen
zwischen 16 und 100 nm groß sind und die verbleibenden Teilchen Größen bis in
den µm-Bereich besitzen, was gut mit den Beobachtungen der Elektronen-
mikroskopie übereinstimmt. Für vergleichende Untersuchungen bzw. die routine-
mäßige Charakterisierung der Dispersionen wurden trotz der Heterogenität der
Proben und wegen des großen Zeitaufwandes, der zur verlässlichen Bestimmung der
Teilchengrößenverteilung aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen notwendig
wäre, auch weiterhin PCS-Messungen mit z-Average-Auswertung mit Angabe der
Verteilungsbreite aus der MSD-Auswertung herangezogen.
Aus den gezeigten Daten lässt sich festhalten, dass unter Verwendung von reinem
DMPC mittels Hochdruckhomogenisation unter den genannten Herstellungsbe-
dingungen keine homogenen Dispersionen hergestellt werden konnten.
100 nm 100 nm
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
29
3.1.2 . Stabilität der Dispersionen in Abhängigkeit von der Lagerungstemperatur und der Phospholipidkonzentration
Die mittels Hochdruckhomogenisation hergestellten Dispersionen wurden bei 2 - 8°C,
13°C und 38°C gelagert. Bei 38°C liegt vollständig hydratisiertes DMPC in der Lα-
Phase vor, bei 13°C in der Lβ`-Phase. Bei 2 - 8°C wird vermutlich zunächst die Lβ`-
Phase ausgebildet, die mit der Zeit in die Lc-Phase übergeht. Auf Veränderungen des
Phasenverhaltens infolge Dispergierung wird in der Diskussion eingegangen.
Generell ist festzustellen, dass die Dispersionen nicht lagerstabil sind und es zum
Teilchengrößenwachstum und zur Niederschlagsbildung kommt. Diese Instabilität ist
in Abhängigkeit von der Lagerungstemperatur jedoch unterschiedlich stark ausge-
prägt, was anhand der 2%igen Dispersion dargestellt werden soll.
Bereits nach 2 Wochen bildete sich ein Niederschlag, der bei 38°C nur sehr fein, bei
2 - 8°C etwas stärker und bei 13°C deutlich ausgeprägt war. Der feine Niederschlag
bei 38°C konnte durch Schütteln leicht redispergiert werden und veränderte bzw.
vermehrte sich über eine Lagerdauer von 6 Monaten nicht. Bei 2 - 8°C bildete sich
dagegen nach 5 Wochen ein grober, stückig-inhomogener Bodensatz, der sich auch
nach Aufschütteln nicht redispergieren ließ. Bei 13°C war diese Inhomogenität noch
stärker ausgeprägt, und nach 8 Wochen zeigte sich die gesamte Probe stückig-
inhomogen. Teilchengrößenmessungen mittels PCS (Abb. 10) bestätigen die makro-
skopischen Beobachtungen, obwohl die gemessenen mittleren Teilchengrößen (z-
Average) mit Sicherheit fragwürdig sind, da multimodale Verteilungen vorliegen und
die gemessenen Größen weit außerhalb des Messbereichs der Methode (etwa 5 nm
bis 3 µm) liegen. Dennoch werden sie hier aufgeführt, da sie zumindest den
deutlichen Unterschied zwischen den bei 38°C und den bei 13°C bzw. 2 - 8°C
gelagerten Proben dokumentieren. Wegen der starken Inhomogenität der 13°C-
Probe wurden Teilchengrößenmessungen nach 5 Wochen abgebrochen.
Vergleichbare Teilchengrößen ergaben auch die Messungen der 1%igen Dispersion.
Obwohl es auch bei den bei 38°C gelagerten Proben zur Ausbildung eines sehr
feinen Niederschlages kam, detektieren die PCS-Messungen nur einen schwachen
Anstieg der mittleren Teilchengrößen. Möglicherweise liegt das an der vergleichswei-
se geringen Anzahl größerer Partikel, die im Laufe der Messung als Ausreißer eli-
miniert wurden.
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
30
Abb. 10 : Vergleich der mittleren Teilchen-größen (z-Average) einer 2%igen (m/m) DMPC-Dispersion bei unterschiedlichen Lagertemperaturen. Die Messungen der bei 13°C gelagerten Probe wurden nach 5 Wochen abgebrochen.
Eine gravierende Steigerung der beschriebenen Instabilität zeigte sich bei 10%igen
Dispersionen: Bei 13°C gelagert, zeigten sie nach 3 Wochen eine Gelierung der ge-
samten Dispersion zu einer festen, weißlich-transparenten Masse ohne bzw. mit
minimalem flüssigen Überstand. Bei 2 - 8°C bildete sich innerhalb von 3 Wochen
zwar ein stückiger Bodensatz, allerdings kam es auch nach 6 Monaten zu keiner voll-
ständigen Verfestigung der Proben. Das Verhalten der 10%igen Dispersionen bei
38°C entspricht dem der 1%igen und 2%igen Dispersionen.
Als Ergebnis dieser Untersuchungen lässt sich festhalten, dass unter den gewählten
Herstellungsbedingungen keine lagerstabilen Dispersionen aus reinem DMPC herge-
stellt werden konnten. Die Stabilität der DMPC-Liposomen ist in der Gelphase im
Vergleich zur Lα-Phase deutlich schlechter. Überraschend war die Beobachtung der
Gelierung der 10%igen Dispersionen bei 13°C, die ansatzweise auch bei den
niedriger konzentrierten Dispersionen und in kühlschrankgelagerten Proben in Form
von stückig-inhomogenen Niederschlägen beobachtet wurde. Da eine Gelbildung bei
DMPC-Liposomen bisher nicht beschrieben wurde, rückte die Untersuchung dieses
speziellen Instabilitätsphänomens ins Zentrum der vorliegenden Doktorarbeit.
3.2 . Das Gelierungsphänomen
3.2.1 . Makroskopische Beschreibung der Geleigenschaften
Liposomengele sind bisher nur aus den Arbeiten von Brandl et al. bekannt (Brandl
et al.,1997a; 1997b; 1998). Diese werden allerdings direkt nach der Hochdruckhomo-
genisation von hochkonzentrierten (30% - 60% [m/m]) Phospholipidsystemen ge-
bildet. Sie bestehen aus dicht gepackten Liposomen und lassen sich mit Wasser
0 1 2 3 4 5 6120160200240280
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000M
ittle
re T
eilc
heng
röße
/P
CS
/ z-
Ave
rage
(nm
)
Lagerdauer (Monate)
2-8 °C
38°C
13°C
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
31
bzw. Pufferlösungen zu homogenen Dispersionen verdünnen.
Im Gegensatz dazu entstehen die hier beobachteten DMPC-Gele aus vergleichswei-
se niedrig konzentrierten und zunächst dünnflüssigen Dispersionen erst nach etwa 3-
bis 4-wöchiger Lagerung bei 13°C. Mit Wasser lassen sie sich nicht verdünnen, der
Versuch der Dispergierung führt lediglich zur Zerkleinerung des Gels in kleinere
Stücke. Mechanische Beanspruchung durch kräftiges Schütteln eines Gels führt zur
Bildung einer breiartig fließfähigen Masse, die sich auch nach mehrmonatigem
Ruhen bei 13°C nicht wieder verfestigt. Bei Temperaturerhöhung über die Ketten-
schmelztemperatur kommt es ebenfalls zur Zerstörung der festen Konsistenz, wobei
inhomogene, fließfähige Systeme entstehen. Auch hier führt eine anschließende
Lagerung bei 13°C zu keiner Wiederherstellung des Gels. Die makroskopische
Festigkeit des entstehenden Gels wird auch durch die mechanische Manipulation
während der Lagerung beeinflusst. So bilden Dispersionen, die über Wochen in Ruhe
gelassen wurden, feste und gleichmäßige Gele, während Proben, die häufig bewegt
oder zwischenzeitlich geschüttelt wurden, stückig-inhomogene und häufig fließfähige
Systeme bilden.
Diese Beobachtungen geben bereits erste Hinweise auf die Art des Gelgerüstes.
Demnach sind Wechselwirkungen an Partikelgrenzflächen als Ursache für die Aus-
bildung eines Gelgerüstes, wie sie zum Beispiel für Bentonitgele beschrieben (Voigt,
2000) oder für Gele aus festen Lipidnanopartikeln angenommen wurden (Siek-
mann, 1994), unwahrscheinlich. Wahrscheinlicher erschien das Vorliegen mecha-
nischer Verhakungen zwischen sowohl mechanisch als auch temperatur-empfind-
lichen vesikulären Strukturen. Dass die Bildung der Gele temperaturabhängig ist und
eine gewisse Zeit benötigt, deutet darauf hin, dass sich derartige Strukturen erst mit
der Zeit und nur in der Gelphase des Lipids bilden. Im folgenden Abschnitt wird
mittels elektronenmikroskopischer Untersuchungen die Ultrastruktur dargestellt und
eine mögliche Ursache für das beobachtete Phänomen vorgeschlagen.
3.2.2 . Elektronenmikroskopische Beschreibung der halbfesten Systeme
Abb. 11 zeigt typische elektronenmikroskopische Aufnahmen (Gefrierbruch-TEM)
von bei 13°C verfestigten Proben. Die Aufnahmen dokumentieren eine sehr hetero-
gene Zusammensetzung, wobei insbesondere lang gestreckte Strukturen mit heli-
kaler Musterung ins Auge fallen. Aufgrund ihres Aufbaus und ihrer Dimensionen
(siehe Kapitel 3.2.2.1.) werden sie als Nanotubes“ bezeichnet. Der aus den Gefrier-
bruch-TEM Aufnahmen ermittelte Durchmesser der Nanotubes beträgt 40 bis 50 nm.
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
32
Die Schraubenstruktur der Nanotubes ist linkshändig (entgegen den Uhrzeigersinn
bezüglich der Ausbreitungsrichtung entlang der Tubulusachse) und die Ganghöhe
oder Pitch beträgt etwa 23 nm. Der Pitchwinkel kann zwischen 15° und 50° variieren.
Daneben findet man Liposomen mit einer polyedrischen Oberflächenstrukturierung
und einer Größe um 100 nm, weiterhin Liposomen der Größenordnung um 50 nm
ohne erkennbare Strukturierung sowie große Vesikel bzw. Lipidpartikel mit Ripple
Strukturierung.
Abb. 11 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen zwei verschiedener 10%iger DMPC-Dispersionen nach Ge-lierung bei 13°C. A) Überblick mit Nanotubes (Pfeil a) und polyedrisch strukturierten Liposomen (Pfeil b); B) Detailansicht eines Bündels von Nanotubes aus A); C) heterogener Probenbereich mit Nano-tube (Pfeil a), Liposomen (Pfeil b) und großen Bilayerbereichen mit Rippelmuster (Pfeil c).
Durch Untersuchung aller bis dahin hergestellten Gele konnte nachgewiesen werden,
dass es sich nicht um einen einmaligen Zufallsbefund handelte, sondern dass die
makroskopische Gelierung immer mit dem Auftreten der Nanotubes korreliert. Die
Untersuchungen der stückig-inhomogenen Niederschläge von bei 2 - 8°C gelagerten
Dispersionen zeigten ebenfalls Nanotubes. Dagegen traten diese Strukturen nie in
frisch hergestellten Dispersionen auf, was belegt, dass sie sich erst im Laufe der
Lagerung bilden.
Dispersionen, die oberhalb bzw. im Bereich der Kettenschmelztemperatur gelagert
wurden und trotz Niederschlagsbildung keinerlei Tendenz zur Gelierung zeigten, wa-
ren frei von Nanotubes. Abb. 12 zeigt stellvertretend eine 10%ige DMPC-Dispersion,
die über 3 Monate bei 23°C gelagert wurde. Untersuchungen des Niederschlags zei-
gen, dass keine kleinen Liposomen der Größenordnung 100 nm und kleiner vor-
lagen, wie sie in den frisch dispergierten Proben und auch noch in den Gelen zu
finden sind. Vielmehr sind bei 23°C alle Vesikel zu großen Liposomen und
Bilayerbereichen bzw. Lipidpartikeln fusioniert, deren Größe über 200 nm liegt. Die
Liposomen und Bilayer weisen Ripple Strukturen auf. Nanotubes sind nicht enthalten.
A B C
100 nm 100 nm 100 nm
b
a
a
b
c
c
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
33
Abb. 12 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen des Niederschlags einer 10%igen DMPC-Dispersion nach dreimonatiger Lagerung bei 23°C. Die Probe wird dominiert von großen Vesikeln, die Ripple Struktu-ren aufweisen. Sie ist frei von Liposomen der Größenordnung 100 nm und kleiner, Nanotubes sind ebenfalls nicht vorhanden.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Nanotubes die Ursache für die beob-
achtete Gelbildung darstellen. Im Folgenden sollen die Nanotubes näher charakteri-
siert und geklärt werden, wie sie zur Bildung eines Gelgerüstes befähigt sind.
3.2.2.1 . Elektronenmikroskopische Charakterisierung der Nanotubes
3.2.2.1.1 . Gefrierbruch-TEM
Standardmäßig erfolgte die Probenpräparation für den Gefrierbruch bei Raum-
temperatur. Durch zügiges Arbeiten konnte die Verweilzeit der Probe bei Raum-
temperatur auf etwa eine halbe Minute reduziert werden. Dennoch ist bei einem
Probenvolumen von 5 µl eine Erwärmung der gesamten Probe sehr wahrscheinlich.
Um auszuschließen, dass es sich bei den beobachteten Nanotubes um Artefakte
durch Temperaturerhöhung handelt, wurde die Präparation mit Hilfe einer thermo-
statisierbaren Kryofixationsapparatur (Drechsler, 1990) unter Vorkühlung der direkten
Umgebungsluft sowie aller probenberührender Gerätschaften bei 13°C ± 1°C
durchgeführt (siehe 2.2.2.5.1). Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen belegen,
dass die Morphologie der Nanotubes im Vergleich zur Präparation bei
Raumtemperatur unverändert ist (Abb. 13). Damit konnte gezeigt werden, dass die
Nanotubes sich nicht infolge kurzzeitiger Erwärmung während der Präparation bilden.
Einen deutlichen Unterschied sieht man allerdings bei den ausgedehnten Lipid-
partikeln: Bei 13°C Präparationstemperatur findet man konvex-konkave Bilayerdefor-
mationen mit Krümmungsradien von etwa 20 nm, wie sie von kalt hydratisiertem
DMPC bekannt sind (Meyer et al., 2000). Im Gegensatz dazu wurden bei der
500 nm 500 nm
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
34
üblichen Präparationsmethode bei Raumtemperatur ausschließlich Lipidpartikel mit
Ripple Muster gefunden (vgl. Abb. 11).
Abb. 13 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen eines Gels (10% DMPC) nach Einfrieren bei genau 13°C. Links erkennt man neben Nanotubes Liposomen der Größenordnung 100 nm. Rechts sind außerdem Bilayer mit konvex-konkaven Deformationen (Pfeile) sichtbar. Der Krümmungsradius dieser Aus-buchtungen beträgt etwa 20 nm.
Meyer et al. beschrieben, dass die konvex-konkaven Bilayerdeformationen schon bei
geringen Temperaturerhöhungen zugunsten der Rippelmuster verschwinden. Das
korreliert mit den vorliegenden Beobachtungen und unterstützt die Vermutung, dass
es während der Präparation bei Raumtemperatur zu einer Erwärmung der Probe
kommt. Die Nanotubes hingegen zeigen keine vergleichbare Temperaturabhängig-
keit, ihre Morphologie und Abmessungen blieben in den kurzen Zeiträumen unverän-
dert.
Die Gefrierbruchpräparation erlaubt zwar das Beurteilen der Vesikeloberflächen,
ermöglicht aber nur einen sehr begrenzten Einblick in die innere Struktur der
Nanotubes. Einige Nanotubes sind im Querschnitt gebrochen (Abb. 14, Kreise). Zu
erkennen ist hier, dass es sich um schlauchartige Gebilde handelt, deren Innenraum
hohl bzw. wassergefüllt erscheint.
Abb. 14 : Gefrierbruch-TEM Aufnahme ei-nes Gels (10% DMPC, gelagert bei 13°C). Einige Nanotubes sind im Querschnitt gebrochen (Kreise) und lassen den schlauchähnlichen Aufbau erkennen.
Allerdings können mit der Gefrierbruchpräparation Fragen nach der Länge, der
Lamellarität sowie nach dem Aussehen der Enden nicht eindeutig beantwortet
100 nm
100 nm 100 nm
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
35
werden. Weiterhin musste geklärt werden, ob diese Strukturen tatsächlich zur
Bildung eines Gerüstes befähigt und damit für die Gelierung der Probe verantwortlich
sind. Dazu wurden die Negative Staining Präparation mit Uranylacetat (Negativkon-
trastierung) und die Kryo-Präparation eingesetzt.
3.2.2.1.2 . Negative Staining Präparation (Negativkontrastierung)
Diese Präparationsmethode ermöglicht, ebenso wie die Kryo-Präparation, eine elek-
tronenmikroskopische Darstellung der Lipidstrukturen in Transmission. Für die Prä-
paration ist es notwendig, die Proben auf eine Lipidkonzentration von ~ 1% zu ver-
dünnen. Dies geschieht durch mechanisches Zerkleinern eines Gelstückes in der
entsprechenden Menge Wasser.
Abb. 15 : Verschiedene Negative Staining Präparation von DMPC-Nanotubes (Erklärungen im Text).
100 nm 100 nm
100 nm
100 nm
1 µm
100 nm
F
A
E
B
C D
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
36
Als Konsequenz dieser Behandlung werden kaum intakte Nanotubes gefunden.
Somit sind keine eindeutigen Aussagen über deren Länge möglich. Das längste
gefundene Bruchstück maß ca. 14 µm (Abb. 15 C), es kann aber davon ausgegan-
gen werden, dass die Nanotubes deutlich länger sind.
Die Nanotubes sind ausnahmslos unilamellar, d.h. sie stellen lange, schlauchartige
Zylinder dar, deren Wand von einer einzigen Bilayerschicht gebildet wird. Die helikale
Strukturierung ist auch hier deutlich erkennbar (Abb. 15 A). Die Ganghöhe beträgt
ca. 23 nm, was etwa den symmetrischen Periodizitäten der Bilayer der Pβ`-Phase
(25 - 30 nm) entspricht. Die Negativkontrastierung mit Uranylacetat unterstützt die
ersten Beobachtungen im Gefrierbruch (Abb. 14), dass es sich um schlauchartige
Gebilde handelt, die einen wässrigen Hohlraum umschließen: In die offenen Enden
konnte das Uranylacetat während der Kontrastierungsphase eindringen, wurde aber
zum Teil bei der Entfernung des Kontrastmittels durch Absaugen mittels Filterpapier
wieder entfernt, was an der Aufhellung der offenen Enden erkennbar ist (Abb. 15 E,
Pfeile). Die TEM-Aufnahmen zeigen aber auch Nanotubes mit intakten Enden
(Abb. 15 B und D, Kreise): Die Röhren sind mit halbrunden Kappen verschlossen. Es
wurden keinerlei Verzweigungen gefunden. In Abb. 15 F ist erkennbar, dass die
Nanotubes eine gewisse Flexibilität aufweisen und dadurch in der Lage sind, sich
untereinander zu verflechten, was die Grundlage für ein dreidimensionales Gelgerüst
darstellen kann.
Damit lassen sich die Nanotubes als unverzweigte, unilamellare, zylinderförmige und
an den Enden durch halbrunde Kappen geschlossene Lipidvesikel beschreiben, die
einen wässrigen Hohlraum einschließen. Aus den TEM-Aufnahmen werden Durch-
messer von etwa 40 nm bis 50 nm und eine Länge von > 14 µm ermittelt. Der Bilayer
zeigt eine linkshändige helikale Struktur.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Nanotubes tatsächlich Bausteine eines
Gelgerüstes sind. Abb. 16 (A und B) zeigt die TEM-Aufnahmen eines völlig intakten
Netzwerks aus Nanotubes. Die Nanotubes sind ähnlich Fäden in einem Gewebe
miteinander verwoben. In den Maschen dieser Netze können Liposomen (Abb. 16 B)
oder auch andere Lipidpartikel eingelagert sein. Die einzelnen Nanotubes verlieren
durch die Vernetzung ihre Identität nicht und es wurden keinerlei Fusionen der Nano-
tubes an den Kontaktstellen beobachtet. Der Zusammenhalt erfolgt demnach auf-
grund rein mechanischer Wechselwirkungen. Im Falle der Verdünnung in Kombina-
tion mit mechanischer Belastung in Vorbereitung auf die Negative Staining Präpara-
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
37
A B C
100 nm 100 nm 100 nm
tion werden derartige Netzwerke in der Regel durch Zerreißen der Nanotubes zer-
stört. Dadurch gelingt die Präparation intakter Netzwerke relativ selten, häufig findet
man aber Nanotubes, die trotz großer Verdünnung an den Kontaktstellen miteinander
verbunden bleiben (Abb. 16 C).
Abb. 16 : TEM-Aufnahmen von vernetzten Nanotubes nach Negative Staining Präparation. A) Intaktes Nanotube-Netzwerk (Überblick); B) Detailansicht des Netzwerks aus Aufnahme A; C) Nanotube-Bruchstücke bleiben auch in der Verdünnung teilweise an ihren Kontaktstellen ver-bunden.
Diese elektronenmikroskopischen Befunde korrelieren sehr gut mit der makrosko-
pischen Sensitivität der Gele gegenüber mechanischer Belastung, die zur Bildung in-
homogener fließfähiger Systeme führt.
Bezüglich der Präparationsmethode lässt sich festhalten, dass sich die Negative
Staining Präparation sehr gut zur Darstellung und Charakterisierung der Nanotubes
und ihrer Netzwerke eignet. Im Vergleich zur Gefrierbruchpräparation und der
nachfolgend genutzten Kryo-Präparation ist sie relativ unkompliziert und schnell
durchführbar, was einen großen Vorteil für Routineuntersuchungen darstellt. Ein
Problem stellt allerdings die notwendige Verdünnung dar, infolge derer die Nanotube-
netzwerke zerstört werden. Kritisch zu bemerken ist außerdem das Auftreten von
Trocknungseffekten. Häufig kommt es zur Abbildung faltiger Liposomen aufgrund der
Kollabierung der Vesikel durch den Flüssigkeitsverlust. In einigen Präparationen tre-
ten außerdem viele kleine stäbchenförmige Gebilde mit Längen von etwa 30 nm und
Dicken von etwa 6 nm auf (siehe auch Abb. 15 A). Dabei kann es sich möglicher-
weise um Stäbchenmizellen handeln, die durch chemische Veränderungen infolge
Hydrolyse (Bildung von Lysophosphatidylcholin und freien Fettsäuren) entstanden
sein könnten. Eine andere Erklärung wäre, dass es sich um durch den Trocknungs-
prozess kollabierte kleine Liposomen handeln, wobei diese Möglichkeit wahrschein-
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
38
licher erscheint, da derartige Stäbchen im Gefrierbruch nicht auftraten.
3.2.2.1.3 . Kryo-Präparation
Auch mittels Kryo-TEM ist die Abbildung der Nanotubes prinzipiell möglich (Abb. 17).
Bemerkenswert ist, dass die mit dieser Methode detektierten Nanotubes einen deut-
lich kleineren Durchmesser von nur etwa 35 - 45 nm aufweisen, während im Gefrier-
bruch und vor allem beim Negative Staining ca. 40 - 50 nm gemessen werden. Die
stäbchenförmigen Strukturen, die in den Negative Staining Präparationen auftraten,
wurden mit Kryo-TEM nicht gefunden. Daher kann davon ausgegangen werden, dass
es sich dabei um Trocknungsartefakte aus kleinen kollabierten Liposomen handelt.
Abb. 17 : Kryo-TEM Aufnahme eines 5 Monate gelagerten DMPC-Gels. Neben Nanotubes mit einem Durchmesser von etwa 40 nm (A, B) lassen sich vor allem Liposomen < 100 nm detektieren (C, D), die zum Teil Falten auf ihrer Oberfläche tragen (Pfeile).
Die meisten Liposomen sind nicht rund, was darauf hinweist, dass sie sich in der
Gelphase befinden. Einige Liposomen enthalten stark kontrastierte Bereiche, die wie
Falten aussehen (Abb. 17 A, C und D, gekennzeichnet durch Pfeile). Die Auflösung
der mit der Restlichtverstärker Videokamera aufgenommenen Bilder vor allem im
Bereich der Nanotubes ist jedoch vergleichsweise schlecht, so dass keine neuen
Strukturinformationen gewonnen werden können und zur Charakterisierung der
50 nm
50 nm
50 nm
50 nm
A B
C D
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
39
Nanotubes der Negative Staining Präparation eindeutig der Vorzug zu geben ist.
Wie bei der Negative Staining Präparation ist auch hier die notwendige Verdünnung
mit ihren Folgen für die Nanotubes kritisch anzumerken. Weiterhin kommt es zu
einer, in der speziell verwendeten Methode begründeten, Auftrennung der Lipo-
somen in Abhängigkeit von der Teilchengröße, was dazu führt, dass hauptsächlich
die kleinen Liposomen abgebildet werden. Große Strukturen werden entweder vor
dem Einfrieren abgesaugt (ebenso beim Negative Staining), oder entziehen sich an
den dickeren Rändern liegend der Betrachtung.
3.2.2.2 . Lagerstabilität der Nanotubes
Die DMPC-Nanotubes erwiesen sich als sehr lagerstabile Strukturen. Die ältesten
untersuchten Gele zeigten im Gefrierbruch nach 12- bzw. 20-monatiger Lagerung bei
13°C keinerlei morphologische Veränderungen der Nanotubes (Abb. 18). Ebenso wie
in jüngeren Proben begleiten sowohl Liposomen als auch größere Lipidpartikel die
Nanotubes.
Abb. 18 : Gefrierbruch-TEM eines über 12 Monate bei 13°C gelagerten DMPC-Gels. A) Übersichtsauf-nahme; B) Detailansicht von A).
3.2.2.3 . Temperatur-Stabilität der Nanotubes
DMPC-Gele, die auf 38°C erwärmt wurden, verflüssigen sich innerhalb von 48
Stunden ohne mechanische Beanspruchung vollständig. Mittels Gefrierbruch-TEM
konnte gezeigt werden, dass es dabei zum vollständigen Verschwinden der Nano-
tubes kommt (Abb. 19). Stattdessen sind neben kleinen Liposomen (SUV`s = Small
Unilamellar Vesicles) sehr große multilamellare (MLV`s = Multilamellar Vesicles) und
multivesikuläre Liposomen (MVV`s = Multivesicular Vesicles) zu finden. Dieser Pro-
zess ist irreversibel, d.h. auch eine anschließende mehrmonatige Lagerung bei 13°C
100 nm 100 nm
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
40
führt nicht wieder zu einer Gelierung. Es konnten keine Nanotubes mehr detektiert
werden. Das Einhergehen der Verflüssigung mit dem Verschwinden der Nanotubes
bestätigt, dass die Nanotubes die strukturelle Grundlage für die Gelierung der
Dispersionen darstellen.
Abb. 19 : Gefrierbruch-TEM Aufnahme einer 10%igen DMPC-Dispersion, die nach vollständiger Gelierung auf 38°C erwärmt wurde. Die Probe ist vollständig verflüssigt, Nanotubes sind nicht mehr zu detektieren.
Aus dieser Beobachtung ergab sich die Frage, wie sich die Morphologie der Nano-
tubes in Abhängigkeit von der Temperatur, besonders bei Temperaturerhöhung,
verändert. Einerseits wäre ein Abbau der Nanotubes zu Liposomen denkbar, die
ihrerseits anschließend durch Fusion große Vesikel bilden. Eine andere Möglichkeit
umfasst die direkte Fusion der Nanotubes zu Vesikeln bzw. Lipidpartikeln. Zur Klä-
rung des Zerstörungsmechanismus der Nanotubes wurden Gefrierbrüche eines
10%igen DMPC-Gels unter stufenweiser Erhöhung der Temperatur in 2°C-Schritten
zwischen 13°C und 19°C angefertigt. Die Probe wurde bei jeder Temperatur
24 h äquilibriert und direkt kryofixiert.
