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Ausgewählte biophysikalische Methoden zur Analyse von Pflanzen (II):
UV/VIS-Spektroskopie - von der Pigmentanalyse bis zur
Quantifizierung von mRNA
Chlorophyll
S0
S2
S1T1
h·ν
h·ν
intersystem crossing
absorption
absorptionfluorescence
intersystem crossingintersystem crossing
phosphoresscence
intersystem crossing EET
Voraussetzung der Messung von UV/VIS-Spektren: Lichtabsorption, Beispiel Chlorophyll
Pigmentbestimmung in Extrakten:moderne UV/VIS-spektroskopische Methode
Prinzip: UV/VIS-Spektren wurden bei Kalibration (publizierte Datenbank!) in mathematische Gleichungen überführt. Eine Summe dieser Gleichungen wird incl. automatischer Korrekturfaktoren für Basislininedrift, Wellenlängenungenauigkeit und Trübung an Extraktspektrum angepasst (“gefittet”).
Pflanzen werden vor der Messung gefriegetrocknet und dann mit 100% Aceton extrahiert.
Metallgehalt:Atomabsorptions-Spektroskopie (AAS)
Prinzip: Metallionen haben spezifisches Linien-Absorptionsspektrum im UV/VIS-Bereich.
Pflanzen werden vor der Messung mit Säure verdaut
Messung von in vivo / in situ-UV/VIS-Spektren (nicht bildgebend)
Warum in vivo / in situ?--> Direkte Korrelation mit physiologischen Parametern möglich--> keine Extraktionsartefakte--> Messung an einzelnen Zellen möglich--> Hohe Zeitauflösung bei Messung von Kinetiken
Nachteile gegenüber der Messung von Extrakten:--> viele überlappende Banden desselben Pigments durch Proteinbindung--> Banden sehr breit--> Extinktionskoeffizienten in vivo meist unbekannt --> meist keine absolute Quantifizierung
Beispiel 1 zur Anwendung von zeitaufgelösten in vivo-Fluoreszenzspektren:
Regulation der Photosynthese für die Stickstoff-Fixierung in Trichodesmium
Methoden der Analyse von in vivo-Spektren: Dekonvolution
Quelle: Lehrbuch (Lawlor, 1990, Thieme Verlag)
Beispiel 2 zur Anwendung von spektral aufgelösten in vivo-Fluoreszenzkinetiken: Änderungen der Fluoreszenzkinetik-
Parameter unter Schwermetallstress
Küpper H, Aravind P, Leitenmaier B, Trtilek M, Šetlík I (2007) New Phytol., 10.1111/j.1469-8137.2007.02139.x.
Beispiel zur Anwendung von in vivo-Absorptionsspektren:Bildung von Cu-Chl bei Kupferstress (und Pheo bei Ansäuerung)
Küpper H, Küpper F, Spiller M (1998) Photosynthesis Research 58, 125-33
Elodea canadensis
Ectocarpus siliculosus
Antithamnion plumula
Küpper H, Šetlík I, Spiller M, Küpper FC, Prášil O (2002) Journal of Phycology 38(3), 429-441
Bildgebende in vivo-VIS-Spektroskopie: moderne Methoden der Fluoreszenzmikroskopie
Methoden--> Trennung von Chromophoren über “linear unmixing”--> FRET--> Messung physiologischer Vorgänge über spez. Fluoreszenzfarbstoffe--> FRAP--> FCS--> QISH--> GFP etc.
Wichtige Voraussetzungen und Fakten--> Apertur vs. Lichtsammlung--> richtige Messung--> Überlapp und Trennung von Signalen
medium inlet medium
outletglass window (0.17 mm thick); sample is placed between this window and the layer of cellophan
o-rings (silicon rubber) layer of cellophan
Entscheidend bei der Nutzung eines Mikroskopsfür physiologische Messungen an lebenden Zellen:
Präparat unter physiologischen Bedingungen halten!
