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Aus der Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. med. K. Diedrich
in Kooperation mit dem
Institut für Pathologie
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. med. A. C. Feller
Die prognostische Aussagefähigkeit von Rad51, Ki-67, uPA und
PAI-1 für das Mammakarzinom
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Universität zu Lübeck
- Aus der Medizinischen Fakultät -
vorgelegt von
Stefanie Schierholz
aus Lüneburg
Lübeck 2010
1. Berichterstatter/in: Priv.- Doz. Dr. med. Dorothea Fischer
2. Berichterstatter/in: Priv.-Doz. Dr. med. Jens Habermann PhD
Tag der mündlichen Prüfung: 27.07.2011
zum Druck genehmigt. Lübeck, den 27.07.2011
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen ................................................... IV
Abbildungen ............................................................................................................................... IV
Tabellen....................................................................................................................................... V
Abkürzungsverzeichnis .................................................................................. VII
1. Einleitung ...........................................................................1
1.1 Epidemiologie .............................................................................................. 1
1.2 Diagnose, Prognose und Therapie des Mammakarzinoms ..................... 1
1.2.1 Prognostische Parameter .................................................................................................. 2
1.2.2 Prädiktive Parameter.......................................................................................................... 3
1.2.3 Risikoadaptierte Therapie .................................................................................................. 4
1.2.4 Therapiegrundsätze .......................................................................................................... 5
1.3 Serinproteasen ............................................................................................ 8
1.4 Rad51 ............................................................................................................ 9
1.5 Ki-67 ............................................................................................................ 11
1.6 Zielsetzung ................................................................................................. 13
2. Material und Methodik ....................................................14
2.1 Gutachten der Ethikkommission ............................................................. 14
2.2 Verbrauchsmaterialien mit Bezugsquelle ............................................... 14
2.3 Charakterisierung der verwendeten Antikörper ..................................... 16
2.4 Herstellung der Lösungen und Puffer ..................................................... 17
2.5 Untersuchungsgut ..................................................................................... 19
2.5.1 Material ............................................................................................................................ 19
2.5.1 Aufbereitung der Gewebeschnitte .................................................................................... 20
2.5.2 Vorbehandlung der Gewebeschnitte ................................................................................ 20
2.5.3 Färbeprotokolle ................................................................................................................ 20
2.5.4 Kontrollen ......................................................................................................................... 26
2.5.5 Auswertung der gefärbten Präparate ............................................................................... 26
2.6 Statistische Analyse.................................................................................. 30
3. Ergebnisse .......................................................................31
3.1 Patientinnenkollektiv ................................................................................. 31
3.2 Klinische und histopathologische Parameter ......................................... 32
Inhaltsverzeichnis
II
3.3 Durchgeführte Therapien .......................................................................... 36
3.3.1 Operative Therapie .......................................................................................................... 36
3.3.2 Radiatio im Zusammenhang mit operativer Therapie ...................................................... 36
3.3.3 Endokrine Therapie .......................................................................................................... 36
3.3.4 Chemotherapie ................................................................................................................. 37
3.4 Immunhistochemische Färbungen der Parameter ................................. 38
3.4.1 Rad51 ............................................................................................................................... 38
3.4.2 Ki-67 ................................................................................................................................. 41
3.4.3 Uroplasminogenaktivator (uPA) ....................................................................................... 43
3.4.4 Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1) ....................................................................... 43
3.5 Rezidiv- und metastasenfreies Überleben .............................................. 44
3.5.1 Rezidivfreies Überleben im Gesamtkollektiv ................................................................... 44
3.5.2 Metastasenfreies Überleben im Gesamtkollektiv ............................................................. 49
3.5.3 Subgruppenanalyse der nodalnegativen Patientinnen .................................................... 52
3.5.4 Chi-Quadrattest nach Pearson für die Parameter Rad51, Ki-67, uPA und PAI-1 ........... 54
3.6 Die Therapien der einzelnen Untergruppen für Rad51 und Ki-67 ......... 59
4. Diskussion .......................................................................60
4.1 Patientinnenkollektiv ................................................................................. 60
4.1.1 Das Alter der Patientinnen ............................................................................................... 60
4.1.2 Histologischer Typ ............................................................................................................ 60
4.1.3 Primärtumorgröße ............................................................................................................ 60
4.1.4 Nodalstatus ...................................................................................................................... 61
4.1.5 Histologisches Grading .................................................................................................... 62
4.1.6 Hormonrezeptorstatus...................................................................................................... 62
4.1.7 Tumorprogredienz ............................................................................................................ 63
4.2 Färbeverfahren .......................................................................................... 64
4.3 Analyse der Studienergebnisse ............................................................... 66
4.3.1 DNA-Reparatur ................................................................................................................ 68
4.3.2 Das biologische Modell von Rad51 .................................................................................. 69
4.3.3 Rad51 – seine übergeordnete Regulation ....................................................................... 70
4.3.4 Rad51 als Prognoseparameter ........................................................................................ 71
4.3.5 Rad51 – Ergebnisse der Arbeitsgruppe im Vergleich ...................................................... 73
4.3.6 Rad51 und Ki-67 - prognostische Aussagekraft .............................................................. 74
4.3.7 PAI-1, uPA und Rad51 - prognostische Aussagekraft ..................................................... 75
4.3.8 PAI-1 und uPA im Zusammenhang mit dem nodalnegativen Kollektiv ........................... 76
4.4 Ausblick ..................................................................................................... 76
5. Zusammenfassung .........................................................78
Inhaltsverzeichnis
III
6. Literaturverzeichnis ........................................................80
7. Anhang .............................................................................97
7.1 TNM Klassifikation .................................................................................... 97
8. Danksagung ...................................................................100
9. Lebenslauf .....................................................................101
Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen
IV
Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen
Abbildungen Abb. 1: Altersverteilung der Mammakarzinomtodesfälle 2004 in Deutschland. ...... 1
Abb. 2: Schematisch vereinfachte Darstellung des Plasminogenaktivators (uPA),
seines Rezeptors (uPAR) sowie eines seiner Inhibitoren PAI-1. ...................... 9
Abb. 3: Vereinfacht dargestellt ist die homologe Rekombination als mögliche
Zellantwort auf einen DNA-Doppelstrangbruch mit ihrem wesentlichen
Bestandteil Rad51. ......................................................................................... 10
Abb. 4: Schematische Darstellung der Färbeschritte zu Protokoll I ...................... 24
Abb. 5: Referenzabbildungen für die Färbungen mit Rad51 und Ki-67 ................ 27
Abb. 6: Altersverteilung des Studienkollektivs bei Diagnosestellung .................... 31
Abb. 7: Nachbeobachtungszeitraum des Gesamtkollektivs .................................. 32
Abb. 8: Hormonrezeptorstatus im Zusammenhang mit der endokrinen Therapie 37
Abb. 9: Chemotherapieformen des Patientinnenkollektivs ................................... 37
Abb. 10: Repräsentativer Ausschnitt eines Tumorbereiches mit niedriger Rad51
Expression ...................................................................................................... 39
Abb. 11: Repräsentativer Ausschnitt eines Tumorbereiches mit höherer Rad51
Expression ...................................................................................................... 39
Abb. 12: Rad51 Expression im Studienkollektiv.....................................................38
Abb. 13: Graphische Darstellung zum Schwellenwert von Rad51........................ 40
Abb. 14: Repräsentativer Ausschnitt eines Tumorbereiches mit niedriger Ki-67
Expression ...................................................................................................... 41
Abb. 15: Repräsentativer Ausschnitt eines Tumorbereiches mit höherer Ki-67
Expression ...................................................................................................... 42
Abb. 16: Ki-67 Expression im Studienkollektiv ..................................................... 42
Abb. 17: Graphische Darstellung zum Schwellenwert von Ki-67 .......................... 43
Abb. 18: Kaplan-Meier-Kurven des rezidivfreien Überlebens der signifikanten
Parameter ....................................................................................................... 47
Abb. 19: Kaplan-Meier-Kurven des metastasenfreien Überlebens der signifikanten
Parameter ....................................................................................................... 51
Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen
V
Tabellen Tab. 1: Aussagefähigkeit von pathologischen Prognoseparametern beim
Mammakarzinom. ............................................................................................. 3
Tab. 2: Aussagefähigkeit von prädiktiven Parametern beim Mammakarzinom. ..... 4
Tab. 3: Risikogruppen nach St. Gallen 2007. ......................................................... 5
Tab. 4: Standardchemotherapieschemata CMF und EC. ....................................... 7
Tab. 5: Entparaffinierungsschema nach Färbeprotokoll I. .................................... 20
Tab. 6: Entparaffinierungsschema nach Färbeprotokoll II. ................................... 20
Tab. 7: Semiquantitative Kategorieeinteilung und repräsentative Abbildungen von
uPA und PAI-1. ............................................................................................... 28
Tab. 8: Immunhistochemische Klassifikation der Her-2 Expression ..................... 29
Tab. 9: Immunreaktiver Score nach Remmele und Stegner ................................. 34
Tab. 10: Übersicht über die histopathologischen Parameter des Studienkollektives
....................................................................................................................... 35
Tab. 11: Statistische Analyse (univariat) der betrachteten Parameter bezogen auf
das rezidivfreie Überleben .............................................................................. 45
Tab. 12: Statistische Analyse (multivariat) der betrachteten Parameter bezogen
auf das rezidivfreie Überleben ........................................................................ 48
Tab. 13: Statistische Analyse (univariat) der betrachteten Parameter bezogen auf
das metastasenfreie Überleben ...................................................................... 49
Tab. 14: Statistische Analyse (multivariat) der betrachteten Parameter bezogen
auf das metastasenfreie Überleben ................................................................ 51
Tab. 15: Statistische Analyse (univariat) der betrachteten Parameter bezogen auf
das rezidivfreie Überleben der nodalnegativen Patientinnen.......................... 52
Tab. 16: Statistische Analyse (univariat) bezogen auf das metastasenfreie
Überleben der nodalnegativen Patientinnen................................................... 53
Tab. 17: Statistische Analyse (multivariat) bezogen auf das rezidiv- und
metastasenfreie Überleben der nodalnegativen Patientinnen. ....................... 54
Tab. 18: Chi-Quadrattest nach Pearson: Rad51. ................................................. 55
Tab. 19: Chi-Quadrattest nach Pearson: Ki-67..................................................... 57
Tab. 20: Kreuztabelle von uPA mit PAI-1. ............................................................ 58
Tab. 21: Prozentualer Anteil der verabreichten Therapieformen in den Rad51-
Subklassen ..................................................................................................... 59
Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen
VI
Tab. 22: Prozentualer Anteil der verabreichten Therapieformen in den Ki-67-
Subklassen ..................................................................................................... 59
Tab. 23: Literaturübersicht: Anteil nodalnegativer Patientinnen ........................... 61
Tab. 24: Histologisches Grading in verschiedenen Mammakarzinomkollektiven . 62
Tab. 25: Prozentualer Anteil hormonrezeptorpositiver Tumore ............................ 62
Tab. 26: Anteil der Patientinnen mit Rezidiv oder Fernmetastasierung im
medianen Nachbeobachtungszeitraum. ......................................................... 63
Tab. 27: Qualitätskriterien für Prognoseparameter. .............................................. 66
Tab. 28: Überblick der prognostischen Faktoren des Mammakarzinoms mit
entsprechendem Evidenzlevel ........................................................................ 67
Tab. 29: Beispielhaft ausgewählte Studien verschiedener Autoren zur
prognostischen Aussagefähigkeit des Proliferationsmarkers Ki-67 ................ 75
Tab. 30: pTNM-Klassifikation des Mammakarzinoms zum Diagnosezeitpunkt .... 97
Tab. 31: aktuelle pTNM-Klassifikation des Mammakarzinoms ............................. 99
Abkürzungsverzeichnis
VII
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
AGO Arbeitsgemeinschaft für Gynäkologische Onkologie
ASCO American Society of Clinical Oncology
BET brusterhaltende Therapie
BIR „break induced replication”
BSA „buffered serum albumine“
CMF Polychemotherapie mit Cyclophsphamid, Methotrexat, Fluorouracil
DAB Diaminobenzidin
DNA Desoxyribonukleinsäure („desoxyribonucleic acid“)
EBCTCG Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group
EC Polychemotherapie mit Epirubicin und Cyclophosphamid
ELISA „Enzyme-linked-Immuno-Sorbend-Assay“
ER Östrogenrezeptor; Östrogenrezeptorstatus
FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
G Grading
GnRH „Gonadotropin releasing hormone”
HNPCC Hereditäres nicht polypöses Kolonkarzinom
Hrsg. Herausgeber
Ig Immunglobulin
IRS Immunreaktiver Score nach Remmele und Stegner
KI Konfidenzintervall
kD Kilo-Dalton
M Fernmetastasen
min. Minuten
MMR Mismatch Reparatursystem
n Anzahl
N, pN Nodalstatus; pathologisch beurteilter Nodalstatus
ns nicht signifikant
p Irrtumswahrscheinlichkeit (lat. probabilitas)
PAI-1 Plasminogen-Aktivator-Inhibitor1
PBS „phosphate buffered saline“
Abkürzungsverzeichnis
VIII
PCI „positive stained cell index“
pos. positiv
PR Progesteronrezeptor; Progesteronrezeptorstatus
RIA Radio-Immunassay
RPA Replication Protein A
RR relatives Risiko
rRNA ribosomale Ribonukleinsäure
s signifikant
s. siehe
SDSA „synthesis-dependent-strand-annealing”
SSA „single strand annealing“
Std. Stunde
T, pT Tumorgröße, pathologisch beurteilte Tumorgröße
Tab. Tabelle
uPA Uroplasminogenaktivator
uPAR Uroplasminogenaktivator-Rezeptor
z. B. zum Beispiel
Die verwendeten Maßeinheiten entsprechen dem internationalen Standard, den
SI-Einheiten und sind daher hier nicht aufgeführt.
Einleitung
1
1. Einleitung
1.1 Epidemiologie Diese Arbeit bezieht sich auf die häufigste Krebserkrankung der Frau in der
westlichen Welt: das Mammakarzinom. In Deutschland erkrankt im Durchschnitt
ungefähr jede 9.-10. Frau im Laufe ihres Lebens an dieser Tumorform [Sauer,
2005]. Die geschätzte Inzidenz liegt bundesweit bei 47.500 Neuerkrankungen pro
Jahr [Giersiepen et al., 2005]. Im Jahr 2006 handelte es sich um die 5. häufigste
Todesursache der weiblichen Bevölkerung. Betrachtet man nur die malignen
Neoplasien mit Todesfolge, war es im Jahr 2006 die häufigste Todesursache:
17.286 Todesfälle sind auf die maligne Entartung der Brustdrüse zurückzuführen
[stat. Bundesamt Wiesbaden, 2007]. Die Altersverteilung der
Mammakarzinomtodesfälle ist in Abb. 1 dargestellt. Bei jüngeren Frauen von 35 –
bis 54 Jahren handelt es sich um die häufigste Todesursache [Remmele, 1997].
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
>5 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Alter in Jahren
Todesfälle
Abb. 1: Altersverteilung der Mammakarzinomtodesfälle 2004 in Deutschland. In diesem Jahr sind 17.592 Frauen am Mammakarzinom verstorben [stat. Bundesamt Wiesbaden, 2005].