Abb. 20 : Gefrierbruch-TEM Aufnahme eines 10%igen DMPC-Gels (Lagerung bei 13°C). Links: Aus-gangssituation nach 2,5-monatiger Lagerung bei 13°C; Rechts: gleiche Probe nach Erwärmung auf 15°C über 24h. Eine Temperaturerhöhung auf 15°C über 24h bewirkt noch keine morphologische Ver-änderung der Nanotubes.
100 nm
13°C 15°C
100 nm100 nm
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
41
!
! 100 nm 100 nm 100 nm
17°C 17°C 17°C
Eine Temperaturerhöhung auf 15°C führt nach einer Äquilibrierungsphase von
24 Stunden zu keiner sichtbaren Veränderung der Nanotubes (Abb. 20). Bei der
weiteren Erwärmung auf 17°C werden allerdings zwei Veränderungen beobachtet:
Neben den bekannten Nanotubes findet man in der erwärmten Probe auch solche,
deren Enden keulenartig aufgeweitet sind bzw. in große Lipidpartikel münden
(Abb. 21, gekennzeichnet durch Kreise). Daneben treten außerdem vereinzelt Nano-
tubes auf, die ihre strenge Strukturierung mit einer Ganghöhe von etwa 23 nm
zugunsten einer etwa doppelten Ganghöhe verloren haben (Abb. 21, Pfeil).
Abb. 21 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen des unter Abb. 20 vorgestellten Gels nach 24-stündiger Lage-rung bei 15°C und weiteren 24 Stunden Lagerung bei 17°C: Neben unveränderten Nanotubes (linke Abbildung, Sternchen) sind vereinzelt keulenartige Ausstülpungen an den Nanotube-Enden zu finden (Kreise). Daneben findet man Nanotubes, deren gleichmäßig enge Schraubung von ca. 23 nm auf 42 - 50 nm aufgeweitet ist (rechte Abbildung: Pfeil).
Abb. 22 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen des unter Abb. 20 gezeigten Gels nach 24 h Lagerung bei 15°C, 24 h Lagerung bei 17°C und 24 h Lagerung bei 19°C. Bei 19°C werden vermehrt Nanotubes mit vergrößerter Ganghöhe gefunden.
Das Auftreten dieser aufgeweiteten Nanotubes nimmt bei der weiteren Temperatur-
100 nm
19°C
100 nm 100 nm
19°C 19°C
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
42
steigerung auf 19°C zu (Abb. 22), während immer weniger der ursprünglichen
Nanotubes mit kleinerer Ganghöhe zu finden sind. Gleichzeitig findet man verstärkt
ausgedehnte Lipidpartikel bzw. große Vesikel mit einer Ripple Phase Struktur. In
einigen Nanotubes ist in den Bereichen vergrößerter Ganghöhe außerdem eine
Längsstreifung zu sehen (Abb. 22, Detailansicht in der Mitte).
Gefrierbruch-Präparationen, bei denen die Gele bis zu 20 Minuten der Raum-
temperatur (21°C ± 2°C) ausgesetzt waren (Abb. 23 A) und auch Negative Staining
Präparationen unter gezielter Erwärmung der Probe auf Raumtemperatur (Abb. 23 B
und C) zeigen Nanotubes mit den gleichen morphologischen Veränderungen.
Abb. 23 : Verschiedene Präparationen von DMPC-Gelen bei Raumtemperatur (21°C). A) Gefrier-bruch-TEM Aufnahme; B) und C) Negative Staining mit Uranylacetat. Die Nanotubes zeigen keulen-artige Aufweitungen.
Die vorgestellten Ergebnisse belegen, dass eine Temperaturerhöhung zu Entspan-
nung und Aufweitung der strengen Schraubenstruktur führt. Dies äußert sich ent-
weder in keulenartigen Ausstülpungen, wobei die Nanotubes in große Vesikel über-
gehen. Zum anderen können Veränderungen auch über das gesamte Nanotube in
der Form einer Aufweitung der Schraubenstruktur stattfinden. Dabei scheint zunächst
jede zweite Windung betroffen zu sein. Die so neu entstandenen Zwischenräume
lassen teilweise eine Längsstreifung erkennen. Endpunkt dieses Veränderungspro-
zesses bildet das vollständige Verschwinden der Nanotubes zugunsten großer Vesi-
kel bzw. ausgedehnter Lipidpartikel.
3.2.3 . Einfluss der Herstellungsmethode auf die Gelbildung und Nanotube- Entstehung
Eine weitere Fragestellung beinhaltete, inwieweit die Art der Dispergierung die
Entstehung der Nanotubes beeinflusst. In diesem Zusammenhang wurde untersucht,
100 nm 100 nm 300 nm
A B C
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
43
ob durch eine Variation der Herstellungsparameter bzw. die Wahl einer anderen
Herstellungsmethode die Gelierung und Entstehung der Nanotubes gezielt gefördert
oder aber verhindert werden kann.
Zunächst wurde geprüft, ob für die Bildung von Nanotubes eine Dispergierung
überhaupt notwendig ist. Dazu wurde vollständig hydratisiertes DMPC bei 13°C für
3,5 Monate ohne mechanische Beanspruchung gelagert. Die TEM-Aufnahmen
(Abb. 24) zeigen, dass ausschließlich ausgedehnte lamellare Lipidstrukturen vorlie-
gen, zwischen denen große Mengen Wasser eingelagert sind. Nanotubes haben sich
unter diesen Umständen nicht gebildet.
Abb. 24 : Gefrierbruch-TEM von vollständig hydratisiertem DMPC-Bulkmaterial nach 3,5 Monaten La-gerung bei 13°C. Es sind ausschließlich ausgedehnte Bilayer mit Rippel-Muster zu sehen, Nanotubes haben sich nicht gebildet.
Daraus lässt sich schließen, dass eine Dispergierung des Phospholipids eine ent-
scheidende Voraussetzung für die Bildung der Nanotubes darstellt.
3.2.3.1 . Eigenschaften der Dispersionen nach Extrusion mit dem EmulsiFlex C5 im Vergleich zur Hochdruckhomogenisation Neben der bisher standardmäßig verwendeten Hochdruckhomogenisation wurden
Liposomen mittels Extrusion durch isopore Polycarbonatmembranen hergestellt. Die
Dispergierung erfolgte über 8 Zyklen durch zwei geschichtete Membranen mit einem
Porendurchmesser von 200 nm bei 40°C. Es wurde DMPC der Charge 5 (MA
040722 Astra Arcus) verwendet und Dispersionen mit 2%, 5% und 10% (m/m) DMPC
hergestellt.
Die Dispersionen sind weiß, homogen und kaum durchscheinend. Die mittels PCS
mit z-Average-Auswertung ermittelten mittleren Teilchengrößen nach der Herstellung
sind in Tab. 4 aufgelistet. Die MSD-Auswertung der PCS-Daten ergab für die 2%ige
100 nm 100 nm
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
44
Dispersion eine sehr enge monomodale Verteilung (160 175 nm), für die 5%ige
Dispersion ebenfalls eine monomodale Verteilung (zwischen 71 und 271 nm) und für
die 10%ige Dispersion eine bimodale Verteilung (95 112 nm und 180 212 nm).
Die Extrusion ermöglicht somit im Gegensatz zur Hochdruckhomogenisation die
Herstellung deutlich homogenerer Dispersionen: Vesikel mit Größen über 300 nm
sind nicht enthalten, ebenso fehlen Liposomen bzw. Lipidpartikel, die kleiner als
50 nm bzw. 30 nm sind. Es handelt sich demnach um verhältnismäßig eng verteilte
Teilchenkollektive, deren mittlere Größe gut durch den z-Average repräsentiert wird.
Eine Gefrierbruch-TEM-Aufnahme einer frisch extrudierten 10%igen Dispersion ist in
Abb. 27 C in direkter Gegenüberstellung mit einer hochdruckhomogenisierten Disper-
sion abgebildet.
DMPC Konzentration 2% (m/m) 5% (m/m) 10% (m/m)
Mittlere Teilchengröße 168 nm 142 nm 149 nm
Polydispersitätsindex 0,01 0,09 0,09
Verteilungsbreite nach MSD-Auswertung
Monomodal (160 175 nm)
Monomodal (71 271 nm)
Bimodal (95 112 nm und 180 212 nm)
Tab. 4 : Mittlere Teilchengrößen und Polydispersitätsindices (PCS mit z-Average Auswertung) sowie Breite der Teilchengrößenverteilung (PCS mit MSD-Auswertung) unterschiedlich konzentrierter DMPC-Dispersionen direkt nach der Herstellung mittels Extrusion durch zwei 200 nm Polycar-bonatmembranen (8 Zyklen, 40°C). Die Werte stellen Mittelwerte aus mindestens 5 Einzelmessungen dar.
Da die Dispersionen weiß sind, ist die Homogenität im Laufe der Lagerung nur
schwer zu beurteilen. Bei Betrachtung der durchschnittlichen Teilchengrößen (z-
Average) weisen alle Dispersionen unabhängig von der Lagerungstemperatur eine
gute Lagerstabilität auf (Abb. 25). Auch die Polydispersitätsindices (hier nicht mit
aufgeführt) verändern sich kaum. Die bei 38°C gelagerten Proben zeigen auch
makroskopisch eine gute Stabilität. Bei den bei 13°C bzw. bei 2 - 8°C gelagerten
Proben scheinen dagegen nach etwa 5 bis 8 Wochen leichte Inhomogenitäten aufzu-
treten, die allerdings wegen der Undurchsichtigkeit der Proben nicht weiter zu
präzisieren sind und sich auch nicht in den Teilchengrößenmessungen nieder-
schlagen.
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
45
0 2 4 6 8 10 12100
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
Dur
chsc
hnitt
liche
Tei
lche
ngrö
ße /
PCS
(nm
)
Lagerdauer (Wochen)
38°C 13°C 2-8°C
0 2 4 6 8 10 12110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
210
Dur
chsc
hnitt
liche
Tei
lche
ngrö
ße /
PC
S (n
m)
Lagerdauer (Wochen)
13°C 38°C2-8°C
2% DMPC 5% DMPC
0 2 4 6 8 10 12110
120
130
140
150
160
170
180
190
Dur
chsc
hnitt
liche
Tei
lche
ngrö
ße /
PCS
(nm
)
Lagerdauer (Wochen)
2-8°C 13°C 38°C
10% DMPC
Abb. 25 : Veränderung der durchschnittlichen Teilchengrößen (PCS mit z-Average Auswertung) ver-schiedener DMPC-Dispersionen in Abhängigkeit von der Lagerungstemperatur über einen Lage-rungszeitraum von 3 Monaten. Alle Dispersionen wurden mit DMPC 5 (MA 040722 Astra Arcus) über Extrusion durch Polycarbonatmembranen mit einer Porengröße von 200 nm (8 Zyklen, 40°C) her-gestellt. Die Werte stellen Mittelwerte aus mindestens 5 Einzelmessungen dar.
Abb. 26 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen einer mittels Extrusion hergestellten 10%igen (m/m) DMPC-Dispersion nach 12 Monaten Lagerung bei 13°C. A) Übersichtsaufnahme: Die Probe enthält haupt-sächlich Liposomen, vereinzelt sind auch größere Lipidpartikel und extrem selten Nanotubes (rechteckiger Kasten bzw. dessen Detailansicht in B) enthalten. Die Liposomen sind häufig länglich verformt (C) und sind polyedrisch bzw. zeigen Ripple Phase Muster.
Im Gegensatz zu den hochdruckhomogenisierten Proben kam es auch nach Lang-
A
200 nm 100 nm 100 nm
B C
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
46
zeitlagerung in keinem Fall zu einer Gelbildung. Gefrierbruch-TEM Aufnahmen der
10%igen Dispersion nach 12 Monaten Lagerung bei 13°C zeigen nur extrem verein-
zelt Nanotubes (Abb. 26). Die Proben werden dominiert von Liposomen, deren
Größe zwischen 50 nm und 200 nm variiert. Die Liposomen sind zum Teil länglich
verformt und besitzen eine polyedrische Oberfläche oder Ripple Muster. Seltener
sind auch größere Vesikel enthalten.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die mittels Extrusion hergestellten Di-
spersionen gegenüber den hochdruckhomogenisierten Dispersionen eine deutlich
bessere Lagerstabilität aufweisen. Zwar kommt es auch hier bei Lagerung in der
Gelphase des Lipids zu leichten Inhomogenitäten, jedoch sind diese nur sehr
schwach ausgeprägt und führen nicht zu einer Gelierung des Systems. Mittels
Elektronenmikroskopie wurde gezeigt, dass auch nach Langzeitlagerung bei 13°C
nur extrem vereinzelt Nanotubes in den Proben zu finden sind, was die ausbleibende
Gelbildung erklärt.
Daraus ergab sich die Frage nach der Ursache für die ausbleibende Nanotube- und
Gelbildung der extrudierten Dispersionen im Gegensatz zu den hochdruckhomogeni-
sierten Dispersionen.
Bei der direkten Gegenüberstellung von frisch hergestellten hochdruckhomogeni-
sierten und extrudierten Dispersionen gleicher Konzentration (Tab. 5) fallen trotz
ähnlicher mittlerer Teilchengrößen (PCS mit z-Average-Auswertung) die sehr unter-
schiedlichen Breiten der Teilchengrößenverteilung auf. In Analogie zu den durch
MSD-Auswertung gewonnenen Informationen über die Breite der Teilchengrößen-
verteilungen veranschaulichen Gefrierbruch-TEM Untersuchungen an frisch herge-
stellten Dispersionen die unterschiedliche Ultrastruktur der Systeme (Abb. 27). Die
hochdruckhomogenisierten Dispersionen zeigen, wie auch bereits in Kapitel 3.1.1
ausgeführt, eine sehr heterogene Zusammensetzung (Abb. 27 A, B): Die über-
wiegende Anzahl der Liposomen ist deutlich kleiner als 100 nm, außerdem sind
kleinste Lipidpartikel mit Größen unter 20 nm enthalten. Daneben liegen wenige
Liposomen der Größenordnung 100 200 nm und große Lipidpartikel vor. Ein voll-
kommen anderes Bild ergeben Gefrierbruch-TEM Aufnahmen von frisch extrudierten
Proben (Abb. 27 C): Die Proben sind sehr homogen, wobei Liposomen mit Größen
zwischen 50 nm und 200 nm dominieren. Große und auch extrem kleine Lipidpartikel
sind praktisch nicht enthalten. Die gleichen Ergebnisse beim Vergleich der resul-
tierenden Teilchengrößen in Abhängigkeit von der Herstellungsmethode erhält man
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
47
auch beim Einsatz anderer DMPC-Chargen und bei der Verwendung von DPPC.
Dispergierungs-methode
Hochdruckhomogenisation Micron Lab 40, 8x500 bar/ 40°C
Extrusion EmulsiFlex C5, 8x 200 nm/ 40°C
Makroskopischen Aussehen
Weißlich-trüb und etwas durchscheinend
Weiß und kaum durchscheinend
Mittlere PCS Teilchen-größe (z-Average)
186 nm 156 nm
Polydispersitätsindex 0,19 0,07
Partikelgrößenverteilung (PCS, MSD-Auswertung)
Trimodal (zwischen 16 nm und 3500 nm)
Bimodal (zwischen 97 nm und 231 nm)
Tab. 5 : Gegenüberstellung von Aussehen, mittlerer Teilchengröße und Polydispersitätsindex (PCS mit z-Average Auswertung) sowie Teilchengrößenverteilung (PCS mit MSD-Auswertung) von frisch hergestellten DMPC-Dispersionen (10% [m/m] DMPC 5 [MA040722 Astra Arcus]) in Abhängigkeit von der Herstellungsmethode. Die Werte stellen Mittelwerte aus mindestens 5 Einzelmessungen dar. Die dazugehörigen Gefrierbruch-TEM-Aufnahmen finden sich in Abb. 27.
Abb. 27 : Gegenüberstellung von Gefrierbruch-TEM Aufnahmen 10%iger DMPC-Dispersionen direkt nach der Herstellung: A) und B) Hochdruckhomogenisation mit 8x 500 bar / 40°C; C) Extrusion 8x 200 nm / 40°C.
Da hochdruckhomogenisierte DMPC-Dispersionen bei 13°C gelieren, extrudierte
Dispersionen dagegen nicht, kann aufgrund der sehr unterschiedlichen Teilchen-
größen davon ausgegangen werden, dass neben der Art der Energieeintragung die
Liposomengröße, im speziellen der Feinanteil an Liposomen und Lipidpartikeln,
einen entscheidenden Faktor für die Nanotube-Entstehung darstellt. In Kapitel 3.2.3
(Abb. 24) wurde bereits nachgewiesen, dass große Lipidpartikel bzw. ausgedehnte
lamellare Lipidstrukturen keine Vorstufe der Nanotubes darstellen. Deshalb wurde im
Folgenden untersucht, wie sich die Verringerung der Liposomengröße auf die
Lagerstabilität auswirkt.
100 nm 100 nm 100 nm
A B C
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
48
3.2.3.2 . Beeinflussung der Gelbildungsneigung durch Variation der Her- stellungsparameter
3.2.3.2.1 . Extrusion
Mittels Extrusion durch 50 nm Membranen (statt durch 200 nm wie bisher) ist es
möglich, die Ausgangsteilchengröße und nachfolgend die Lagerstabilität der Disper-
sionen bei 13°C deutlich herabzusetzen. Für diese Untersuchungen wurde das
Phospholipid DMPC 1 (100/93 Astra Arcus) in 10%iger (m/m) Konzentration verwen-
det. Die ermittelten Teilchengrößen sind daher nicht direkt mit denen der bisher be-
schriebenen Proben vorheriger Kapitel vergleichbar, da diese mit einer anderen
DMPC-Charge (MA 040722 Astra Arcus) hergestellt wurden. Zum direkten Vergleich
der Dispersionseigenschaften wurde parallel eine Dispersion mittels Hochdruck-
homogenisation (8 x 500 bar / 40°C) hergestellt. In Kapitel 3.2.4 wird auf die abwei-
chenden Dispersionseigenschaften in Abhängigkeit von der verwendeten Lipid-Char-
ge eingegangen.
Herstellungsmethode E1: Extrusion 8 x 200 nm / 40°C
E2: Extrusion 8 x 200 nm + 8 x 50 nm /
40°C
Hochdruck-homogenisation
(8 x 500 bar) / 40°C Mittlere PCS Teilchen-größe (z-Average) / Polydsipersitätsindex
111 nm / 0,14 70 nm / 0,25 77 nm / 0,24
Breite der Teilchen-größenverteilung (PCS mit MSD-Auswertung)
Bimodal (22 26 nm;
101 148 nm)
Trimodal (12 21 nm; 49 87 nm;
124 224 nm)
Tetramodal (9 35 nm;
35 174 nm; 343 678 nm;
1340 4175 nm) Makroskopisches
Aussehen nach der Herstellung
Weißlich-trüb, durchscheinend und
homogen
Weißlich-trüb, durchscheinend und
homogen
Weißlich-trüb, durchscheinend und
homogen
Nach 2 Wochen bei 13°C
Unverändert Bodensatz wie ein Teppich verdichtet, nach
Aufschütteln stückig inhomogen
Inhomogen: Transparente Gelklumpen
Nach 6 Wochen Unverändert Inhomogen: Transparente Gelklumpen
Vollständig inhomogen
Nach 12 Wochen Sehr wenig feinflockiger Niederschlag
Unverändert Unverändert
Nach 29 Wochen Unverändert Unverändert Unverändert
Tab. 6 : Durchschnittliche Teilchengrößen und Polydispersitätsindices (PCS mit z-Average Auswer-tung) sowieTeilchengrößenverteilung (PCS mit MSD-Auswertung) nach der Herstellung und makro-skopische Stabilität bei 13°C von unter verschiedenen Bedingungen extrudierten Dispersionen im Vergleich zu einer hochdruckhomogenisierten Dispersion. Alle Dispersionen wurden mit DMPC 1 (100/93 Astra Arcus) hergestellt. Dispersion E1 (8 x 200 nm) ist im Vergleich zu den anderen beiden Dispersionen etwas weniger durchscheinend. Die Messwerte stellen Mittelwerte aus mindestens 5 Einzelmessungen dar.
Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass durch Verwendung der 50 nm
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
49
Membran der Feinanteil an Liposomen deutlich zugenommen hat und ein Teil der
Vesikel kleiner als 50 nm ist (Abb. 28 B, C), was auch durch die über PCS ermittelten
Werte für die Breite der Verteilung (MSD-Auswertung) bestätigt wird (Tab. 6).
Abb. 28 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen von extrudierten DMPC-Dispersionen direkt nach der Her-stellung. A) Extrusion 8 x 200 nm/ 40°C, Übersichtsaufnahme; B) Extrusion 8 x 200 nm und an-schließend 8 x 50 nm, Übersichtsaufnahme; C) Detailansicht von B. Durch die zusätzliche Extrusion durch Membranen mit 50 nm Porendurchmesser hat sich der Feinanteil deutlich erhöht. Nahezu alle Liposomen sind kleiner als 100 nm, daneben existieren auch kleinste Lipidpartikel mit Größen unter 20 nm.
Die Ergebnisse zeigen, dass durch die Wahl kleinerer Porendurchmesser bei der
Extrusion Dispersionen mit einem höheren Feinanteil an Liposomen bzw. Lipidparti-
keln hergestellt werden können, wobei die erzielten Teilchengrößen im Durchschnitt
etwas größer sind als die, die während der Hochdruckhomogenisation entstehen. Die
durch 50 nm Membranen extrudierten Proben zeichnen sich im Vergleich zu den
durch 200 nm Membranen extrudierten Proben durch eine deutlich verschlechterte,
im Vergleich zu den hochdruckhomogenisierten Proben durch eine etwas bessere
Lagerstabilität aus, was sich nach etwa 2 Wochen bei 13°C in einer teilweisen
Gelierung der Dispersionen äußert. Im stückigen Niederschlag konnten mittels Trans-
missionselektronenmikroskopie Nanotubes nachgewiesen werden (hier nicht ge-
zeigt).
3.2.3.2.2 . Hochdruckhomogenisation
Wie bei der Extrusion ist es auch bei der Hochdruckhomogenisation möglich, die
Gelbildung hier durch Erhöhung des Homogenisierdruckes - zu forcieren. Während
bei der Verwendung des DMPC der Charge 1 unter Standardbedingungen (8x
500 bar/ 40°C) nach 4 Wochen Lagerung bei 13°C lediglich inhomogen-stückige
Systeme entstehen, wird durch Drucksteigerung auf 1000 bar im selben Zeitraum
und bei 1400 bar bereits nach 3 Wochen eine komplette Gelierung der Probe er-
100 nm 100 nm
A B C
50 nm
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
50
reicht. Abb. 29 stellt dar, wie sich die mittlere Teilchengröße (z-Average) der
Dispersionen in Abhängigkeit vom Homogenisierdruck verändert. Die Verkleinerung
der mittleren Teilchengröße durch Druckerhöhung korreliert mit der gesteigerten
Gelierungsneigung der Dispersionen.
Abb. 29 : Veränderung der mittleren Teilchen-größen (PCS mit z-Average Auswertung) 10%iger DMPC-Dispersionen in Abhängigkeit vom Homo-genisierdruck bei der Hochdruckhomogenisation. Die Werte stellen Mittelwerte aus mindestens 5 Einzelmessungen dar.
Anhand der Grafiken der MSD-Auswertung wird die Zunahme an Liposomen und
Lipidpartikeln mit Größen unter 50 nm mit zunehmendem Homogenisierdruck
verdeutlicht (Abb. 30). In allen Proben verbleiben neben diesen sehr kleinen Partikeln
auch große Teilchen mit bis zu mehreren µm Größe.
Abb. 30 : Auswertung von PCS-Daten mittels MSD-Methode von frisch hergestellten 10%igen DMPC-Dispersionen nach Hochdruckhomogeni-sation unter verschiedenen Drücken. Die Teil-chengrößen sind logarithmisch aufgetragen. Die Balken stellen die Anzahl an Partikel in der entsprechenden Größenklasse dar, während die Kurven die Summenverteilung darstellen.
Die Transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen der entstandenen
Gele zeigen, dass der erhöhte Homogenisierdruck keinen Einfluss auf die Morpholo-
8 x 500 bar 8 x 1000 bar
8 x 1400 bar
400 600 800 1000 1200 1400
30
40
50
60
70
80
Mitt
lere
Tei
lche
ngrö
ße (z
-Ave
rage
) / n
m
Homogenisierdruck (bar)
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
51
gie der Nanotubes hat (Abb. 31). Weit ausgedehnte Nanotubenetzwerke sind trotz
Verdünnung häufig gut erhalten anzutreffen.
Abb. 31 : TEM Aufnahmen (Negative Staining mit Uranylacetat) eines Gels nach 5-wöchiger Lagerung bei 13°C (Herstellung der Dispersion mittels Hochdruckhomogenisation, 8 x 1400 bar / 40°C). Die Morphologie der Nanotubes ist auch bei diesem hohen Herstellungsdruck unverändert. Dominierend sind weit ausgedehnte Nanotube-Netztwerke. Die in der Dispersion verbleibenden Liposomen sind zwischen 40 und 150 nm groß.
Während neben den Nanotubes weiterhin größere Liposomen (zwischen 50 nm
und 150 nm) im Gel vorhanden sind, werden nahezu keine kleinen Lipidpartikel
(< 20 nm) gefunden, wie sie direkt nach der Herstellung vorliegen (vergleiche
Abb. 27 A bzw. Abb. 30).
3.2.3.2.3 . Ultraschall
Zum Abschluss dieser Versuchsreihe sollte geprüft werden, ob bei der Dispergierung
mittels Ultraschall ein vergleichbarer Zusammenhang zwischen dem Energieeintrag
während der Herstellung (und damit der Liposomengröße) und der Gelierungs-
neigung besteht. Als Beschallungszeiten wurden 10 Minuten bzw. 30 Minuten ge-
wählt. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in Abb. 32 und Tab. 7 dargestellt.
Die MSD-Auswertung der PCS-Daten ergab, dass nach 10 Minuten Ultraschall Teil-
chengrößen zwischen 20 und 161 nm entstehen, während nach 30 Minuten Ultra-
schall zusätzlich eine Population kleinster Partikel mit Größen zwischen 8 und 15 nm
gebildet wird.
A B
1 µm 100 nm
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
52
Abb. 32 : Vergleich der Entwicklung der durchschnittlichen Teilchengrößen (LD/PIDS: Laserdiffrakto-metrie mit PIDS gekoppelt; PCS mit z-Average-Auswertung) und des Polydispersitätsindex von zwei verschiedenen, durch Ultraschall hergestellten DMPC-Dispersionen in Abhängigkeit von der Lager-dauer bei 13°C. Die Veränderung des makroskopischen Erscheinungsbildes ist in Tab. 7 zusammen-gefasst. Im Fall von inhomogenen Proben (siehe Tab. 7) wurde nur noch der flüssige Überstand zur Vermessung herangezogen, nach 3 Wochen wurden die Teilchengrößenmessungen wegen zu starker Inhomogenität abgebrochen.
Bei der Betrachtung des Überstandes (Abb. 32) fällt auf, dass es bereits innerhalb
der ersten Woche bei beiden Dispersionen unabhängig von der Ausgangsteilchen-
größe zu einem Anstieg der mittleren Teilchengröße auf etwa 80 nm bis 90 nm (ab-
hängig von der genutzten Meßmethode) kommt. Dieser Wert vergrößert sich nach-
folgend nur noch wenig auf etwa 95 nm bis 105 nm.