Küpper H, Šetlík I, Trtilek M, Nedbal L (2000) Photosynthetica 38(4), 553-570
Entscheidend bei der Nutzung eines Mikroskopsfür physiologische Messungen an lebenden Zellen:
NICHT ZUVIEL LICHT! --> Lichtintensität bestimmen!
Lens Light fielddiameter
Measuringirradiance
Actinicirradiance
Saturatingirradiance
[mm] [µmol m-2 s-1] [µmol m-2 s-1] [µmol m-2 s-1] 6.3×/0.20 2.90 0.006 686 524 16×/0.40 1.06 0.026 2835 2167 25×/0.63 0.67 0.075 8295 6332 40×/0.95 0.38 0.200 22058 16904 63×/0.95 0.23 0.270 30311 23218100×/1.30 0.16 0.270 29441 22546
Küpper H, Šetlík I, Trtilek M, Nedbal L (2000) Photosynthetica 38(4), 553-570
numerische Apertur NA = I * sinus q
I = Brechungsindex des Mediumsq = halber Öffnungswinkel des Objektivs
Apertur
Wichtiger Faktor bei der Nutzung eines Mikroskops alsSpektrometer: Apertur bestimmt Effizienz der Lichtsammlung
Wichtiger Faktor bei der Nutzung eines Mikroskops alsSpektrometer:
Korrekte Einstellung von Hintergrund und Verstärkung
Wichtiger Faktor bei der Nutzung eines Mikroskops alsSpektrometer:
korrekte Eichung / Bestimmung der LinearitätP
ixel
gre
y va
lue
Irradiance [%]0.1 1 10
1
10
100Model: y = ax + b
Levenberg-Marquardt, statistical weighting
χ2 = 0.10176
a = 10.261 ± 0.157
b = -0.039 ± 0.069
Küpper H, Šetlík I, Trtilek M, Nedbal L (2000) Photosynthetica 38(4), 553-570
Wichtiger Faktor bei der Nutzung eines Mikroskops alsSpektrometer: Überlapp von Absorptions-/Emissions-Banden
Preliminary tests with GFP in young leaves of Arabidopsis thaliana
Fluorescence observed through GFP filterset
NON-transformed plant...
All the signal was AUTOFLUORESCENCE
Epidermis
40 μm
Mesophyll
Nutzung überlappender Abs/Em-Banden für FluorescenceResonanceEnergyTransfer (FRET)
Voraussetzungen für FluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET)
Messung physiologischer Vorgänge über Fluoreszenzfarbstoffe (I): Kalibration
Leitenmaier B, Küpper H, (2008) unpublished
Transmission (Hellfeld, Phasenkontrast, ...):
Information über Struktur
FDA-Fluoreszenz:
Vitalitätstest
Rhod5N-Fluoreszenz:
Cadmium-Aufnahme
Messung physiologischer Vorgänge über Fluoreszenzfarbstoffe (II): Anwendungsbeispiele, bildgebend
Leitenmaier B, Küpper H, (2008) unpublished
Messung physiologischer Vorgänge über Fluoreszenzfarbstoffe (III): Anwendungsbeispiel quantitativer Daten
Rhod5N-Fluoreszenzkinetik: Cadmium-Aufnahme
Leitenmaier B, Küpper H, (2008) unpublished
Bildgebendes „holeburning“: FluorescenceRecoveryAfterPhotobleaching (FRAP)
FluorescenceCorrelation
Spectroscopy(FCS)
FluorescenceCorrelation
Spectroscopy (FCS) II
--> info about molecular concentration, brightness, diffusion,
and chemical kinetics
Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) III
Quantitative mRNA in situ hybridisation (QISH):overview of the method
cut out
max. 2x5 mm
vacuum infiltrate with alkaline fixation solution
extract pigments and dehydrate
extract hydrophobic compounds
digest proteins
hybridise with fluorescent
oligonucleotides
rehydrate
postfixate
quantify record images in CLSM extract and quench background
Küpper H, Seib LO, Sivaguru M, Hoekenga OA, Kochian LV (2007) The Plant Journal 50(1), 159-187
ZNT1 in young leaves of Thlaspi caerulescens Prayon:comparison of different QISH hybridisation probes
overlays of green autofluorescence and red fluorescence of ZNT1-probes