1.2 Diagnose, Prognose und Therapie des Mammakarzinoms Patientinnen mit Mammakarzinom haben eine schlechtere Überlebensrate im
Vergleich zur weiblichen Normalbevölkerung: Daten des Tumorregisters München
zeigen, dass das relative Überleben der Brustkrebspatientinnen unterhalb der
Überlebenserwartung des entsprechenden Normalkollektivs liegt [Sauer 2005]. In
den USA findet sich seit 1981 ein stabiles Niveau bzw. ein Rückgang der
Mortalität bei Patientinnen mit Mammakarzinom, besonders bei jenen, die zum
Diagnosezeitpunkt das 30. Lebensjahr vollendet hatten und von verbesserten
Screeningprogrammen und Therapiestrategien profitierten [Bleyer et al., 2006]. In
Einleitung
2
Deutschland gibt es kein einheitlich bundesweites Krebsregister, die Inzidenzen
sind daher Hochrechnungen. Es wird davon ausgegangen, dass insbesondere die
Früherkennung als auch effektivere und standardisierte Therapien eine
wesentliche Rolle bei der Prognoseverbesserung spielen. Ein weiterer Vorteil
könnte sich durch eine individualisierte Therapie ergeben: Das Ziel ist, bei guter
Verträglichkeit und geringen Nebenwirkungen, den Progress der Erkrankung zu
verhindern, im Idealfall eine Heilung zu erreichen. Grundlage für eine
individualisierte Therapie ist die genaue Kenntnis der jeweiligen Tumorbiologie
und des Erkrankungsstadiums. Neue prognostische und prädiktive Parameter sind
dafür notwendig.
Derzeit besteht der pathologische Standard des Mammakarzinoms aus folgenden
Komponenten: histologische Tumorentität, Primärtumorgröße, Nodalstatus,
Metastasierungsstatus, histologisches Grading, Östrogen-, Progesteron-, und
HER-2-Rezeptorstatus. Bedeutend für die Therapiefestlegung in der adjuvanten
Situation sind weiterhin der Menopausenstatus, das Alter der Patientin,
Begleiterkrankungen sowie der Wunsch der Patientin [Opitz, 2002; Sauer, 2005].
Bei der Diagnosestellung werden zwei Parametergruppen unterteilt: die
prognostischen und die prädiktiven Parameter. Ein prognostischer Parameter
korreliert in Abwesenheit einer weiteren Therapie mit dem Gesamtüberleben und
dem krankheitsfreien Überleben [AGO, 2010]. Hiervon abzugrenzen sind die
prädiktiven Parameter, die eine Aussage über das Ansprechen einer Therapie
treffen: also direkt für oder wider eine Therapieform sprechen [AGO, 2010].
1.2.1 Prognostische Parameter Die wichtigsten prognostischen Parameter des Mammakarzinoms sind der TNM-
Status (Primärtumorgröße, Nodalstatus, Metastasierungsstatus), die
Tumormorphologie (Grading, histologischer Typ, peritumorale Gefäßinvasion) und
der Steroidhormonrezeptorstatus (Progesteron- und Östrogenrezeptorstatus) zum
Diagnosezeitpunkt, das Alter der Patientin sowie der mittels ELISA bestimmte
uPA/PAI-1-Status [AGO, 2010].
Einleitung
3
Einen Überblick über die wesentlichen Aussagen der einzelnen Parameter gibt
Tabelle 1. Die TNM-Klassifikation ist im Anhang, Tab. 30 (zum Diagnosezeitpunkt
dieses Kollektivs) und Tab. 31 (aktuell) zu finden.
Prognostischer Parameter Korrelation zur Gesamtüberlebenszeit und zum rezidivfreien Überleben
TNM-Status: • Primärtumorgröße • Je größer der Primärtumor ist, umso kürzer ist das
Überleben. Eine Studie von Engel et al. zeigt folgende relative prozentuale Anteile für das Gesamtüberleben nach 15 Jahren: pT1: 77,6%; pT2: 52,3%; pT3: 31,4%; pT4 24,1% [Engel et al., 2003]. Andere Autoren berichten von ähnlichen Ergebnissen [Michaelson et al., 2002].
• Nodalstatus • Stärkster Prognosefaktor in Bezug auf das Überleben in der adjuvanten Situation: Je ausgeprägter der Lymphknotenbefall ist, desto schlechter ist die individuelle Prognose [Sauer, 2005; Engel et al., 2003].
• Metastasierungsstatus • Ein fortgeschrittenes Tumorleiden hat weiterhin eine schlechtere Prognose und gilt prinzipiell als nicht heilbar.
Morphologie • Grading • Je undifferenzierter der Tumor ist, umso schlechter ist die
Prognose (Rezidiv-, Fernmetastasierungsrisiko) [AGO, 2010].
• Histologischer Typ • Das duktale Karzinom hat eine schlechtere Prognose als Karzinome histologischer Sonderformen (muzinös, tubulär, papillär) [Sauer, 2005]. Das lobulär invasive Karzinom vom klassischen Typ ist gegenüber dem invasiv duktalen Karzinom prognostisch günstiger [Toikkanen et al., 1997; Silverstein et al., 1994].
• Hämangiosis • Je invasiver sich der Tumor im histologischen Umfeld zeigt, desto schlechter ist die Prognose und umso höher ist das Risiko eines lokalen Rezidivs [AGO, 2010].
Steroidhormonrezeptorstatus • Nodalpositive Patientinnen ohne adjuvante Hormontherapie zeigen bei positivem Östrogenrezeptorstatus ein um 20% besseres Überleben als solche Patientinnen mit negativem Hormonrezeptorstatus [Esteva und Hortobagyi, 2004]. Ein signifikant besseres Überleben von rezeptorpositiven im Vergleich zu rezeptornegativen Patientinnen wurde nachgewiesen und ist bereits länger bekannt [Colleoni et al., 2004; Crowe et al., 1991].
Tab. 1: Tabelle zur Aussagefähigkeit von pathologischen Prognoseparametern beim Mammakarzinom.
1.2.2 Prädiktive Parameter Zu den lange etablierten prädiktiven Markern beim Mammakarzinom gehören der
Menopausenstatus, der Steroidhormonrezeptorstatus und der HER-2-
Rezeptorstatus [Sauer, 2005].
Einleitung
4
Zum Hormonrezeptorstatus werden der Östrogen- und der
Progesteronrezeptorstatus gezählt. Häufig in diesem Zusammenhang wird die
HER-2-Expression erwähnt. Bei HER-2 oder früher c-erbB-2 handelt es sich um
ein Onkogen [Stemmler et al., 2005], dessen Translationsprodukt beim
Mammakarzinom erhöht sein kann. In der Literatur finden sich verschiedene
Angaben von vermehrter Expression bei Mammakarzinompatientinnen. Diese
belaufen sich zwischen 10-30 % [Ellsworth et al., 2008; Gown et al., 2008; Lal et
al., 2004; Owens et al. 2004; Yaziji et al. 2004; Slamon et al., 2001]. Es ist
unbehandelt mit einer signifikant schlechteren Gesamtüberlebensrate und mit
einem verkürzten krankheitsfreien Überleben assoziiert [Muss et al., 1994] und
wird als „Aktivator“ zellulärer Differenzierung, Adhäsion und Motilität angesehen
[Ignatoski et al., 2000; Adam et al., 1998; Xu et al., 1997]. Die Bestimmung dieses
Parameters erfolgt entweder mittels Immunhistochemie oder Fluoreszenz-in-situ-
Hybridisierung (FISH).
Die prädiktive Aussagefähigkeit des Steroidrezeptorstatus und des HER-2-
Rezeptorstatus ist Tab. 2 zu entnehmen.
Prädiktiver Parameter Aussagefähigkeit zu entsprechender Therapieform
Steroidhormonrezeptorstatus • Eine endokrine Therapie ist nur bei positivem Hormonrezeptorstatus indiziert [Sauer et al., 2005]. Rezeptorpositive Patientinnen zeigen unter Tamoxifentherapie ein besseres Überleben [Green et al., 2002; Muss et al., 1994]; jedoch gilt dieses mit Einschränkungen [Hayaschi und Yamaguchi, 2005].
• Steroidhormonrezeptornegative Tumore reagieren gut auf eine Chemotherapie [Tordai et al., 2007; Mazouni et al., 2007]: Es konnten mehr pathologische Komplett- Remissionen nachgewiesen werden, eine bessere Wirksamkeit ist für die adjuvante und neoadjuvante Chemotherapie anzunehmen [Colleoni et al., 2004].
HER-2-Rezeptorstatus • Die Therapie mit dem humanisierten Antikörper Trastuzumab ist indiziert bei HER-2-Überexpression [Sauer, 2005].
Tab. 2: Aussagefähigkeit von prädiktiven Parametern beim Mammakarzinom.
1.2.3 Risikoadaptierte Therapie Für die jeweilige Therapieempfehlung werden die Patientinnen Risikogruppen
zugeordnet. Nach den Konsensusempfehlungen des internationalen
Expertentreffens in St. Gallen zur adjuvanten Therapie des Mammakarzinoms
werden derzeit drei Risikogruppen unterschieden: niedriges, mittleres und hohes
Einleitung
5
Risiko. Diese orientieren sich an den prädiktiven und prognostischen Parametern
(siehe Tab. 3).
Niedriges Risiko Intermediäres Risiko Hohes Risiko Nodalnegativ Nodalnegativ Nodalpositiv
und alle nachfolgenden Charakteristika: • Primärtumorgröße:
pT < 2 cm • Grading: G I • keine starke peritumorale
vaskuläre Invasion • ER und/oder PR positiv • HER-2 negativ • Alter > 35 Jahre
und mindestens eines der nachfolgenden Charakteristika: • Primärtumorgröße:
pT > 2 cm • Grading: G II - III • starke peritumorale
vaskuläre Invasion • ER und PR negativ • HER-2 positiv • Alter < 35 Jahre
1-3 Lymphknoten befallen und:
• ER und PR negativ oder
• HER-2 positiv > 4 befallene Lymphknoten
Nodalpositiv (1-3 befallene Lymphknoten)
und alle nachfolgenden Charakteristika: • ER und/oder PR positiv • HER-2 negativ
Tab. 3: Risikogruppen nach St. Gallen 2007 [Kapp et al., 2007].
1.2.4 Therapie des Mammakarzinoms Die adjuvante Therapie des Mammakarzinoms setzt sich aus mehreren
Bestandteilen zusammen: Operation, Radiatio, Chemotherapie, endokrine
Therapie und/oder Antikörpertherapie. Schwerpunkt nachfolgender Betrachtungen
sind die 90’er Jahre, in denen die Erstdiagnosen der Patientinnen dieses
Kollektivs gestellt wurden (1992-1998): Es wird die zum damaligen Zeitpunkt als
Standard angesehene Therapie dargestellt.
1.2.4.1 Operation
Die operative Therapie besteht beim Mammakarzinom abhängig von der
Primärtumorgröße, der Tumorlokalisation, der Art des Tumors und dem Wunsch
der Patientin entweder in einer brusterhaltenden Therapie (BET) oder einer
Mastektomie. Diese kann modifiziert radikal erfolgen, jedoch auch unter Erhalt der
Haut oder des Mamillen-Areolakomplexes durchgeführt werden. Die
Überlebensraten nach BET mit Radiatio und modifiziert radikaler Mastektomie
zeigen keinen Unterschied, wenn der BET eine Radiatio folgt [Veronesi et al.,
2002; Fisher et al., 2002]. Vor Etablierung des Sentinel Lymphknotenverfahrens
Einleitung
6
wurde standardmäßig eine Axillarevision der Lymphknoten Level I und II
durchgeführt. Dieses entspricht den Lymphknoten der unteren und mittleren Axilla
[Schmidt-Matthießen et al., 2002].
1.2.4.2 Radiatio
Die postoperative Radiatio ist Voraussetzung für ein operativ brusterhaltendes
Vorgehen. Durch die Bestrahlung wird der Anteil der Patientinnen, die ein
intramammäres Rezidiv erleiden, um den Faktor zwei bis drei reduziert [Fisher et
al., 2002; EBCTCG, 2000]. Der Nutzen der Radiatio konnte auch im Überblick
mehrerer randomisierter Studien gezeigt werden [Clarke et al., 2005]. In der Regel
wird die betroffene Mamma mit einer Gesamtdosis von 50 Gy konventioneller
Fraktionierung (2 Gy) und zusätzlichem Tumorboost von 10 Gy bestrahlt.
Gegebenenfalls werden auch noch die parasternalen, supra- und infraclaviculären
Lymphknotenareale, selten auch die axillären Lymphknoten bestrahlt. Die
adjuvante Radiatio nach Mastektomie ist ebenfalls bei Risikopatientinnen indiziert.
Bei diesen verbessert sich die 10-Jahres- Überlebenswahrscheinlichkeit bis zu
10% [Schmidt-Matthießen et al., 2002].
1.2.4.3 Chemotherapie
In der kurativen Situation unterscheidet man die neoadjuvante (präoperativ) von
der adjuvanten Chemotherapie. Ein weiterer Einsatz der Chemotherapie liegt im
palliativen Bereich.
Mitte bis Ende der 90’er Jahre wurden adjuvant zwei Chemotherapieschemata als
Standard verabreicht: CMF und EC (siehe Tab. 4). Die Indikation wurde
risikoabhängig gestellt, wobei der Nodalstatus eine besondere Bedeutung
eingenommen hat: Nodalnegative Patientinnen erhielten, sofern eine nur
endokrine Therapie nicht ausreichend war, eine Chemotherapie nach dem CMF-
Schema nach Bonadonna. Selbiges galt für nodalpositive Patientinnen mit
maximal drei positiven Lymphknoten und keinen weiteren Risikofaktoren. Bei mehr
als drei positiven Lymphknoten erhielten die Patientinnen das EC-Schema mit
anschließend drei Zyklen CMF [Müllerleile et al., 2002].
Die bessere Wirkung anthrazyklinhaltiger Chemotherapieschemata wurde in
Langzeitbeobachtungen bestätigt: Eine Metaanalyse von mehr als 14.000
Patientinnen der Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group (EBCTCG)
Einleitung
7
zeigt nach 15 Jahren Nachbeobachtungszeit, dass anthrazyklinhaltige
Chemotherapieschemata gegenüber dem klassischen CMF-Schema das
Rezidivrisiko senken und das Gesamtüberleben erhöhen [Glück 2005].
CMF-Schema nach Bonadonna
(6 Zyklen, Wiederholung Tag 29)
EC-Schema
(4 Zyklen, Wiederholung Tag 22)
Cyclophosphamid 500 mg/m² i.v. Tag 1 + 8 Epirubicin 90 mg/m²
Methotrexat 40 mg/m² i.v. Tag 1 + 8 Cyclophosphamid 600mg/m²
Fluorouracil 600 mg/m² i.v. Tag 1 + 8
Tab. 4: Standardchemotherapieschemata CMF und EC des Mammakarzinoms [Schmidt-Matthiesen et al., 2002].
1.2.4.4 Endokrine Therapie
In Abhängigkeit vom Hormonrezeptorstatus ist eine endokrine Therapie indiziert.
Bei der Auswahl der Substanzen wird der Menopausenstatus berücksichtigt.
Derzeit stehen drei endokrine Therapieprinzipien zur Auswahl: die
Östrogenrezeptorblockade bzw. Modulation des Östrogenrezeptors, die
Östrogensynthesehemmung und die Suppression der Ovarialfunktion. Betroffene
mit stark positivem Hormonrezeptorstatus in der Postmenopause profitieren am
meisten von einer antiöstrogenen Therapie. Zum Diagnosezeitpunkt des
betrachteten Kollektives galt Tamoxifen als das Standardmedikament. In der
Prämenopause wurden zusätzlich GnRH-Analoga eingesetzt. Der Einsatz von
Aromatasehemmern hat sich in der Postmenopause der alleinigen
Tamoxifentherapie überlegen gezeigt: Es resultierte in einigen Studien ein
verbessertes Überleben sowie ein häufigeres ereignisfreies Überleben [Boccardo
et al., 2006; Jakesz et al., 2005; Thurlimann et al., 2005; Coombes et al., 2004].