10 Minuten Ultraschall / 40°C 30 Minuten Ultraschall / 40°C
Direkt nach der Herstellung
Stark durchscheinend, wenig trüb Sehr stark durchscheinend, fast klar
1 Woche Unverändert Minimale Inhomogenität am Boden (kleine Flocken)
3 Wochen Inhomogen: Probe enthält einige Stückchen
Stückig-inhomogener Bodensatz
9 Wochen Probe komplett stückig-inhomogen Vollständig geliert
13 Wochen Probe komplett stückig-inhomogen, am Boden verfestigt
Vollständig geliert
Tab. 7 : Veränderung des makroskopischen Erscheinungsbildes zweier durch Ultraschall hergestellter DMPC-Dispersionen im Verlauf der Lagerung bei 13°C. Eine Ultraschallbehandlung über 30 Minuten führt zu einer erhöhten Instabilität, die nach 9 Wochen in eine vollständige Verfestigung mündet.
Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen, dass die Größe der neben den
entstandenen Nanotubes verbliebenen Liposomen zwischen 50 nm und 200 nm liegt
(Abb. 33). Dagegen sind auch hier, wie schon bei den hochdruckhomogenisierten
und extrudierten Proben, die sehr kleinen Liposomen bzw. Lipidpartikel nicht mehr
vorhanden.
0 1 2 30,00,10,20,3
30405060708090
100P
olyd
ispe
rsitä
t / P
artik
elgr
ößen
(nm
)
Lagerdauer bei 13°C (Wochen)
LD/PIDS-Partikelgrößen PCS-Partikelgrößen
Polydispersitätsindex
0 1 2 30,00,10,20,3
30405060708090
100110
Pol
ydis
pers
itäts
inde
x /
Par
tikel
größ
en (n
m)
Lagerdauer bei 13°C (Wochen)
LD/PIDS Partikelgrößen PCS-Partikelgrößen
Polydispersitätsindex
10 min Ultraschall 30 min Ultraschall
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
53
Abb. 33 : TEM-Aufnahmen von mittels Ultraschall hergestellten DMPC-Dispersionen nach 7 Wochen Lagerung bei 13°C. Abgebildet sind die neben den Nanotubes verbliebenen Liposomen. A) Dispergie-rung mittels 10 Minuten Ultraschall; B) Dispergierung mittels 30 Minuten Ultraschall.
3.2.3.2.4 . Zusammenfassung
Als Ergebnis der in diesem Kapitel beschriebenen Untersuchungen lässt sich
zusammenfassen, dass ein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Teilchengröße
der Dispersionen und ihrer Neigung zur Gelierung bzw. Nanotube-Entstehung be-
steht. Aus den gezeigten Daten geht hervor, dass mit großer Wahrscheinlichkeit der
Anteil an kleinen Liposomen (deutlich kleiner als 100 nm) und Lipidpartikeln
(< 20 nm) entscheidend für die Nanotube-Entstehung sind, da extrudierte Disper-
sionen, denen dieser Feinanteil fehlt, nahezu keine Nanotubes ausbilden und keine
Gelierung zeigen. Es wurde gezeigt, dass es möglich ist, die Nanotubebildung gezielt
durch Variation der Herstellungsparameter zu fördern bzw. zu unterdrücken. In
einem abschließenden Vergleich der Herstellungsverfahren lässt sich folgende
Reihenfolge bezüglich der Gelbildungstendenz aufstellen:
Extrusion Hochdruck-homogenisation
Ultra-schall
Ultra-schall
Hochdruck-homogenisation
Hochdruck-homogenisation
8 x 200 nm
8 x 200 nm + 8 x 50 nm
8 x 500 bar 10 min 30 min 8 x 1000 bar 8 x 1400 bar
Abb. 34 : Übersicht über den Zusammenhang zwischen Herstellungsmethode und Herstellungs-bedingungen und der Neigung der Dispersionen zur Gelbildung.
Zunahme der Gelbildungstendenz
100 nm 100 nm
A B
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
54
3.2.4 . Einfluss verschiedener DMPC-Chargen auf die Gelbildungstendenz
Im Folgenden wird vorgestellt, wie sich die Verwendung unterschiedlicher DMPC-
Chargen auf die Liposomengröße sowie Gelierungsneigung und Nanotube-Ent-
stehung der Dispersionen auswirkt. Von der Firma Astra standen verschiedene
DMPC-Chargen zur Verfügung, zusätzlich wurde DMPC der Firma Lipoid für die
Untersuchungen herangezogen (siehe Kap. 2.1.1.). Zum Vergleich wurden alle Di-
spersionen mit 10% (m/m) DMPC mittels Hochdruckhomogenisation bei 8 x 500 bar /
40°C hergestellt. Die Ergebnisse für die Lipide 1 (100/93 Astra Arcus) und 5 (MA
040722 Astra Arcus) wurden ausführlicher bereits in den vorangegangenen Kapiteln
(3.1.1 und 3.2.3) dargelegt. Weiterhin wurden DMPC 2 (562191-1, Lipoid), DMPC 3
(201/92, Astra Arcus) und DMPC 3 (200/92, Astra Arcus) verwendet.
Trotz gleicher Prozessführung resultieren Dispersionen mit unterschiedlichen Eigen-
schaften (Abb. 35): Die DMPC-Chargen 3 und 4 ergaben stark durchscheinende Di-
spersionen mit mittleren Teilchengrößen von deutlich weniger als 100 nm, während
die DMPC-Chargen 1, 2 und 5 weiße und wenig durchscheinende Dispersionen mit
mittleren Teilchengrößen von 100 nm und mehr ergaben. Verfolgt man die Lager-
stabilität der Dispersionen bei 13°C, so ergibt sich der überraschende Befund, dass
die Chargen, die kleinere mittlere Partikelgrößen aufweisen, eine geringere Neigung
zur Gelbildung zeigen: Während bei Dispersionen der Chargen 2 und 5 nach 3
Wochen ein Gel gebildet wird, bildet Charge 1 im selben Zeitrahmen nur stückig-
inhomogene Systeme. Bei den Chargen 3 und 4 ist der Effekt noch schwächer
ausgeprägt, nach erst 5 bzw. 6 Wochen treten stückig-inhomogene Niederschläge
auf. Das beschriebene Ausmaß der Gelbildung ändert sich im Verlauf einer 12-
monatigen Lagerung bei 13°C nicht.
Als Ursache für die beobachteten Unterschiede in den Eigenschaften der Disper-
sionen sind Reinheitsunterschiede zwischen den Chargen wahrscheinlich. So schei-
nen vor allem die Chargen 3 und 4 Substanzen zu enthalten, die eine stärkere
Krümmung der DMPC-Bilayer ermöglichen und damit kleinere Partikelgrößen stabili-
sieren. Desweiteren tragen die Verunreinigungen zu einer erhöhten Lagerstabilität
der Liposomen bei, was sich in einer verminderten Nanotube-Bildung und damit einer
verzögerten und abgeschwächten Gelierung äußert. Die Ergebnisse der Reinheits-
untersuchungen, die zur Klärung dieses unterschiedlichen Verhaltens der Disper-
sionen in Abhängigkeit von der verwendeten DMPC-Charge beitragen, sind in Kapitel
3.3. ausgeführt.
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
55
Charge Makroskopischen Aussehen direkt nach der Herstellung (8x 500 bar, 40°C)
DMPC 1 Weißlich-trüb, durchscheinend
DMPC 2 Weiß, wenig durchscheinend
DMPC 3 Weißlich- trüb, stark durch-scheinend
DMPC 4 Weißlich-trüb, sehr stark durch-scheinend
DMPC 5 Weiß, wenig durchscheinend
Abb. 35 : Zusammenhang zwischen der verwendeten DMPC-Charge und dem makroskopischen Aussehen (siehe Tabelle), der durchschnittlichen Teilchengröße (ermittelt über PCS [z-Average]) und der Gelbildungsneigung (siehe Diagramm) bei 13°C Lagertemperatur. Die Herstellung erfolgte über Hochdruckhomogenisation, 8 x 500 bar / 40°C. Im Diagramm ist neben der Teilchengröße aufge-tragen, nach wie viel Wochen deutliche makroskopische Anzeichen der Gelierung der Dispersionen festzustellen waren. Es wird darauf hingewiesen, dass die Zeitangaben ungefähre Werte darstellen (± 3 Tage) und die Ausprägung der Gelierung stark differiert: DMPC 2 und 5 bilden Gele, DMPC 1 stückig-inhomogene Dispersionen und DMPC 3 und 4 lediglich stückige Niederschläge.
In allen Fällen konnten in den Gelen bzw. entsprechenden Niederschlägen Nano-
tubes nachgewiesen werden (hier nicht gezeigt). Für die nachfolgenden Untersu-
chungen zum Einfluss von Konservierungsmitteln und Lipid-Zusätzen auf die Nano-
tube- und Gelbildung wurde die Charge 1 verwendet, da die Chargen 2 und 5 nicht
mehr in ausreichender Menge vorhanden waren und die Chargen 3 und 4 nur eine
schwache Gelbildung zeigten.
3.2.5 . Einfluss von Konservierungsmitteln auf die Eigenschaften 10%iger DMPC-Dispersionen
Um auszuschließen, dass das Phänomen der Nanotube-Entstehung auf die An-
wesenheit von Thiomersal (bisher standardmäßig als Konservierungsmittel der Was-
serphase in einer Konzentration von 0,01% (m/V) eingesetzt) zurückzuführen ist,
wurden DMPC-Dispersionen ohne Konservierungsmittel hergestellt und die Lagersta-
bilität sowie die Ultrastruktur der Systeme untersucht. Von Interesse war weiterhin
die Frage, inwieweit sich eine höhere Thiomersalkonzentration und die Verwendung
anderer Konservierungsmittel auf die Gelierung der Dispersionen und die Ultrastruk-
tur der Nanotubes bei 13°C auswirken. Als alternative Konservierungsmittel wurden
Natriumazid und eine Mischung von Propyl-4-hydroxybenzoat und Methyl-4-hydroxy-
benzoat eingesetzt (Abb. 36). Alle Dispersionen enthielten 10% (m/m) DMPC 1
(100/93, Astra Arcus). Die Hydratation des Lipid-Pulvers erfolgte über 2 Tage bei
DMPC 1 DMPC 2 DMPC 3 DMPC 4 DMPC 52
4
6
DMPC-Charge
Gel
ieru
ng (W
oche
n)(S
ymbo
l: D
reie
ck)
40
60
80
100
120
140
Durchschn. Teilchengröße (nm
) (Sym
bol: Kreis)
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
56
40°C, die Dispergierung wurde mittels Hochdruckhomogenisation mit dem Micron
Lab 40 über 8 Zyklen mit 500 bar bei 40°C durchgeführt.
Abb. 36 : Chemische Struktur der verwendeten Konservierungsmittel.
3.2.5.1 . DMPC-Dispersionen ohne Konservierungsmittel
Mit Hilfe der DSC am hydratisierten Bulkmaterial wurde nachgewiesen, dass sowohl
bei An- als auch bei Abwesenheit von Thiomersal zur Konservierung der wässrigen
Phase identische DSC Heizkurven resultieren (Daten nicht gezeigt). Daher ist davon
auszugehen, dass der Verzicht auf Thiomersal in der Rezeptur keine entscheidenden
Veränderungen im Verhalten der Dispersionen bedingt. Der pH-Wert des demine-
ralisierten Wassers betrug 6,5.
Die Eigenschaften der Dispersion sind in Tab. 8 zusammengefasst.
Makroskopisches Aussehen Weißlich-durchscheinend und homogen
Mittlere Teilchengröße (PCS: z-Average) 53 nm
Polydispersitätsindex 0,31
Teilchengrößenverteilung (PCS: MSD-Auswertung)
Trimodal (9 16 nm; 23 - 48 nm; 99 179 nm)
Mittlere Teilchengröße und Teilchengrößenverteilung (LD/PIDS)
82 nm (Monomodal zwischen 40 und 200 nm)
Tab. 8 : Überblick über die Eigenschaften einer frisch hergestellten 10%igen DMPC-Dispersion ohne Konservierungsmittelzusatz. Die Werte stellen Mittelwerte aus mindestens 5 Einzelmessungen dar. Eine Gefrierbruch-TEM Aufnahme der Dispersion ist in Abb. 37 A abgebildet.
Die elektronenmikroskopischen Gefrierbruchaufnahmen (Abb. 37 A) zeigen neben
einer Population mittelgroßer Liposomen (65 bis 90 nm), etwa ebenso viele sehr
kleine Partikel (Durchmesser ≤ 20 nm) und nur vereinzelt findet man sehr große
Vesikel (Durchmesser > 200 nm).
NaN3
Thiomersal Natriumazid Propyl-4-hydroxybenzoat Methyl-4-hydroxybenzoat
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
57
Bei den mittelgroßen Liposomen ist eine deutliche polyedrische Oberflächenstruktu-
rierung zu erkennen. Die sehr großen Vesikel zeigen Ripple Strukturierung.
Abb. 37 : Elektronenmikroskopische Aufnahmen einer 10%igen DMPC-Dispersion in konservierungs-mittelfreiem Wasser. A) Gefrierbruch-Aufnahme der Dispersion direkt nach der Herstellung (Hoch-druckhomogenisation mit Micron Lab 40, 8 x 500 bar / 40°C); B) und C) Negative Staining Präpara-tion (Uranylacetat) des stückig-inhomogenen Systems nach 4-wöchiger Lagerung bei 13°C.
Nach der Herstellung wurden die Proben bei 13°C, und zum Vergleich auch bei 2 -
8°C (Kühlschrank) und 23°C gelagert.
Bereits zwei Wochen nach der Herstellung zeigen die bei 13°C gelagerten Proben
eine zunehmende Trübung und mittels LD/PIDS wird eine sehr breite bimodale Teil-
chengrößenverteilung zwischen 40 nm und 8 µm detektiert. Nach 4-wöchiger Lage-
rung bei 13°C sind die Proben durchweg gelig-stückig inhomogen, weitere Teilchen-
größenmessungen sind unmöglich. Die Negative Staining Präparation dieser Gel-
stückchen zeigt die Anwesenheit der typisch strukturierten Nanotubes (Abb. 37 B),
die auch in Knäulen verschlungen anzutreffen sind (Abb. 37 C). Es ergibt sich also
das gleiche Bild wie bei den Proben, die 0,01% Thiomersal zur Konservierung
enthielten. Bei den im Kühlschrank (2 - 8°C) gelagerten Proben zeigt sich ein
ähnliches, jedoch im Vergleich zu den bei 13°C gelagerten Proben stark abge-
schwächtes Verhalten: Erst nach 10 Wochen tritt ein stückig-inhomogener Nieder-
schlag auf und nach Negative Staining Präparation des Bodensatzes finden sich
auch hier Nanotubes, wie sie bei den 13°C-Proben (vgl. Abb. 37 B, C) aufgetreten
sind.
Kritisch zu bemerken ist in diesem Versuch sicher das Fehlen einer Konservierung,
da keine anderen keimmindernden Verfahren eingesetzt wurden. Die bei 23°C
gelagerten Proben zeigen bereits nach 2 Wochen erste Anzeichen eines mikrobiellen
Befalls, der nach 4 Wochen in dick-weiße inhomogene Systeme mündet, an denen
keine weiteren Untersuchungen vorgenommen wurden.
Abschließend lässt sich jedoch feststellen, dass eine Beteiligung von Thiomersal an
100 nm 100 nm 100 nm
A B C
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
58
0 5 10 15 20 25 30 35 40
2,50
2,55
2,60
2,65
2,70
2,75
2,80
2,85
Hea
t Flo
w E
ndo
Up
(mW
)
Temperatur (°C)
0,01% Thiomersal
0,1% Parahydroxy-benzoesäureester
der Ausbildung der tubulären Strukturen ausgeschlossen werden kann. Auch ohne
Thiomersal entstehen während der Lagerung bei 13°C gelige Stückchen, die bei
elektronenmikroskopischer Untersuchung die typischen Nanotubes als Bausteine
eines Gelgerüstes aufweisen.
3.2.5.2 . Konservierung mit einem Gemisch aus Propyl-4-hydroxybenzoat und Methyl-4-hydroxybenzoat im Verhältnis 1:3 (m/m) Als alternatives Konservierungsmittel wurde ein Gemisch aus einem Teil Propyl-4-
hydroxybenzoat und drei Teilen Methyl-4-hydroxybenzoat in 0,1%iger (m/m) Konzen-
tration eingesetzt. Der pH-Wert der wässrigen Phase betrug 5,7. Mittels DSC wurde
nach der Quellungsdauer von 2 Tagen geprüft, ob die Parahydroxybenzoesäureester
das Phasenverhalten des vollständig hydratisierten Lipids beeinflussen (Abb. 38).
Abb. 38 : DSC-Heizkurven von vollständig hy-dratisiertem DMPC nach 2 Tagen Quellung bei 40°C. Obere Kurve: Wässrige Phase kon-serviert mit 0,01% Thiomersal; untere Kurve: Wässrige Phase konserviert mit 0,1% Para-hydroxybenzoesäureestern.
Anhand der DSC-Heizkurven ist ersichtlich, dass die Parahydroxybenzoesäureester
einen deutlichen Einfluss auf das Phasenverhalten des DMPC haben. Der Vorüber-
gang (Tp(Onset) = 7,2°C) und auch der Hauptübergang (Tm(Onset) = 22,7°C) sind gegen-
über den mit Thiomersal konservierten Proben zu niedrigeren Temperaturen ver-
schoben. Weiterhin kommt es zu einer Peakverbreiterung. Daher ist davon
auszugehen, dass es zu Wechselwirkungen zwischen den Parahydroxybenzoesäure-
estern und den DMPC-Molekülen kommt, was ein verändertes Verhalten der
Dispersionen erwarten lässt.
In Tab. 9 sind die Eigenschaften der Dispersion nach der Herstellung zusammen-
gefasst.
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
59
Makroskopisches Aussehen Weiß-gräulich durchscheinend und homogen
Mittlere Teilchengröße (PCS: z-Average) 80 nm
Polydispersitätsindex 0,26
Teilchengrößenverteilung (PCS: MSD-Auswertung)
Trimodal (17 48 nm; 89 248 nm; 846 1564 nm)
Mittlere Teilchengröße und Teilchengrößenverteilung (LD/PIDS)
92 nm (Monomodal zwischen 40 und 200 nm)
Tab. 9 : Eigenschaften einer mit 0,1% Parahydroxybenzoesäureestern konservierten DMPC-Disper-sion direkt nach der Herstellung über Hochdruckhomogenisation (8 x 500 bar / 40°C).
Nach 2-wöchiger Lagerung bei 13°C bildet sich zunächst ein sehr dünner Nieder-
schlag aus. Dieser verdichtet sich nach 4 Wochen zu einem flockigen Bodensatz. Die
Teilchengrößenmessungen mittels LD/PIDS detektieren allerdings trotz Aufschüttelns
des Bodensatzes lediglich die kleinen Liposomen und zeigen eine monomodale
Verteilung zwischen 40 nm und 200 nm mit einer mittleren Teilchengröße von
116 nm an. Die elektronenmikroskopischen Untersuchungen des Bodensatzes zei-
gen Nanotubes (Abb. 39).
Abb. 39 : Transmissionselektronenmikrosko-pische Aufnahme (Negativkontrastierung mit Uranylacetat) des Bodensatzes einer bei 13°C gelagerten 10%igen DMPC-Disper-sion, die mit Parahydroxybenzoesäureestern konserviert wurde.
Die Lagerung bei 2 - 8°C verursacht nach etwa 4 Wochen ebenfalls die Bildung eines
flockigen inhomogenen Niederschlages, auch hier konnten Nanotubes detektiert wer-
den.
Somit lässt sich festhalten, dass auch bei der Verwendung von Parahydroxybenzoe-
säureestern in 0,1%iger Konzentration zur Konservierung bei 13°C und auch 2 - 8°C
innerhalb von 4 Wochen Nanotubes gebildet werden, was makroskopisch zur Bildung
flockig inhomogener Niederschläge führt. Wegen beschränkter Lagerkapazitäten
wurden die Proben jedoch nicht über einen längeren Zeitraum beobachtet.
3.2.5.3 . Konservierung mit 0,05% (m/m) Natriumazid
Weiterhin wurde Natriumazid in einer Konzentration von 0,05% (m/m) zur Konser-
100 nm 100 nm
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40
1,90
1,95
2,00
2,05
2,10
2,15
2,20
2,25
Hea
t Flo
w E
ndo
Up
(mW
)
Temperatur (°C)
0,01% Thiomersal
0,05% Natriumazid
vierung eingesetzt. Der pH-Wert der wässrigen Phase betrug 7,5. Die thermo-
analytischen Untersuchungen (Abb. 40) des über 2 Tage hydratisierten Bulkmaterials
ergaben keine Beeinflussung des Phasenverhaltens im Vergleich zu Bulkmaterial,
welches mit 0,01% Thiomersal konserviert wurde. Das Peakmaximum des Vorüber-
gangs ist leicht zu höheren Temperaturen verschoben. Die Onset-Werte der Phasen-
übergänge (14,0°C für den Vorübergang und 24,1°C für den Hauptübergang) sind
mit denen der thiomersalhaltigen Proben (13,9°C für den Vorübergang und 24,1°C
für den Hauptübergang) vergleichbar. Die Peakbreite bleibt unverändert.
Abb. 40 : DSC-Heizkurven von vollständig hy-dratisiertem DMPC nach 2 Tagen Quellung bei 40°C. Obere Kurve: Wässrige Phase konser-viert mit 0,01% Thiomersal; untere Kurve: Wässrige Phase konserviert mit 0,05% Natriumazid.
Die Eigenschaften der frisch hergestellten Dispersion sind in Tab. 10 zusammen-
gefasst.
Makroskopisches Aussehen Weißlich-durchscheinend
Mittlere Teilchengröße (PCS: z-Average) 91 nm
Polydispersitätsindex 0,30
Teilchengrößenverteilung (PCS: MSD-Auswertung)
Trimodal (18 29 nm; 58 103 nm; 184 326 nm)
Mittlere Teilchengröße und Teilchengrößenverteilung (LD/PIDS)
Nicht bestimmt
Tab. 10 : Eigenschaften einer mit 0,05% Natriumazid konservierten 10%igen DMPC-Dispersion direkt nach der Herstellung mittels Hochdruckhomogenisation (8 x 500 bar / 40°C).
Nach zweiwöchiger Lagerung bei 13°C bildete sich ein Niederschlag aus, der sich
nach 4 Wochen zu einem dick-flockigen Bodensatz ausweitete. Die elektronen-
mikroskopische Untersuchung des flockigen Bodensatzes mittels Negative Staining
zeigt deutlich die Anwesenheit von Nanotubes, die in Netzwerken verflochten vor-
liegen (Abb. 41 A).
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
61
Abb. 41 : Transmissionselektro-nenmikroskopische Aufnahme (Negative Staining mit Uranyl-acetat) von 10%igen DMPC-Dispersionen nach 9 Wochen Lagerung, Konservierung mit 0,05% Natriumazid. A) Lagerung bei 13°C; B) Lagerung bei 2 - 8°C.
Das gleiche Verhalten zeigen Dispersionen, die bei 2 - 8°C gelagert wurden. Sie sind
hinsichtlich des makroskopischen Erscheinungsbildes und der Teilchengrößenver-
teilung kaum von den bei 13°C gelagerten Dispersionen zu unterscheiden. Die elek-
tronenmikroskopische Untersuchung bestätigt die Vermutung, dass auch hier Nano-
tubes zur Bildung der flockigen Niederschläge geführt haben (Abb. 41 B).
Damit konnte gezeigt werden, dass auch bei Anwesenheit von 0,05% (m/m) Natrium-
azid zur Konservierung Nanotubes entstehen, die die Grundlage für flockige Boden-
sätze bilden. Nach 2 Monaten wurde die Lagerung wegen mangelnder Lagerkapa-
zität abgebrochen. Daher sind keine Aussagen dazu möglich, ob es mit der Zeit zu
einer vollständigen Gelierung des Systems kommt.
3.2.5.4 . Konservierung mit 0,1% Thiomersal Da Thiomersal als organisches Molekül (siehe Abb. 36) mit den Bilayern interagieren
könnte sollte geklärt werden, ob die Erhöhung der Thiomersalkonzentration um das
zehnfache die Nanotube-Bildung beeinflusst. Dazu wurden Dispersionen mit 0,1%
(m/m) Thiomersal konserviert (d.h. auf 60 DMPC-Moleküle kommt ein Thiomersal-
Molekül).
Anhand der DSC-Daten ist kein Einfluss der höheren Thiomersalkonzentration auf
das Phasenverhalten des DMPC erkennbar (Abb.42).
Abb. 42 : DSC-Heizkurven von vollständig hy-dratisiertem DMPC nach 2 Tage Quellung bei 40°C. Obere Kurve: Wässrige Phase konser-viert mit 0,01% Thiomersal; untere Kurve: Wässrige Phase konserviert mit 0,1% Thio-mersal.
0 5 10 15 20 25 30 35 402,05
2,10
2,15
2,20
2,25
2,30
2,35
0,01% Thiomersal
0,1% Thiomersal
Hea
t Flo
w E
ndo
Up
Temperatur (°C)
A B
100 nm 100 nm
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
62
Um die Gelierung und Nanotubebildung zu beschleunigen, wurde die Dispergierung
mit dem Hochdruckhomogenisator über 8 Zyklen bei 8 x 500 bar und anschließend
weiteren 6 Zyklen bei 1400 bar durchgeführt. Die Eigenschaften der frisch herge-
stellten Dispersion sind in Tab. 11 zusammengefasst.
Makroskopisches Aussehen Stark durchscheinend, homogen
Mittlere Teilchengröße (PCS: z-Average) 45 nm
Polydispersitätsindex 0,15
Teilchengrößenverteilung (PCS: MSD-Auswertung)
Trimodal (11 31 nm; 50 121 nm; 470 929 nm)
Tab. 11 : Eigenschaften einer mit 0,1% Thiomersal konservierten 10%igen DMPC-Dispersion direkt nach der Herstellung mittels Hochdruckhomogenisation (8 x 500 bar und 6 x 1400 bar / 40°C).
Nach 4 Wochen Lagerung bei 13°C hat sich ein gelig fester Pfropf mit flüssigem
Überstand gebildet. Die Teilchengröße des stark durchscheinenden Überstandes
wurde mittels PCS auf 82 nm (z-Average) mit einem Polydispersitätsindex von 0,13
bestimmt. Die elektronenmikroskopische Untersuchung bestätigt das Vorhandensein
der Nanotubes in dem gelig verfestigten Teil der Probe (Abb. 43). Daneben finden
sich auch Liposomen, die ≤ 100 nm sind.
Abb. 43 : Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme (Negative Staining mit Uranylacetat) einer gelierten DMPC-Dispersion nach 4-wöchiger Lagerung bei 13°C; Konservierung mit 0,1% Thiomersal.
Die Ergebnisse zeigen, dass auch höhere Thiomersalkonzentrationen die Gelbildung
und Nanotubeentstehung bei 13°C weder fördern noch behindern.
3.2.5.5 . Zusammenfassung Aus den dargestellten Ergebnissen geht hervor, dass die Bildung der Nanotubes
nicht durch Konservierungsmittel beeinflusst wird. Bei allen untersuchten Konservie-
rungsmittelzusätzen und auch bei konservierungsmittelfreien Dispersionen konnten
nach 2 bis 4 Wochen Lagerung bei 13°C sichtbare Anzeichen einer Gelbildung in
Form von flockig-stückigen Bodensätzen beobachtet werden. Die elektronenmikro-
100 nm
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
63
skopische Untersuchung dieser Bodensätze wies in allen Fällen die Anwesenheit der
Nanotubes nach. Veränderungen in der Morphologie der Nanotubes wurden nicht
festgestellt. Aufgrund der Inhomogenität der Proben und der notwendigen Ver-
dünnung im Zuge der Negative Staining Präparation war es nicht möglich, Unter-
schiede in der Quantität der Nanotubes oder deren Länge in Abhängigkeit vom Kon-
servierungsmittel zu detektieren.