full-length antisense RNA probe fragmented (200 b) antisense RNA probe 34 b synthetic oligonucleotide
Küpper H, Seib LO, Sivaguru M, Hoekenga OA, Kochian LV (2007) The Plant Journal 50(1), 159-187
QISH vs. nicht-normiermte detektion: Effekte der Gewebe-Optik
Küpper H, Seib LO, Sivaguru M, Hoekenga OA, Kochian LV (2007) The Plant Journal 50(1), 159-187
Regulation der ZNT1 Transkription analysiert über QISH
Küpper H, Seib LO, Sivaguru M, Hoekenga OA, Kochian LV (2007) The Plant Journal 50(1), 159-187
spon
gy m
esop
hyll
phloe
mbu
ndle
shea
thpa
lisad
e mes
ophy
ll
epide
rmal
metal s
torag
e cell
s
epide
rmal
subs
idiary
cells
epide
rmal
guard
cells
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
c(ZN
T1 m
RN
A) /
c(1
8s rR
NA
) 10 µM Zn2+ Thlaspi caerulescens 10 µM Zn2+ Thlaspi arvense 1 µM Zn2+ Thlaspi arvense
transform Agrobacterium with the constructs
transfrom plants by agrobacteriuminfection (floral dip with or without
vacuum infiltration)
select healthy (resistant) seedlings
prepare tissue pieces or whole mounts
germinate seeds of transformed plants on selective medium(e.g. agar containing Kanamycin)
select for YFP expression
quantify record images in CLSM
promoter
EYFP
Construct vectors for plant transformation
Qualitative Beobachtung der Transkription&Translation in vivoüber fluoreszierende Proteine
35S promoter in young leaves of Arabidopsis thaliana:epidermis
Overlays of green autofluorescence, red (chlorophyll) autofluorescence and yellow YFP fluorescence
Trichome base, epidermal cells and stoma Trichome
35S promoter in young leaves of Arabidopsis thaliana:mesophyll
Overlays of green autofluorescence, red (chlorophyll) autofluorescence and yellow YFP fluorescence
Clone with high YFP expression Clone with medium YFP expression
Comparison of our in situ hybridisation method
with promoter-GFP/YFP/DsRed/... constructs
In situ hybridisation
- Easy cellular quantification because whole cells are labelled
- No macroscopic (whole plant) quantification possible because of diffusion limits
- Low background fluorescence because chlorophyll, carotenoids, flavonoids and many further fluorescent
compounds are extracted
- No direct comparison of gene expression with physiology because samples are fixed (dead)
- Very fast: Ordering the fluorescently labelled oligonucleotides takes 1-2 weeks, the hybridisation
procedure itself takes 3 days
- All plants can be analysed ( Thlaspi work)
Fluorescent proteins
- Quantification on a cellular level difficult because only the narrow ring of cytoplasm is labelled
- Macroscopic (whole plant) observation and quantification easily possible with fluorescence measuring camera (so far only tested with GFP)
- High background fluorescence because all autofluorescent compounds are present in the samples
- Direct comparison of gene expression with physiological parameters (photosynthesis, electrophysiology) possible because samples are alive
- Very time-consuming because of the cloning, transformation and plant growth/selection steps;
- The plant has to be transformed ( Arabidopsis)
- The gene sequence has to be known - The promoter has to be cloned
Küpper H, Seib LO, Sivaguru M, Hoekenga OA, Kochian LV (2007) The Plant Journal 50(1), 159-187
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