1.2.4.5 Antikörpertherapie
Eine Antikörpertherapie mit Trastuzumab, dem ersten beim Mammakarzinom
eingesetzten monoklonalen Antikörper, wird in Abhängigkeit vom HER-2
Rezeptorstatus eingesetzt. Unter dieser Therapie zeigte sich ein verlängertes
Überleben in der adjuvanten sowie in der metastasierten Situation [Gianni, 2002].
Einleitung
8
1.3 Serinproteasen Es werden weitere Marker erforscht, die bei der Tumorgenese relevant sein
können. Zu diesen Parametern gehören neben Onkogenen auch Enzyme. So wird
unter anderem das Urokinase Plasminogen Aktivator System untersucht, welches
zu den Serinproteasen gezählt wird, einem Enzymsystem, das an der
Degradierung von extrazellulären Matrixbestandteilen und am Abbau der
Basalmembran beteiligt ist [Danø et al., 2005; Andreasen et al., 1997; Boyd,
1996]. Der Aktivitätszustand dieses Enzymsystems kann als Maß für die
Invasivität und Metastasierungsbereitschaft eines Tumors gesehen werden [Han
et al., 2005; Duffy, 1996]. Die Namensgebung dieses Enzymsystems erfolgte nach
seinem ersten Nachweisort: dem Urogenitaltrakt. Am Mammakarzinom sind vor
allem zwei der Komponenten dieses Enzymsystems bisher untersucht worden: der
Uroplasminogenaktivator (uPA) und einer seiner Inhibitoren, der
Plasminogenaktivatorinhibitor 1 (PAI-1). Dieses Enzymsystem katalysiert die
Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin, welches unter anderem Bestandteile der
extrazellulären Matrix, wie Fibronectin, Laminin und Vitronectin spalten kann
[Behrendt, 2004]. Die Funktion dieser beiden Faktoren ist in Abb. 2 schematisch
dargestellt (s. Seite 9).
Beim Mammakarzinom führt eine erhöhte Konzentration von uPA und/ oder PAI-1
zu einem geringeren rezidiv- und metastasenfreien Überleben und
Gesamtüberleben [Look et al., 2002]. Retrospektiv zeigte sich, dass Patientinnen
mit hohem uPA und PAI-1 einen signifikant größeren Nutzen von adjuvanter
Chemotherapie haben als solche mit niedriger uPA und PAI-1 Expression
[Harbeck et al., 2002]. Nodalnegative Patientinnen mit geringen Werten von uPA
und PAI-1 haben eine sehr gute Prognose, so dass eine adjuvante Chemotherapie
bei diesen Patientinnen nicht indiziert scheint [Jänicke et al., 2001]. Vor allem für
nodalnegative Patientinnen scheinen die Serinproteasen eine bisher existente
Lücke von prognostischer Aussagefähigkeit zu schließen [Han et al., 2005].
Sie finden sich in den Empfehlungen der Arbeitsgemeinschaft Gynäkologische
Onkologie e. V. (AGO) [AGO, 2010] sowie in den Leitlinien der American Society
of Clinical Oncology (ASCO). Problematisch ist jedoch weiterhin die aufwändige
und teure Bestimmung mittels ELISA am Frischgewebe, was einer der Gründe ist,
warum sich diese Parameter bisher noch nicht in der Routine durchgesetzt haben
und die Bestimmung wenigen Zentren vorbehalten bleibt: Nur 15 Laboratorien in
Einleitung
9
Deutschland arbeiten derzeit mit dem kommerziell vertriebenen Femtelle®-Test
zur Bestimmung von uPA und PAI-1 mittels ELISA.
Abb. 2: Schematisch vereinfachte Darstellung des Plasminogenaktivators (uPA), seines Rezeptors (uPAR) sowie eines seiner Inhibitoren (PAI-1). In Teilabbildung A ist die aktive Form von uPA
dargestellt, die zu einer Aktivierung der Vorstufe Plasminogen zu Plasmin führt. In Teilabbildung B ist die Inhibierung des Uroplasminogenaktivators durch seinen Inhibitor 1 dargestellt. In diesem Fall
erfolgt keine Aktivierung von Plasminogen.
Im Rahmen der NNBC-3-Studie wurde untersucht, inwiefern die Gabe einer
Chemotherapie bei nodal-negativen Patientinnen vom Status der Serinproteasen
abhängig gemacht werden kann [German Breast Group, 2006]. Erste Ergebnisse
werden für 2010 erwartet.
Im Rahmen dieser Dissertation ist die immunhistochemische Färbung dieser
beiden Parameter erfolgt.
1.4 Rad51 Rad ist die Kurzform des englischen Wortes „radiation“ (Strahlung).
Zurückzuführen ist diese Namensgebung auf Untersuchungen im Jahre 1992 an
Hefe-Mutanten (Saccharomyces cerevisiae), welche eine hohe Sensitivität
gegenüber Röntgenstrahlen zeigen. Die einzelnen Mutanten wurden im Rahmen
der damaligen Untersuchung durchnummeriert und die verursachenden Gene in
Einleitung
10
der anschließenden Auswertung mit der jeweiligen Nummer benannt. Im Verlauf
weiterer wissenschaftlicher Untersuchungen konnte Rad51 als das eukaryontische
Homolog des prokaryontischen RecA-Protein aus Escherichia coli nachgewiesen
werden [Opitz, 2002; Knippers, 2001].
Es handelt sich bei Rad51 um einen wesentlichen Faktor der homologen
Rekombination, einem Reparaturmechanismus der Zelle (Abb. 3). Der
Schwerpunkt dieses Reparaturmechanismus liegt dabei in der Reparatur von
DNA-Doppelstrangbrüchen.
Abb. 3: Vereinfacht dargestellt ist die homologe Rekombination als mögliche Zellantwort auf einen DNA-Doppelstrangbruch mit ihrem wesentlichen Bestandteil Rad51. Sie ermöglicht ein Fortsetzen des Zellzyklus. (SDSA – sythesis–dependent-strand-annealing, SSA – single-strand annealing, BIR – break
induced replication.) [Sung und Klein, 2006].
Die Brustkrebssuszeptibilitätsgene des hereditären Mammakarzinoms, BRCA I
und BRCA II, interagieren im Rahmen der homologen Rekombination mit Rad51
[Venkitaraman, 2001].
Eine vermehrte Expression von Rad51 wurde in verschiedenen Tumorzelllinien
nachgewiesen [Raderschall et al., 2002]: Es zeigte sich für das humane
Adenokarzinom des Pankreas [Han et al., 2002; Maacke et al., 2000a], für das
Einleitung
11
nicht kleinzellige Bronchialkarzinom [Qiao et al., 2005] und das invasive
Mammakarzinom [Maacke et al., 2000b] eine erhöhte Expression. Das invasiv
duktale Mammakarzinom weist eine Korrelation mit dem histologischen Grading
auf [Maacke et al., 2000b]. Als unabhängiger prognostischer Marker stellt es sich
beim nicht kleinzelligen Bronchialkarzinom dar [Qiao et al., 2005].
Interessant scheint Rad51 noch aus einem weiteren Grund: Von einigen Autoren
wird die Hypothese aufgestellt, dass ein Zusammenhang zwischen
Pharmakoresistenz und Rad51 Expression besteht [Christodoulopoulos et al.,
1999]. Eine induzierte geringe Expression von Rad51 wurde mit erhöhter
Strahlensensitivität in Verbindung gebracht [Collis et al., 2001; Ohnishi et al.,
1998].
Bisher fehlt eine Einordnung von Rad51 in den Gesamtzusammenhang der
prognostischen Parameter des Mammakarzinoms.
1.5 Ki-67 Der im Jahre 1983 entdeckte Antikörper Ki-67 dient zum Nachweis des Ki-67
Antigens der Zelle. Die Namensgebung erfolgte nach der Stadt der Entdeckung
Kiel und dem 67. Antikörperklon einer Versuchsreihe. Von 164 Antikörperklonen
zeigte sich der 67. Klon im Rahmen der damaligen Studie als ein möglicher
Marker für Proliferation und Zellaktivität [Gerdes et al., 1983]. Ki-67 zeigte eine
unterschiedliche Expression in den einzelnen Phasen des Zellzyklus [Gerdes et
al., 1984]. Das Antigen konnte in allen Phasen des Zellzyklus außer in ruhenden
Zellen nachgewiesen werden, so dass eine Aussage zur Wachstumsfraktion eines
entsprechenden Gewebes möglich ist [Scholzen und Gerdes, 2000]. Die
Geschwindigkeit, mit der sich ein Gewebe teilt, wird dabei nicht beschrieben.
Bereits in den neunziger Jahren wurde der Ki-67 Expression eine bessere
Aussagefähigkeit zur Wachstumsfraktion eines Gewebes zugesprochen als dem
Mitoseindex [Schwarting, 1993]. Eine prognostische Bedeutung konnte
insbesondere beim Prostata- [Borre et al., 1998; Aaltomaa et al., 1997] und beim
Mammakarzinom nachgewiesen werden. Bei letzterem konnte Ki-67 in vielen
Studien als ein unabhängiger prognostischer Parameter für das Gesamtüberleben
Einleitung
12
und/oder für das rezidivfreie Überleben nachgewiesen werden [Colozza et al.,
2005; Trihia et al., 2003; Jansen et al., 1998; Railo et al., 1997; Brown et al., 1996;
Domagala et al., 1996; Querzoli et al., 1996; Seshadri et al., 1996; Pinder et al.,
1995; Gaglia et al., 1993; Railo et al., 1993]. Aufgrund einer widersprüchlichen
Datenlage und fehlender Standardisierung der Bestimmung ist dieser Parameter
nicht fest etabliert. Die genaue Funktion dieses Kernproteins ist trotz erfolgter
Strukturanalyse unklar, wahrscheinlich ist eine regulative Funktion im Rahmen des
Zellzyklus [Scholzen und Gerdes, 2000]. Eine Veröffentlichung mutmaßt eine
Rolle bei der Regulation höher geordneter Chromatinstrukturen [Scholzen et al.,
2002]. 2006 wurde ein Zusammenhang mit der Promotor- und
Transkriptionsregion von rRNA beschrieben, welcher eine Funktion von Ki-67 für
die rRNA-Synthese vermuten lässt [Bullwinkel et al., 2006].
Einleitung
13
1.6 Zielsetzung Am Mammakarzinom sollen mittels immunhistochemischer Färbung retrospektiv
folgende Fragestellungen im Kontext der etablierten klinisch-pathologischen
Parameter (histologisches Grading, Primärtumorgröße, Nodalstatus,
Fernmetastasierungsstatus, Östrogen-, Progesteron-, HER-2-Rezeptorstatus,
Alter) bearbeitet werden:
1.) Ist Rad51 ein Prognoseparameter beim Mammakarzinom?
2.) Stellt Ki-67 als Proliferationsmarker möglicherweise einen unabhängigen
prognostischen Parameter für das Mammakarzinom dar?
3.) Besteht eine Korrelation von Rad51 und Ki-67 zu neueren
Prognoseparametern wie uPA und PAI-1?
4.) Sind immunhistochemische Untersuchungsergebnisse von uPA und PAI-1
vergleichbar mit Ergebnissen anderer Studien, die deren Expression mittels
Enzyme linked Immuno Sorbend Assay (ELISA) bestimmt haben?
Material und Methodik
14
2. Material und Methodik
2.1 Gutachten der Ethikkommission Die Genehmigung dieser Studie erfolgte durch die Ethik-Kommission der
Universität zu Lübeck (Aktenzeichen: 98-039). Das positive Votum vom 11. Mai
1998 wurde mit einem Schreiben vom 23.01.2003 erweitert.
2.2 Verbrauchsmaterialien mit Bezugsquelle Alle im Folgenden aufgeführten Substanzen entsprechen den üblichen
analytischen Reinheitsgraden. Zur besseren Übersicht erfolgen die nachfolgenden
Auflistungen tabellarisch.
2.2.1 Chemikalien und Biochemikalien Substanz Hersteller
• Albumine Bovine Fraction Serva, Heidelberg
• Aqua bidest. destilliert im Hause
• Avidin/Biotin Blocking Kit Vector Laboratories, Burlinghame,
USA
• Borg Decloaker (pH = 9,5) Sanova Pharma GesmbH, Wien,
Österreich
• DAB Substrate Kit Vector Laboratories, Burlinghame,
USA
• Chem MateTM Detection Kit
Peroxide DAB, Rabbit/Mouse,
Kit 5001
Dako Cytomation Denmark A/S,
Glostrup, Dänemark
• Di-Natriumhydrogen-
phosphat (Na2HPO4 * 2H2O)
Merck KgaA, Darmstadt
• Ethanol 100% Apotheke der Universität zu Lübeck
• Eukitt (Eindeckmedium) O. Kindler GmbH, Freiburg
• Kaliumchlorid Merck KgaA, Darmstadt
• Kaliumdihydrogenphosphat Merck KgaA, Darmstadt
• Mayer’s Hämalaunlösung Waldeck GmbH & CoKG, Münster
Material und Methodik
15
• Natriumchlorid Merck KgaA, Darmstadt
• Natriumcitrat, Monohydrat Sigma, Steinheim
• Natriumhydroxid Merck KgaA, Darmstadt
• Peroxidase Blocking Solution Dako Cytomation Denmark A/S,
Glostrup, Dänemark
• Pertex (Eindeckmedium) Medite GmbH, Burgdorf
• Salzsäure Merck KgaA, Darmstadt
• Tris Base Sigma, Steinheim
• Tris HCl Sigma, Steinheim
• Triton X-100 Sigma, Steinheim
• Tween Merck-Schuchardt, Hohenbrunn
• Vectastain Elite ABC-
Peroxidase-Kit
Vector Laboratories, Burlinghame,
USA
• Wasserstoffperoxidlösung Apotheke der Universität zu Lübeck
• Xylol Apotheke der Universität zu Lübeck
2.2.2 Seren Serum Verdünnung Hersteller
Normalserum (Horse) 15 µl/ml
Pufferlösung
Vector Laboratories,
Burlinghame, USA
2.2.3 Zusätzlich verwendeter Laborbedarf
Laborbedarf Hersteller
• Feuchte Kammer
• Dampfdrucktopf
• Dampfgarer Multi Gourmet Braun GmbH, Kronberg/Taunus
• Deckgläschen Menzel-Gläser, Braunschweig
• Eindeckelmaschine Firma Mersei
• Eppendorf Pipetten Eppendorf AG, Hamburg
• Eppendorf Easypet Eppendorf AG, Hamburg
• Küvetten/Messgefäße
• Magnetrührer
Material und Methodik
16
• Objekträger: Chem Mate
Capillary Gap Microscope
Slides, 75 µm
Dako Cytomation Denmark A/S,
Glostrup, Dänemark
• Pap Pen G. Kisker, Steinfurt
• Pasteurpipetten
• Pinzetten/Spatel
• Stoppuhren
2.3 Charakterisierung der verwendeten Antikörper Die Charakterisierung bezieht sich auf die jeweiligen Herstellerangaben. Die
entsprechende Verdünnung aller nicht vom Hersteller gebrauchsfertigen
Antikörper erfolgte in 5%-iger BSA/PBS-Blocking-Lösung (Herstellung siehe 2.4)
mit 15 µl/ml Normalserum.
2.3.1 Anti-Rad51-Antikörper (1G8) (Konzentration: 1:2000) Es handelt sich um einen monoklonalen Antikörper, der die Aminosäuren 16-20
des humanen Rad51 als Bindungspunkt erkennt. Untersuchungen mit diesem
Antikörper wurden bereits zuvor an Paraffinmaterial durchgeführt [Opitz, 2002;
Maacke et al., 2000b]. Der Antikörper entstammt eigener Herstellung [Buchhop et
al., 1996].
2.3.2 Anti-Ki-67-Antikörper (Konzentration: 1:400) Der monoklonale Maus-Antikörper ermöglicht den Nachweis von humanem Ki-67-
Antigen. Bindungspunkt ist das C-terminale Ende des Proteins. Erworben wurde
dieser Antikörper von der Firma Oncogene Research Products, San Diego, USA.