3.2.6 . Einfluss des Zusatzes von Lipiden auf Lagerstabilität und Ultrastruktur von 10%igen DMPC-Dispersionen
Ziel der folgenden Untersuchungen war es zu klären, welchen Einfluss der Zusatz
von lipidartigen Verunreinigungen auf die Gelierung und Nanotubebildung in 10%igen
DMPC-Dispersionen bei 13°C hat. Alle Dispersionen für diese Versuchsreihe wurden
mit DMPC 1 (100/93 Astra Arcus) hergestellt. Um die Gelierung zu forcieren, erfolgte
die Dispergierung des hydratisierten Lipids mit dem Hochdruckhomogenisator über 8
Zyklen bei 1000 bar / 40°C.
3.2.6.1 . Die Referenz-Dispersion aus reinem DMPC Zum direkten Vergleich wurde eine reine DMPC-Dispersion unter denselben Be-
dingungen hergestellt. Die Eigenschaften der frisch hergestellten Dispersion sind in
Tab. 12 zusammengefasst.
Makroskopisches Aussehen Weißlich, stark durchscheinend
Mittlere Teilchengröße (PCS: z-Average) 46 nm
Polydispersitätsindex 0,15
Teilchengrößenverteilung (PCS: MSD-Auswertung)
Trimodal (7 61 nm [> 95%]; 147 282 nm; 1041 2483 nm)
Mittlere Teilchengröße und Teilchengrößenverteilung (LD/PIDS)
78 nm Monomodal 40 200 nm
Tab. 12 : Eigenschaften einer 10%igen DMPC-Disperision direkt nach der Herstellung mittels Hoch-druckhomogenisation (8 x 1000 bar / 40°C).
Die elektronenmikroskopische Untersuchung (Abb. 44 A) zeigt hauptsächlich sehr
kleine Liposomen mit Durchmessern von weniger als 70 nm und Lipidpartikel mit
Größen unter 20 nm. Nach 4 Wochen Lagerung bei 13°C ist die Dispersion bereits
vollständig geliert. Im Elektronenmikroskop sind nach Negative Staining Präparation
Nanotubes in großräumigen Netzwerken zu sehen, zwischen ihnen findet man
vereinzelt Liposomen (Abb. 44 B). Der Teil der Probe, der bei 2 - 8°C gelagert wurde,
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
64
bildet nach 4 Wochen einen flockigen, teppichartig zusammengeballten Bodensatz.
Der Überstand ist trüb und enthält Stückchen. Die elektronenmikroskopische
Untersuchung des verfestigten Teils detektiert auch hier Nanotubes (Abb. 44 C).
Dagegen bleibt der bei 28°C gelagerte Teil der Probe durchscheinend-homogen und
niederschlagsfrei, lediglich ein dünner Schleier ist sichtbar. Die Probe wird dominiert
von Liposomen der Größenordnung 20 nm bis 100 nm (Abb. 44 D), daneben werden
vereinzelt größere Vesikel (> 150 nm) gefunden. Nanotubes sind nicht enthalten.
Abb. 44 : Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen (Negative Staining mit Uranylacetat): A) Frisch hergestellte DMPC-Dispersion; B) Gel nach 4-wöchiger Lagerung bei 13°C; C) Bodensatz nach 5-wöchigerLagerung bei 2 - 8°C; D) Dispersion nach 5-wöchiger Lagerung bei 28°C.
3.2.6.2 . Einfluss der Verunreinigungen auf das Phasenverhalten von DMPC
Neben 10% (m/m) DMPC wurden als Verunreinigungen etweder Myristinsäure, Lyso-
phosphatidylcholin oder hydriertes Soja-Lecithin (S75-3) in Konzentrationen von
0,1% (m/m) zugesetzt. Bezogen auf den Gesamtlipidgehalt entspricht das einer Kon-
zentration von 1% (m/m). Mit der niedrigen Konzentration sollte das Vorliegen dieser
Substanzen als Verunreinigung bzw. Abbauprodukte simuliert werden.
Die Substanzen wurden genau gewogen und in einer 2:1 (V/V) Mischung aus
Chloroform und Methanol vollständig gelöst. Nach Abrotieren des Lösungsmittelge-
misches unter Vakuum bei 40°C wurden die Lipidgemische mit demineralisiertem
Wasser (konserviert mit 0,01% Thiomersal) versetzt und über 2 Tage bei 40°C hy-
dratisiert.
Vor der Dispergierung wurde mittels DSC geprüft, ob die Verunreinigungen einen
Einfluss auf das Phasenverhalten des DMPC ausüben. In Abb. 45 und Tab. 13 sind
die Ergebnisse dieser Messungen zusammengefasst.
100 nm 2 µm
A B C D
100 nm 100 nm
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
65
0 5 10 15 20 25 30 35 401,70
1,75
1,80
1,85
1,90
1,95
2,00
2,05
2,10
2,15
2,20
2,25
2,30H
eat F
low
End
o U
p (m
W)
Temperatur (°C)
DMPC1
DMPC1 + LysoPC
DMPC1 + MA
DMPC1 + S75-3
Abb. 45 : DSC-Heizkurven von hydrati-siertem DMPC unter Zusatz ver-schiedener lipidartiger Verunreini-gungen. LysoPC: Lysophosphatidyl-cholin; MA: Myristinsäure; S75-3: hy-driertes Soja-Lecithin.
Proben-bezeich-nung
Zusammen-setzung
Vorübergang TOnset (°C) ∆H(J/g)
Hauptübergang TOnset (°C) ∆H(J/g)
DMPC 1 10% DMPC 13,9 ± 0,1 0,43 ± 0,13 24,1 ± 0,05 4,05 ± 0,5
DMPC1 + LysoPC
10% DMPC 0,1% Lyso-PC
11,6 ± 0,1 0,30 ± 0,01 23,8 ± 0,05 3,45 ± 0,1
DMPC1 + MA
10% DMPC 0,1% Myristinsäure
16,3 ± 0,2 0,44 ± 0,02 24,9 ± 0,01 3,91 ± 0,03
DMPC1 + S75-3
10% DMPC 0,1% hydriertes Soja-PC
13,8 0,48 24,4 3,80
Tab. 13 : Onset-Temperaturen und Umwandlungsenthalpien von vollständig hydratisiertem DMPC unter Zusatz verschiedener lipidartiger Verunreinigungen. LysoPC: Lysophosphatidylcholin; MA: Myristinsäure; S75-3: hydriertes Soja-Phosphatidylcholin; Alle Daten stellen (mit Ausnahme von S75-3) Mittelwerte aus mindestens 2 unabhängigen Einzelmessungen dar.
Der Zusatz von 0,1% hydriertem Soja-Lecithin beeinflusst das Phasenverhalten von
DMPC nicht. Dagegen führt die Zugabe von 0,1% Lysophosphatidylcholin zu einer
deutlichen Erniedrigung der Phasenübergangstemperaturen sowohl des Vor-, als
auch des Hauptübergangs. Auch die Enthalpien der Phasenübergänge werden leicht
erniedrigt. Im Gegensatz dazu bewirkt der Zusatz von Myristinsäure eine deutliche
Erhöhung der Phasenübergangstemperaturen, wobei die Enthalpien beider Phasen-
übergänge im Vergleich zum reinen DMPC keine Veränderungen erfahren.
3.2.6.3 . Eigenschaften der Dispersionen In Abb. 46 sind die Teilchengrößenverteilungen (PCS mit MSD-Auswertung) und das
makroskopische Aussehen der vier Dispersionen direkt nach der Herstellung zu-
sammengefasst.
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
66
Auf die Angabe des z-Average-Wertes für die mittlere Teilchengröße wurde verzich-
tet, da dieser durch die wenigen zum Teil sehr großen Partikel verfälscht wird und
damit die wahren Teilchengrößen nur unzureichend repräsentiert.
Zusammensetzung Aussehen der Dispersionen 10% DMPC dünn-weißlich durchscheinend
10% DMPC + 0,1% Lyso-PC stark durchscheinend, fast klar
10% DMPC + 0,1% MA dünn-weißlich durchscheinend
10% DMPC + 0,1% S75-3 dünn-weißlich durchscheinend
Abb. 46 : Makroskopisches Aussehen und Teilchengrößenverteilung (PCS mit MSD-Auswertung) von DMPC-Dispersionen unter Zumischung verschiedener Verunreinigungen direkt nach der Herstellung mittels Hochdruckhomogenisation (8 x 1000 bar / 40°C). LysoPC: Lysophosphatidylcholin; MA: Myri-stinsäure; S75-3: hydriertes Soja-Lecithin. In allen Dispersionen sind etwa 98% der Teilchen zwischen 5 und 50 nm groß.
Gemäß der MSD-Auswertung der PCS-Messungen sind in allen Dispersionen etwa
98% der Teilchen zwischen 5 und 50 nm groß, nur etwa 2% der Teilchen sind grö-
ßer, wobei im Falle des Lysophosphatidylcholins maximale Teilchengrößen von bis
zu 10 µm auftreten. Die elektronenmikroskopischen TEM-Aufnahmen (Negativ-
kontrastierung, Abb. 47) zeigen bei allen Dispersionen Liposomen mit Größen zwi-
10% DMPC 10% DMPC + 0,1% LysoPC
10% DMPC + 0,1% Myristinsäure 10% DMPC + 0,1% hydriertes Soja-Lecithin
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
67
DMPC + LysoPC DMPC + MA DMPC + S75-3
100 nm 100 nm100 nm
schen 20 nm und 100 nm. In den mit Lysophosphatidylcholin versetzten Proben fin-
den sich neben den Liposomen auch kleinste fadenförmige Mizellen (Abb. 48). Die
Mizellen haben eine Dicke von etwa 5 nm und eine Länge von etwa 50 nm.
Abb. 47 : TEM Aufnahmen (Negative Staining mit Uranylacetat) von frisch hergestellten Dispersionen, die 10% DMPC und 0,1% Verunreinigung (LysoPC: Lysophosphatidylcholin; MA: Myristinsäure; S75-3: Hydriertes Soja-Lecithin) enthalten. Die Herstellung erfolgte über Hochdruckhomogenisation bei 8 x 1000 bar / 40°C.
Abb. 48 : Stark vergrößerter Bereich einer TEM Aufnahme (Negativkontrastierung mit Uranylacetat) einer frisch hergestellten Dispersion aus 10% DMPC und 0,1% Lysophosphatidylcholin nach Herstellung mittels Hochdruckhomogenisation (8 x 1000 bar / 40°C). Die Abbildung zeigt fadenförmige Mizellen, deren Dicke etwa 5 nm entspricht.
Im Verlauf der Lagerung bei 13°C kommt es innerhalb von 4 bis 5 Wochen bei den
Myristinsäure bzw. Soja-Lecithin enthaltenden Dispersionen zu einer Gelbildung, wie
sie auch in der Dispersion ohne Verunreinigung beobachtet wurde. Die Dispersion
mit Lysophosphatidylcholin wurde im selben Zeitraum viskos, blieb aber noch flüssig.
Zu einer Verfestigung kommt es hier nach insgesamt etwa 8 Wochen.
Die elektronenmikroskopischen TEM-Aufnahmen der verfestigten Systeme nach 4
Monaten sind in Abb. 49 zusammengefasst. Während der Zusatz von 0,1% Myristin-
säure (Abb. 49 B) bzw. 0,1% hydriertem Soja-PC (Abb. 49 C) keinen Einfluss auf die
Ultrastruktur der Gele hat, treten unter Zusatz von 0,1% Lysophosphatidylcholin
neben Nanotubes (Abb. 49 A1 [Pfeil a]) zwei neue Bänderstrukturen in den Vorder-
grund: Die Bänder sind verdrillt und weisen eine Breite von 20 bis 25 nm (Abb. 49 A1
25 nm
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
68
[Pfeil b] und A4) bzw. 50 bis 60 nm (Abb. 49 A1 [Pfeil c] und A3) auf. Sie sind
mehrere Mikrometer lang und ebenso wie die Nanotubes in der Lage, Netzwerke zu
bilden (Abb. 49 A2), was mit der makroskopisch beobachteten Verfestigung der
Dispersionen korreliert.
Abb. 49 : TEM-Aufnahmen (Negative Staining mit Uranylacetat) der unter Abb. 47 beschriebenen Di-spersionen nach 4 Monaten Lagerung bei 13°C. A1-A4) 10% DMPC + 0,1% Lysophosphatidylcholin; B) 10% DMPC + 0,1% Myristinsäure; C1-C2) 10% DMPC + 0,1% Hydriertes Soja-Lecithin. Die Pro-ben aus einer Mischung aus 10% DMPC und 0,1% Lysophosphatidylcholin (A1-A4) werden neben den selten auftretenden Nanotubes (A1, Pfeil a) von zwei Sorten helikal verdrillter Bänder dominiert: Die großen Bänder sind zwischen 50 und 60 nm breit (siehe A1, Pfeil c sowie A3), die schmalen Bänder haben eine Breite von etwa 20 bis 25 nm (siehe A1, Pfeil b sowie Detailansicht A4). Die Bänder sind in der Lage, ein Netzwerk auszubilden (siehe A2). Der Zusatz von Myristinsäure (B) bzw. hydriertem Soja-Lecithin (C1 und C2) hat keinen Einfluss auf die Bildung und Morphologie der Nanotubes; in diesen Proben bilden wie schon für reines DMPC beschrieben Nanotubenetzwerke die vorherrschende Struktur.
Bei einer Lagerung bei 2 - 8°C kommt es bei allen Dispersionen zu vergleichbaren In-
stabilitäten. Allerdings setzen Gelbildung bzw. Verfestigung später ein und sind
schwächer ausgeprägt (maximal 1/3 der Probe sind betroffen). Bei der Untersuchung
der verfestigten Bereiche der Probe im Transmissionselektronenmikroskop treten die
gleichen Strukturen wie bei 13°C (vgl. Abb. 49) auf.
Während der Lagerung bei 28°C kommt es im Gegensatz dazu in keinem Fall zu
100 nm 500 nm
100 nm
100 nm
A(1) A(2) A(3)
A(4)
B C(1) C(2)
100 nm 100 nm 100 nm
a
b
c
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
69
einer Gelbildung. Die Dispersionen bleiben flüssig und durchscheinend, sich ab-
setzender Niederschlag konnte mittels Elektronenmikroskopie als große Vesikel iden-
tifiziert werden (nicht gezeigt).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Myristinsäure und hydriertes Soja-Lecithin
in der verwendeten Konzentration keinen Einfluss auf die Lagerstabilität der Disper-
sionen und die Morphologie der Nanotubes haben. Dagegen bilden sich unter Zusatz
von 0,1% Lysophosphatidylcholin neue Strukturen in Form langer verdrillter Bänder
aus, die in ähnlicher Weise wie die Nanotubes zur Bildung von dreidimensionalen
Netzwerken und damit zur Gelierung der Dispersionen befähigt sind.
Aus Zeitgründen konnten der Einfluss von lipidischen Verunreinigungen sowie die
Bänderstrukturen jedoch nicht genauer untersucht werden, so dass die gezeigten
Ergebnisse erst den Beginn ausführlicher Untersuchungen darstellen. So wäre es
beispielsweise interessant, über Konzentrationsreihen die für die Bänderentstehung
notwendige Lysophosphatidylcholin-Konzentration zu bestimmen und die Morpholo-
gie der Strukturen bei weiterer Erhöhung des LysoPC Gehaltes zu verfolgen. Weiter-
hin wären systematische Untersuchungen von DMPC-Dispersionen mit höheren
Myristinsäure- bzw. Soja-Lecithingehalten denkbar. Eigene Untersuchungen mit der
10fachen Menge hydriertem Soja-Lecithin (hier nicht dargestellt) haben ergeben,
dass damit Nanotubebildung und Gelierung vollständig unterbunden werden.
3.3 . Untersuchungen zur Reinheit von DMPC Im folgenden Kapitel sind Untersuchungen zu physikochemischen Eigenschaften und
zur Reinheit der Lipide zusammengefasst. Diese wurden notwendig, da die im Laufe
der Arbeit eingesetzten verschiedenen DMPC-Chargen bei gleicher Prozessführung
Dispersionen mit zum Teil sehr unterschiedlichen Eigenschaften ergaben (Tab. 14).
Dispersionen der Chargen 2 und 5 bestehen aus durchschnittlich größeren Lipo-
somen und zeigen ein ausgeprägteres Gelierungsverhalten im Vergleich zu den
Dispersionen der anderen drei Lipide. Tab. 14 fasst die Unterschiede zwischen den
physikochemischen Eigenschaften der Dispersionen verschiedener DMPC-Chargen
zusammen.
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
70
DMPC-Charge Eigenschaften der Dispersionen nach Hochdruckhomogenisation (8x500bar / 40°C)
(1) 100/93 (Astra Arcus) • Teilchengröße (PCS, z-Average) nach Herstellung ca. 100 nm, • deutlich stückig-inhomogen bei 13°C nach ca. 4 Wochen, auch später
kein komplettes Gelieren (2) 562191-1 (Lipoid) • Teilchengröße (PCS, z-Average) nach Herstellung ca. 110 - 160 nm,
• komplette Gelierung bei 13°C nach 3 Wochen (3) 201/92 (Astra Arcus) • Teilchengröße (PCS, z-Average) nach Herstellung ca. 75 nm,
• leicht stückig-inhomogen bei 13°C nach ca. 5 Wochen, auch später kein komplettes Gelieren
(4) 200/92 (Astra Arcus) • Teilchengröße (PCS, z-Average) nach Herstellung ca. 50 nm, • leicht stückig-inhomogen bei 13°C nach ca. 6 Wochen, auch später
kein komplettes Gelieren (5) MA 040722 (Astra Arcus)
• Teilchengröße (PCS, z-Average) nach Herstellung ca. 110 - 160 nm, • komplette Gelierung bei 13°C nach 3 Wochen
Tab. 14 : Zusammenhang zwischen der verwendeten DMPC-Charge und den wichtigsten Unterschie-den in den Eigenschaften der resultierenden Dispersionen (hergestellt mittels Hochdruckhomogeni-sation, 8 x 500 bar / 40°C)
In den folgenden Abschnitten werden die Ergebnisse des makroskopischen Quel-
lungsverhaltens, der thermoanalytischen Untersuchungen, der Röntgenkleinwinkel-
messungen sowie der dünnschichtchromatographischen Untersuchungen vorgestellt.
Mit DMPC der Charge MA040722 konnten keine dünnschichtchromatographischen
Reinheitsuntersuchungen durchgeführt werden, da die Charge zu diesem Zeitpunkt
bereits vollständig verbraucht war.
3.3.1 . Makroskopisches Quellungsverhalten
Die trockenen, pulverförmigen Lipide zeigten makroskopisch keine Unterschiede. Zur
Untersuchung des Quellungsverhaltens wurden die pulverisierten Lipide genau
gewogen und bei Raumtemperatur mit filtriertem Aqua purificata, das 0,01% Thio-
mersal zur Konservierung enthielt, versetzt, so dass eine Lipidkonzentration von
10 % (m/m) resultierte. Nach kurzem Umschütteln (15x, per Hand) wurden die Ge-
fäße verschlossen und 2 Tage bei 40°C stehen gelassen. In einer zweiten Versuch-
sreihe wurden die Lipide in gleicher Weise mit konservierungsmittelfreiem Wasser
versetzt, um einen möglichen Einfluss des Konservierungsmittels auf das Quellungs-
verhalten zu untersuchen.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tab. 15 aufgeführt. Die An- bzw.
Abwesenheit von Thiomersal hatte keinen Einfluss auf das Aussehen der Lipide nach
der Hydratation.
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
71
Charge (1) 100/93 Astra Arcus
(2) 562191-1 Lipoid
(3) 201/92 Astra Arcus
(4) 200/92 Astra Arcus
(5) MA040722 Astra Arcus
makroskop. Aussehen
schleimig- durchschein. Masse; zäh, aber fließend; viele kleine Luftbläschen inkorporiert
Lipid weiß am Boden abgesetzt, überstehendes Wasser nahezu klar, dünnflüssig
schleimig- durchschein. Masse; zäh, aber fließend; viele kleine Luftbläschen inkorporiert
schleimig- durchschein. Masse; zäh, aber fließend; viele kleine Luftbläschen inkorporiert
Lipid als weißer Niederschlag am Boden; wässriger, leicht trüber Überstand, flüssig
Tab. 15 : Makroskopisches Aussehen verschiedener DMPC-Chargen nach Quellung in thiomersal-freiem bzw. thiomersalhaltigem Wasser. Hydratationsdauer: 2 Tage; Hydratationstemperatur: 40°C.
Es ist deutlicher Unterschied im makroskopischen Erscheinungsbild der hydrati-
sierten Phospholipide zu beobachten: die Lipide 1, 3 und 4 ergeben nach Quellung
eine zähe, durchscheinende Masse schleimiger Konsistenz, in der das gesamte
Wasser inkorporiert ist. Dagegen bilden die Lipide 2 und 5 einen weißen, dichten
Niederschlag mit überschüssigem Wasser als Überstand.
3.3.2 . Thermoanalytische Untersuchungen
Um festzustellen, ob sich das makroskopisch stark unterschiedliche Verhalten der
hydratisierten Lipide auch in ihrem thermoanalytischen Verhalten widerspiegelt,
wurde anschließend das Phasenverhalten der unter 3.3.1 hergestellten Proben
untersucht. Nach Abkühlen auf 2°C und Halten dieser Temperatur für 45 Minuten
wurden die Proben mit 5°C/min auf 40°C aufgeheizt. Für alle Lipide wurden die für
vollständig hydratisiertes DMPC bekannten DSC-Heizkurven mit einem kleinen endo-
thermen Ereignis für den Vorübergang und einem großen endothermen Ereignis für
den Hauptübergang erhalten. Zur Charakterisierung wurden die Onset-Temperaturen
der Phasenübergänge ermittelt und das Verhältnis der Enthalpien der Phasen-
übergänge errechnet (Tab. 16). Die An- oder Abwesenheit von Thiomersal hatte
keinen Einfluss auf die Lage und die Enthalpien der Übergänge.
Die Temperatur des Hauptübergangs (Kettenschmelzen, Pβ` → Lα) ist bei allen fünf
Chargen nahezu gleich und liegt bei ca. 24,2°C. Betrachtet man jedoch die Lage der
Vorübergänge (L β` → Pβ`), lassen sich die Lipide in Analogie zu den makro-
skopischen Beobachtungen in zwei Gruppen einteilen: DMPC 2 und 5 weisen eine
deutlich höhere Vorübergangstemperatur (etwa 2°C höher) auf als die Lipide 1, 3
und 4. Dieselbe Gruppenbildung ergibt sich auch, wenn man das Verhältnis der
Enthalpien der Phasenübergänge ∆HTm/ ∆HTp betrachtet: Die Werte für DMPC 2 und
5 liegen deutlich tiefer als die Werte für die Lipide 1, 3 und 4 (Differenz etwa 2,4).
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
72
Charge (1) 100/93 Astra Arcus
(2) 562191-1 Lipoid
(3) 201/92 Astra Arcus
(4) 200/92 Astra Arcus
(5) MA040722Astra Arcus
Vorübergang Tp(Onset) Hauptübergang Tm(Onset) ∆HTm/ ∆HTp
13,9 ± 0,04°C 24,1 ± 0,02 °C 7,9 ± 0,1
15,9 ± 0,02 °C 24,3 ± 0,03 °C 5,4 ± 0,1
13,7 ± 0,08°C 24,2 ± 0,03°C 7,8 ± 0,2
13,4 ± 0,05 °C 24,1 ± 0,02°C 7,9 ± 0,1
15,5 ± 0,03 °C 24,1 ± 0,05°C 5,4 ± 0,1
Tab. 16 : Gegenüberstellung der T(Onset) -Werte der Phasenübergangstemperaturen und der Verhält-nisse der Umwandlungsenthalpien verschiedener DMPC-Chargen im vollständig hydratisierten Zu-stand, bestimmt mittels DSC. (Tp(Onset): Onset der Temperatur des Vorübergangs; Tm(Onset): Onset der Temperatur des Hauptübergangs; ∆HTm Umwandlungsenthalpie des Hauptübergangs; ∆HTp Umwand-lungsenthalpie des Vorübergangs ). Alle Werte stellen Mittelwerte aus 3 Einzelmessungen dar.
Substanzen, die mit den Lipidmolekülen interagieren, wie zum Beispiel Cholesterol,
stören die Ordnung der Bilayer in der Gelphase und erhöhen die Flexibilität der
Lipidmoleküle, was zu einer Erniedrigung der Umwandlungstemperatur sowie zu
einer Erniedrigung der Umwandlungsenthalpie führt. Versteht man die Lage des
Vorüberganges also als ein Reinheitskriterium, so ergibt sich, dass die Lipide 2 und 5
einen höheren Reinheitsgrad aufweisen als die Lipide 1, 3 und 4, in denen sowohl
Phasenübergangstemperatur Tp als auch die Umwandlungsenthalpie erniedrigt sind.
Die Unterschiede zwischen den letztgenannten sind nur sehr gering. Es ist eine
Tendenz erkennbar, dass die Reinheit in der Reihenfolge 4 < 3 < 1 leicht zunimmt.
3.3.3 . Ergebnisse der Röntgenkleinwinkeluntersuchungen
Aufgrund der stark veränderten Quellungseigenschaften sowie der deutlichen Er-
niedrigung der Phasenübergangstemperaturen der Lipide 1, 3 und 4 wurde davon
ausgegangen, dass bei den verschiedenen DMPC-Chargen Bilayer mit unterschied-
lichen Eigenschaften vorliegen. Mit Hilfe von Röntgenkleinwinkeluntersuchungen
sollten Differenzen in den Bilayerabständen der Lamellarphase (Lα) detektiert
werden. Dafür wurden die Lipide wie unter 3.3.1 beschrieben hydratisiert und an-
schließend sofort bei 40°C vermessen (Abb. 50). Eine Ausnahme bildet DMPC 5,
welches bereits zu einem früheren Zeitpunkt der Arbeit untersucht wurde. Die
Hydratationsbedingungen sind identisch mit denen der anderen Lipide, jedoch
entstammt das Diffraktogramm einem Temperaturscan von 20°C bis 50°C in 0,6°C-
Schritten. Der Beamstop zum Ausblenden des Primärstrahls endete bei der Messung
von DMPC 5 bei einer etwas kleineren Kanalnummer, woraus die unterschiedlichen
Kurvenbeginne resultieren.
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
73
Abb. 50 : Röntgenkleinwinkeldiffrakto-gramme der vollständig hydratisierten DMPC-Chargen. Lipid 5 wurde unab-hängig von den restlichen Lipiden vermes-sen, Messdauer hier nur 15 Minuten (Messdauer für Lipide 1 bis 4: 60 Minu-ten). Die obersten zwei Kurven entspre-chen dem typischen Röntgenkleinwinkel-diffraktogramm einer Lamellarphase.
Die DMPC-Chargen 2 und 5 zeigen die für eine Lamellarphase typischen scharfen
Interferenzpeaks. DMPC 1 zeigt zusätzlich zu einem sehr breiten Interferenzpeak nur
eine sehr schwach angedeutete scharfe Interferenz, während die Diffraktogramme
der Lipide 3 und 4 ausschließlich den breiten Interferenzpeak aufweisen. Anhand der
Peaklagen wurden folgende d-Werte (vgl. 2.2.2.6.) ermittelt: DMPC 2: 6,3 nm; DMPC
5: 7,1 nm und DMPC 1: 6,5 nm. Der d-Wert des DMPC 2 stimmt am besten mit dem
Literaturwert für vollständig hydratisiertes DMPC in der Lα-Phase überein (6,27 nm
bei 30°C, Nagle & Tristram-Nagle, 2000). Da DMPC 5 eine andere Vorbehandlung
erfahren hat sind die d-Werte allerdings nicht direkt miteinander vergleichbar.
Die Ergebnisse dokumentieren, dass sich nur bei den Lipiden 2 und 5 die erwartete
multilamellare Phase ausgebildet hat, während in den Lipiden 3 und 4 Bilayer
vorliegen, die keine lamellare Ordnung aufweisen. DMPC 1 nimmt eine Zwischen-
stellung ein: Hier liegen hauptsächlich ungeordnete Bilayer neben wenigen lamellar
geordneten Bilayern vor. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen von vollständig
hydratisiertem DMPC der Charge 1 (Kapitel 3.2.3, Abb. 24) zeigen ebenfalls Bilayer
(allerdings in der Gelphase), die anstelle einer multilamellaren Ordnung große
Volumina Wasser eingelagert haben, so dass die Abstände zwischen den Bilayern
bis zu 200 nm betragen. Auch in diesem Versuch zeigten die thiomersalhaltigen und
die thiomersalfreien Proben ein identisches Verhalten, ihre Diffraktogramme werden
daher nicht getrennt aufgeführt.