2.3.3 Anti-uPA-Antikörper, Produktnr. 3689 (Konzentration: 1:100) Dieser monoklonale murine IgG1 Antikörper dient dem Nachweis der B-Kette des
uPA. Extrahiert wurde dieser Antikörper vom Hersteller American Diagnostica inc.,
Stamford, USA, aus Zellkulturen mit anschließender Aufreinigung in der
Agarosegelsäule (agarose gel column). Reaktivität zeigt der Antikörper gegenüber
dem B-Kettenepitop der humanen Urokinase in der Nähe der katalytischen
Material und Methodik
17
Einheit. Die Bindung erfolgt mit der rezeptorgebundenen, einzeln vorliegenden
Urokinase und mit dem B-Kettenfragment (33 kD). Immunhistochemische
Untersuchungen mit diesem Antikörper wurden bereits durchgeführt [Constantini
et al., 1996; Jankun et al., 1993].
2.3.4 Anti-PAI-1-Antikörper, Produktnr. 3785 (Konzentration: 1:25) Zur immunhistochemischen Darstellung des PAI-1-Antigens diente der
monoklonale Antikörper gegen humanes PAI-1 der Firma American Diagnostica
inc., Stamford, USA. Aufbereitet wurde dieser vom Hersteller aus der humanen
Melanomzelllinie MJZJ. Es handelt sich um einen IgG-Antikörper, dessen
spezifischer Bindungsort nicht beschrieben ist: Die Bindung erfolgt mit PAI-1 und t-
PA/PAI-1. Der Antikörper wurde bereits von anderen Arbeitsgruppen verwendet
[Constantini et al., 1996; Jankun et al., 1993].
2.3.5 Anti-Mouse (Horse IgG H+L), biotinyliert (Konzentration: 1:200) Dieser Antikörper kann als biotinylierter Sekundärantikörper zum Nachweis von
IgG (H + L) Mausantikörpern verwandt werden. Bezugslabor ist das Vector
Laboratories, Burlinghame, USA.
2.3.6 Chem MateTM Link, biotinylated secondary antibody-aus dem Kit 5001 Diese von der Firma Dako Cytomation Denmark A/S (Glostrup, Dänemark)
gebrauchsfertige Antikörperlösung enthält biotinylierte Anti-Maus und Anti-
Kaninchen Ziegen-Immunglobuline in gepufferter Lösung mit stabilisierendem
Protein und Natriumazid.
2.4 Herstellung der Lösungen und Puffer • ABC-Peroxidase-Kit: 30 Minuten vor Gebrauch werden zu 2,5 ml
Blocking-Lösung ein Tropfen „Reagenz A“ und ein Tropfen „Reagenz B“
gegeben und anschließend bei Raumtemperatur inkubiert.
• BSA/PBS-Blocking-Lösung, 5%: Für eine 5%-ige Lösung werden 5g
„buffered serum albumine“ (BSA) mit „phoshate buffered saline“ (PBS) auf
Material und Methodik
18
ein Volumen von 100 ml aufgefüllt, wobei zu starkes Rühren wegen der
Proteine zu vermeiden ist. Die Lösung kann als Vorrat bei –20 °C
eingefroren werden, sollte aber besser frisch angesetzt werden.
• Chromogen DAB (3,3’-Diaminobenzidintetrahydrochlorid)-
Färbelösung: 20 µl Chromogen DAB werden unter dem Abzug zu 1000 µl
„HRP Substrate Puffer“ aus dem Kit 5001 hinzugegeben.
• Citratpuffer, 0,01 M, pH = 6,0: In 1000 ml Aqua bidest. werden 2,1g
Natriumcitrat gelöst. Der pH wird entsprechend mit Natronlauge oder
Salzsäure eingestellt.
• DAB (3,3’-Diaminobenzidin)-Färbelösung: Zu 2,5 ml Aqua bidest.
werden 1 Tropfen „Buffer Stock Solution“, zwei Tropfen „DAB Stock
Solution“ und 1 Tropfen „Hydrogen Peroxide Solution“ aus dem „DAB
Substrate Kit“ hinzugegeben. Vor Zugabe der jeweils nächsten Substanz ist
auf eine ausreichende Mischung der Lösung zu achten. Da DAB
wahrscheinlich karzinogen ist, sollte auf entsprechende
Vorsichtsmaßnahmen geachtet werden. Bei lichtgeschützter Aufbewahrung
und einer Temperatur von 4 °C ist diese Färbelösung bis zu sechs Stunden
stabil.
• Phosphate Buffered Saline (PBS), pH = 7,4: Benötigt werden 8g
Natriumchlorid (137 mmol/l), 0,2g Kaliumchlorid (2,7 mmol/l), 1,44g di-
Natriumhydrogenphosphat (8 mmol/l) und 0,24 g
Kaliumdihydrogenphosphat (1,8 mmol/l). Gelöst werden diese Substanzen
zunächst in 1000 ml Aqua bidest. Die Lösung sollte einen pH-Wert von 7,4
haben, sollte das nicht der Fall sein, muss gegebenenfalls mit Salzsäure
korrigiert werden. Es ist empfehlenswert, mit einer 10-fach konzentrierten
Stammlösung zu arbeiten.
• Triton X-100-Lösung, 0,2%: Unter Rühren und bei einer Temperatur von
50 °C werden 200 µl Triton X-100 zu 100 ml PBS-Lösung hinzugegeben.
• TRIS und Tween Pufferlösung, 0,003%, pH=7,45: In 1000 ml Aqua
bidest. werden 8,78g Natriumchlorid, 0,9 g Tris Base, 6,85 g Tris-HCl und
300 µl Tween unter Rühren gelöst.
Material und Methodik
19
2.5 Untersuchungsgut
2.5.1 Material Die Untersuchung wurde an formalinfixiertem, paraffineingebettetem Material von
invasiv-duktalen und invasiv-lobulären Mammakarzinomen durchgeführt, welches
freundlicherweise vom Institut für Pathologie des Städtischen Klinikums Lüneburg
(Direktorin: Dr. med. A. Peters) zur Verfügung gestellt wurde. Erfasst wurden
Patientinnen, die im Städtischen Klinikum Lüneburg mit der Erstdiagnose eines
Mammakarzinoms im Zeitraum von 1996 – 1998 behandelt wurden. Bei nicht
ausreichenden Nachbeobachtungsdaten wurden zusätzlich weitere Fälle mit
Erstdiagnosestellungen der Jahre 1992 – 1995 eingeschlossen. Es lagen
insgesamt 358 Fälle vor, von denen 143 mit hinreichendem Follow-up ausgewertet
werden konnten. Die Datenerhebung erfolgte anhand der Auswertung von
archivierten Krankenhausakten und mit Unterstützung des niedersächsischen
Krebsregisters [Onkologische Nachsorgeleitstelle, Elbinger Straße 2, 37083
Göttingen].
Es handelt sich bei den ausgewerteten Fällen um 19 lobulär-invasiv und 124
duktal-invasiv wachsende Tumore.
Das histologische Grading erfolgte von Seiten des Pathologen Prof. Dr. med.
Stefan Krüger aus dem Institut für Pathologie des Universitätsklinikums SH,
Campus Lübeck (Direktor: Prof. Dr. med. A. C. Feller) an Hämatoxilin-Eosin
gefärbten Präparaten. Die Färbung erfolgte im Routinelabor des Institutes. Dieses
Vorgehen diente dem Ausschluss unterschiedlicher Befundung durch mehrere
Untersucher. Die histologische Klassifizierung erfolgte nach den Grading Kriterien
von Elston und Ellis [Elston und Ellis, 1991].
An weiteren Paraffinschnitten derselben Tumorblöcke erfolgten die im Folgenden
beschriebenen immunhistochemischen Färbungen.
Normalgewebe wurde im Rahmen der Untersuchung dieser Präparate nicht
beurteilt, da es fraglich ist, ob es sich bei tumornahem Gewebe um
repräsentatives Normalgewebe handelt.
Material und Methodik
20
2.5.1 Aufbereitung der Gewebeschnitte Das formalinfixierte und in Paraffin eingebettete Gewebe wurde nach dem
Schneiden in einer Schichtdicke von 4µm im Streckbad auf die Objektträger
aufgezogen und anschließend über Nacht bei 37 °C im Brutschrank getrocknet.
Die anschließende Lagerung erfolgte bei Raumtemperatur.
2.5.2 Vorbehandlung der Gewebeschnitte
Die Paraffinschnitte werden ausgehend vom Xylol in der absteigenden
Alkoholreihe entparaffiniert. Die einzelnen Zeitangaben sind in den nachfolgenden
Tabellen 5 und 6 aufgelistet:
Alkoholform Verweildauer in entsprechendem Alkohol (min.)
Xylol 2 x 15’ Ethanol 100% 2 x 15’ Ethanol 80% 2’ und anschließend 1’ Ethanol 70% 2’ Ethanol 50% 1’
Tab. 5: Entparaffinierungsschema nach Färbeprotokoll I.
Alkoholform Verweildauer in entsprechendem Alkohol (min.)
Xylol 3 x 10’ Ethanol 100% 2 x 1’ Ethanol 80% 2 x 1’
Tab. 6: Entparaffinierungsschema nach Färbeprotokoll II.
2.5.3 Färbeprotokolle Es wurden zwei Protokolle für die immunhistochemischen Färbungen angewandt.
Der Ki-67-Antikörper wurde nach einem in der Arbeitsgruppe etablierten Verfahren
gefärbt, alle weiteren Antikörper wurden mit einem Verfahren, das an ein
Routinefärbeverfahren des Institutes für Pathologie des Universitätsklinikums SH,
Campus Lübeck angelehnt ist, gefärbt (Protokoll II). Zunächst wird das
Färbeprotokoll für Ki-67 erläutert (Protokoll I).
2.5.3.1 Protokoll zur Färbung von Ki-67 (Protokoll I)
Die Vorbehandlung der Gewebeschnitte erfolgte durch Entparaffinieren nach
Tabelle 5. Die durch die Fixierungsmethode bedingten Aldehydquervernetzungen
mit der Folge der dreidimensionalen Strukturveränderungen des
nachzuweisenden Antigens wurden durch mindestens dreiminütiges Kochen der
Material und Methodik
21
Gewebeproben in einem handelsüblichen Dampfdrucktopf bei maximalem
Dampfdruck gelöst. Als umgebendes Medium der Gewebeproben diente
Citratpuffer 0,01 M, pH=6,0. Das Abkühlen des Dampfdrucktopfes wurde mit
Leitungswasser beschleunigt. Im Anschluss wurde der Gewebebereich auf dem
Objektträger mit einem Pap Pen umrahmt, der als eine Art hydrophobe Barriere
diente, um den Verbrauch der nachfolgend eingesetzten Substanzen zu
minimieren und deren Benetzung auf der Gewebeprobe zu verbessern. Es erfolgte
eine Permeabilisierung der Membranen mit Triton-X-Lösung (0,2%) für einen
Zeitraum von zehn min., um dem Antikörper den Zugang zum Antigen zu
ermöglichen. Zur Verminderung von Hintergrundfärbungen wurden endogene
Peroxidasen blockiert. Dazu wurden die Gewebeschnitte mit 3%-iger
Wasserstoffperoxidlösung für fünf min. bedeckt. Im Anschluss werden endogene
Biotine blockiert. Da die Färbemethode auf biotinylierten Substanzen beruht, wird
somit die Spezifität der Färbungen erhöht. Diese wurde mit Avidin, das vier
Bindungsstellen für Biotin besitzt, durchgeführt. Dazu wurden die Gewebeschnitte
für 15 min. in der gebrauchsfertigen Avidinlösung inkubiert. Im Anschluss wurde
für weitere 15 min. exogenes Biotin hinzugegeben, so dass an die zuvor noch
freien drei Bindungstellen von Avidin nachfolgend keine biotinylierten Substanzen
mehr binden können, wenn im nachfolgenden Färbeprozess biotinylierte
Substanzen verwendet werden. Jetzt wurden die Gewebeproben für eine Std. mit
Normalserum, welches in Blockingpuffer verdünnt wurde (15µl/ml), inkubiert, um
Hintergrundfärbungen, bedingt durch Bindung des Antikörpers an die
Objektträgeroberfläche, zu reduzieren. Es erfolgte eine Bindung des
Primärantikörpers Ki-67 (Konzentration: 1:400) an die Antigenstrukturen. Beim
Lösungsmedium des Antikörpers handelte es sich um BSA/PBS-Blocking-Lösung
mit 15µl/ml Normalserum. Die Inkubationszeit betrug eine Std.. Zur Darstellung
des Primärantikörpers ist eine weitere einstündige Inkubation mit dem zweiten
biotinylierten Antikörper notwendig. Das Signal des gebundenen Zweitantikörpers
(Anti-Mouse (Horse IgG H+L), biotinyliert, Konzentration: 1:200) wurde durch eine
wiederum einstündige Inkubation mit ABC-Kit verstärkt, der eine halbe Std. zuvor
zubereitet und anschließend bei Raumtemperatur abgedunkelt aufbewahrt wurde.
Dieser enthält Avidin gebunden mit biotinylierter Meerrettichperoxidase. Das
Avidin dient als Bindeglied zwischen dem sekundären Antikörper und der
Peroxidase zur Signalverstärkung. Gefärbt wurden die Gewebeproben im
Material und Methodik
22
Anschluss für 60 sec. mit DAB. Dieses führte zu einer Braunfärbung im Bereich
der mit Meerrettichperoxidase markierten Bereiche. Die Färbereaktion wurde
durch die kontinuierliche Zufuhr von fließendem Leitungswasser von mindestens
fünf min., jedoch maximal zehn min. beendet. Eine Kerngegenfärbung wurde mit
Hämalaun-Färbelösung nach Mayer für einen Zeitraum von drei min. durchgeführt.
Überschüssige Färbelösung wurde durch 5- minütiges Bläuen unter Zugabe von
fließendem Wasser entfernt und die Reaktion beendet. Das Eindeckeln der
Gewebeschnitte erfolgte mit der Eindeckelmaschine der Firma Mersei. Dazu war
zunächst eine Behandlung der Gewebeschnitte mit der aufsteigenden
Alkoholreihe nötig (jeweils 15’’ Spülung in Ethanol 70%, 96%, 2 x 100%, in
Isopropanol, 3 x in Xylol), da das Eindeckmedium (Pertex ®) auf hydrophober
Basis aufgebaut ist. In Ausnahmefällen wurde manuell mit Eukitt ® eingedeckelt.
Das zwischenzeitige Waschen nach jedem einzelnen Schritt der
immunhistochemischen Färbung wurde mit einfachem PBS- Puffer durchgeführt.
In der Regel erfolgte das Waschen für jeweils fünf min. nach jedem einzelnen
Färbeschritt bis zur DAB-Färbung. Ausnahmen waren die Schritte der Avidin- und
Biotinzugabe, an deren Anschluss nur eine Spülung der Gewebeschnitte erfolgte.
Es folgt ein schematischer Abbildungsüberblick für dieses Färbeverfahren:
Material und Methodik
23
a.) Ausgangszustand der Gewebeprobe, Ak=Antikörper
b.) Zustand nach Demaskierung der Gewebeprobe, Ak=Antikörper
c.) Zustand nach Permeabilisierung der Zellmembran der Gewebeprobe, Ak=Antikörper
d.) Zustand nach Blockierung endogener Peroxidasen der Gewebeprobe, Ak=Antikörper
e.) Zustand nach Bindung von Avidin an endogenes Biotin, Ak=Antikörper
f.) Zustand nach Bindung von exogenem Biotin an Avidin, Ak=Antikörper
Abb. 4: In den Teilabbildungen a.)-f.) sind die einzelnen Färbeschritte für den Ki-67 Antikörper schematisch dargestellt.
Material und Methodik
24
g) Zustand nach Bindung des Erstantikörpers
h.) Zustand nach Bindung des biotinylierten Zweitantikörpers an den Primärantikörper
i.) Zustand nach Bindung der biotinylierten Meerrettichperoxidase an den biotinylierten Sekundärantikörper,
Ak=Antikörper
Abb. 4: In den Teilabbildungen g.)-i.) sind die einzelnen Färbeschritte für den Ki-67 Antikörper (Protokoll I) schematisch dargestellt.
2.5.3.2. Protokoll zur Färbung von Rad51, uPa, PAI-1 (Protokoll II) Dieses Protokoll wurde für die Antikörperfärbungen Rad51, PAI-1 und uPA
angewandt. Da dieses Verfahren prinzipiell dem Protokoll I ähnelt, wurde auf eine
schematische Abbildungsdarstellung verzichtet. Es werden im Folgenden nur
Material und Methodik
25
wesentliche Unterschiede dargestellt: Das Entparaffinieren erfolgt in der
absteigenden Alkoholreihe, siehe dazu Tab. 6. Beim verwendeten Spülmedium
handelte es sich bei diesem Protokoll um TRIS und Tween Pufferlösung, 0,003%.
Die Demaskierung erfolgte hier für einen Zeitraum von 45 min. im Dampfgarer der
Firma Braun. Die Gewebeproben sind dabei vollständig von Borg Decloaker
umgeben. Diese Lösung dient der Unterstützung der hitzeinduzierten
Antigendemaskierung im Temperaturbereich von 90-95 °C. Dieses Verfahren
ermöglichte, auf den Schritt der Membranpermeabilisierung von Protokoll I zu
verzichten.
Im Anschluss erfolgte die Inkubation mit dem Primärantikörper für einen Zeitraum
von 30 min. Die Antikörper wurden in folgendem Konzentrationsverhältnis im obig
beschriebenen Lösungsmedium gelöst: Anti-Rad51-Antikörper (1G8) 1:2000, Anti-
uPA-Antikörper 1:100 und Anti-PAI-1-Antikörper 1:25. Für weitere 15 min. wurde
der gebrauchsfertige biotinylierte Sekundärantikörper (Chem MateTM Link,
biotinylated secondary antibody - aus dem Kit 5001) hinzugegeben. Zur
Signalspezifizierung durch Blockierung endogener Peroxidasen wurden die
Gewebeschnitte mit der „Peroxidase Blocking Solution“ für 5 min bedeckt. Dieser
Schritt wurde drei Mal wiederholt und erst im Anschluss an diese drei
Wiederholungen gespült. Bei dieser Lösung handelte es sich nach
Herstellerangaben u. a. um Phosphatpuffer mit Wasserstoffperoxid (15 mmol/l).
Das Signal der gebundenen Antikörper wurde mit dem „Streptavidin HRP-
Komplex“ aus dem Kit 5001 vervielfacht. Diese Lösung enthält einen Komplex aus
Streptavidin, welcher an Meerrettich Peroxidase konjugiert ist. Zu diesem Zweck
erfolgte eine Inkubation von 15 min. mit dieser Substanz.
Die eingesetzte Färbelösung ist 3,3’-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid aus dem
Kit 5001 in einer Konzentration von 1:50. Es erfolgte eine Braunfärbung der zuvor
markierten Bereiche. Die Dauer dieser Färbung ist für exakt acht min. festgelegt,
um eine Vergleichbarkeit der Proben zu gewährleisten. Beendet wurde die
Färbereaktion mittels Spülung in Leitungswasser. Die Kerngegenfärbung und das
Eindeckeln erfolgte analog zu Protokoll I. Ein versuchsweise zusätzlicher Schritt
mit zusätzlicher Inkubation mit Normalserum zeigte keine optimierten
Färbeverhältnisse, so dass dieser nicht durchgeführt wurde.
Material und Methodik
26
2.5.4 Kontrollen
2.5.4.1 Negativkontrolle Die Negativkontrolle wurde stichprobenartig an Tumorpräparaten ohne
Primärantikörper, also nur dem Lösungsmedium ohne Antikörper, durchgeführt.
Die übrigen Färbebedingungen entsprachen den Färbeprotokollen.
2.5.4.2 Positivkontrolle Die Positivkontrolle bei Rad51 im Zusammenhang mit Protokoll II erfolgte mittels
eines Blasen- bzw. Pankreaskarzinom bekannt hoher Rad51 Expression. Für uPA
und PAI-1 stand kein Positivkontrollmaterial zur Verfügung.
2.5.5 Auswertung der gefärbten Präparate
2.5.5.1 Auswertung der Färbungen von Rad51 und Ki-67 Bei diesen beiden Antikörpern wurden die Präparate mit Hilfe eines
computergestützen Bildanalyseprogramms („PiClick Image Analysis“, Sven Opitz)
ausgewertet [Opitz, 2002]. Die Präparate wurden dazu mit Hilfe des
Bildanalysenmikroskops Axioskop 2 MOT Zeiss und der Kamera AxioCam Zeiss
(beide Fa. Carl Zeiss Microlmaging GmbH, Jena) digitalisiert.
Es erfolgte ein Auszählen der invasiven Tumorzellbereiche von mindestens 500
Tumorzellen in 200-facher Vergrößerung. Abhängig von der Intensität der
Kernfärbung jeder einzelnen Tumorzelle wurde eine Zelle als positiv oder negativ
bewertet. Die zytoplasmatische Färbung, sofern vorhanden, blieb
unberücksichtigt. Als Referenzbild siehe nachfolgende Teilabbildung 5A für Rad51
und Teilabbildung 5B für Ki-67. Das Verhältnis von positiv zu negativ ausgezählten
Tumorzellen wurde prozentual berechnet, auch als „positive stained cell index“
(PCI) bezeichnet, und diente der statistischen Analyse als Grundlage. Auch
andere Autoren haben unter anderem mit dem PCI als Auswertungsgrundlage
gearbeitet [Linder et al., 1997].
Material und Methodik
27
Abb. 5: Referenzabbildungen für die Färbungen mit Rad51 (Teilabbildung A) und Ki-67 (Teilabbildung B), gekennzeichnet sind als positiv zu wertende Zellen (schwarzer und weißer Pfeil)
und als negativ zu wertende Zellen (roter Pfeil); Vergrößerung 200-fach.
2.5.5.2 Auswertung der Färbungen von uPA und PAI-1 Diese beiden Antikörper wurden semiquantitativ in den Kategorien 0 bis III bei
200-facher Vergrößerung am Bildanalysenmikroskop Axioskop 2 MOT Zeiss (Fa
Carl Zeiss Microlmaging GmbH, Jena) ausgewertet. Die Erläuterung der
Kategorien 0-III findet sich in Tab. 7.
Material und Methodik
28
Kategorie
prozentual gefärbter
Zellanteil und Färbeintensität
repräsentative Abbildung bezüglich der Färbeintensität bei
uPA
repräsentative Abbildung bezüglich der Färbeintensität bei
PAI-1
0 < 5% positiv
I > 5% schwach
positiv
II
> 5%
mäßig/mittelgradig
positiv
III > 5% stark positiv
Tab. 7: Semiquantitative Kategorieeinteilung und repräsentative Abbildungsausschnitte von uPA und PAI-1, Vergrößerung 200-fach, digitale Bildgrößenanpassung.
Material und Methodik
29
2.5.5.3 Auswertung der Färbungen von HER-2 Bei nur wenigen Patientinnen war zum Diagnosezeitpunkt der HER-2-Status
bestimmt worden, so dass eine Nachbestimmung über das Routinelabor des
Institutes für Pathologie, UK-SH, Campus Lübeck erfolgte. Die Auswertung wurde
nach dem allgemein gültigen Standard durchgeführt, siehe Tab. 8. Der
aktualisierte Standard wurde zuletzt in der Hinsicht geändert, dass mehr als 30%
der Zellen gefärbt sein müssen, um eine positive Wertung aussprechen zu können
[Mayr et al., 2009].
Kategorie Definition 0 Keine Färbung bzw. membranständige Färbung von weniger
als 10% der Tumorzellen. Klinische Wertung: negativ.
1+ Partielle, schwache membranständige Färbung von mehr als 10% der Tumorzellen. Klinische Wertung: negativ.
2+ Schwache bis mäßige membranständige Färbung von mehr als 10% der Tumorzellen. Klinische Wertung: fraglich positiv, Klärung durch FISH-Untersuchung.
3+ Starke membranständige Färbung von mehr als 10 % der Tumorzellen. Klinische Wertung: positiv.
Tab. 8: Immunhistochemische Klassifikation der Her-2 Expression [Dendukuri et al., 2007; Hicks und Tubbs, 2005].
Material und Methodik
30
2.6 Statistische Analyse Als Grundlage der statistischen Analyse diente das SPSS®-Statistikprogramm
(SPSS, München, Version 13.0). Das Signifikanzniveau wurde jeweils mit p=0,05
festgelegt. Zur Darstellung des rezidivfreien Überlebens der Patientinnen dienten
Kaplan-Meier-Überlebenskurven, deren Vergleichsgruppen unter Verwendung des
log-rank Tests auf statische Signifikanz geprüft wurden. Im selben
Zusammenhang wurden auch Cox-Regressions-Analysen durchgeführt, sowohl
uni- als auch multivariat. Als beschreibende Parameter dieser Ergebnisse dienen
die Berechnung des relativen Risikos (RR), das 95%-Konfidenzintervall (95% KI)
und der p-Wert. Ausgangspunkt der multivariaten Analyse waren diejenigen
Parameter, die in der univariaten Analyse eine statistische Signifikanz gezeigt
haben. Zum direkten Vergleich der einzelnen Parameter diente der Chi-
Quadrattest nach Pearson. Die statistische Auswertung erfolgte in Kooperation mit
Prof. Dr. med. Krüger.
2.6.1 Festlegung der Schwellenwerte für Rad51 und Ki-67 Zur Darstellung von graphischen Überlebenskurven musste ein Schwellenwert für
die beiden Antikörper Rad51 und Ki-67 gefunden werden. Dazu wurde für jeden
prozentualen Wert als möglichem Schwellenwert sowohl für das rezidivfreie als
auch für das metastasenfreie Überleben eine Cox-Regressionsanalyse
durchgeführt. Derjenige Wert, bei dem die größte Signifikanz und das größte
relative Risiko vorlagen, wurde als Schwellenwert festgelegt. Bei Ki-67 ergab sich
somit ein Schwellenwert zur Unterscheidung von hoher und niedriger Expression
von < 25% und bei Rad51 ein Wert von < 31%. Es erfolgte auf dieser Grundlage
eine Unterteilung der ausgewerteten Fälle in zwei Kategorien, nämlich der hoher
Expression, wenn der prozentuale Anteil der gefärbten Kernbereiche oberhalb des
jeweiligen Schwellenwertes lag und der niedriger Expression, wenn sie unterhalb
des Schwellenwertes lag.
Ergebnisse
31
3. Ergebnisse
Rad51, ein wesentlicher Bestandteil der homologen Rekombination, wurde in
Bezug auf das Mammakarzinom zu seiner prognostischen Aussagefähigkeit auf
immunhistochemischer Basis ausgewertet. Zusätzlich wurden im Rahmen dieser
Studie weitere mögliche prognostische bzw. prädiktive Parameter untersucht: Ki-
67, uPA und PAI-1.
3.1 Patientinnenkollektiv Die Erhebung der klinischen Daten der 143 Patientinnen erfolgte retrospektiv. Die
Erstdiagnose der Patientinnen wurde in den Jahren 1992-1998 gestellt (1992: 1
Patientin, 1993: 2 Patientinnen, 1994: 2 Patientinnen, 1995: 4 Patientinnen; 1996:
44 Patientinnen; 1997: 48 Patientinnen; 1998: 42 Patientinnen). Der Median des
Lebensalters bei Erstdiagnosestellung lag bei 63 Jahren (Spannweite: 32 - 91
Jahre). Die weitere Altersaufschlüsselung ist Abbildung 6 zu entnehmen. Zur
Gruppierung als Grundlage der statistischen Analyse dient der Median als
Grenzwert.
0
5
10
15
20
25
30
30
-34
35
-39
40
-44
45
-49
50
-54
55
-59
60
-64
65
-69
70
-74
75
-79
80
-84
85
-89
90
-94
Alter in Jahren
Häufigkeit (n)
Abb. 6: Altersverteilung des Studienkollektivs bei Diagnosestellung.
Bei 59 der 143 Patientinnen kam es innerhalb des Beobachtungszeitraumes zu
einer Fernmetastasierung. 40 Patientinnen erlitten im Verlauf ein Lokalrezidiv.
Ergebnisse
32
Der Beobachtungszeitraum erstreckt sich mit einer Spannweite von 116 Monaten
auf minimal vier bis maximal 120 Monate. Der Median der Beobachtungszeit
beträgt 62 Monate. Das ’25er-Quartil liegt bei 33 Monaten und das ’75er-Quartil
bei 72 Monaten. Die weitere Aufschlüsselung erfolgt in Abb. 7.
05
101520253035404550
0-12 13-24 25-36 37-48 49-60 61-72 73-84 85-96 97-108
109-120
Zeit in Monaten
Häufigkeit (n)
Abb. 7: Nachbeobachtungszeitraum des Gesamtkollektivs.
3.2 Klinische und histopathologische Parameter Die klinische und histopathologische Beschreibung beinhaltet folgende Punkte:
Die Größe des Primärtumors, die Anzahl der befallenen Lymphknoten, das
Vorliegen einer Fernmetastasierung. Diese drei Kriterien werden entsprechend der
TNM-Klassifikation dargelegt.
Zusätzlich wird die histologische Tumorentität, der Differenzierungsgrad sowie das
Expressionsverhalten der Hormonrezeptoren und des HER-2-Rezeptorstatus
aufgeführt. Zu einer der neueren Faktoren gehört die Angioinvasion [Gasparini,
2001] und Lymphgefäßinfiltration, welche im Zeitraum der Diagnosestellungen
nicht etabliert gewesen ist, sondern in Studien erprobt wurde, z. B. von Weidner
und Kollegen [Weidner et al., 1991].
3.2.1. Histologie Im vorliegenden Kollektiv fanden sich 19 lobuläre und 124 duktal invasiv
wachsende Mammakarzinome. Das Grading zeigte 26 Fälle hoher Differenzierung
(G1), 81 Fälle mittlerer Differenzierung (G2) und 36 Fälle geringer Differenzierung
Ergebnisse
33
(G3). Davon waren 15 der lobulären Fälle mittlerer Differenzierung (G2) und 4
Fälle geringer Differenzierung (G3). Bei den duktal invasiven Karzinomen waren
26 Fälle hoher Differenzierung (G1), 66 Fälle mittlerer Differenzierung (G2) und 32
Fälle geringer Differenzierung (G3).
3.2.2 Tumorgröße Bei 57 Patientinnen zeigte sich zum Diagnosezeitpunkt eine pT1-Situation.
Zusammengefasst wurden in dieser Kategorie die Tumorstadien pT1a (5
Patientinnen), pT1b (5 Patientinnen) und pT1c (47 Patientinnen). 59 Patientinnen
hatten einen Primärtumor des Tumorstadiums pT2, 5 Patientinnen ein
Tumorstadium pT3 und 22 Patientinnen ein Tumorstadium der Tumorgröße pT4.
Für die weitere statistische Auswertung erfolgte eine weitere Zusammenfassung
der Tumorgruppengröße pT3 und pT4 zu einer Kategorie.