3.3.4 . Hochauflösende Dünnschichtchromatographie
Die auffällig erhöhte Wasseraufnahmefähigkeit, die Erniedrigung der Phasen-
übergangstemperatur des Vorübergangs und die fehlende bzw. verminderte Aus-
bildung einer multilamellaren Phase bei den DMPC-Chargen 1, 3 und 4 deuten
0 200 400 600 800
0
10000
20000
30000
40000
50000
DMPC 5 (MA040722 Astra)
DMPC 2 (562191-1 Lipoid)
DMPC 1 (100/93 Astra)
DMPC 3 (201/92 Astra)
DMPC 4 (200/92 Astra)
Inte
nsitä
t
Kanal-Nummer
Beamstop zum Ausblenden des
Primärstrahls
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
74
darauf hin, dass diese Lipide zusätzlich Substanzen enthalten, die mit den Lipid-
molekülen interagieren und deren Eigenschaften stark beeinflussen. Ein voll-
ständiges Analysenzertifikat zur Reinheit lag nur für das Lipid 2 der Firma Lipoid vor.
Der Gehalt an Lysophosphatidylcholin wurde als < 0,1%, freie Fettsäuren < 0,05%
und Unbekannte < 0,1% angegeben (Lipoid GmbH, 2001a). Die Lipide der Firma
Astra Arcus besaßen hingegen keine oder nur sehr unvollständige Zertifikate, waren
bereits mehr als fünf Jahre alt und zum Teil unkontrolliert (z.T. über mehrere Monate
ungekühlt) gelagert. Weiterhin ist nicht bekannt, auf welchem Wege das DMPC der
Firma Astra Arcus synthetisiert wurde, was das Abschätzen von Verunreinigungen,
die aus dem Herstellungsprozess kommen, unmöglich macht. Im Rahmen dieser
Arbeit wurde daher mittels hochauflösender Dünnschichtchromatographie untersucht,
inwieweit Reinheitsunterschiede zwischen den Chargen bestehen. Dabei richtete
sich das Hauptaugenmerk auf die Verunreinigung mit anderen Lipidklassen sowie
Zersetzungsprodukte.
Im ersten Chromatogramm (Abb. 51) erfolgte die Detektion mit Hilfe des Kupfer-
sulfat-Phosphorsäure-Tauchbades, welches nur Lipide mit ungesättigten Fettsäure-
resten und Cholesterol in Form von schwarzen Spots detektiert. Lipidmengen von
0,1 µg können deutlich detektiert werden (vgl. Abb. 51, Laufbahn 9: je 0,1 µg Lipid
verschiedener Klassen).
Abb. 51 : Dünnschichtchromatogramm nach Detektion im Kupfersulfat-Phosphorsäure-Tauchbad zur Detektion ungesättigter Lipide. Die Auftragsmengen der Lipide sind Tab. 17 zu entnehmen. Chol: Cholesterol; GC: Galactocerebroside; Sulf: Sulfatide; PE: Phosphatidylcholin; PG: Phosphati-dylglycerol; PI: Phosphatidylinositol; PS: Phosphatidylserin; PC: Phosphatidylcholin; SM: Sphingo-myelin. Da mit Laufmittel 1 nur bis zur gekennzeichneten Position auf der DC-Platte entwickelt wird (4,8 cm), mit den darauf folgenden Laufmitteln 2 und 3 (unpolarer, trennen die unpolaren Lipide weiter auf) allerdings über die gesamte Länge der Platte, liegt der Spot des Cholesterols oberhalb der Lauf-mittelfront des Laufmittels 1.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Laufmittelfront (Laufmittel 1)
Chol GC Sulf PE PG PI PS PC SM
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
75
SpotNr.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Lipid
DMPC1
DMPC1
DMPC2
DMPC2
DMPC3
DMPC3
DMPC4
DMPC4
Std
Std
Std
DMPC1
DMPC2
DMPC3
DMPC4
Men-ge
[µg]
10
100
10
100
10
100
10
100
0,1
0,2
0,3
20
20
20
20
Tab. 17 : Übersicht über Art und Auftragsmengen der in Abb. 51 chromatographierten Lipide. DMPC: Dimyristoylphosphatidylcholin; Std: Standard-Mischung (enthält je 1µg/µl Sphingomyelin, Phos-phatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylethanol-amin, Sulfatide, Galactocerebroside und Cholesterol).
Die untersuchten DMPC-Chargen ergaben keine Färbung. Auch bei einer Auftrags-
menge von 100 µg Lipid pro Spot konnte bei den untersuchten Chargen kein Lipid
detektiert werden, es sind lediglich verschmierte weiße Flecken in Höhe des Phos-
phatidylcholin- bzw. Phosphatidylserinfleckes des Standards zu erkennen. Somit
kann ausgeschlossen werden, dass die vier DMPC-Chargen mehr als 0,1% (m/m)
ungesättigte Phospholipide bzw. Cholesterol enthalten.
Abb. 52 zeigt ein Chromatogramm, in welchem die Detektion mittels Dittmer-Lester-
Reagenz erfolgte. Art und Auftragsmengen der Lipide sind Tab. 18 zu entnehmen.
Cholesterol, Galactocerebroside und Sulfatide der Standard-Mischung können mit
diesem Reagenz nicht detektiert werden (Dittmer & Lester, 1964).
Abb. 52 : Dünnschichtchromatogramm nach Detektion mit Dittmer-Lester-Reagenz. Die Art und Men-gen der aufgetragenen Lipide sind Tab. 18 zu entnehmen. SM. Sphingomyelin; PC: Phosphatidyl-cholin; PS: Phosphatidylserin; PI: Phosphatidylinositol; PG: Phosphatidylglycerol; PE: Phosphatidyl-ethanolamin; Lyso: Lysophosphatidylcholin.
PE PG PI PS PC SM Lyso
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
76
Spot-Nr.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Lipid DM PC 1
DM PC 2
DM PC 3
DM PC 4
DM PC 1
DM PC 2
DM PC 3
DM PC 4
Std+ DMPC
1
Std+ DMPC
2
Std+ DMPC
3
Std+ DMPC
4
Menge [µg]
0,2 0,2 0,2 0,2 100 100 100 100 0,3 + 0,5
0,3 + 0,5
0,3 + 0,5
0,3 + 0,5
Spot-Nr.
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Lipid Std + Lyso
Std Std LM DM PC 1
DM PC 2
DM PC 3
DM PC 4
DM PC 1 +Lyso
DM PC 2 +Lyso
DM PC 3 +Lyso
DM PC 4 +Lyso
Menge [µg]
0,3 + 0,3
0,3 0,5 5 15 15 15 15 12 + 0,2
12 + 0,2
12 + 0,2
12 + 0,2
Tab. 18 : Art und Auftragsmengen der in Abb. 52 chomatographierten Lipide. DMPC: Dimyristoylphos-phatidylcholin; Std: Standard-Lipid-Mischung; LM: reines Lösungsmittel; Lyso: Lysophosphatidylcholin
Das Chromatogramm muss zur Dokumentation nach dem Trocknen des Sprüh-
reagenzes sofort eingescannt werden, da die blauen Flecken sehr schnell wieder
verblassen. Das ist der Grund dafür, warum die Spots der DMPC-Chargen 1 bis 4
(Abb. 52, Positionen 1 bis 4) nur noch schlecht erkennbar sind.
Neben der Standardmischung verschiedener Phospholipidklassen wurde zusätzlich
Lysophosphatidylcholin aufgetragen (Abb. 52, als Zumischung zur Standardmi-
schung in Position 13 und in Position 21 - 24 als Zumischung zu den DMPC-Chargen
1 bis 4). Damit konnte gezeigt werden, dass sich Lysophosphatidylcholin neben
DMPC und anderen Lipidklassen deutlich detektieren lässt, auch wenn der DMPC-
Spot infolge Überladung der Platte breit nach unten verschmiert. Keine der
untersuchten DMPC-Chargen enthält Lysophosphatidylcholin in einer Konzentration
von mehr als 0,2 %. Um den Einfluss von Überladung durch zu hohe Auftrags-
mengen auf die Form bzw. Lage der Spots zu untersuchen, wurden in Position 9 bis
12 zu jeweils 0,3 µg Standard zusätzlich je 0,5 µg DMPC der Charge 1 bis 4 zuge-
geben. Man erkennt, dass der Phosphatidylcholin-Fleck unter Zugabe von 0,5 µg
DMPC im Vergleich zum reinen Standard (Abb. 52, Positionen 13 bis 15) leicht zu
kleineren Rf-Werten verschmiert. Bei höheren Auftragmengen tritt dieser Effekt noch
ausgeprägter auf. Auch bei Auftragsmengen von 100 µg lassen sich keine weiteren
Lipide neben den durch DMPC verursachten Spots detektieren. Das bedeutet, dass
keine der DMPC-Chargen Phosphatidylserin, -inositol, -glycerin oder -ethanolamin in
Konzentrationen von mehr als 0,3% (m/m) enthält. Einzig über das Vorhandensein
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
77
von Sphingomyelin kann wegen der Fleckverbreiterung des DMPC keine Aussage
getroffen werden, allerdings ist die Anwesenheit von Sphingomyelin unwahrschein-
lich.
Weiterhin wurden die DMPC-Chargen auf freie Myristinsäure geprüft. Das Reagenz
nach Dittmer-Lester ist nicht geeignet, freie Myristinsäure anzufärben, allerdings
konnten bei Auftragung von 2 µg, 3 µg und 4 µg Myristinsäure weiße Spots auf dem
hellblauen Untergrund beobachtet werden (vgl. Abb. 53, umrandete Spots an
Position 4 bis 6). Weder in diesem, noch in anderen Chromatogrammen, die bis zu
300 µg DMPC enthielten, waren vergleichbare weiße Spots erkennbar. Damit kann
ausgeschlossen werden, dass in den untersuchten DMPC-Chargen mehr als 0,7 %
freie Myristinsäure vorhanden ist.
Abb. 53 : Ausschnitt aus einem Dünnschichtchromatogramm nach Detektion mit Dittmer-Lester-Rea-genz. Art und Menge der aufgetragenen Lipide sind in Tab. 19 zusammengefasst. Lyso: Lysophos-phatidylcholin; SM: Sphingomyelin; PC: Phosphatidylcholin; PI: Phosphatidylinositol; PG: Phos-phatidylglycerol; PE: Phosphatidylethanolamin; MA: Myristinsäure.
Spot-Nr.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Lipid Std Std LM MA MA MA + Lyso
DMPC 1
DMPC 2
DMPC 3
DMPC 3
DPPC
Menge [µg]
0,5 1,0 5,0 2,0 4,0 3,0 + 0,5
50 50 50 50 20
Tab. 19 : Zusammenfassung über Art und Menge der in Abb. 53 chromatographierten Lipide. Std: Standard-Mischung; LM: reines Lösungsmittel; MA: Myristinsäure; DMPC: Dimyristoylphosphatidyl-cholin; DPPC: Dipalmitoylphosphatidylcholin.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass mit Hilfe der dünnschichtchromato-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
MA PE PG PI PS PC SM Lyso
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
78
graphischen Untersuchungen keine Unterschiede in der Lipidzusammensetzung der
verschiedenen Chargen detektiert werden konnten. In keiner der Chargen konnten
mehr als 0,7% freie Myristinsäure (oder andere langkettige, gesättigte Fettsäuren),
mehr als 0,2% Lysophosphatidylcholin, 0,1% ungesättigte Lipide anderer Klassen
und Cholesterol sowie mehr als 0,2% gesättigte Lipide anderer Klassen nachge-
wiesen werden.
3.3.5 . Einfluss der Lipidvorbehandlung
Da die dünnschichtchromatographischen Untersuchungen keine Erklärung für die
aufgetretenen Chargenunterschiede lieferten, wurde untersucht, ob die unterschied-
lichen Eigenschaften möglicherweise auf differierende Vorbehandlungsverfahren der
pulverisierten Lipide (bedingt zum Beispiel durch Ausfällung aus verschieden polaren
Lösungsmitteln) zurückzuführen sind. Zu diesem Zweck wurden die Lipide zunächst
getrocknet, gewogen und nachfolgend in einer Mischung aus Chloroform und
Methanol im Verhältnis 2:1 (V/V) gelöst. Unter Vakuum wurde bei 45°C ein Lipidfilm
gebildet und dieser nach vollständiger Trocknung mit Wasser (konserviert mit 0,01%
Thiomersal) versetzt, so dass eine Lipidkonzentration von 10% (m/m) resultierte. Auf
diese Weise wurden alle Lipide derselben Vorbehandlung unterzogen und somit
vergleichbare Oberflächeneigenschaften geschaffen. Die Hydratation erfolgte analog
zu den vorangegangenen Untersuchungen über 2 Tage bei 40°C. Auch nach dieser
Vorbehandlung ergab sich bei allen Lipiden das gleiche makroskopische Quellungs-
verhalten, thermoanalytische Phasenverhalten sowie exakt dieselben Röntgenklein-
winkeldiffraktogramme, wie bereits bei den nicht vorbehandelten Proben, dargestellt
in Abschnitt 3.3.1, 3.3.2 und 3.3.3. Somit können Unterschiede in den Vorbehand-
lungsmethoden als Ursache für das uneinheitliche Verhalten der DMPC-Chargen
ausgeschlossen werden.
3.3.6 . Zweiwertige Kationen
Da weder lipidartige Verunreinigungen noch Unterschiede in der Oberflächen-
beschaffenheit für das unterschiedliche Verhalten der DMPC-Chargen verantwortlich
gemacht werden konnten, wurde untersucht, ob Kationen die Ursache hierfür dar-
stellen. Mehrwertige Kationen könnten als Rückstände aus dem Herstellungsprozess
der Lipide stammen.
Die Lipide 1, 3 und 4 wurden in etwas Chloroform gelöst und eventuell vorhandene
zweiwertige Kationen mit einer 2%igen (m/V) Natrium-EDTA-Lösung (pH 6,5) ent-
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
79
fernt. Nach Abtrennung durch Zentrifugation wurde die Chloroform-Phase unter
Vakuum bei 40°C über Nacht getrocknet. Die so behandelten Lipide wurden mit Aqua
purificata versetzt, so dass eine Lipidkonzentration von etwa 10% (m/m) resultierte
und 2 Tage bei 40°C hydratisiert. Die Eigenschaften der Lipide wurden mit denen des
Lipids DMPC 2 (562191-1 Lipoid) verglichen (Werte siehe Tab. 15, Tab. 16 sowie
Abb. 50). Alle Proben zeigten nach der Behandlung mit Natrium-EDTA ein mit der
Referenz vergleichbares Verhalten: Nach der Hydratation bildeten die Lipide einen
weißen Niederschlag mit einem wässrigen, leicht trüben Überstand. Die Onset-Werte
der Übergangstemperaturen des Vorübergangs erhöhten sich um etwa 1,3°C. Die
Lage des Hauptübergangs blieb hingegen unverändert (Tab. 20).
Charge
DMPC 1 (100/93 Astra)
T(Onset) P T(Onset)
M
DMPC 3 (201/92 Astra)
T(Onset) P T(Onset)
M
DMPC 4 (200/92 Astra)
T(Onset) P T(Onset)
M
vor Ausschütteln mit Na-EDTA
13,9°C 24,1°C 13,7°C 24,2°C 13,4°C 24,1°C
nach Ausschütteln mit Na-EDTA
15,2°C 24,2°C 15,1°C 24,2°C 15,4°C 24,2°C
Tab. 20 Onset-Temperaturen der Phasenübergänge verschiedener DMPC-Chargen vor und nach dem Ausschütteln mit Natrium-EDTA-Lösung.
Auch die Röntgenkleinwinkelmessungen zeigten eine deutliche Veränderung: Nach
der Behandlung mit Natrium-EDTA konnte bei allen drei Lipiden das Vorliegen einer
mulitlamellaren Phase detektiert werden (Abb. 54).
Abb. 54 : Röntgenkleinwinkeldiffraktogramme vollständig hydratisierter DMPC-Chargen vor (untere Kurven) und nach (obere Kurven) Ausschütteln mit Natriumedetat-Lösung. A: DMPC 1 (100/93 Astra); B: DMPC 3 (201/92 Astra); C: DMPC 4 (200/92 Astra).
Aus diesen Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass zweiwertige Kationen in den
Lipiden 1, 3 und 4 zum veränderten makroskopischen Quellungsverhalten, der Er-
niedrigung der Phasenübergangstemperatur des Vorübergangs sowie zur
schwachen bzw. fehlenden Ausbildung der multilamellaren Phase führten.
A B C
0 200 400 600 800
0
10000
20000
30000
40000
50000
Inte
nsitä
t
Kanal-Nummer
DMPC 3 (201/92 Astra)nach Ausschütteln mit Na-EDTA
DMPC 3 (201/92 Astra)
0 200 400 600 800
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
Inte
nsitä
t
Kanal-Nummer
DMPC 4 (200/92 Astra) nach Ausschütteln mit Na-EDTA
DMPC 4 (200/92 Astra)
0 200 400 600 8000
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
Inte
nsitä
t
Kanal-Nummer
DMPC 1 (100/93 Astra)nach Ausschüttelnmit Na-EDTA
DMPC 1 (100/93 Astra)
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
80
Als Gegenprobe zur Unterstützung dieser Ergebnisse wurden anhand des Lipids
DMPC 2 (562191-1, Lipoid) geprüft, ob durch Zumischung steigender Mengen
Calcium-Ionen die betreffenden Eigenschaften gezielt verändert werden können.
Anstelle von gereinigtem Wasser wurden Calciumchlorid-Lösungen der Konzentra-
tionen 0,08 mmol/l bis 15,10 mmol/l zur Hydratation verwendet. Bereits makrosko-
pisch sind nach der Hydratationsdauer von 2 Tagen Veränderungen zu erkennen: Mit
steigenden Calcium-Konzentrationen geht das hydratisierte Lipid in eine zunehmend
viskose Masse über, in der das gesamte Wasser inkorporiert ist.
Thermoanalytische Untersuchungen (Abb. 55) detektieren im Bereich zwischen
0,08 und 3,78 mmol/l Calciumchlorid eine Verringerung der Phasenübergangstempe-
ratur Tp des Vorübergangs auf etwa 14,3°C. Die Temperatur des Hauptübergangs
verändert sich in diesem Konzentrationsbereich kaum. Ab einer Calciumchlorid-Kon-
zentration von 3,78 mmol/l kommt es allerdings zu einem deutlichen Anstieg der
Onset-Temperaturen sowohl des Vor-, als auch des Hauptüberganges. Die Tempera-
turen beider Phasenübergänge bei 15,1 mmol/l sind im Vergleich zur calciumchlorid-
freien Referenz um etwa 1°C erhöht.
Abb. 55 : Onset-Temperaturen der Phasen-übergänge des Lipids DMPC 2 unter Zusatz steigender Calciumchorid-Konzentrationen.
Die parallel dazu durchgeführten Röntgenkleinwinkelmessungen zeigen, dass durch
Zugabe von Calciumchlorid auch die Ausbildung der multilamellaren Phase unter-
bunden wird (Abb. 56). Bei Konzentrationen von 0,38 mmol/l und 0,76 mmol/l sind
die Peaks der Lamellarphase zwar noch schwach angedeutet, aber bereits von
einem breiten "Buckel" von ungeordnet vorliegenden Bilayern überlagert. Ab Konzen-
trationen von 1,89 mmol/l kann keine Lamellarphase mehr detektiert werden, es wird
nur noch ein diffuser Peak als Zeichen des Vorliegens von Bilayern ohne lamellare
Ordnung detektiert.
0 2 4 6 8 10 12 14 1610
12
14
16
24
26
Ons
et d
er Ü
berg
angs
tem
pera
tur (
°C)
Calciumchlorid-Konzentration (mmol/l)
Tm (Onset) Hauptübergang
Tp (Onset)Vorübergang
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
81
Abb. 56 Röntgenkleinwinkeldiffrakto-gramme von vollständig hydratisiertem DMPC 2 (Charge 562191-1, Lipoid) unter Zusatz steigender Mengen Calciumchlorid.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass durch die Entfernung zweiwertiger
Kationen bei den DMPC-Chargen 1, 3 und 4 ähnliche Hydratationseigenschaften
erzeugt werden konnten, wie sie von den DMPC-Chargen 2 und 5 bekannt waren.
Daher kann davon ausgegangen werden, dass die Anwesenheit von zweiwertigen
Kationen einen entscheidenden Faktor für die veränderten Eigenschaften der Lipide
1, 3 und 4 darstellt. Da es nicht möglich war, genau die Onset-Temperatur des Vor-
übergangs der Lipide 2 bzw. 5 zu erreichen, gibt es neben den zweiwertigen
Kationen möglicherweise noch weitere Ursachen für das abweichende Phasenver-
halten.
Durch Zugabe von Calciumchlorid konnten das makroskopische Quellverhalten
verändert, die Vorübergangstemperatur gesenkt und die Ausbildung der multi-
lamellaren Phase unterdrückt werden. Dabei sind sehr niedrige CaCl2-Konzen-
trationen zur Verursachung der genannten Effekte ausreichend (Molverhältnis
DMPC:Calcium etwa 80:1), während höhere Calcium-Konzentrationen (ab einem
Molverhältnis DMPC:Calcium von unter 40:1) bezüglich der Phasenübergangs-
temperaturen einen gegenteiligen Effekt erzeugen (Abb. 55). Durch Calciumionen-
Zugabe konnte allerdings keine Senkung der Vorübergangstemperatur auf < 14°C,
wie sie von den Lipiden 1, 3 und 4 ermittelt wurde, erreicht werden. Dieses Ergebnis
korreliert mit der Beobachtung, dass durch Entfernen von zweiwertigen Ionen keine
entsprechende Steigerung der Phasenübergangstemperatur möglich war und
unterstützt die Vermutung, dass in den Chargen 1, 3 und 4 zusätzliche Verunreini-
gungen vorliegen.
Abschließend lässt sich zusammenfassen, dass für die Chargenunterschiede haupt-
sächlich zweiwertige Kationen verantwortlich gemacht werden können. Aus Zeit-
0 200 400 600 8000
100002000030000400005000060000700008000090000
100000110000120000130000140000150000160000170000180000
Inte
nsitä
t
Kanal-Nummer
Aqua purificata
0,08 mmol/l CaCl20,38 mmol/l CaCl20,76 mmol/l CaCl21,89 mmol/l CaCl23,78 mmol/l CaCl27,55 mmol/l CaCl2
15,10 mmol/l CaCl2
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
82
gründen wurde keine weitergehende Analyse zur Identifizierung der Kationen durch-
geführt.
3.4 . Dispersionen aus einer Mischung von DMPC und DPPC im Verhältnis 4:1 (m/m) Eine weitere Fragestellung beinhaltete, wie sich die Lagerstabilität von Dispersionen
bei der Verwendung einer Mischung der beiden gesättigten Phosphatidylcholine
DMPC und DPPC darstellt und ob es zur Gel- bzw. Nanotubebildung kommt. DMPC
und DPPC wurden in einem definierten Massenverhältnis von 4:1 (m/m) eingesetzt.
Die Lipide wurden zusammen in einer Mischung aus Chloroform und Methanol (2:1,
V/V) gelöst und nach dem Trocknen mit konserviertem Wasser (0,1% Thiomersal)
bei 50°C für 2 Tage hydratisiert. Die Dispergierung erfolgte entweder über Hoch-
druckhomogenisation (8 x 500 bar / 50°C) oder über Extrusion (8 x 200 nm / 50°C).
Als Lagerungstemperatur wurde 2 - 8°C gewählt. Für Lipidgehalte von 5% bzw. 10%
(m/m) wurden die Teilchengrößen und die Stabilität der Dispersionen über einen La-
gerzeitraum von 3 Monaten untersucht (Abb. 57).
Abb. 57 : Vergleich der mittleren Teilchengrößen (bestimmt mittels PCS, z-Average) von 5 bzw. 10%igen Dispersionen aus einer Mischung von DMPC und DPPC (Verhältnis DMPC:DPPC 4:1 [m/m]) über einen Lagerungszeitraum von 12 Wochen bei 2 - 8°C. Links: Dispergierung durch Hochdruck-homogenisation; Rechts: Dispergierung durch Extrusion.
Bezüglich der Dispergierungsmethoden ergibt sich ein ähnliches Bild, wie es bereits
für die Dispergierung von reinem DMPC beschrieben wurde. Die mittels Hochdruck-
homogenisation hergestellten Systeme ergeben kleinere mittlere Teilchengrößen (z-
Average) als die extrudierten Dispersionen, was sich auch im makroskopischen
Erscheinungsbild widerspiegelt: Die extrudierten Dispersionen sind bei gleicher
0 2 4 6 8 10 12102030405060708090
100110120
Dur
chsc
hnitt
l. Te
ilche
ngrö
ße (n
m) /
PCS
Lagerdauer bei 2-8°C (Wochen)
10% DMPC/DPPC-Mischung 5% DMPC/DPPC-Mischung
0 2 4 6 8 10 12102030405060708090
100110120
Dur
chsc
hnitt
. Tei
lche
ngrö
ße (n
m) /
PC
S
Lagerdauer bei 2-8°C (Wochen)
10% DMPC/DPPC-Mischung 5% DMPC/DPPC-Mischung
Hochdruckhomogenisation (Micron Lab 40) 8x 500 bar/ 40°C
Extrusion (EmulsiFlex C5) 8x 200 nm/ 40°C
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
83
Phospholipidkonzentration weißer und weniger durchscheinend als die hochdruck-
homogenisierte Dispersionen. Dabei zeigen die Polydispersitätsindices (Hoch-
druckhomogenisation: Um 0,1 bis 0,2; Extrusion: Zwischen 0,05 bis 0,1) eine engere
Partikelgrößenverteilung bei den extrudierten Dispersionen an. Die MSD-Auswertung
der PCS-Daten bestätigt für die hochdruckhomogenisierten Dispersionen breitere
Teilchengrößenverteilungen, die vor allem durch den zusätzlichen Anteil kleinerer
Partikel (zwischen 10 und 30 nm) verursacht werden.
Die Stabilität aller Dispersionen bei 2 - 8°C ist über den beobachteten Zeitraum
hinaus gut. Bei den hochdruckhomogenisierten Dispersionen kommt es innerhalb der
ersten 2 Wochen der Lagerung zum Absetzten von sehr wenig feinem Niederschlag
am Boden, der sich über einen Lagerzeitraum von 10 Monaten jedoch nicht ver-
mehrt. Parallel dazu wird ein Teilchengrößenwachstum beobachtet, welches sich
nach 3 Monaten bei einer mittleren Teilchengröße von etwa 90 nm stabilisiert. Mittels
MSD-Auswertung ist das Verschwinden der sehr kleinen Partikel (10 30 nm) detek-
tierbar, während der Anteil an Partikeln mit Größen > 270 nm leicht zunimmt. Die
extrudierten Dispersionen bleiben sowohl makroskopisch als auch bezüglich der Teil-
chengrößen stabil.
Abb. 58 zeigt Gefrierbruch-TEM Aufnahmen der beiden 10%igen Dispersionen nach
9 Monaten Lagerung bei 2 - 8°C. In beiden Dispersionen dominieren Liposomen,
selten findet man auch größere Partikel (in den gezeigten Ausschnitten nicht abge-
bildet). Die Liposomen der hochdruckhomogenisierten Dispersion sind etwas kleiner
als die der extrudierten Dispersion, was sehr gut mit den Ergebnissen der Teilchen-
größenmessungen korreliert (vgl. Abb. 57). Es kam in keinem Fall zu einer Gelbil-
dung, keine der Dispersionen enthielt Nanotubes.
Die Ergebnisse zeigen, dass durch die Mischung zweier gesättigter Phosphatidyl-
choline vergleichsweise stabile Dispersionen resultieren, die auch nach mehr-
monatiger Lagerung bei 2 - 8°C keine Nanotubes bilden und keinerlei Anzeichen
einer Gelbildung aufweisen. Wie schon bei reinen DMPC-Dispersionen sind durch
Extrusion mit dem EmulsiFlex C5 im Vergleich zur Hochdruckhomogenisation
homogenere Dispersionen mit einer verbesserten Lagerstabilität herstellbar.
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
84
Abb. 58 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen 10%iger Dispersionen (DMPC/DPPC 4:1 [m/m] nach 9 Wo-chen Lagerung bei 2 - 8°C. A) Herstellung mittels Hochdruckhomogenisation (Micron Lab 40, 8 x 500 bar / 40°C); B) Herstellung über Extrusion (EmulsiFlex C5, 8 x 200 nm / 40°C). Die mit Hochdruck-homogenisation dispergierten Proben weisen hauptsächlich Partikel mit Größen zwischen 25 nm und 140 nm auf, die mittels Extrusion hergestellten Proben enthalten Partikel mit Größen zwischen 30 nm und 170 nm, wobei der Anteil an kleinen Partikeln (< 50 nm) im Vergleich zu den hochdruck-homogenisierten Proben geringer ist. Größere Lipidpartikel werden nur sehr selten gefunden, Nano-tubes sind nicht enthalten.
3.5 . Dispersionen aus DPPC In diesem Kapitel werden Ergebnisse zur Lagerstabilität von Dispersionen aus
reinem DPPC zusammengefasst. Ziel der Untersuchungen war es zu klären, ob auch
DPPC in der Lage ist, unter vergleichbaren Bedingungen, also bei Lagerung in der
Gelphase, Nanotubes zu bilden. Weiterhin wurde untersucht, ob lagerstabile
Dispersionen aus reinem DPPC herstellbar sind, und wie sich die Dispergierungs-
methode auf die Eigenschaften der Dispersionen auswirkt.
Für alle Untersuchungen wurde DPPC der Charge 105/93 (Astra Arcus) in den
Konzentrationen 2%, 5% und 10% eingesetzt. Die Hydratation erfolgte über 2 Tage
bei 60°C. Die Dispergierung wurde analog der Herstellung von DMPC-Dispersionen
einmal über Hochdruckhomogenisation mit dem Micron Lab 40 (8 x 500bar/ 60°C),
zum anderen über Extrusion mit dem EmulsiFlex C5 (8 x 200 nm / 60°C) durchge-
führt.
In Anlehnung an das Phasenverhalten von vollständig hydratisiertem DPPC wurden
die Dispersionen bei 2 - 8°C (tilted gel, mit der Zeit Übergang in die Lc-Phase), 23°C
(tilted gel) und 38°C (Ripple Phase) gelagert.
In Abb. 59 sind die Dispersionen beider Herstellungsverfahren gegenübergestellt und
die Entwicklung der durchschnittlichen Teilchengrößen (z-Average) aller Disper-
sionen über einen Lagerzeitraum von 3 Monaten zusammengefasst.
100 nm100 nm
A B
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
85
Abb. 59 : Gegenüberstellung der Lagerstabilität von verschieden konzentrierten DPPC-Dispersionen über 12 Wochen in Abhängigkeit von der Lagerungstemperatur. Die Teilchengrößen (PCS mit z-Average Auswertung) stellen Mittelwerte aus mindestens 5 Einzelmessungen dar.
Aus den gezeigten Daten geht hervor, dass die mittels Hochdruckhomogenisation
hergestellten Dispersionen kleinere mittlere Teilchengrößen aufweisen als die durch
Extrusion hergestellten Dispersionen. Die Polydispersitätsindices (nicht gesondert
0 2 4 6 8 10 120
50
100
150
600
800
1000
1200
1400
1600
Dur
chsc
hnitt
l. Te
ilche
ngrö
ße (n
m) /
PCS
Lagerdauer (Wochen)
38°C 23°C 2-8°C
0 2 4 6 8 10 12
50
100
150
400
500
600
700
Dur
chsc
hnitt
l. Te
ilche
ngrö
ße (n
m) /
PC
S
Lagerdauer (Wochen)
2-8°C 23°C 38°C
0 2 4 6 8 10 120
100
200
300
400
500
Dur
chsc
hnitt
l. Te
ilche
ngrö
ße (n
m) /
PC
S
Lagerdauer (Wochen)
2-8 °C 23°C 38°C
2 % DPPC
5 % DPPC
10 % DPPC
Hochdruckhomogenisation (Micron Lab 40) 8x 500 bar / 60°C
0 2 4 6 8 10 122030405060708090
100110120130140
Dur
chsc
hnitt
l. Te
ilche
ngrö
ße (n
m) /
PC
S
Lagerdauer (Wochen)
2-8°C 23°C 38°C
0 2 4 6 8 10 122030405060708090
100110120130140
Dur
chsc
hnitt
l. Te
ilche
ngrö
ße (n
m) /
PC
S
Lagerdauer (Wochen)
2-8°C 23°C 38°C
0 2 4 6 8 10 12405060708090
100110120130140150160
Dur
chsc
hnitt
l. Te
ilche
ngrö
ße (n
m) /
PC
S
Lagerdauer (Wochen)
2-8°C 23°C 38°C
Extrusion (EmulsiFlex C5) 8x 200 nm / 60°C
2 % DPPC
5 % DPPC
10 % DPPC
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
86
aufgeführt) weisen darauf hin, dass die Hochdruckhomogenisation deutlich hetero-
genere Teilchenkollektive hervorbringt (Polydispersitätsindices zwischen 0,12 bis
0,24) als die Extrusion (Polydispersitätsindices von 0,05 bis 0,12). Der Einfluss der
Dispergierungsmethoden bezüglich der Teilchengrößen und der Breite der Verteil-
ungen von DPPC-Dispersionen steht in Analogie zu den Beobachtungen bei Disper-
sionen aus DMPC (Kapitel 3.2.3) und Dispersionen einer Mischung aus DMPC und
DPPC (Kapitel 3.4).
Alle Dispersionen weisen unabhängig von der DPPC-Konzentration und der
Herstellungsmethode eine gute Lagerstabilität bei 2 - 8°C und 23°C auf. Es kommt
im Beobachtungszeitraum von 3 Monaten maximal zu einer Zunahme der mittleren
Teilchengröße um etwa 15 nm, wobei die Teilchengrößen bei 23°C stets etwas
niedriger sind als die Teilchengrößen bei 2 - 8°C (Abb. 59).
Makroskopisch bleiben die extrudierten Dispersionen vollkommen homogen, wäh-
rend die hochdruckhomogenisierten Dispersionen mit 5% und 2% DPPC nach 2 Wo-
chen einen sehr dünnen Schleier eines feinen Niederschlags aufweisen, der sich
über einen Lagerungszeitraum von 10 Monaten jedoch nicht verstärkt. Gefrierbruch-
TEM Aufnahmen (Abb. 60, oben und Mitte), die nach 10-monatiger Lagerung erstellt
wurden, bestätigen die beschriebenen Beobachtungen: Liposomen, aufgrund der
Lagerung in der Gelphase polyedrisch verformt, dominieren in den Proben, größere
Vesikel werden nur extrem vereinzelt in hochdruckhomogenisierten Proben ge-
funden. Die Stabilität der Dispersionen bei Lagerung kurz unterhalb der Ketten-
schmelztemperatur (Lagertemperatur 38°C) ist hingegen gering: Nach einer Lager-
dauer von 2 bis 5 Wochen tritt eine deutliche Viskositätserhöhung auf, bei den hoch-
druckhomogenisierten Proben sind zusätzlich noch Schlieren sichtbar. Das damit
einhergehende Teilchengrößenwachstum ist bei den hochdruckhomogenisierten
Proben stärker ausgeprägt als bei den extrudierten Proben. Gefrierbruch-TEM Auf-
nahmen (Abb. 60, unten) zeigen die Ultrastruktur dieser viskos-schlierigen Systeme:
Liposomen sind nur noch in den extrudierten Proben zu finden, daneben existieren
ausgedehnte Lipidpartikel. Die hochdruckhomogenisierten Proben zeigen nahezu
ausnahmslos ausgedehnte Lipidpartikel, kleinere Liposomen sind hier nur noch sehr
selten zu finden. Die Lagerung bei 38°C führt demnach zu einer Fusion der
Liposomen, wodurch sich ähnliche Lipidsysteme ergeben, wie sie nach der
Hydratation von Bulkmaterial vorliegen. Bei den gemessenen Teilchengrößen
(Abb. 59, Werte für 38°C Lagerung), vor allem bei den hochdruckhomogenisierten
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
87
Proben, handelt es daher mit großer Wahrscheinlichkeit um die Größen von
Vesikeln, die erst durch den notwendigen Verdünnungsschritt aus den sehr großen
Lipidpartikeln entstanden sind.
Im Gegensatz zum DMPC bildet DPPC bei den hier erprobten Lagerbedingungen
keine Nanotubes aus. Auch Versuche, durch Verringerung der Ausgangsliposomen-
größe (durch Ultraschalldispergierung über 30 Minuten) und Variation der Lagerungs-
temperaturen (zusätzlich 13°C und 28°C) eine Nanotubebildung zu erreichen,
brachten keinen Erfolg. Vielmehr erwiesen sich die durch Ultraschall hergestellten
Liposomendispersionen mit mittleren Teilchengrößen von 100 nm bei Lagerungs-
temperaturen von 2 - 8°C, 13°C, 23°C und 28°C als sehr stabil (Daten nicht gezeigt).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Liposomendispersionen aus reinem DPPC
im Vergleich zu DMPC bei Lagerung in der Gelphase eine gute Lagerstabilität
aufweisen. Es wurde gezeigt, dass die Extrusion durch isopore Polycarbonat-
Membranen mit dem EmulsiFlex C5, wie schon bei DMPC-Dispersionen und
Dispersionen aus einer Mischung von DMPC und DPPC beschrieben, homogenere
und stabilere Liposomendispersionen als die Hochdruckhomogenisation mit dem
Micron Lab 40 liefert. DPPC ist unter vergleichbaren Bedingungen, also bei Lagerung
von Dispersionen in der Gelphase, nicht in der Lage, Nanotubes zu bilden; eine
Gelbildung findet nicht statt.
Ergebnisse
_________________________________________________________________________________
88
Abb. 60 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen 10%iger DPPC-Dispersionen, hergestellt mittels Hochdruck-homogenisation (links) bzw. Extrusion (rechts), nach 10 Monaten Lagerung bei 2 - 8°C (oben), 23°C (Mitte) und 38°C (unten). Bei 2 - 8°C und 23°C sind nach einer 10-monatigen Lagerdauer Liposomen dominierend, wobei die Hochdruckhomogenisation kleinere Teilchengrößen (< 100 nm) hervorruft, während die durch Extrusion hergestellten Liposomen etwa 100 bis 200 nm groß sind. Lagerung bei 38°C führt zu einer umfassenden Fusion der Liposomen infolge derer ausgedehnte Lipidpartikel entstehen.
100 nm 100 nm
2-8°C; Hochdruckhomogenisation 2-8°C; Extrusion
100 nm 100 nm
23°C; Hochdruckhomogenisation 23°C; Extrusion
200 nm 100 nm 200 nm
38°C; Hochdruckhomogenisation 38°C; Extrusion
Diskussion
____________________________________________________________________ 89
4. Diskussion In der vorliegenden Arbeit wurde ausgehend von der Frage nach der Lagerstabilität
von DMPC-Dispersionen gesättigter Phosphatidylcholine in der Gelphase ein spezi-
elles Gelbildungsphänomen aufgezeigt. Ziel der Arbeit war es, den Mechanismus der
beobachteten Gelbildung zu klären, wozu umfangreiche elektronenmikroskopische
Untersuchungen durchgeführt wurden. Als Grundbaustein des Gelgerüstes wurde
eine neue Spezies von Nanotubes entdeckt, deren Charakterisierung wegen ihrer
Neuartigkeit sowie ihrer gravierenden Auswirkungen auf die Lagerstabilität der Di-
spersionen ins Zentrum der vorliegenden Arbeit gestellt wurde. Im Hinblick auf eine
potenzielle pharmazeutische Anwendung der DMPC-Nanotubes sollten Einflüsse der
Herstellungsmethode sowie lipidartiger Verunreinigungen auf die Nanotubebildung
untersucht sowie erste Erfahrungen zur Anwendung verschiedener Konservierungs-
mittel gesammelt werden. Reinheitsuntersuchungen an verschiedenen DMPC-Char-
gen bildeten wegen ihrer Relevanz für die Nanotubebildung einen weiteren Schwer-
punkt.
4.1. Vorstellungen zur Morphologie der Nanotubes im Vergleich zu bereits bekannten tubulären Strukturen
Mittels Transmissionselektronenmikroskopie konnte unter Anwendung verschiedener
Präparationstechniken die Morphologie der Nanotubes aufgeklärt werden. Beim Be-
stimmen der Nanotubedurchmesser aus den elektronenmikroskopischen Aufnahmen
fallen deutliche Unterschiede zwischen Proben, die mittels Negativkontrastierung
präpariert wurden (40 - 50 nm, vgl. Abb. 15, S. 35) und Proben, die mit Kryo-Elektro-
nenmikroskopie untersucht wurden (35 - 40 nm, vgl. Abb. 17, S. 38), auf. Dieses
Phänomen lässt sich durch den notwendigen Trocknungsschritt während der Nega-
tivkontrastierung erklären, infolge dessen Hohlkörper, wie die hier beschriebenen,
kollabieren können.
Olsen et al. (Olsen et al., 1979) haben für die Negativkontrastierung einen Korrektur-
faktor von 0,75 zur Berechnung von "wahren" Liposomendurchmessern aus ge-
messenen Liposomendurchmessern eingeführt. Sie gingen davon aus, dass die
Liposomen während der Trocknung vollständig zu flachen Scheiben kollabieren. Un-
tersuchungen von Drechsler et al. haben allerdings gezeigt, dass frisch präparierte
kleinere Liposomen (d < 100 nm) nicht vollständig kollabieren, sondern vielmehr als
Halbkugeln bzw. Halbkugeln mit Vertiefungen bestehen bleiben (Drechsler,
Diskussion
____________________________________________________________________ 90
f = 0,75 f = 0,87 f = 0,87
r l
persönliche Mitteilung; Drechsler et al., 1995). Sie haben hierfür einen Korrektur-
faktor von 0,87 errechnet. Es ist allerdings zu beachten, dass bei längerer Lagerung
der Trocknungsprozess fortschreitet, wodurch sich die Morphologie mit der Zeit
weiter verändern kann. Abb. 61 zeigt eine schematische Darstellung der morpho-
logischen Veränderungen am Beispiel eines kugelförmigen Vesikels bei der
Negativkontrastierung mit den entsprechenden Korrekturfaktoren.
Abb. 61: Schematische Darstellung der morphologischen Veränderungen von Liposomen während des Trocknungsprozesses im Rahmen der Negativkontrastierung (nach Drechsler, unveröffentlicht). r l= Radius des Liposoms; r d = Radius der Scheibe; r h = Radius der Halbkugel bzw. einer deformier-ten Halbkugel. Die Darstellung ist übertragbar auf den Querschnitt eines Nanotubes. Der wahre Durchmesser (r l) ergibt sich durch Multiplikation des gemessenen Durchmessers r d bzw. r h mit dem entsprechenden Korrekturfaktor.
Geht man davon aus, dass die mittels Kryo-TEM ermittelten Durchmesser von etwa
35 - 40 nm die wahren Nanotube-Durchmesser darstellen, zeigt sich, dass der von
Drechsler et al. vorgeschlagene Korrekturfaktor von 0,87 eine bessere Korrelation
ergibt. Für die aus der Negative Staining Präparation ermittelten Durchmesser von
40 bis 50 nm ergeben sich unter Annahme des Korrekturfaktors von 0,87 wahre
Durchmesser von 34,4 bis 43,5 nm, was gut mit den mittels Kryo-TEM ermittelten
Durchmessern übereinstimmt. Bei der Annahme eines Korrekturfaktors von 0,75 wür-
den wahre Durchmesser zwischen 30 und 37,5 nm resultieren, diese Werte konnten
mittels Kryo-TEM jedoch nicht bestätigt werden. Es kann daher davon ausgegangen
werden, dass in Analogie zu den Beobachtungen von Drechsler et al. die Nanotubes
bei der Negative Staining Präparation nicht vollständig kollabieren, sondern abhängig
vom Trocknungsgrad als mehr oder weniger intakte halbrunde Schläuche bestehen
bleiben. Der wahre Durchmesser der Nanotubes kann somit auf ca. 35 - 45 nm ein-
gegrenzt werden.
Als Ergebnis der elektronenmikroskopischen Untersuchungen mit den verschiedenen
Präparationsmethoden kann eine Modellvorstellung für die Morphologie der DMPC-
Nanotubes entwickelt werden (Abb. 62). Die Streifen entlang des Nanotubes kenn-
zeichnen die geschraubte Rippelstruktur (vgl. Abb. 15 und 20).
Diskussion
____________________________________________________________________ 91
Abb. 62: Modellvorstellung für die Morphologie der DMPC-Nanotubes. Die Wand wird von einem ein-zelnen Bilayer gebildet. Die Abmessungen ergeben sich nach Ausmessung der elektronenmikrosko-pischen Aufnahmen. Die Schraubungsrichtung der Rippelstruktur verläuft bezüglich der Ausbreitungs-richtung entlang der Längsachse eines Nanotubes entgegen dem Uhrzeigersinn (= linkshändig). Ein Umlauf einer Rippel ergibt einen Abstand von 2 Rippeln
In Tab. 21 sind die morphologischen Eigenschaften der Nanotubes und anderer,
ausschließlich phospholipidbasierter, tubulärer Strukturen gegenübergestellt (sche-
matische Darstellung der Strukturen: siehe Abb.6, S.12). Die DMPC-Nanotubes sind
aufgrund ihres Aufbaus klar von den anderen Strukturen abzugrenzen: Neben ihrer
Größe unterscheiden sie sich vor allem in der Anzahl der die Tubuluswand bildenden
Bilayerschichten und darin, dass die Enden der DMPC-Nanotubes im Gegensatz zu
allen anderen tubulären Strukturen geschlossen sind.
DMPC-Nanotubes Cochleate Microtubes Nanotubes Lipid(e) DMPC z.B. Phosphatidyl-
serin + Calcium-ionen
DC8,9PC u.a. polymerisierbare Phosphatidylcholine
DC8,9PC + DNPC
Durchmesser ca. 40 nm 200 - 1000 nm 400 - 1000 nm 50 - 60 nm Länge mehrere µm mehrere µm 1 - 200 µm 10 - 100 µm Lamellarität unilamellar multilamellar oligolamellar
(1 - 10 Bilayerschichten)
oligolamellar (2 - 4 Bilayerschichten)
wässriger Innenraum
ja nein ja ja
Aussehen der Enden
geschlossen durch halbrunde Kappen
offen offen offen
Oberflächen-strukturierung
helikal undulierter Bilayer, Ganghöhe ca. 23 nm, Windung linkshändig
keine z.T. helikale Streifung erkennbar
keine
Tab. 21: Gegenüberstellung der Eigenschaften verschiedener tubulärer Lipidstrukturen. DMPC: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin; DC8,9PC (auch DC23PC): 1,2-bis(10,12-tricosadinoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin; DNPC: 1,2-bis(dinonanoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin.
Charakteristisch und einzigartig ist weiterhin die gleichmäßige helikale Undulierung
des Bilayers, die bezüglich des Aussehens und der Ganghöhe (ca. 23 nm) etwa der
Periodizität eines symmetrisch modulierten Bilayers der Ripple Phase vergleichbar ist
Durchmesser 35 - 45 nm
Ganghöhe ca. 23 nm
Ende durch halbrunde Kappe geschlossen
Drehsinn der linkshändigen
helikalen Windungen
Diskussion
____________________________________________________________________ 92
(25 - 30 nm, Meyer & Richter, 2001). Die DMPC-Nanotubes lassen sich somit in
keine Gruppe der bekannten tubulären Strukturen einordnen und können als neue,
eigenständige Spezies von Vesikeln mit tubulärer, gerippelter Struktur aufgefasst
werden.
4.2. Überlegungen zum Entstehungsmechanismus der Nanotubes
Neben morphologischen Unterschieden zu den bekannten tubulären Strukturen wei-
sen die DMPC-Nanotubes weiterhin Unterschiede hinsichtlich der Bildungsvorausset-
zungen auf, die Vermutungen auf einen möglichen Entstehungsmechanismus zulas-
sen.
Obwohl die Microtubes polymerisierbarer Phospholipide und Cochleaten sich mor-
phologisch voneinander unterscheiden (siehe Abb.6 und Tab. 21), wird für ihre Ent-
stehung, gestützt durch elektronenmikroskopische Beobachtungen, ein vergleichba-
rer Bildungsmechanismus diskutiert (Schnur et al., 1987). Eine zentrale Rolle spielt
für beide Strukturen das Durchlaufen des Phasenübergangs aus der Lα-Phase in die
Gelphase. Dieser Phasenübergang wird im Falle der Microtubes durch langsame
Temperaturerniedrigung knapp unterhalb die Kettenschmelztemperatur, im Falle der
Cochleate isotherm durch Calciumzugabe induziert. Entscheidend scheint in diesem
Zusammenhang die Verringerung der Hydratation der polaren Kopfgruppe zu sein.
Die Vorstufe von Tubes der polymerisierbaren Phospholipide bilden große multi-
lamellare Vesikel. Unterschreiten die Ausgangsliposomen hingegen eine bestimmte
Größe (etwa 1 µm), unterbleibt die Tubebildung (Yager et al., 1985; Rudolph &
Burke, 1987; Schnur et al., 1987). Als Mechanismus gilt ein Aufrollen großer Vesikel
bzw. Bilayer um eine Tubulusachse (Yager et al., 1988). Da gelegentlich eine heli-
kale Streifung der Microtubes beobachtet wird, wird auch eine Bildung über die
Fusion von spiralig gewundenen Lipidbändern diskutiert (Schnur et al., 1994). Ausge-
hend von kleinen unilamellaren Vesikeln ist eine direkte Transformation in Micro-
tubes nicht möglich. Sie fusionieren zunächst bei drastischer Temperaturerniedri-
gung zu großen Bilayerstapeln, die ihrerseits nach Transformation in die Lα-Phase
und anschließendem Durchlaufen des Phasenübergangs aus der Lα-Phase in die
Gelphase Microtubes bilden (Rudolph & Burke, 1987; Burke et al., 1988).
Die Bildung von Cochleaten erfolgt ausgehend von kleinen unilamellaren Vesikeln.
Diese fusionieren bei Anwesenheit von Calcium zu großen Bilayern, die sich an-
schließend ohne Freilassung wässriger Innen- und Zwischenräume zu den Cochle-
Diskussion
____________________________________________________________________ 93
aten Lipidzylindern aufrollen (Papahadjopoulos, 1975). Der Prozess dieser Transfor-
mationen zu Microtubes bzw. Cochleaten vollzieht sich spontan innerhalb von Mi-
nuten. Die entstehenden tubulären Strukturen führen nicht zu einer Gelierung des
Systems.
In den 90er Jahren wurde die Bildung von Lipid-Nanotubes (siehe Abb.6 und
Tab. 21) ausgehend von einer äquimolaren Mischung des microtubebildenden
DC8,9PC mit dem kurzkettigen gesättigten DNPC beschrieben (Markowitz et al.,
1994; Svenson & Messersmith, 1999). Von den Autoren wird ein den Microtubes
ähnlicher Bildungsmechanismus ausgehend von großen Vesikeln vermutet. Der
Prozess der Transformation ist innerhalb von Minuten abgeschlossen. Nach weiterer
Inkubation bei Raumtemperatur transformieren die Nanotubes zu oligolamellaren,
helikal gewundenen Bändern. Diese bilden ein ausgedehntes dreidimensionales
Netzwerk, was sich in einer Gelierung der Dispersion niederschlägt.
Wie bei den oben erwähnten Microtubes und Cochleaten spielt auch bei den hier
erstmalig beschriebenen DMPC-Nanotubes der Übergang in die Gelphase eine
entscheidende Rolle. Im Rahmen der Arbeit wurde deutlich, dass neben der
Teilchengröße die Lagerungstemperatur einen entscheidenden Einfluss auf die
Bildung der Nanotubes hat: Nanotube- und Gelbildung wurden immer dann
beobachtet, wenn die Dispersionen bei 13°C gelagert wurden. Auf den ersten Blick
scheint es so, als sei eine Lagerung der Dispersionen knapp unterhalb des
Vorübergangs (Tp) zwischen der Lβ`-und der Pβ`-Phase von Bedeutung, legt man das
Phasenverhalten von vollständig hydratisiertem Bulkmaterial zu Grunde. Es ist je-
doch zu beachten, dass sich das Phasenverhalten kleiner unilamellarer Vesikel
(SUV) deutlich vom Phasenverhalten des Bulkmaterials bzw. multilamellarer Vesikel
(MLV) unterscheidet: Kodama et al. wiesen nach, dass eine Dispergierung von
DMPC-MLV`s zu SUV`s mittels Ultraschall zu einem Verschwinden des Vorüber-
gangs führt, während sich der Hauptübergang stark verbreitert. Zusätzlich zum ur-
sprünglichen Hauptpeak (Tm, etwa 24°C, hier als primärer Peak bezeichnet) ent-
wickelt sich bei steigendem Anteil an SUV`s ein sehr breiter, so genannter
sekundärer Peak mit einem Maximum bei etwa 19°C. Das Verschwinden des primä-
ren und Wachsen des sekundären Peaks ist ein gradueller Prozess, der mit zuneh-
mender Beschallungszeit fortschreitet. Das DSC Thermogramm einer SUV-Disper-
sion wird schließlich durch den sekundären Peak bei 19°C dominiert, der eine
Diskussion
____________________________________________________________________ 94
schwache Schulter bei niedrigeren Temperaturen aufweist. Der primäre Peak bei
höherer Temperatur ist nur noch schwach als Schulter sichtbar. Der Temperaturbe-
reich des Phasenübergangs liegt zwischen ca. 12°C und 30°C (Kodama et al., 1993).
Eigene DSC Untersuchungen (Daten in der Arbeit nicht gezeigt) frisch hergestellter
Dispersionen bestätigten die vorgestellten Veränderungen des thermoanalytischen
Verhaltens von DMPC infolge Dispergierung. Außerdem zeigte sich ein deutlicher
Unterschied in den DSC Thermogrammen von hochdruckhomogenisierten im Ver-
gleich zu extrudierten Dispersionen: Der sekundäre Peak bei 19°C war bei hoch-
druckhomogenisierten Proben stärker ausgeprägt als bei den extrudierten Proben.
Das bestätigte die Ergebnisse der Teilchengrößenmessungen und elektronenmikro-
skopischen Untersuchungen, nach denen die hochdruckhomogenisierten Disper-
sionen einen höheren Anteil an SUV`s und kleinsten Lipidpartikeln aufweisen. Da die
Ergebnisse dieser Arbeit darauf hindeuten (wird nachfolgend diskutiert), dass SUV`s
bzw. noch kleinere Lipidpartikel die entscheidende Rolle für die Nanotubebildung
spielen, ergibt sich, dass sich die Lipide der relevanten Vesikel bei 13°C nicht knapp
unterhalb des Vorübergangs zwischen den beiden Gelphasen befinden, sondern
vielmehr im Bereich des Übergangs von der Lα-Phase in die Gelphase.
Im Gegensatz zu den bekannten tubulären Strukturen dauert die Transformation
einer DMPC-Dispersion in ein hauptsächlich aus Nanotubes bestehendes System
allerdings mehrere Tage (erste Nanotubes sind nach etwa einer Woche zu finden)
bis Wochen.