3.2.3 Nodalstatus Der Nodalstatus war zum Diagnosezeitpunkt bei 140 Patientinnen bekannt
gewesen und wurde entsprechend der TNM-Klassifikation in die Klassen 0 – 3
unterklassifiziert. Nodalnegativ waren 81 der Patientinnen und 59 der Patientinnen
waren nodalpositiv. 32 von den nodalpositiven Patientinnen gehörten in die
Kategorie pN1, 18 in die Kategorie pN2 und 9 in die Kategorie pN3. Bei drei der
Patientinnen lag kein Lymphknotenstatus vor, weil sie entweder nicht operiert
wurden (2 Patientinnen) oder weil er aus den Unterlagen nicht ersichtlich gewesen
ist (eine Patientin).
3.2.4 Östrogen- und Progesteronrezeptorstatus Bei Diagnosestellung war der Östrogenrezeptor- und der
Progesteronrezeptorstatus bestimmt worden. In 102 Fällen lag ein positiver
Östogenrezeptorstatus vor, in 100 Fällen ein positiver Progesteronrezeptorstatus.
Die Bestimmung des Rezeptorstatus erfolgte bei 28 Patientinnen mittels
immunhistochemischer Färbung. Die Ergebnisse wurden nach dem
immunreaktiven Score (IRS) nach Remmele und Stegner klassifiziert [Remmele
und Stegner, 1987]. Mittels biochemischer Bestimmung in Form des
Ergebnisse
34
Radioimmunassay (RIA) wurde bei 107 Patientinnen der Hormonrezeptorstatus
bestimmt. Dieses Verfahren dient dem Nachweis des löslichen Cytosolproteins. Im
Rahmen dieser Studie wurden Werte ab 21 fmol/mg (entspricht einem IRS > 2) als
positiv gewertet. Letzteres Verfahren ist heute obsolet, da es durch die
Immunhistochemie ersetzt wurde. In 5 Fällen wurde der Rezeptorstatus nicht
bestimmt, bei 3 Patientinnen war das Verfahren aus den Unterlagen nicht
ersichtlich.
Prozentsatz positiver Tumorzellkerne
x Färbeintensität = IRS
Positive Kerne Punkte Farbreaktion Punkte Gesamtpunkte keine < 10%
10-50% 51-80% > 80%
0 1 2 3 4
keine schwach massig stark
0 1 2 3
0-12 Punkte
Tab. 9: Immunreaktiver Score nach Remmele und Stegner [Sauer, 2005].
3.2.5 HER-2-Rezeptorstatus Es erfolgte eine Nachbestimmung des HER-2-Status bei 137 Patientinnen. Bei
nicht ausreichendem Tumormaterial konnte bei 6 Patientinnen keine Bestimmung
durchgeführt werden. Die Einteilung des HER-2-Status erfolgte in den Kategorien
0 bis 3+. Im Studienkollektiv zeigte sich folgender Rezeptorstatus: Kategorie 0 lag
bei 34 Patientinnen, Kategorie 1+ bei 58 Patientinnen, Kategorie 2+ bei 22
Patientinnen und Kategorie 3+ lag bei 22 Patientinnen vor. Als Grundlage für die
statistische Auswertung wurden die Kategorien 0, 1+ und 2+ zusammengefasst
und der Kategorie 3+ gegenübergestellt, da immunhistochemisch nur die
Kategorie 3+ als eindeutig positiv zu werten ist [Dendukuri et al., 2007].
Ergebnisse
35
2.3.6 Überblick der histopathologischen Parameter Die histopathologischen Parameter sind in der nachfolgenden Tabelle 10
zusammengefasst:
Parameter n Subklasse Häufigkeit Häufigkeit (%) Häufigkeit (%)
Histologie 143 lobulär 19 13,3
0% 50% 100%
duktal 124 86,7
Grading (G) 143 G1 26 18,2
G2 81 56,6
G3 36 25,2
Tumorgröße (pT) 143 pT1 57 39,9
pT2 59 41,3
pT3 5 3,5
pT4 22 15,4
Nodalstatus (pN) 140 pN0 81 56,6
pN1 32 22,4
pN2 18 12,6
pN3 9 6,3
ER 138 IRS < 2 36 25,2
IRS > 2 102 71,3
PR 138 IRS < 2 38 26,6
IRS > 2 100 69,9
HER-2-Status 136 0 34 23,8
1+ 58 40,6
2+ 22 15,4
3+ 22 15,4
Tab. 10: Übersicht über die histopathologischen Parameter des Studienkollektives.
Ergebnisse
36
3.3 Durchgeführte Therapien
3.3.1 Operative Therapie Bei 76 Patientinnen wurde eine BET, bei 65 Patientinnen eine Ablatio jeweils mit
Axilladissektion durchgeführt. Eine Patientin wurde nur abladiert. Bei 2
Patientinnen erfolgte wegen fortgeschrittenem Tumorleiden keine operative
Therapie, sondern nur eine Probeentnahme aus dem Tumorareal. Die derzeit bei
klinisch unauffälliger Axilla als Standard eingesetzte Wächterlymphknotentechnik
wurde im Untersuchungszeitraum nicht angewendet.
3.3.2 Radiatio im Zusammenhang mit operativer Therapie Bei 38 Patientinnen wurde keine Radiatio durchgeführt. Von diesen Patientinnen
sind 37 abladiert worden, eine dieser Patientinnen ist wegen progredientem
Tumorleiden nicht operiert worden. 106 Patientinnen wurden im Therapieverlauf
bestrahlt. Dazu zählten unter anderem alle brusterhaltend operierten Patientinnen
und 28 abladierte Patientinnen.
3.3.3 Endokrine Therapie Die Behandlung der Wahl im Untersuchungszeitraum bei positivem
Rezeptorstatus stellte Tamoxifen, ein selektiver Östrogenrezeptormodulator, dar,
welches 101 Patientinnen des Kollektivs erhielten. Die Standarddosis entspach
20mg/d für einen Zeitraum von 5 Jahren.
Fünf prämenopausalen Patientinnen wurde ein GnRH-Analogon in Kombination
mit Tamoxifen verabreicht, eine weitere prämenopausale Patientin bekam einen
Aromatasehemmer. 36 Patientinnen erhielten keine endokrine Therapie. Abb. 8
zeigt den Zusammenhang von endokriner Therapie mit dem
Östrogenrezeptorstatus. Gründe, warum bei negativem Rezeptorstatus eine
Therapie durchgeführt und z.T. bei positivem Rezeptorstatus keine Therapie
durchgeführt wurde, waren aus der Datenlage nicht ersichtlich. Es ist davon
auszugehen, dass angenommen wurde, dass auch rezeptornegative Patientinnen
von einer endokrinen Therapie profitieren würden.
Ergebnisse
37
5
82
20
22
14
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
keine Angabe zu ER-Status
ER-Status pos. / endokrine Therapie
ER-Status pos. / keine endokrine Therapie
ER-Status neg. / endokrine Therapie
ER-Status neg. / keine endokrine Therapie
Anzahl der Patientinnen (n)
Abb. 8: Die Abbildung zeigt den Zusammenhang von entsprechendem Hormonrezeptorstatus mit der endokrinen Therapie, die in diesem Zusammenhang nicht weiter aufgegliedert wurde (ER-Status =
Östrogenrezeptorstatus).
3.3.4 Chemotherapie 58 der Patientinnen erhielten im Verlauf eine zytostatische Therapie nach dem
therapeutischen Standard zum Zeitpunkt der Diagnosestellung (siehe Einleitung S.
6). Zwei Patientinnen wurden neoadjuvant behandelt, vier kombiniert neoadjuvant
und adjuvant. Die übrigen Patientinnen erhielten eine adjuvante Therapie. Zu den
verabreichten Therapieschemata siehe Abb. 9.
8 4
3 2
1 3
1 3
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0
k e ine C hem othe rap ie
C M F
E C
C M F , E C
Anzah l d er P a tien tinnen (n )
Abb.9: Dargestellt sind die angewendeten adjuvanten Chemotherapieschemata.
Ergebnisse
38
3.4 Immunhistochemische Färbungen der Parameter Die Auswertungen der immunhistochemischen Färbungen sollen im Folgenden
anhand repräsentativer Abbildungen gezeigt werden. Als Kontrolle dienten
Negativkontrollen und zur Verfahrensetablierung bei Rad51 ein bekanntes
Blasenkarzinom mit bekannter Rad51 Expression. Normalgewebe wurde nicht
gesondert ausgewertet, da es fraglich ist, ob tumornahes Normalgewebe
entsprechend repräsentativ ist.
3.4.1 Rad51 141 der 143 Tumorschnitte konnten in Bezug auf den Antikörper zum Nachweis
von Rad51 ausgewertet werden, zwei der gefärbten Präparate waren aufgrund der
Färbeartefakte nicht auswertbar. Repräsentative Abbildungen sind in den
nachfolgenden Abbildungen 10 und 11 dargestellt. Die positiv gefärbten Areale
zeigen sich als bräunliche Anfärbungen des Nukleus. Auffällig war bei der Färbung
mit Rad51 in einigen Tumoren eine zusätzlich zur nukleären Färbung noch
intensivere Färbung des Nukleolus. Weiterhin stellte sich auch in vielen
Präparaten eine Braunfärbung des Zytoplasmas, vor allem bei stärker
exprimierenden Tumoren, dar. Die Kernfärbung war von höherer Intensität als die
zytoplasmatische Färbung und stellte in Form des PCI-Index die Grundlage der
statistischen Auswertung für die 141 ausgewerteten Fälle. Es zeigen sich für
Rad51 folgendes Wertespektrum: Der Median der mit Rad51 gefärbten Tumore
lag bei 18,9% (Spannweite: 0,2% - 56,7%). Die Rad51 Expression im
Studienkollektiv ist Abb. 12 zu entnehmen. Für weitere statistische Berechnungen
wurde ein Schwellenwert von < 31% bestimmt. Die Auswahl dieses Wertes ist auf
die Cox-Regressionsanalyse kumulativer p-Werte des metastasen- und
rezidivfreien Überlebens möglicher Cutoff-Werte von 6% - 38% zurückzuführen
(siehe dazu Abb. 13). Diese Wahl des Schwellenwertes führte zu einer
Unterteilung innerhalb des Kollektivs zu 108 Tumoren niedriger Expression und zu
33 Tumoren hoher Expression.
Ergebnisse
39
Abb. 10: Repräsentativer Ausschnitt eines Tumorbereiches mit niedriger Rad51 Expression, nachgewiesen mittels Diaminobenzidin, Fotographie in 200-facher Vergrößerung, digitale
Bildgrößenanpassung.
Abb. 11: Repräsentativer Ausschnitt eines Tumorbereiches mit höherer Rad51 Expression, gefärbt mit Diaminobenzidin, Fotographie in 200-facher Vergrößerung, digitale Bildgrößenanpassung.
Ergebnisse
40
0
5
10
15
20
25
30
35
0-5
5-1
0
10-1
5
15-2
0
20-2
5
25-3
0
30-3
5
35-4
0
40-4
5
45-5
0
50-5
5
55-6
0
Rad51 (PCI in %)
Häufigkeit (n)
Abb. 12: Rad51 Expression im Studienkollektiv: Die Abbildung zeigt die Verteilung der Rad51-PCI-Werte bei 141 ausgewerteten Tumoren.
0 0,5 1 1,5 2
6.0
9.0
12.0
15.0
18.0
21.0
24.0
27.0
30.0
33.0
36.0
Cutoff des Rad51-Index
kumulativer p -W ert
Abb. 13: Graphische Darstellung zur Festlegung des Schwellenwertes von Rad51: Hellgrau ist der p-Wert des rezidivfreien Überlebens und dunkelgrau der p-Wert des metastasenfreien Überlebens
dargestellt.
Ergebnisse
41
3.4.2 Ki-67 Auswertbar in Bezug auf Ki-67 erwiesen sich 142 der 143 Präparate.
Repräsentative Abbildungen zeigen Abb. 14 und 15. Ki-67 wird in der Regel nur im
Zellkern angefärbt. Die Auszählung der positiv gefärbten Nuklei im Verhältnis zu
den insgesamt pro Tumorschnitt ausgewerteten Zellkernen ergab einen Median
von 16,8% (Spannweite: 0,7% bis 88,1%). Der klassifizierende Schwellenwert liegt
bei < 25%. Dieser ergibt sich aus der Cox-Regressionsanalyse verschiedener
möglicher Cutoff-Werte von 4,0% bis 46,0%. Für diesen Wert ergibt sich die
höchste statistische Signifikanz mit einem jeweils hochsignifikanten p-Wert (p =
0,0001) für das metastasen- und rezidivfreie Überleben (siehe auch Abb. 17). Das
Kollektiv unterteilt sich somit in 95 Fälle niedriger Ki-67 Expression und 47 Fälle
hoher Ki-67 Expression. Die weitere Aufschlüsselung der Ki-67 Expression im
Studienkollektiv ist Abb. 16 zu entnehmen.
Abb.14: Repräsentativer Ausschnitt eines Tumorbereiches, nachgewiesen mittels DAB wurde Ki-67 in niedriger Expression, Fotographie in 200-facher Vergrößerung, digitale Bildgrößenanpassung.
Ergebnisse
42
Abb. 15: Repräsentativer Ausschnitt eines Tumorbereiches, nachgewiesen mit DAB wurde ebenfalls Ki-67, in höherer Expression, Fotographie in 200-facher Vergrößerung, digitale Bildgrößenanpassung.
0
5
10
15
20
25
30
0-5
5-1
0
10
-15
15
-20
20
-25
25
-30
30
-35
35
-40
40
-45
45
-50
50
-55
55
-60
60
-65
65
-70
70
-75
75
-80
80
-85
85
-90
Ki-67 (PCI in %)
Häufigkeit (n)
Abb. 16: Ki-67 Expression im Studienkollektiv. Die Graphik zeigt die Verteilung der ausgewerteten Ki-67-PCI-Werte von 142 ausgewerteten Tumoren.
Ergebnisse
43
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
5.0
9.0
13.0
17.0
21.0
25.0
29.0
33.0
37.0
41.0
45.0
Cutoff des Ki-67 Index
kumulativer p-Wert
Abb. 17: Kumulative p-Werte der Cox-Regressionsanalyse zur Schwellenwertbestimmung bei Ki-67: Hellgrau sind die p-Werte des rezidivfreien und dunkelgrau die p-Werte des metastasenfreien
Überlebens dargestellt.
3.4.3 Uroplasminogenaktivator (uPA) Ausgewertet wurden 141 Tumorschnitte des Gesamtkollektivs, die zuvor
immunhistochemisch gefärbt wurden. Die Einteilung der Kategorien nach
Färbeintensität ist in Tabelle 7 repräsentativ dargestellt. Im Studienkollektiv zeigte
sich folgende Verteilung der Tumore: 2 mal Kategorie 0, 23 mal Kategorie I, 80
Tumore wurden in Kategorie II, und 36 in Kategorie III eingestuft.
3.4.4 Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1) Bei 140 Patientinnen konnte PAI-1 ausgewertet werden, die Zuordnung in vier
Kategorien basiert auf der immunhistochemischen Färbung. Bezeichnet wurden
diese Kategorien mit 0 – 3. Für die Tumore des Kollektivs zeigte sich folgende
Verteilung: 11 wurden in Kategorie 0 eingeordnet, 36 innerhalb Kategorie I
eingestuft, 65 Tumore zu Kategorie II und 28 der Kategorie III zugeordnet. Die
genaue Definition der einzelnen Kategorien ist ebenfalls Tab. 7 zu entnehmen, in
der entsprechend repräsentative Abbildungen dargestellt sind.