Im Rahmen der Arbeit konnten trotz intensiver elektronenmikroskopischer Unter-
suchungen keine eindeutigen Hinweise auf den Mechanismus der Nanotubebildung
in Form von Übergangsstrukturen gefunden werden. Es gibt keine Anzeichen dafür,
dass vor der Nanotubebildung verstärkt ausgedehnte Bilayer oder große multi-
lamellare Vesikel gebildet werden. Zwar zeigen viele TEM-Aufnahmen von gelierten
Systemen neben Nanotubes auch derartige Strukturen, allerdings konnte ihre Exi-
stenz auch bereits direkt nach der Herstellung nachgewiesen werden. Auch helikale
Bänderstrukturen, wie sie beispielsweise im Zusammenhang mit Nanotubes aus
DC8,9PC / DNPC beschrieben wurden, wurden in reinen DMPC-Dispersionen nie
gefunden. Vielmehr deuten die vorgelegten Ergebnisse der elektronenmikrosko-
pischen Untersuchungen darauf hin, dass im Gegensatz zu den bisher bekannten
tubulären Strukturen kleine unilamellare Vesikel (SUV`s) und kleinste Lipidpartikel
die direkte Vorstufe für die Nanotubes darstellen. Untersuchungen zum Einfluss der
Diskussion
____________________________________________________________________ 95
Herstellungsmethode haben eindeutig gezeigt, dass mit zunehmendem "Feinheits-
grad" der DMPC-Dispersionen die gelierungsverursachende Nanotubebildung forciert
wird. Aus multilamellaren Vesikeln (MLV`s) und großen Lipidpartikeln bzw. Bilayern
von undispergiertem DMPC hingegen wurden innerhalb von 3,5 Monaten nachweis-
lich keine Nanotubes gebildet. Die Irreversibilität der Transformation von Nanotubes
zu großen Vesikeln bzw. Bilayerbereichen durch Temperaturerhöhung unterstützt
diese Hypothese. Dem gegenüber steht eine Beobachtung von Meyer et al. (Meyer
et al., 1998, 2000): Die Autoren beschreiben mittels Gefrierbruch-TEM im Zu-
sammenhang mit konvex-konkaven Bilayerdeformationen bei kalt hydratisiertem (4 -
8°C), undispergiertem DMPC das gelegentliche Auftreten einer den Nanotubes
ähnlichen Struktur. Die Autoren vermuten, dass sich ein solcher "schraubenartig
strukturierter Konus" aus helikal gewundenen Bändern entwickelt (Meyer & Richter,
2001). Weiterführende Untersuchungen zur Charakterisierung dieser Strukturen
sowie ihrer Bildung wurden jedoch nicht beschrieben.
Berücksichtigt man weiterhin den vergleichsweise kleinen Nanotuberadius sowie die
Tatsache, dass die Nanotubes ausnahmslos unilamellar und ihre Enden geschlossen
sind, erscheint es unwahrscheinlich, dass ein den Microtubes und Cochleaten ähn-
licher Entstehungsmechanismus über das Aufrollen von Bilayern zugrunde liegt.
Vielmehr ist als mögliche Zwischenstufe einer direkten Fusion von SUV`s und kleinen
Lipidpartikeln eine perlschnurartige Zusammenlagerung von zwei oder mehreren
Partikeln denkbar. Ein entsprechendes Modell für die Entstehung der DMPC-Nano-
tubes wird in Abb. 63 vorgeschlagen. Dass diese vorgeschlagenen Zwischenstufen
elektronenmikroskopisch nicht nachgewiesen werden konnten, kann zwei Gründe
haben: Für Negativkontrastierung und Kryo-TEM wurden die Proben stark verdünnt
und mechanisch beansprucht, wodurch agglomerierte Vesikel getrennt worden sein
können. Bei der Gefrierbruch-Präparation hingegen wird zwar die native,
unbehandelte Probe verwendet, jedoch verläuft der Bruch durch die Probe rein
zufällig und die Wahrscheinlichkeit, dass die Bruchebene ausgerechnet senkrecht
zur Fusionsebene zweier kleiner Vesikel verläuft, muss als gering eingeschätzt
werden.
Die Möglichkeit, dass Nanotubes über die Assoziation gelöster DMPC-Monomere
gebildet werden, kann wegen der extrem niedrigen CMC (critical micelle
concentration) von Phosphatidylcholinen mit gesättigten Fettsäureketten (weniger als
10-9 M) ausgeschlossen werden.
Diskussion
____________________________________________________________________ 96
Abb. 63: Modellvorstellung zur Entstehung von DMPC-Nanotubes aus SUV`s und kleinen Lipidparti-keln und ihrem Abbau durch Temperaturerhöhung. Auf die Darstellung der geschraubten Rippel-struktur der Nanotubes wurde aus Gründen der Vereinfachung in dieser Modellzeichnung verzichtet. SUV`s: kleine unilamellare Vesikel; MLV`s: multilamellare Vesikel; MVV`s: multivesikuläre Vesikel.
Es ist allgemein bekannt, dass kleine unilamellare Vesikel wegen der starken
Krümmung ihrer Bilayer und Packungsdefekten vergleichsweise instabil sind und
daher stärker als große Vesikel zur Fusion neigen. Die Frage, aus welchem Grund
die Nanotubes und nicht LUV`s (große unilamellare Vesikel) oder MLV`s (multi-
lamellare Vesikel) das offensichtlich bevorzugte Produkt der Fusion von fein disper-
giertem DMPC bei Lagerung bei 13°C darstellen, lässt sich bis jetzt nur hypothetisch
beantworten. Ein Anhaltspunkt ergibt sich bei der Berücksichtigung des so genann-
ten Lipid Flip-Flops. Der Flip-Flop, d.h. der Platzwechsel eines Lipidmoleküls zwi-
schen dem äußeren und inneren Monolayer der Doppelschicht, ist in der Gelphase
extrem gehemmt und benötigt Wochen (Lasic, 1993). Für die Fusion von SUV`s und
kleinsten Lipidpartikeln zu größeren Vesikeln mit geringerer Krümmung des Bilayers
ist aber genau dieser Flip-Flop notwendig, da sich in kleinen Vesikeln im äußeren
Monolayer deutlich mehr Moleküle befinden als im inneren Layer (Verhältnis
zwischen äußerem zu innerem Monolayer etwa 2:1 in SUV`s). In großen Vesikeln ist
dieses Verhältnis etwa 1:1. In einer exemplarischen Überschlagsrechnung kann ge-
zeigt werden (Abb. 64), dass für die Fusion von 20 SUV`s (d = 30 nm) zu einem
zylindrischen Nanotube nahezu gleicher Molekülzahl (Durchmesser = 40 nm, Län-
ge = 386 nm) etwa 25% DMPC-Moleküle weniger den Flip-Flop vom äußeren in den
inneren Layer durchführen müssen, als wenn diese 20 SUV`s zu einem kugelförmi-
gen LUV ebenfalls nahezu gleicher Molekülzahl (Durchmesser = 121 nm) fusionieren
würden.
Für die Berechnung wurde ein Platzbedarf eines DMPC-Moleküls innerhalb eines
Monolayers in der Lβ´-Phase von 0,46 nm2 sowie eine Bilayerdicke von 4,2 nm zu-
MLV`s, MVV`s, ausgedehnte Lipidpartikel Nanotube
T ≤ 13°C
SUV`s und Lipidpartikel
< 50 nm
T ↑ T > 15°C
mögliche Zwischenstufen (Agglomerate)
Diskussion
____________________________________________________________________ 97
grunde gelegt (Cevc, 1993). Gemäß der Berechnung der Oberfläche einer Kugel (für
SUV und LUV) bzw. der Mantelfläche eines Zylinders zuzüglich der Oberfläche
zweier Halbkugeln (geschlossenes Nanotube) lässt sich die Anzahl der DMPC-
Moleküle im äußeren und inneren Layer abschätzen. Es wird ersichtlich, dass die
Fusion von SUV`s bzw. kleinsten Lipidpartikeln zu Nanotubes unter dem Gesichts-
punkt des in der Gelphase gehemmten Flip-Flops vorteilhafter ist als die Fusion zu
LUV`s.
Anzahl Moleküle im äußeren Layer (= äL)
99 941
122 860
105 395
Anzahl Moleküle im inneren Layer (= iL)
86 546
63 700
81 450
Gesamtzahl Moleküle (äL+iL)
186 487 186 560 186 845
Verhältnis äL / iL 1,15 : 1 1,9 : 1 1,3 : 1
Abb. 64: Ergebnisse der Überschlagsrechnung zum notwendigen Platzwechsel (Flip-Flop) von DMPC-Molekülen bei der Fusion von SUV`s zu einem Nanotube im Vergleich zur Fusion zu einem LUV in der Gelphase. Die Gesamtzahl an DMPC-Molekülen ist in alle drei Fällen nahezu gleich. Die Oberfläche einer Kugel errechnet sich nach A = 4 π r2. Für den äußeren Layer wird der Vesikelradius r = d / 2 eingesetzt, für den inneren Layer der Vesikelradius abzüglich 4,2 nm (Dicke des Bi-layers = 4,2 nm ). Die Oberfläche eines Nanotubes wird vereinfacht aus der Mantelfläche eines Zylinders (M = 2 π r l mit l = lN - 2r) zuzüglich der Oberfläche zweier Halbkugeln berechnet. Für den inneren Layer wird der Radius r abzüglich 4,2 nm eingesetzt. Durch Division der errechneten Ober-flächen durch den Platzbedarf eines einzelnen DMPC-Moleküls erhält man die Anzahl an DMPC-Molekülen im äußeren und inneren Layer.
Betrachtet man außerdem die durch eine Fusion bedingte Vergrößerung der von den
Bilayern umschlossenen wässrigen Volumina wird deutlich, dass die Fusion von 20
SUV`s zu einem Nanotube eine geringere Penetration von Wasser durch die Lipid-
doppelschicht erfordert (nur etwa die Hälfte) als eine Fusion zu einem LUV. Da die
Lipiddoppelschichten kleiner unilamellarer Vesikel allerdings wegen der Packungs-
Flip-Flop: ca. 22 900 Moleküle
Flip-Flop: ca. 17 400 Moleküle
LUV mit d = 121 nm
Nanotube mit d = 40 nm,
lN = 386 nm
20 SUV`s mit d = 30 nm
Diskussion
____________________________________________________________________ 98
defekte sehr gut wasserdurchlässig sein dürften, erscheint dieses Argument im Ge-
gensatz zur Relevanz des Lipid Flip-Flops für die Nanotubebildung von untergeord-
neter Bedeutung zu sein.
Dass die Nanotubes die "Grundbausteine" für ein dreidimensionales Gelgerüst dar-
stellen, konnte in der Arbeit durch elektronenmikroskopische Nachweise netzartig
verwobener Nanotubes sowie durch die Beobachtung, dass eine Verflüssigung der
Gele durch Temperaturerhöhung mit dem Verschwinden der Nanotubes zu Gunsten
großer multilamellarer Vesikel einhergeht, belegt werden. Die Gelgerüststruktur
ähnelt der von Markowitz et al. und Svenson & Messersmith gezeigten Gelstruktur
aus vernetzten, helikal gewundenen Bändern (Markowitz et al., 1994; Svenson &
Messersmith, 1999). Im Unterschied zu den erwähnten Bänder-Gelen wurden in
DMPC-Gelen keine Anzeichen dafür gefunden, dass die Nanotubes an ihren Kon-
taktstellen miteinander fusioniert sind.
Aufgrund der starken Krümmung des Bilayers an den Enden der Nanotubes und der
damit verbundenen höheren Energie im Vergleich zum zylindrischen Abschnitt eines
Tubes ist es vorstellbar, dass die Nanotubes theoretisch einem permanenten Län-
genwachstum unterliegen können. Dagegen ist die Fusion eines SUV`s mit dem
zylindrischen Abschnitt des Tubes unwahrscheinlich, da seitens des Nanotubes neue
gekrümmte Flächen geschaffen werden müssten, was energetisch ungünstig ist. Tat-
sächlich traten nie verzweigte Nanotubes auf. Eine Grundvoraussetzung für das
"Wachstum" der Nanotubes gemäß der oben beschriebenen Hypothese ist ein aus-
reichendes Angebot an SUV`s, Lipidpartikeln oder anderen Nanotubes, um eine aus-
reichende hohe Kollisionswahrscheinlichkeit als ersten Schritt für eine Fusion zu ge-
währleisten. Tatsächlich belegen die Untersuchungen zum Einfluss der Herstellungs-
methode, dass Dispersionen mit einem höheren Anteil kleiner, packungsfrustrierter
Vesikel bzw. Lipidpartikel bereits innerhalb eines kürzeren Zeitraums eine ausge-
prägtere Gelierung zeigen als Dispersionen mit geringerem "Feinanteil", woraus eine
Korrelation zwischen der Anzahl an kleinen fusionsrelevanten Partikeln und Lipo-
somen (und damit ihrer Kollisionswahrscheinlichkeit) und der die Gelierung verur-
sachenden Nanotubeentstehung abgeleitet werden kann. Allerdings dauert das
Auftreten der Gelierung als makroskopisch wahrnehmbarer Effekt der in ausgedehn-
ten Netzwerken verflochtenen Nanotubes auch hier mindestens 2 Wochen, was
Diskussion
____________________________________________________________________ 99
ebenfalls die Hypothese vom "schrittweisen" Längenwachstum der Nanotubes unter-
stützt (vgl. Abb. 63).
Die DMPC-Gele bilden unter mechanischer Beanspruchung (z.B. kräftiges Schütteln)
inhomogene, fließfähige Systeme, die sich auch nach mehrmonatiger Lagerung nicht
wieder verfestigen. Ähnlich wie bei der mechanischen Beanspruchung während des
Verdünnens für die Präparation zur Negativkontrastierung oder Kryo-TEM ist ein
"Zerbrechen" von Nanotubes sehr wahrscheinlich, worauf größere Gelstücke entste-
hen, die sich nun gegeneinander verschieben können und innerhalb derer die netz-
artige Struktur noch intakt ist. An den aufgebrochenen Enden der Nanotubes sind die
hydrophoben Kohlenwasserstoffketten der Lipidmoleküle nun dem direkten Kontakt
mit Wasser ausgesetzt, was energetisch ungünstig ist. Zur Energieminimierung sind
zwei Mechanismen denkbar: Einerseits könnten die Nanotubeenden durch Fusion
mit entsprechenden SUV`s oder Lipidpartikeln geschlossen werden. Die Geschwin-
digkeit dieses "Heilungsprozesses" hängt von der Verfügbarkeit fusionsrelevanter
Partikel ab. Das Resultat wären weiterhin voneinander getrennte Bereiche vernetzter
Nanotubes, die Probe bliebe makroskopisch fließfähig. Andererseits ist auch eine
Fusion von zwei offenen Nanotubeenden denkbar. Im Ergebnis könnten die ge-
trennten Nanotubebereiche zumindest teilweise wieder "zusammenwachsen", was
eine Verfestigung des Systems zur Folge haben würde. Allerdings ist aufgrund der
erhöhten Viskosität ein "passgenaues" Zusammentreffen zweier Nanotubeenden ver-
hältnismäßig unwahrscheinlich. Die Beobachtung, dass sich durch Schütteln ver-
flüssigte Gele auch nach mehrmonatiger Lagerung nicht wieder verfestigen, deutet
auf eine untergeordnete Bedeutung der letztgenannten Möglichkeit hin. Den Prozess
mittels Elektronenmikroskopie zu verfolgen, ist wegen der bereits (im Ergebnisteil)
erwähnten unterschiedlichen Präparationsmanipulationen und der damit verbun-
denen Probleme nicht möglich; eine Verfolgung des Prozesses mittels Lichtmikrosko-
pie verbietet sich aufgrund der Dimensionen der beteiligten Vesikel. Somit können
keine verbindlichen Aussagen über eine mögliche "Heilung" zerstörter Nanotubes
nach mechanischer Belastung getroffen werden.
Über die molekulare Organisation der Lipidmoleküle innerhalb der Nanotubes kann
nur spekuliert werden, da im Rahmen der vorliegenden Arbeit keine Untersuchungen
zur Klärung der molekularen Struktur durchgeführt wurden. Die erarbeiteten Erkennt-
nisse über die DMPC-Nanotubes zeigen jedoch einige Parallelen zu den Microtubes,
Diskussion
____________________________________________________________________ 100
so dass ähnliche Ordnungsphänomene als treibende Kraft für die Nanotubeent-
stehung angenommen werden können.
Innerhalb der Microtubes wird, basierend auf fluoreszenzmikroskopischen Beobach-
tungen, spektroskopischen Befunden (Raman-Spektroskopie, 1H-NMR, FTIR) und
Polymerisationsexperimenten ein hoher Ordnungsgrad der Acylketten angenommen
(Schoen et al., 1987; Rudolph et al., 1989; Plant et al., 1990). Spätere Röntgenunter-
suchungen haben ergeben, dass bei der Microtubebildungstemperatur die lamellare
Lα-Phase (fluide Fettsäureketten) und die Lβ`-Phase (kristalline Fettsäureketten,
geneigt bezüglich der Bilayernormalen) koexistent sind. Die Autoren schlußfolgern,
dass die wesentliche Triebkraft der Tubebildung die Kristallisation der Acylketten dar-
stellt (Thomas et al., 1995). Wie bei den Microtubes findet - unter Annahme der
Hypothese über die Fusion von SUV`s und kleinsten Lipidpartikeln - die Bildung der
DMPC-Nanotubes im Bereich des Übergangs von der Lα-Phase in die Gelphase
statt, was ein Indiz dafür ist, dass auch hier die Kristallisation der Fettsäureketten von
Bedeutung ist.
Viele Vorstellungen zur Entstehung tubulärer Strukturen gehen außerdem davon
aus, dass die Chiralität der Lipidmoleküle eine wichtige Rolle spielt (Chappell &
Yager, 1991; Thomas et al., 1995). Schnur et al. konnten anhand Zirkulardichroismus
Untersuchungen zeigen, dass die molekulare Packung der Lipidmoleküle innerhalb
eines Microtubes chiral ist, während die Packung der Lipidmoleküle innerhalb sphä-
rischer Vesikel nicht chiral ist (Schnur et al., 1994). Alle DMPC-Nanotubes zeigen
eine Rippelstruktur, die linkshändig geschraubt ist. Daher scheint auch hier die
Chiralität der eingesetzten Lipidmoleküle für die resultierende Struktur eine Rolle zu
spielen. Weiterführende Untersuchungen könnten zeigen, ob sich mit dem D-
Enantiomer des DMPCs Nanotubes mit einer im Uhrzeigersinn geschraubte Rippel-
struktur (rechtshändig) ergeben würden.
Aufbauend auf den dargelegten Erkenntnissen über die Nanotubes eröffnet sich ein
weites Feld für weiterführende Strukturuntersuchungen, die dazu beitragen können,
die Natur dieser für gesättigte Phosphatidylcholine einzigartigen Struktur besser zu
verstehen.
4.3. Der Einfluss von Zusätzen auf die Nanotubebildung
Im Rahmen der Arbeit wurde der Einfluss verschiedener Konservierungsmittel sowie
lipidartiger Verunreinigungen auf die Nanotubebildung untersucht.
Diskussion
____________________________________________________________________ 101
Für keines der untersuchten Konservierungsmittel (Thiomersal, Parahydroxybenzoe-
säureester und Natriumazid; Strukturformeln siehe Abb.36, S. 55) wurde ein Einfluss
auf die Bildung der Nanotubes festgestellt, obwohl im Gegensatz zu Thiomersal bei
den Parahydroxybenzoesäureestern und auch bei der Verwendung von Natriumazid
Veränderungen des thermoanalytischen Verhaltens des undispergierten Bulkmaterial
nachgewiesen wurden. Obwohl die Parahydroxybenzoesäureester und Natriumazid
in vergleichbaren Molmengen eingesetzt wurden (DMPC / Natriumazid etwa 20:1;
DMPC / Parabene etwa 24:1), beeinflussten sie das Phasenverhalten unterschiedlich
stark, was wahrscheinlich in ihrer unterschiedlichen chemischen Struktur begründet
ist. Die Parahydroxybenzoesäureester sind lipophil, was eine Einlagerung in die
Lipiddoppelschicht begünstigt. Sie erniedrigten sowohl den Vor- als auch den Haupt-
übergang, was dafür spricht, dass die Wechselwirkungen der organischen Moleküle
mit den Bilayern eine Störung der Ordnung innerhalb der Bilayer bewirken.
Der Einfluss von Natriumazid war nur schwach ausgeprägt und äußerte sich in einer
leichten Verschiebung des Peakmaximums des Vorübergangs zu höheren Tempera-
turen, während jedoch die Onset-Temperatur unverändert bleib. Für einwertige Kat-
ionen wie Natrium ist beschrieben, dass sie keine signifikanten Effekte auf das
Phasenverhalten gesättigter Phosphatidylcholine, wie beispielsweise DPPC, verur-
sachen (Jain & Wu, 1977).
Dass Thiomersal keine Effekte auf das Phasenverhalten ausübt, liegt wahrscheinlich
zum einen an seiner guten Wasserlöslichkeit, die einer Einlagerung in die Lipiddop-
pelschicht entgegenwirkt, und zum anderen an der geringen Konzentration: Bei der
üblicherweise eingesetzten Konzentration von 0,01% (m/V) bezogen auf die Wasser-
phase kommen bei einer 10%igen DMPC-Dispersion auf ein Thiomersalmolekül ca.
600 DMPC-Moleküle, bei 0,1% Thiomersal sind es dementsprechend ca. 60 DMPC-
Moleküle.
Ungeachtet der beschriebenen Wechselwirkungen zeigten alle Dispersionen unab-
hängig vom verwendeten Konservierungsmittel im Beobachtungszeitraum von 2 Mo-
naten ähnliche Eigenschaften und bildeten gelig-stückige Niederschläge bei 13°C, in
denen die Nanotubes nachgewiesen werden konnten.
Weiterhin wurde untersucht, ob geringe Mengen anderer Lipide oder ähnlicher Sub-
stanzen einen Einfluss auf die Eigenschaften der Dispersionen und die Nanotubebil-
dung haben. Als "Verunreinigungen" wurden Lysophosphatidylcholin, Myristinsäure
Diskussion
____________________________________________________________________ 102
(als mögliche Abbauprodukte infolge Hydrolyse) oder hydriertes Soja-Lecithin in je-
weils 1%iger Konzentration (m/m) bezogen auf den DMPC-Gehalt zugesetzt.
Die Untersuchungen ergaben, dass bei der Lysophosphatidylcholin enhaltenden Pro-
be nach der Dispergierung neben Liposomen auch fadenförmige Mizellen vorlagen.
Sie wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie identifiziert; eine quanitative
Aussage anhand der elektronenmikroskopischen Aufnahmen zu treffen, war wegen
der Präparationsmanipulationen nicht möglich.
Obwohl die Lysophosphatidylcholin enthaltende Probe im Gegensatz zu den rest-
lichen drei Dispersionen makroskopisch nahezu klar war, was für das Vorliegen von
Mizellen typisch ist, schlug sich dieser Effekt in den Teilchengrößenmessungen nicht
nieder. Vielmehr ist in allen Proben, auch in der reinen DMPC-Dispersion, der über-
wiegende Anteil der Teilchen (ca. 98%) zwischen 5 und 50 nm groß. Dieser hohe
Anteil an extrem kleinen Teilchen liegt im hohen Homogenisierdruck (1000 bar) be-
gründet. Wie erwartet, sind die Dispersionen (mit Ausnahme der Lysophosphati-
dylcholin enthaltenden Probe) extrem instabil und gelieren bei 13°C innerhalb von 4
Wochen vollständig. Zum Vergleich: Bei der Verwendung desselben Lipids (DMPC 1)
führt ein Homogenisierdruck von nur 500 bar unter gleichen Lagerungsbedingungen
zwar zur Bildung inhomogen-stückiger Systeme, allerdings nie zu einer vollständigen
Gelierung, was wiederum die Hypothese von einer direkten Beteiligung kleinster
Lipidpartikel und SUV`s an der gelierungsverursachenden Nanotubebildung unter-
stützt.
Der Zusatz von Lysophosphatidylcholin bewirkt offenbar eine teilweise Transforma-
tion von DMPC-Vesikeln in fadenförmige Mischmizellen (vgl Abb. 48). Diese Trans-
formation lässt sich mit einem einfachen Modell in Anlehnung an die Theorie des
Packungsparameters von Israelachvili (siehe Abb. 2, S.3) beschreiben (Israelachvili
et al., 1977 & 1980). DMPC hat einen Packungsparameter von ~ 1, da der Volumen-
anteil der polaren Kopfgruppe und der beiden Alkylketten etwa gleich groß ist. In
Liposomen ist er wahrscheinlich wegen der Krümmung der Bilayer im äußeren
Monolayer etwas kleiner als 1, im inneren Monolayer etwas größer als 1. Lyso-
phosphatidylcholin hat einen Packungsparameter P < 1/3, was bedeutet, dass hier
der Volumenanteil der hydrophilen Kopfgruppe deutlich größer ist als der Volumen-
anteil der hydrophoben Kette. Die Einlagerung von Lysophosphatidylcholin in die
DMPC-Bilayer bewirkt eine wesentliche Verkleinerung des Packungsparameters in
der Umgebung des Lysophosphatidylcholins, so dass einige Liposomen "aufgelöst"
Diskussion
____________________________________________________________________ 103
werden und Mischmizellen entstehen (Abb. 65). Höchstwahrscheinlich würden höhe-
re Lysophosphatidylcholin-Konzentrationen zu einer vollständigen Überführung der
Phospholipidvesikel in ein mischmizellares System führen.
Abb. 65: Schematische Darstellung der Packungsverhältnisse eines SUV`s aus DMPC und einer fadenförmigen Mischmizelle aus DMPC und Lysophosphatidylcholin. Die Moleküle sind schematisch entsprechend ihres Packungsparameters dargestellt; die hydrophile Kopfgruppe ist durch einen ver-stärkten schwarzen Strich gekennzeichnet.
Der Zusatz von Myristinsäure oder auch hydriertem Soja-Lecithin führte hingegen zu
keiner vergleichbaren Vesikel-Mizell-Transformationen. Für Myristinsäure ist davon
auszugehen, dass sie, da die wässrige Phase neutral bis schwach sauer war, haupt-
sächlich in ihrer protonierten Form vorlag. Als lipophiles Molekül kann sie vor allem in
den lipophilen Teil des Bilayers eingelagert werden, ohne die Packungsgeometrie
entscheidend zu verändern. Hydriertes Soja-Lecithin stellt ein Gemisch verschie-
dener Phospholipidklassen dar, wobei laut Herstellerangaben Phosphatidylcholin mit
65 - 70% den Hauptanteil darstellt. Daneben sind etwa 7 - 10% Phosphatidylethanol-
amin, maximal 3% Lysophosphatidylcholin sowie maximal 3% Triglyceride enthalten
(Lipoid GmbH, 2001b). Alle Fettsäureketten sind gesättigt, für die enthaltenen
Phospholipide ist ein Packungsparameter von etwa 1 anzunehmen. Der Anteil an
Lysophosphatidylcholin ist vergleichsweise gering, so dass von dieser Seite bei der
eingesetzten niedrigen Konzentration keine gravierenden Veränderungen des
Packungsparameters zu erwarten sind.
Bezüglich der Nanotubebildung konnte gezeigt werden, dass weder Myristinsäure
noch hydriertes Soja-Lecithin in der verwendeten Konzentration einen Einfluss auf
die Nanotubebildung ausüben: Makroskopisch und auch bezüglich der Ultrastruktur
sind keine Unterschiede zur reinen DMPC-Dispersion feststellbar.
Beim Zusatz von Lysophosphatidylcholin hingegen bleibt die Gelbildung nach etwa 4
Wochen aus; erst nach 8 Wochen verfestigt sich die Probe. Die Ultrastruktur der
Probe wird neben den Nanotubes von zwei neuen Bänderstrukturen dominiert (vgl.