Ergebnisse
44
3.5 Rezidiv- und metastasenfreies Überleben Die zuvor beschriebenen Parameter wurden statistisch in Bezug auf das
rezidivfreie und metastasenfreie Überleben analysiert. Die Darstellung erfolgt mit
Kaplan-Meier-Kurven, basierend auf dem log-rank-Test zur Überprüfung der
statistischen Signifikanz der Vergleichsgruppen. Cox-Regressionsanalysen,
sowohl uni- als auch multivariat wurden ebenfalls durchgeführt. Beschreibend
dienen in diesem Zusammenhang folgende Parameter: das relative Risiko (RR),
das 95%-Konfidenzintervall (95% KI) und der p-Wert. Das Signifikanzniveau
wurde mit p < 0,05 festgelegt. Da in der Literatur eine prognostische
Aussagefähigkeit für uPA und PAI-1 für die nodalnegativen Fälle beschrieben wird
[Jänicke et al., 2001], wurde dieses explizit mit den der anderen Analysen
entsprechenden Tests für uPA, PAI-1 und auch für die übrigen Parameter
untersucht. Abschließend erfolgte für die vier Parameter Rad51, Ki-67, uPA und
PAI-1 zum direkten Vergleich die Analyse mittels Chi-Quadrattest nach Pearson.
3.5.1 Rezidivfreies Überleben im Gesamtkollektiv Bei dieser Analyse wurden folgende Parameter univariat in Bezug auf das
rezidivfreie Überleben ausgewertet: Alter, histologischer Tumortyp,
Primärtumorgröße (pT-Status), Nodalstatus (pN-Status), Grading,
Östrogenrezeptorstatus (ER-Status), Progesteronrezeptorstatus (PR-Status),
HER-2-Status, Rad51 Index, Ki-67 Index, PAI-1- und uPA-Status. Bei acht der
zwölf betrachteten Parameter zeigt sich eine statistische Signifikanz, bei den vier
weiteren Parametern keine Korrelation mit dem rezidivfreien Überleben.
Hochsignifikant mit einem p-Wert < 0,0001 im log-rank-Test ist der Ki-67 Index,
der Her-2-, der Progesteron- und der Östrogenrezeptorstatus. Die
Primärtumorgröße (p=0,01), der Nodalstatus (p=0,023), das histologische Grading
(p=0,003) sowie Rad51 (p= 0,028) zeigen eine signifikante Korrelation mit dem
rezidivfreien Überleben. Keine Signifikanz stellt sich beim Alter, beim uPA-Status,
beim PAI-1-Status und beim histologischen Tumortyp heraus. Die obig im Text
erwähnten p-Werte entstammen dem log-rank-Test. Die übrigen p-Werte des log-
rank-Testes und die entsprechenden Werte der Cox-Regression sind Tabelle 11
zu entnehmen.
Ergebnisse
45
Parameter Fallzahl p1-Wert P2-Wert RR 95% KI
Histologischer Typ 19;124 0,293 0,303 1,855 0,572-6,019
PAI-1-Status 11;36;66;27 0,287 0,379 1,191 0,807-1,758
Alter 71;72 0,221 0,226 0,677 0,359-1,274
uPA-Status 2;23;80;36 0,165 0,495 0,854 0,543-1,343
Rad51 Index 108;33 0,024 0,028 2,107 1,084-4,094
pN-Status 81;32;18;9 0,023 0,012 1,495 1,092-2,046
pT-Status 57;59;27 0,01 0,006 1,789 1,182-2,708
Grading 26;81;36 0,003 0,003 2,116 1,300-3,443
HER-2-Status 114;22 0,0001 0,001 3,438 1,687-7,008
PR-Status 38:100 0,0001 0,0001 0,227 0,119-0,435
ER-Status 36;102 0,0001 0,0001 0,243 0,127-0,467
Ki-67 Index 95;47 0,0001 0,0001 5,69 2,973-10,889
Tab. 11: Statistische Analyse (univariat) der betrachteten Parameter, sortiert nach dem p1-Wert, bezogen auf das rezidivfreie Überleben (p1=p-Wert des log-rank-Tests, p2=p-Wert des Cox-
Regressions-Tests, RR= relatives Risiko des Cox-Regressionstest, 95% KI= 95%-Konfidenzintervall der Cox Regression).
Ergebnisse
47
Abb. 18: Dargestellt sind die Kaplan-Meier-Kurven der sich als signifikant abzeichnenden Parameter beim rezidivfreien Überleben. Es handelt sich dabei um die Primärtumorgröße (A), den Nodalstatus
(B), das Grading (C), den Her-2- (D), den Östrogen- (E) und den Progesteronrezeptorstatus (F), Rad51 Index (G) und Ki-67 Index (H). Zusätzlich gezeigt ist der jeweilige p-Wert des log-rank-Testes.
Ergebnisse
48
Die multivariate Analyse bestimmt die unabhängigen Parameter unter den
signifikant abhängigen Parametern der univariaten Analyse. Das Ergebnis der
multivariaten Cox-Regressionsanalyse stellte drei unabhängige Parameter in
Bezug auf das rezidivfreie Überleben heraus: den Ki-67 Index (p=0,0001), den
Progesteronrezeptorstatus (p=0,001) und die Primärtumorgröße (p=0,031). Rad51
stellte sich nicht als unabhängiger Parameter dar. Die Analyseergebnisse sind in
der nachfolgenden Tabelle 12 dargestellt.
Parameter p-Wert Multivariat-Analyse
(univariat) p RR 95% KI
Rad51 Index 0,028 0,859 0,927 0,401-2,140
pN-Status 0,012 0,781 0,944 0,627-1,420
Grading 0,003 0,676 0,873 0,463-1,649
Östrogen-Status 0,0001 0,347 0,638 0,251-1,627
HER-2-Status 0,001 0,112 1,842 0,849-3,999
pT-Status 0,006 0,031 1,737 1,051-2,870
Progesteron-Status 0,0001 0,001 0,305 0,149-0,623
Ki-67 Index 0,0001 0,0001 4,677 2,233-9,798
Tab. 12: Statistische Analyse (multivariat) der betrachteten Parameter bezogen auf das rezidivfreie Überleben, gezeigt sind die p-Werte der uni-und multivariaten Cox-Regression sowie das relative
Risiko (RR) und das 95%-Konfidenzintervall (95% KI) der multivariaten Analyse. Die Parameter sind nach der Signifikanz des p-Wertes der multivariaten Analyse sortiert.
Ergebnisse
49
3.5.2 Metastasenfreies Überleben im Gesamtkollektiv Die zur Analyse herangezogenen Parameter entsprechen der univariaten Analyse
im Rahmen des rezidivfreien Überlebens (siehe 3.5.1). Beim metastasenfreien
Überleben zeigen ebenfalls acht der zwölf Parameter eine Signifikanz. Vier
Parameter stellen sich als hochsignifikant (log-rank-Test, p=0,0001) heraus: der
Ki-67 Index, die Primärtumorgröße, der Nodalstatus und der
Progesteronrezeptorstatus. Die weiteren signifikanten Parameter sind folgende:
Rad51 (p=0,033), histologisches Grading (p=0,031), HER-2- (p= 0,008) und der
Östrogenrezeptorstatus (p=0,001). Keine Signifikanz zeigen der uPA-Status, der
PAI-1-Status, der histologische Tumortyp und das Alter mit dem metastasenfreien
Überleben des Gesamtkollektivs. Die weiteren p-Werte des log-rank-Testes und
die Werte der Cox-Regressions-Analyse sind der nachfolgenden Tabelle 13 zu
entnehmen.
Parameter Fallzahl p1-Wert P2-Wert RR 95% KI
uPA-Status 2;23;80;36 0,903 0,723 0,933 0,635-1,371
Alter 71;72 0,433 0,436 0,815 0,487-1,364
histologischer Typ 19;124 0,427 0,431 0,76 0,384-1,505
PAI-1-Status 11;36;66;27 0,424 0,223 0,828 0,611-1,221
Rad51 Index 108;33 0,033 0,037 1,806 1,036-3,148
Grading 26;81;36 0,031 0,009 1,674 1,135-2,470
HER-2-Status 114;22 0,008 0,01 2,345 1,227-4,480
ER-Status 36;102 0,001 0,002 0,416 0,240-0,721
PR-Status 38:100 0,0001 0,001 0,388 0,223-0,676
pN-Status 81;32;18;9 0,0001 0,0001 1,904 1,471-2,464
pT-Status 57;59;27 0,0001 0,0001 2,337 1,639-3,331
Ki-67 Index 95;47 0,0001 0,0001 2,665 1,569-4,527
Tab. 13: Statistische Analyse (univariat) der betrachteten Parameter bezogen auf das metastasenfreie Überleben (p1=p-Wert des log-rank-Tests, p2=p-Wert der Cox-Regressions-Analyse, RR= relatives Risiko und 95%-KI= 95%-Konfidenzintervall, jeweils der Cox-Regressions-Analyse). Die Parameter
sind nach der statistischen Signifikanz der p-Werte geordnet.
Ergebnisse
51
Abb. 19: Dargestellt sind die Kaplan-Meier-Kurven der sich als signifikant abzeichnenden Parameter in Bezug auf das metastasenfreie Überleben. Es handelt sich dabei um die Primärtumorgröße (A), den
Nodalstatus (B), das Grading (C), den HER-2- (D), den Östrogen- (E) und den Progesteronrezeptorstatus (F), Rad51 Index(G) und Ki-67 Index(H). Zusätzlich ist der jeweilige p-
Wert des log-rank-Testes gezeigt.
In der multivariaten Analyse der acht univariat signifikanten Parameter wurden drei
unabhängige Variablen ermittelt. Es handelt sich dabei um den
Östrogenrezeptorstatus (p=0,0001), den Nodalstatus (p=0,004) und den
Primärtumorstatus (p=0,044). Rad51 zeigt sich auch für das metastasenfreie
Überleben nicht als unabhängiger Parameter. Weitere Analyseergebnisse sind der
nachfolgenden Tabelle 14 zu entnehmen.
Parameter p-Wert Multivariat-Analyse
(univariat) p RR 95% KI
Grading 0,009 0,787 0,927 0,536-1,603
Rad51 Index 0,037 0,594 0,811 0,376-1,751
HER-2-Status 0,01 0,471 1,345 0,601-3,014
Progesteron-Status 0,001 0,381 0,693 0,305-1,575
Ki-67 Index 0,0001 0,173 1,6 0,814-3,146
pT-Status 0,0001 0,044 1,527 1,011-2,305
pN-Status 0,0001 0,004 1,587 1,160-2,170
Östrogen-Status 0,002 0,0001 0,361 0,2-0,652
Tab. 14: Statistische Analyse (multivariat) der betrachteten Parameter bezogen auf das metastasenfreie Überleben, gezeigt sind die p-Werte der uni-und multivariaten Cox-Regression sowie
das relative Risiko (RR) und das 95%-Konfidenzintervall (95% KI) der multivariaten Analyse.
Ergebnisse
52
3.5.3 Subgruppenanalyse der nodalnegativen Patientinnen Durchgeführt wurde die univariate Analyse mit denselben Parametern (außer des
Nodalstatus) wie die univariate Analyse des Gesamtkollektivs (siehe 3.5.1). Vier
Parameter erweisen sich in diesem Zusammenhang als statistisch signifikant (log-
rank-Test): der Ki-67 Index (p=0,0001), der uPA-Status (p=0,0001), der
Östrogenrezeptorstatus (p=0,012) und der Progesteronrezeptorstatus (p=0,007).
In der Cox-Regressionsanalyse lässt sich die Signifikanz für uPA nicht
nachweisen (p-Wert = 0,078). Für PAI-1 konnte keine Signifikanz nachgewiesen
werden.
Die entsprechenden Ergebnisse der Cox-Regressionsanalyse finden sich in der
nachfolgenden Tabelle 15.
Parameter Fallzahl p1-Wert p2-Wert RR 95% KI
PAI-1-Status 6;20;36;16 0,518 0,189 1,511 0,816-2,798
HER-2-Status 68;10 0,304 0,314 1,908 0,542-6,711
Grading 18;46;17 0,296 0,146 1,673 0,836-3,349
pT-Status 45;31;5 0,259 0,217 1,558 0,770-3,152
Alter 37;44 0,191 0,201 0,522 0,193-1,413
Rad51 Index 68;11 0,176 0,188 2,126 0,692-6,526
histologischer Typ 10;71 0,089 0,281 26,027 0,069-9774,61
ER-Status 19;61 0,012 0,017 0,308 0,0116-0,813
PR-Status 14;66 0,007 0,012 0,279 0,103-0,757
uPA-Status 1;12;46;21 0,0001 0,078 0,529 0,26-1,075
Ki-67 Index 61;20 0,0001 0,0001 6,891 2,540-18,697
Tab. 15: Statistische Analyse (univariat) der betrachteten Parameter bezogen auf das rezidivfreie Überleben der nodalnegativen Patientinnen (p1=p-Wert des log-rank-Tests, p2=p-Wert der Cox-
Regressions-Analyse, RR= relatives Risiko und 95%-KI= 95%-Konfidenzintervall (jeweils der Cox-Regressions-Analyse). Die Parameter sind nach dem p1-Wert sortiert.
Die Analyse des metastasenfreien Überlebens wurde ebenfalls mit denselben
Parametern wie die univariate Analyse des Gesamtkollektivs durchgeführt (außer
des Nodalstatus). Es zeigte sich bei drei Parametern eine statistische Signifikanz:
der Ki-67 Index (p=0,0001), die Primärtumorgröße (p=0,0046) und das
histologische Grading (p=0,0165). Bei den zuvor genannten p-Werten handelt es
sich um die Werte des log-rank-Tests. Die weiteren Werte des log-rank-Testes
und die Werte der Cox-Regressionsanalyse sind in Tabelle 16 dargestellt. Die
Ergebnisse
53
Parameter uPA und PAI-1 zeigen in diesem Zusammenhang keine statistische
Relevanz.
Parameter Fallzahl p1-Wert p2-Wert RR 95% KI
Alter 37;44 0,974 0,975 0,986 0,427-2,280
histologischer Typ 10;71 0,822 0,822 1,153 0,334-3,977
HER-2-Status 68;10 0,727 0,728 0,772 0,179-3,320
uPA-Status 1;12;46;21 0,712 0,291 0,714 0,382-1,335
Rad51 Index 68;11 0,467 0,471 1,491 0,503-4,418
PR-Status 14;66 0,35 0,356 0,597 0,199-1,787
PAI-1-Status 6;20;36;16 0,242 0,1 0,677 0,426-1,078
Grading 18;46;17 0,239 0,11 1,631 0,896-2,970
pT-Status 45;31;5 0,014 0,015 2,136 1,162-3,927
ER-Status 19;61 0,013 0,018 0,35 0,147-0,834
Ki-67 Index 61;20 0,001 0,002 4,133 1,688-10,115
Tab. 16: Statistische Analyse (univariat) der betrachteten Parameter, sortiert nach der Signifikanz, bezogen auf das metastasenfreie Überleben der nodalnegativen Patientinnen (p1=p-Wert des log-rank
Tests, p2=p-Wert der Cox-Regressions-Analyse, RR= relatives Risiko und 95%-KI= 95%-Konfidenzintervall, jeweils der Cox-Regressions-Analyse).
Bei der multivariaten Analyse der Subgruppe der nodalnegativen Patientinnen, in
die die signifikanten Parameter der univariaten Analyse einbezogen wurden,
zeigen sich der Ki-67 Index und der Östrogenrezeptorstatus für das rezidiv- und
metastasenfreie Überleben unabhängig (rezidivfreies Überleben: Ki-67
(p=0,0001), Östrogenrezeptorstatus (p=0,034); metastasenfreies Überleben: Ki-67
(p=0,005), Östrogenrezeptorstatus (p=0,017)). Die weiteren Ergebnisse der
multivariaten Analyse sind der nachfolgenden Tabelle 17 zu entnehmen.