SUV d ~ 20 nm
Mischmizelle d ~ 5 nm, l ~ 50 nm
DMPC
Lysophos-phatidylcholin
Diskussion
____________________________________________________________________ 104
Abb. 49, S.68): Die Bänder sind entweder 20 - 25 nm oder 50 - 60 nm breit und in re-
gelmäßigen Abständen verdrillt. Ähnlich wie die Nanotubes sind die Bänder in der
Lage, ausgedehnte Netzwerke und somit ein Gel zu bilden. Aufgrund der beschriebe-
nen Ausgangsdispersion ergibt sich die Vermutung, dass sich die Nanotubes aus
verbliebenen "reinen" DMPC-Vesikel gebildet haben, während Lysophosphatidylcho-
lin an der Entstehung der Bänderstrukturen beteiligt zu sein scheint. So ist es
beispielsweise denkbar, dass die Bänder endliche DMPC-Bilayer darstellen, deren
Ränder durch Lysophosphatidylcholin vom umgebenden wässrigen Medium
abgeschirmt und somit stabilisiert werden. Offenbar herrscht innerhalb der Bänder
ein gewisser Twist-Winkel vor, der dazu führt, dass die Bänder in regelmäßige
Abständen verdrillt vorliegen.
4.4. Einfluss von zweiwertigen Kationen auf die Hydratations- und Dispersions- eigenschaften von DMPC
Im Rahmen der Arbeit wurden verschiedene DMPC-Chargen (siehe 2.2.1., Tab. 2)
zur Dispersionsherstellung verwendet, wobei Systeme mit zum Teil sehr unterschied-
lichen Eigenschaften resultierten. Aus Gründen der Reproduzierbarkeit im Hinblick
auf eine mögliche pharmazeutische Nutzung der Nanotubes war es wichtig, die Ursa-
che für diese chargenabhängigen Unterschiede zu klären.
Wichtig sind in diesem Zusammenhang bereits die makroskopischen Beobachtungen
während der Hydratation der Phospholipide: DMPC 2 und 5 bildeten einen weissen
Niederschlag mit nahezu klarer wässriger Phase als Überstand, DMPC 1, 3 und 4
bildeten bei gleicher Behandlung eine schleimig-zähe Masse, in die die gesamte
wässrige Phase inkorporiert war. Die DSC-Untersuchungen zeigten, dass die Über-
gangstemperatur des Vorübergangs bei den Lipiden 1, 3 und 4 deutlich niedriger ist
als bei den Lipiden 2 und 5. Parallel dazu durchgeführte Röntgenkleinwinkelmessun-
gen ergaben, dass sich bei Hydratation im Wasserüberschuss nur bei den Lipiden
2 und 5 eine multilamellare Phase ausbildet, während die Bilayer des Lipids 1 nur
teilweise eine lamellare Ordnung zeigen und bei den Lipiden 3 und 4 überhaupt
keine lamellare Ordnung festzustellen ist (vgl. Abb. 50, S. 73). All diese Befunde
sprechen für die Anwesenheit von Verunreinigungen in den Lipiden 1, 3 und 4, die
mit den hydrophilen Kopfgruppen interagieren, die Hydratation verbessern und die
Einarbeitung großer Mengen Wasser zwischen die Bilayerschichten ermöglichen, so
Diskussion
____________________________________________________________________ 105
dass diese auseinanderdriften, was auch in elektronenmikroskopischen Aufnahmen
des undispergierten DMPC 1 gezeigt werden konnte (Abb. 24, S.43).
Die dünnschichtchromatographischen Reinheitsuntersuchungen ergaben, dass zwi-
schen den Chargen hinsichtlich lipidartiger Verunreinigungen im Rahmen der Nach-
weisgenauigkeit keine Unterschiede bestehen. Im vorangegangenen Kapitel wurde
bereits gezeigt, dass Zusätze von Myrisinsäure bzw. hydriertem Soja-Lecithin in
1%iger Konzentration keine Veränderungen der Eigenschaften der Dispersionen her-
vorrufen. Auch eine unterschiedliche Vorbehandlung der Lipide kann als Versuracher
des unterschiedlichen Hydratations- und Dispergierverhaltens von DMPC ausge-
schlossen werden, da sich die Chargenunterschiede nach Anwendung einer für alle
Lipide gleichen Vorbehandlungsprozedur (Filmbildung aus Chloroform / Methanol)
nicht eliminieren ließen.
Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass zweiwertige Kationen eine ent-
scheidende Rolle für die Eigenschaften der verwendeten DMPC-Chargen spielen.
Bereits makroskopisch sind nach dem Entfernen von zweiwertigen Kationen mittels
Natrium-EDTA Unterschiede im Hydratationsverhalten der DMPC-Chargen 1, 3
und 4 festzustellen: Die Lipide bildeten im Wasserüberschuss nach zweitägiger Hy-
dratation analog zu den Chargen 2 und 5 weisse Niederschläge mit einem nahezu
klaren Überstand der wässrigen Phase. Die DSC-Untersuchungen der hydratisierten
Lipide haben gezeigt, dass die Phasenübergangstemperatur des Vorübergangs nach
Natrium-EDTA-Behandlung auf > 15°C ansteigt, was in etwa der ermittelten Phasen-
übergangstemperatur für die Lipide 2 und 5 entspricht. Analog ergaben die Röntgen-
kleinwinkelmessungen, dass die Lipide 1, 3 und 4 nach Natrium-EDTA-Behandlung
im Wasserüberschuss eine multilamellare Phase ausbilden. Diese Ergebnisse bele-
gen eindeutig, dass zweiwertige Kationen die Hauptursache für die variierenden Ei-
genschaften der verwendeten DMPC-Chargen darstellen.
Der beispielhafte Zusatz steigender Mengen Calciumionen zu DMPC der Charge 2
zeigt (vgl. Abb.55 und 56, S. 80, 81), dass möglicherweise bereits extrem geringe
Mengen an Kationen für die Verursachung der beschriebenen Abweichungen von
dem für DMPC zu erwartenden Phasenverhalten ausreichend sind: Eine Cal-
ciumchlorid-Konzentration von 1,89 mmol/l (entspricht einem Molverhältnis DMPC:
Calcium von etwa 80:1) bewirkt eine Senkung des Onsets der Vorübergangstempe-
ratur von 15,9°C auf 14,3°C sowie eine vollständige Unterbindung der Ausbildung
der multilamellaren Phase; das gequollene Phospholipid bildet eine viskose Masse
Diskussion
____________________________________________________________________ 106
ohne wässrigen Überstand. Die Wechselwirkungen des Kations mit der Kopfgruppe
von DMPC führt demnach zu einer weitreichenden Störung der Kettenordnung
innerhalb des Bilayers, wodurch die Konformationsumwandlung zwischen den
beiden Gelphasen erleichtert wird. Daraus ergibt sich die Erniedrigung der Tempera-
tur des Vorübergangs; die Temperatur des Hauptübergangs bleibt jedoch
unbeeinflusst. Die Einführung der Ladung in die Bilayer durch Wechselwirkungen des
Calciums mit einer oder meheren Kopfgruppen induziert durch verstärkte Hydratation
eine Bilayerkrümmung (Abb. 66), infolge derer die lamellare Schichtung der Bilayer
aufgeweitet bzw. zerstört wird. Weiterhin ist eine elektrostatische Abstoßung der
positiv geladenen Bilayer wahrscheinlich, was zusätzlich die Einlagerung von Wasser
zwischen die Bilayerschichten fördert. Das erklärt sowohl die makroskopischen
Veränderungen sowie das in den Röntgenkleinwinkelmessungen detektierte
Verschwinden der Peaks für die multilamellare Phase bei steigender Calciumchlorid-
Konzentration.
Abb. 66: Modellvorstellung zum Einfluss von Calciumionen auf das Hydratationsverhalten von DMPC und die Eigenschaften der Liposomen. Die Calciumionen sind schematisch mit ihrer Hydrathülle dargestellt.
+ Ca2+
Dispergierung
bzw.
Dispergierung
+ Na-EDTA
Nanotube Nanotube
Diskussion
____________________________________________________________________ 107
Die Dispergierung der verschiedenen DMPC-Chargen ergab, dass die resultierenden
Dispersionen mit abnehmendem "Reinheitsgrad" des DMPCs (wenn man davon aus-
geht, dass die Erniedrigung der Vorübergangstemperatur des hydratisierten Bulkma-
terials mit zunehmender Kationenkonzentration fortschreitet) kleinere durchschnitt-
liche Teilchengrößen aufwiesen, und dass die Neigung zur Gel- und Nanotubebil-
dung bei 13°C abnahm. Offensichtlich vermögen die zweiwertigen Kationen größere
Bilayerkrümmungen und somit kleinere Teilchengrößen zu stabilisieren. Carasso et
al. haben vergleichbare Auswirkungen der Wechselwirkungen von Calciumionen mit
Phospholipiden beschrieben. Sie konnten zeigen, dass der Zusatz steigender Men-
gen Calciumionen zu phospholipidstabilisierten Emulsionen zunächst zu einer Ver-
minderung der ursprünglich negativen Ladung der Emulsionstropfen führt, was mit
einer Vergrößerung der mittleren Teilchengröße einhergeht. Dieser Effekt erreicht am
isoelektrischen Punkt sein Maximum. Nach Ladungsumkehr nimmt mit steigender
positiver Ladung die mittlere Teilchengröße wieder ab (Carasso et al., 1995).
Da der Bilayer durch die Interaktion der Kopfgruppen mit den Kationen eine positive
Nettoladung besitzt (Abb. 66), ist eine Annäherung der nun geladenen Liposomen
und Lipidpartikel als notwendige Vorstufe für eine Fusion infolge elektrostatischer Ab-
stoßung behindert. Das erklärt die verminderte Neigung zur gelierungsverursachen-
den Nanotubebildung. Untersuchungen von Mosharraf et al. zum Einfluss von Calci-
umionen auf die Oberflächenladung und Agglomerationsneigung von DPPC haben
ergeben, dass eine Korrelation zwischen der Ladung der Liposomen und ihrer Agglo-
merationsneigung besteht: Die Agglomerationsrate ist am höchsten, wenn die Vesi-
kelladung minimal ist (Mosharraf et al., 1995).
Über die Identität der zweiwertigen Kationen kann keine Aussage gemacht werden,
da weiterführende Untersuchungen zur Identifizierung des Kations bzw. möglicher-
weise verschiedener Kationen nicht durchgeführt wurden. Bezüglich des Instabilitäts-
phänomens "Gelbildung" lässt sich schlussfolgern, dass durch das Einführen von
Ladungen in den Bilayer, beispielsweise durch Zusatz von zweiwertigen Kationen
oder möglicherweise auch geladenen Phospholipiden, die Gelbildung während der
Lagerung bei 13°C zurückgedrängt werden kann.
Diskussion
____________________________________________________________________ 108
4.5. Fazit und Ausblick
Eine wichtige pharmazeutisch-technologische Fragestellung beinhaltet die Lagersta-
bilität pharmazeutischer Zubereitungen bzw. Arzneistoffträgersysteme.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das Hauptaugenmerk auf ein spezielles,
in der Literatur bisher nicht beschriebenes Instabilitätsphänomen bei der Lagerung
kolloidaler DMPC-Dispersionen gelegt: Die Gelierung von DMPC-Dispersionen nach
etwa vierwöchiger Lagerung bei 13°C. Die Ursache für diese gravierende Instabilität
- eine neue Spezies von Nanotubes, die dreidimensionale Netzwerke ausbildet -
wurde aufgeklärt und ein möglicher Mechanismus für ihre Bildung vorgeschlagen.
Durch die Wahl der Herstellungsmethode kann die Nanotubebildung entscheidend
beeinflusst werden. So ist es möglich, diese gelierungsverursachende Nanotubeent-
stehung zu verhindern, indem die Herstellung der Dispersionen über Extrusion durch
Membranen der Porengröße 200 nm erfolgt, infolge derer relativ eng verteilte Teil-
chengrößenkollektive ohne nennenswerten "Feinanteil" entstehen. Der hohe Energie-
eintrag während der Hochdruckhomogenisation und der Ultrabeschallung bewirkt
hingegen die Entstehung kleinster Partikel und forciert so die Nanotubeentstehung
und somit die unerwünschte, wenngleich intellektuell spannende Gelbildung. Weiter-
hin wurde gezeigt, dass die Einführung kleinster Mengen an zweiwertigen Kationen
sowie der Zusatz von DPPC stabilisierend auf die DMPC-Dispersionen und so der
Nanotube- und Gelbildung entgegen wirken. Aus den hier vorgestellten Ergebnissen
ergeben sich also sowohl Richtlinien für die gezielte Herstellung als auch Ansätze für
die Verhinderung der Entstehung von Nanotubes und der durch sie bedingten
Gelbildung.
Ein weiterer Aspekt der pharmazeutischen Technologie ist die Suche nach neuen
Arzneistoffträgersystemen. Es wäre theoretisch denkbar, die Nanotubes als Vehikel
für hydrophile Arzneistoffe zu nutzen. Aus den folgenden Gründen wurde dieser
Gedanke im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht weiterverfolgt:
Eines der Probleme stellt der verhältnismäßig enge und unphysiologische Tempera-
turbereich dar, innerhalb dessen die Nanotubes entstehen bzw. stabil sind und ober-
halb dessen sie irreversibel zerstört werden: etwa 2°C bis 15°C. Der Versuch, durch
Nutzung von DPPC unter vergleichbaren Bedingungen Nanotubes mit einem Exi-
stenzbereich bei entsprechend höheren Temperaturen herzustellen, brachte unter
den hier gewählten Bedingungen jedoch keinen Erfolg. Die Empfindlichkeit der Nano-
Diskussion
____________________________________________________________________ 109
tubes gegenüber mechanischer Beanspruchung, infolge derer sie "brechen" und so-
mit den eingeschlossenen Arzneistoff freigeben würden, stellt ein weiteres Hindernis
dar. Und schließlich lässt der hier vorgeschlagene Mechanismus der Nanotubebil-
dung über die Fusion von SUV`s bzw. kleinsten Lipidpartikeln nur sehr niedrige Ein-
schlusseffizienzen für hydrophile Arzneistoffe erwarten.
Aufbauend auf dieser Arbeit ergeben sich jedoch verschiedene Ansatzpunkte für
weiterführende Arbeiten. Ein wichtiger Aspekt wäre die Untersuchung von Möglich-
keiten für die Stabilisierung der Nanotubes einerseits gegenüber mechanischer Be-
anspruchung und andererseits gegenüber Temperaturerhöhung, um eine Applikation
in den menschlichen Organismus grundsätzlich zu ermöglichen. Interessant wäre in
diesem Zusammenhang auch die Frage nach der Übertragbarkeit der beschriebenen
Ergebnisse auf andere gesättigte Phosphatidylcholine, wie DLPC, DPPC (bei ande-
ren, als den in dieser Arbeit untersuchten Bedingungen) oder DSPC, wobei beson-
ders DPPC und DSPC wegen des möglichen Existenzbereiches bei Körpertempera-
tur interessant wären.
Möglicherweise mehr als für die eher anwendungsbezogenen Disziplinen dürften die
Nanotubes derzeit jedoch für die grundlagenorientierten Fächer von Interesse sein.
Die vorliegende Arbeit hat gezeigt, dass es trotz intensiver Forschung in der Klasse
der Phosphatidylcholine seit nunmehr drei Jahrzehnten - DMPC gehört neben DPPC
zu den meist untersuchten Lipiden weltweit (Koynova & Caffrey, 1998) - immer noch
große Lücken bei der Kenntnis der Eigenschaften der Lipide gibt. Wünschenswert
wären hier beispielsweise weiterführende Arbeiten zur Aufklärung der molekularen
Organisation der DMPC-Moleküle innerhalb der Nanotubes sowie die Entwicklung
eines Modells für die Bildung dieser tubulären Vesikel.
Zusammenfassung 110
__________________________________________________________________________________
5. Zusammenfassung
Der Ausgangspunkt der Arbeit beinhaltete die Aufklärung eines speziellen, in der Li-
teratur bisher nicht beschriebenen Instabilitätsphänomens: Die Gelbildung in Disper-
sionen des gesättigten Phospholipids 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcho-
lin (DMPC).
Das Gelbildungsphänomen tritt anhängig von der Phospholipidkonzentration, der La-
gerungstemperatur und der Lagerdauer auf: Nur bei 13°C kommt es bei 10%igen
(m/m) Dispersionen innerhalb von etwa 3 - 4 Wochen zu einer kompletten Gelierung.
Niedrigere Lagerungstemperaturen (2 - 8°C) sowie geringere Lipidkonzentrationen
verursachen lediglich stückig-inhomogene Niederschläge. Bei höheren Temperatu-
ren bleibt die Gelbildung aus.
Unter Nutzung unterschiedlicher Präparationsmethoden für die Transmissionselek-
tronenmikroskopie konnte als Ursache für die Instabilität eine neue Spezies von Na-
notubes, die dreidimensionale Netzwerke bildet, eindeutig aufgeklärt werden. Die
Nanotubes wurde umfassend morphologisch charakterisiert. Sie zeichnen sich durch
eine hohe Lagerstabilität aus. Infolge von Temperaturerhöhung kommt es jedoch zu
irreversiblen Strukturveränderungen, die mit einer vollständigen Zerstörung der
Nanotubes zu Gunsten großer multilamellarer und multivesikulärer Vesikel
(einhergehend mit einer makroskopischen Verflüssigung der Probe) abschließen.
Die Dispergierung des Lipids ist essentiell für die Nanotubebildung, wobei der
Herstellungsmethode eine Schlüsselrolle zukommt: Über die Höhe des Energieein-
trags bei der Dispergierung und die damit verbundene Teilchengröße der Ausgangs-
dispersion lässt sich die Nanotube- und damit Gelbildung gezielt fördern oder verhin-
dern. Dispersionen mit einem hohen Anteil an SUV`s und kleinsten Lipidpartikeln,
hergestellt durch Hochdruckhomogenisation oder Ultraschall, gelieren, während
durch Extrusion hergestellte Dispersionen ohne diesen "Feinanteil" nahezu frei von
Nanotubes bleiben und keine Gelierung zeigen. Undispergiertes Lipid, LUVs (large
unilamellar vesicles) und MLV`s (multilamellar vesicles) können als Grundlage für die
Nanotubeentstehung ausgeschlossen werden.
Auf der Basis der erarbeiteten Erkenntnisse über die Bedingungen, die zur Bildung
der Nanotubes führen sowie elektronenmikroskopischer Untersuchungen wurde ein
Mechanismus für ihre Bildung über die Fusion von SUV`s (small unilamellar vesicles)
und kleinsten Lipidpartikeln vorgeschlagen.
Zusammenfassung 111
__________________________________________________________________________________
Es konnte gezeigt werden, dass die Bildung der Nanotubes unabhängig von der Art
des verwendeten Konservierungsmittels der wässrigen Phase ist. Auch geringe "Ver-
unreinigungen" mit Myristinsäure oder hydriertem Soja-Phosphatidylcholin beeinflus-
sen die Nanotubebildung nicht. Der Zusatz kleinster Mengen Lysophosphatidylcholin
hingegen bewirkt in der Ausgangsdispersion eine teilweise Transformation von Lipo-
somen in Mischmizellen. Diese Systeme bilden bei 13°C neben Nanotubes verdrillte
Bänder, die wie die Nanotubes ausgedehnte Netzwerke bilden und eine Gelierung
verursachen. Der Zusatz größerer Mengen Fremdlipide verhindert hingegen die Na-
notubebildung, wie am Beispiel des Zusatzes des Homologen 1,2-Dipalmitoyl-sn-gly-
cero-3-phosphatidylcholin (DPPC) gezeigt werden konnte.
Im Verlauf der Arbeit wurden unterschiedliche DMPC-Chargen verwendet, die in
ihren physikochemischen Eigenschaften sowie bezüglich der Eigenschaften der
Dispersionen und im Ausmaß der Nanotube- bzw. Gelbildung deutliche Unterschiede
zeigten. Im Zuge von Reinheitsuntersuchungen konnten Unterschiede in der Vorbe-
handlung der Lipide und mittels hochauflösender Dünnschichtchromatographie eine
Verunreinigung mit Fremdlipiden verschiedener Klassen als Ursachen ausgeschlos-
sen werden. Es konnte hingegen mittels thermoanalytischer Untersuchungen und
Röntgenkleinwinkelstreuung eindeutig nachgewiesen werden, dass Verunreinigun-
gen mit zweiwertigen Kationen die Hauptursache für die chargenabhängigen Unter-
schiede darstellen.
Neben DMPC wurde außerdem DPPC auf seine Fähigkeit zur Nanotubebildung
untersucht. Unter den hier gewählten Bedingungen haben sich jedoch keine Hinwei-
se darauf ergeben, dass DPPC ebenfalls Nanotubes bildet.
Die hier vorgestellten DMPC-Nanotubes sind aus pharmazeutisch-technologischer
Sicht vor allem als Verursacher der beschriebenen Instabilität während der Lagerung
von Interesse. Dabei ist neben liposomalen Zubereitungen beispielsweise auch an
phospholipidstabilisierte kolloidale Emulsionen zu denken, in denen Liposomen häu-
fig als Nebenprodukt anfallen. Vorschläge für eine pharmazeutische Nutzung der
Nanotubes als Arzneistoffträgersystem scheinen wegen der Vielzahl noch offener
Fragen bezüglich der molekularen Struktur und den für einen Arzneistoffträger
ungünstigen Eigenschaften der Nanotubes derzeit verfrüht.
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112
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Anhang
i
A.1. Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
DC23PC 1,2-bis(10,12-tricosadinoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (= DC8,9PC)
DC8,9PC 1,2-bis(10,12-tricosadinoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (=DC23PC)
DMPC 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin
DNPC 1,2-bis(dinonanoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin
DPPC 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin
DSC Dynamische Differenzkalorimetrie
DSPC 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin
DSPG 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylglycerol
Ei-PC Phosphatidylcholin, aus Eigelb gewonnen
HPTLC Hochauflösende Dünnschichtchromatographie (high performance thin layer chromatographie)
LD Laserdiffraktometrie
LUV großes unilamellares Vesikel (large unilamellar vesicle)
MLV multilamellares Vesikel (multilamellar vesicle)
MPEG-DSPC
Methoxypolyethylenglycol-Distearoylphosphatidylcholin
MSD Multi Size Distribution
MVV multivesikuläres Vesikel (multivesicular vesicle)
Na-EDTA Natriumedetat; Dinatriumsalz der (Ethylendinitrilo)tetraessigsäure
OLV oligolamellares Vesikel (oligolamellar vesicle)
PC Phosphatidylcholin
PCS Photonenkorrelationsspektroskopie
PIDS Polarization Intensity Differential Scattering
Soja-PC Phosphatidylcholin, aus der Sojabohne gewonnen
SUV kleines unilamellares Vesikel (small unilamellar vesicle)
Tab. Tabelle
TEM Transmissionselektronenmikroskop(ie)
Tm Temperatur des Hauptübergangs, Kettenschmelztemperatur
Tp Vorübergangstemperatur
Ts Subübergangstemperatur
vgl. vergleiche
ii
A.2. Anmerkungen zu den verwendeten Teilchengrößenbestimmungs- methoden
In der vorliegenden Arbeit wurden zur Charakterisierung der Dispersionen die Teil-
chengrößen mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) und teilweise mittels
PIDS-gekoppelter Laserdiffraktometrie (LD/PIDS) bestimmt. Zusätzlich wurden zur
Überprüfung der Aussagekraft der durch die Laserverfahren ermittelten Teilchengrö-
ßen und zur Bestimmung der Morphologie der Nanotubes transmissionselektronen-
mikroskopische Untersuchungen durchgeführt.
Als Standardmethode zur Charakterisierung der Teilchengrößen wurden die Photo-
nenkorrelationsspektroskopie (PCS) eingesetzt. Für die mittels Hochdruckhomogeni-
sation hergestellte Dispersionen zeigte sich, dass der mit Hilfe der PCS ermittelte z-
Average als Maß für die mittlere Teilchengröße häufig nur unzureichend die tatsächli-
chen Verhältnisse innerhalb der Probe widerspiegelt. Die Bestimmung des z-Average
erfolgt unter der Annahme, dass es sich um eine monomodale Verteilung handelt.
Gefrierbruch-TEM Aufnahmen belegen allerdings, dass diese Dispersionen neben
vielen zum Teil extrem kleinen Teilchen (< 50 nm) auch immer wenige z.T. sehr
große Partikel bis in den µm-Bereich enthalten (siehe Kapitel 3.1.1. und 3.2.3.1.).
Umfassendere Informationen erhält man bei Auswertung der PCS-Daten unter Ver-
wendung der MSD-Auswertung (MSD: Multi Size Distribution), die sehr gut die große
Bandbreite der aus Gefrierbruch-TEM ermittelten Teilchengrößen erfasst: Es wurden
sowohl die große Anzahl kleiner als auch die wenigen sehr großen Partikel detektiert.
Bezüglich der LD/PIDS-Messungen muss gesagt werden, dass hier trotz elektronen-
mikroskopisch detektierter und teilweise sogar makroskopisch sichtbarer Partikel
diese in den Messungen meist nicht erfasst wurden. Die Ursache liegt höchstwahr-
scheinlich in der Wahl der Messkonzentration begründet: So wurden für die
Messungen die erforderlichen Messkonzentration im PIDS-Bereich zwar erreicht,
jedoch waren die Probenmengen für eine weitere Messung unter Beachtung der
erforderlichen Messkonzentration zur Detektion großer Partikel meist zu gering, so
dass darauf verzichtet werden musste. Die ermittelten Teilchengrößenverteilungen
reichten bei frisch hochdruckhomogenisierten Dispersionen von 40 bis 200 nm. Da
Partikel < 40 nm mittels LD/PIDS nicht detektiert werden können, lagen die mittleren
Teilchengrößen meist über den mittels PCS ermittelten z-Average Werten. Für
Proben ohne "Feinanteil" und mit durchschnittlichen Teilchengrößen um 100 nm (z.B.
verbliebener flüssiger Überstand über einem Bodensatz von Nanotubes) ergab sich
iii
hingegen eine gute Übereinstimmung von dem z-Average aus PCS-Messungen
und der mittleren Teilchengröße aus LD/PIDS-Messungen (siehe Kapitel 3.2.3.2.3.).
Anhand der transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen und auch der
PCS-Messungen konnte gezeigt werden, dass die Dispergierung mittels Extrusion zu
deutlich homogeneren Teilchengrößenkollektiven führt (siehe Tab. 4, S.44; Tab. 5
sowie Abb. 27, S.47). Bei diesen Dispersionen lässt sich die Teilchengrößenvertei-
lung sehr gut mit dem z-Average unter Angabe des Polydispersitätsindex beschrei-
ben. Die Elektronenmikroskopie lieferte zusätzlich die Information, dass die Liposo-
men häufig nicht kugelförmig, sondern länglich verformt sind (siehe Kapitel 3.2.3.1.).
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name: Ulrike Lauf
Geburtsdatum: 09.02.1973
Geburtsort: Magdeburg
Familienstand: ledig
Kinder: keine
Nationalität: Deutsch
Schulausbildung
September 1979 - August 1989 Polytechnische Oberschule in Magdeburg
September 1989 - Juni 1991 Erweiterte Oberschule in Magdeburg
Juni 1991 Abitur
Berufsausbildung
Oktober 1992 - November 1996 Pharmazie-Studium an der Technischen
Universität Carolo Wilhelmina in Braunschweig
September 1994
November 1996
1. Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung
2. Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung
Dezember 1996 - Mai 1997 1. Teil des praktischen Jahres an der Friedrich-
Schiller-Universität Jena
Juni 1997 - November 1997 2. Teil des praktischen Jahres in der „Apotheke
im MSZ“ in Magdeburg
Dezember 1997
Januar 1998
3. Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung
Approbation als Apotheker
seit Februar 1998 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Lehrstuhl für
Pharmazeutische Technologie der Friedrich-
Schiller-Universität Jena
Ulrike Lauf
Jena, den 24.06.2003
Selbstständigkeitserklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und nur unter
Verwendung der angegebenen Hilfsmittel und Literatur angefertigt habe.
Ulrike Lauf
Jena, den 24.06.2003
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