Ergebnisse
54
Parameter rezidivfreies Überleben metastasenfreies Überleben
p-Wert Multivariat-Analyse p-Wert Multivariat-Analyse
(univariat) p RR 95% KI (univariat) p RR 95% KI
uPA-Status 0,078 0,16 0,569 0,259-
1,250 0,291 * * *
PR-Status 0,012 0,448 0,611 0,171-
2,184 0,356 * * *
pT-Status 0,217 * * * 0,015 0,228 1,562 0,757-
3,226
ER-Status 0,017 0,034 0,346 0,130-
0,921 0,018 0,017 0,345
0,144-
0,827
Ki-67 Index 0,0001 0,0001 6,471 2,376-
17,622 0,002 0,005 3,84
1,497-
Tab. 17: Statistische Analyse (multivariat) der betrachteten Parameter bezogen auf das rezidiv- und metastasenfreie Überleben der nur nodalnegativen Patientinnen, gezeigt sind die p-Werte der uni- und multivariaten Cox-Regression sowie das relative Risiko (RR) und das 95%-Konfidenzintervall (95%
KI) der jeweils multivariaten Analyse [* in diesen Fällen wurden die Parameter wegen der univariaten Ergebnisse (p-Wert > 0,2) von der multivariaten Analyse ausgeschlossen].
3.5.4 Chi-Quadrattest nach Pearson für die Parameter Rad51, Ki-67, uPA und PAI-1 Unabhängig vom metastasen- und rezidivfreien Überleben wurden die einzelnen
Parameter mit dem Chi-Quadrattest nach Pearson miteinander in Beziehung
gesetzt. Durchgeführt wurde diese Analyse mit allen vier gefärbten Parametern
dieser Arbeit.
3.5.4.1 Rad51 Rad51 zeigt mit fünf Parametern eine Signifikanz, hoch signifikant stellt sich ein
Zusammenhang mit Ki-67 (p=0,0001) heraus.
Eine weitere Korrelationen stellt sich mit dem Alter der Tumorpatientinnen dar:
Ältere Patientinnen exprimieren Rad51 weniger als jüngere Patientinnen
(p=0,011). Beim Progesteronrezeptorstatus zeigt sich bei hoher
Progesteronexpression häufiger eine niedrige Rad51 Expression (p=0,006). Mit
zunehmendem Nodalstatus nimmt der prozentuale Anteil der Tumore hoher
Rad51 Expression zu (p=0,027). Der prozentuale Anteil der Rad51
exprimierenden Tumoren innerhalb einer Grading-Subklasse ist umso geringer, je
Ergebnisse
55
differenzierter die der Gruppe zugeordneten Tumore sind (p=0,033). Die
nachfolgende Tabelle 18 zeigt zusätzlich zu den signifikanten Ergebnissen auch
solche, die sich als nicht signifikant herausgestellt haben.
Parameter Gesamtgruppe
(n)
niedriger Rad51 Index
(Angaben in %)
hoher Rad51 Index (Angaben in %)
statistische Signifikanz
PAI-1 0,627 Index=0 11 81,8 18,2 Index=1 35 82,9 17,1 Index=2 65 73,8 26,2 Index=3 27 70,4 29,6
uPA 0,559 Index=0 2 100 0 Index=1 23 73,9 26,1 Index=2 78 79,5 20,5 Index=3 36 69,4 30,6
Typ 0,47 lobulär 18 83,3 16,7 duktal 123 75,6 24,4
pT-Status 0,278 PT1a-pT1c 55 83,6 16,4
pT2 59 72,9 27,1 pT3 & pT4 27 70,4 29,6
HER-2-Status 0,133 0,1,2 112 78,6 21,4
3 22 63,6 36,4 ER-Status 0,115
niedrig 36 69,4 30,6 hoch 100 82 18
Grading 0,033 G1 26 92,3 7,7 G2 79 77,2 22,8 G3 36 63,9 36,1
pN-Status 0,027 0 79 86,1 13,9 1 32 71,9 28,1 2 18 61,1 38,9 3 9 55,6 44,4
Alter 0,011 < 63 71 67,6 32,4 > 63 70 85,7 14,3
PR-Status 0,006 niedrig 38 63,2 36,8 hoch 98 84,7 15,3
Ki-67 0,0001 < 25% 93 86 14 >25% 47 57,4 42,6
Tab. 18: Chi-Quadrattest nach Pearson: Rad51 im Zusammenhang mit den das Kollektiv beschreibenden Parametern und den anderen untersuchten Parametern.
Ergebnisse
56
3.5.4.2 Ki-67 Bei der Betrachtung von Ki-67 stellt sich mit sechs Parametern eine statistisch
signifikante Korrelation dar, bei fünf ist diese hochsignifikant: Rad51, Östrogen-,
Progesteron-, Her-2-Rezeptorstatus und das histologische Grading. Der
Zusammenhang zwischen Rad51 und Ki-67 ist bereits im vorigen Absatz
beschrieben (siehe 3.5.4.1). Je höher die Ki-67 Expression, desto höher ist die
Rad51 Expression, desto undifferenzierter ist das Grading, umso wahrscheinlicher
ist ein niedriger Progesteron- oder Östrogenrezeptorstatus und ein höherer HER-2
-Rezeptorstatus. Die zunehmende Primärtumorgröße zeichnet sich mit
zunehmender Ki-67 Expression als signifikant ab (p=0,015), der Nodalstatus zeigt
einen Trend, dass der prozentuale Anteil von hoher Ki-67 Expression bei
Patientinnen größer ist, die einen ausgeprägten Lymphknotentumorbefall
vorweisen (p=0,06). Die anderen untersuchten Parameter, uPA, PAI-1, der
histologische Tumortyp und das Alter der Patientinnen zeigen keine signifikante
Korrelation. Weitere Angaben sind der Tabelle 19 zu entnehmen.
Ergebnisse
57
Parameter Gesamtgruppe
(n)
niedriger Ki-67 Index
(Angabe in %)
hoher Ki-67 Index (Angabe in %)
statistische Signifikanz
uPA 0,86 Index=0 2 50 50 Index=1 23 60,9 39,1 Index=2 80 68,8 31,3 Index=3 36 66,7 33,3
Alter 0,858 < 63 71 66,2 33,8 > 63 71 67,6 32,4
Typ 0,294 lobulär 18 77,8 22,2 duktal 124 65,3 34,7
PAI-1 0,105 Index=0 11 90,9 9,1 Index=1 36 72,2 27,8 Index=2 65 67,7 32,3 Index=3 27 51,9 48,1
pN-Status 0,06 0 81 75,3 24,7 1 32 53,1 46,9 2 17 64,7 35,3 3 9 44,4 55,6
pT-Status 0,015 pT1a-pT1c 57 80,7 19,3
pT2 59 55,9 44,1 pT3 & pT4 26 61,5 38,5
Grading 0,0001 G1 26 100 0 G2 81 72,8 27,2
G3 35 28,6 71,4 HER-2-Status 0,0001
0,1,2 113 74,3 25,7 3 22 31,8 68,2
PR-Status 0,0001 niedrig 38 36,8 63,2 hoch 99 80,8 19,2
ER-Status 0,0001 niedrig 36 41,7 58,3 hoch 101 78,2 21,8
Rad51 0,0001 < 31% 107 74,8 25,2 > 31% 33 39,4 60,6
Tab. 19: Chi-Quadrattest nach Pearson: Ki-67 im Zusammenhang mit den das Kollektiv beschreibenden Parametern und den anderen untersuchten Parametern.
Ergebnisse
58
3.5.4.3 uPA und PAI-1 Die Untersuchung mit uPA und PAI-1 im Chi-Quadrattest nach Pearson zeigt eine
signifikante Korrelation zwischen uPA und PAI-1 (p=0,006). Es zeigt sich, dass bei
einem Tumor die Wahrscheinlichkeit größer ist, bei hoher uPA Expression
ebenfalls eine hohe PAI-1 Expression vorzuweisen. Alle weiteren Parameter
erweisen mit diesen beiden Parametern keine signifikante Korrelation und sind
daher nicht weiter dargelegt. Tabelle 20 zeigt die Expression von PAI-1 und uPA.
uPA
0 (2) 1 (22) 2 (79) 3 (35)
PAI-1
0 (11) 9,1% 18,2% 63,6% 9,1%
1 (36) 0% 22,2% 63,9% 13,9%
2 (64) 1,6% 14,1% 62,5% 21,9%
3 (27) 0% 11,1% 33,3% 55,6%
Tab. 20: Kreuztabelle von uPA mit PAI-1. Bei den Angaben in Klammern handelt es sich um die jeweilige Fallzahl n.
Ergebnisse
59
3.6 Die Therapien der einzelnen Untergruppen für Rad51 und Ki-67 Wenn in einem Kollektiv Untergruppen gebildet werden, ist es wichtig zu wissen,
ob sich diese Untergruppen in der verabreichten Therapie unterscheiden.
Wünschenswert wäre eine Gleichbehandlung der Kollektivuntergruppen, um die
gleiche Basis für die statistische Analyse zu gewährleisten. Für die sich als
signifikant herausgestellten Färbungen Rad51 und Ki-67 wird dieses entsprechend
überprüft. In den Tabellen 21 und 22 ist der prozentuale Anteil der in den
Untergruppen verabreichten Therapieformen dargestellt. Ebenfalls aufgeführt ist
das Gesamtkollektiv.
Therapiemöglichkeit Fallzahl (n) Rad51 (< 31%) Rad51 (>31%) Gesamtkollektiv
(Angabe in %) (n) (%)
Chemotherapie keine 82 82,9 17,1 84 58,7
erhalten 58 67,2 32,8 58 40,6
Radiatio keine 36 75 25 37 25,9
erhalten 105 77,1 22,9 106 74,1
Endokrine
Therapie
keine 36 63,9 36,1 36 25,2
erhalten 105 81 19 107 74,8
Tab. 21: Prozentualer Anteil der verabreichten Therapieformen in den Rad51 Subklassen und im Gesamtkollektiv.
Therapiemöglichkeit Fallzahl (n) Ki-67 (< 25%) Ki-67(> 25%) Gesamtkollektiv
(Angabe in %) (n) (%)
Chemotherapie keine 84 70,2 29,8 84 58,7
erhalten 57 61,4 38,6 58 40,6
Radiatio keine 36 61,1 38,9 37 25,9
erhalten 106 68,9 31,1 106 74,1
Endokrine
Therapie
keine 35 65,7 34,3 36 25,2
erhalten 107 67,3 32,7 107 74,8
Tab. 22: Prozentualer Anteil der verabreichten Therapieformen in den Ki-67-Subklassen und im Gesamtkollektiv.
Diskussion
60
4. Diskussion
In dieser Studie wurden erstmals gemeinsam die Expression des
Rekombinationsfaktors Rad51, des Proliferationsmarkers Ki-67 und die
Expression des Uroplasminogenaktivatorsystems mit dem
Uroplasminogenaktivator uPA und dem Inhibitor PAI-1 im Mammakarzinom in
Bezug auf ihre prognostische Aussagefähigkeit untersucht. Es wurde ein
Verfahren verwendet, das von vornherein eine Umsetzbarkeit für die Routine
gewährleisten und bei der Beurteilung eine möglichst große diagnostische
Sicherheit geben sollte - die Immunhistochemie.
4.1 Patientinnenkollektiv
4.1.1 Das Alter der Patientinnen Der Altersmedian liegt in unserem Kollektiv bei 63 Jahren und entspricht somit
dem in der Literatur angegebenen mit einem Altersgipfel von 50-70 Jahren
[Schmidt-Matthiesen et al., 2002]. Im Tumorregister München findet sich für das
mittlere Erkrankungsalter mit 61,4 Jahren ein vergleichbarer Wert [Sauer, 2005].
4.1.2 Histologischer Typ Histologisch sind 86,7% der invasiven Karzinome dieser Studie duktal und 13,3%
lobulär. Literaturquellen beziffern den invasiv duktalen Typ mit 40-75% und den
invasiv lobulären Tumortyp mit 5-15% [Sauer 2005]. Das untersuchte Kollektiv ist
somit repräsentativ, der höhere Anteil des duktalen Anteils erklärt sich durch das
Nichtbetrachten weiterer histologischer Entitäten im Rahmen dieser Studie. In
anderen Untersuchungen werden differente histologische Formen in bis zu 17%
beobachtet [Minisini et al., 2007; Offersen et al., 2007].
4.1.3 Primärtumorgröße Die Primärtumorgröße unterteilt sich nach der TNM-Klassifikation
folgendermaßen: 39,9% entsprechen einer Primärtumorgröße pT1, 41,3% einem
pT2-Status, 3,5% einer pT3-Größe und weitere 15,4% sind pT4-Karzinome. Die
hohe Anzahl der primären T4-Tumore ist wahrscheinlich einerseits auf späte
Diskussion
61
Diagnosestellungen bei einem eher ländlichen Patientinnenkollektiv und
andererseits auf einen potentiellen Bias in der Patientenauswahl zurückzuführen.
Da nur Patientinnen aufgenommen wurden, bei denen ein Follow-up vorlag,
welches häufiger bei Patientinnnen größerer Tumorstadien der Fall ist, werden
dadurch mehr Patientinnen der fortgeschrittenen Tumorgrößen erfasst, da diese
sich im Verlauf in der Regel häufiger in der Klinik vorstellen. Dieses muss
entsprechend kritisch betrachtet werden, da sich dadurch im Kollektiv ein Bias
ergibt. Verglichen mit der Feldstudienkohorte (n=3210) des Münchener
Tumorregisters [Sauer, 2005] unterscheidet sich das vorliegende Kollektiv im
prozentualen Anteil der größeren Primärtumore auf Kosten der kleineren T1-
Tumore (Tumorregister München: T1 51,3%; T2 33,4%; T3 4,9%; T4 5,0%). Eine
Auswertung amerikanischer Tumordaten der Jahre 1988-2003 zeigt einen noch
größeren Anteil von kleineren Tumoren (T1-Tumore: 64,8%, T2-Status: 30,9% und
T3/T4-Tumore: 4,3%) [Mc Bride et al., 2007].
4.1.4 Nodalstatus Der Anteil der nodalnegativen Patientinnen (n=140) beträgt im vorliegenden
Kollektiv 56,6 %. Dieser prozentuale Anteil entspricht trotz des hohen Anteils an
initialen T4-Tumoren den Angaben der Literatur (Tab. 23). Den Erwartungen hätte
ein im Vergleich höherer Anteil an nodalpositiven Patientinnen entsprochen.
Verglichen mit der Feldstudienkohorte aus München von 1996-98 trifft dieses auch
zu. Von anderen Untersuchungsergebnissen abweichend stellt sich in der Analyse
des rezidivfreien Überlebens heraus, dass Patientinnen mit Nodalstatus N2 ein
besseres Überleben haben als Patientinnen, die in die Subklasse N1 eingeteilt
sind. Entsprechend vorheriger Analysen zeigt sich für das metastasenfreie
Überleben ein längeres Überleben, umso weniger Lymphknoten befallen sind.
Studie nodalnegative Patientinnen
Zeitraum n Land
eigenes Kollektiv 56,6% 1992-1998 143 Deutschland Jansen et al., 1998 53,7% 1982-1987 341 Maastricht, Niederlande Mc Bride et al., 2007 66,5% 1988-2003 256174 USA Look et al., 2002 56% 1978-1995 8377 Europa Harbeck et al., 2002 51% 1987-1999 3424 Europa Sauer 2005 63,4% 1996-1998 3210 Deutschland Offersen et al., 2007 48% 1990-1994 438 Dänemark Göhring et al., 1996 46% 1983-1989 296 Deutschland
Tab. 23: Anteil nodalnegativer Patientinnen im Vergleich mit weiteren Studien zum Mammakarzinom (n=Fallzahl).
Diskussion
62
4.1.5 Histologisches Grading Das histologische Grading unserer Studie zeigt eine Verteilung von 18% G1-, 57%
G2- und 25% G3-Tumore. Dies ist repräsentativ, allerdings findet sich in anderen
Studien ein etwas höherer Anteil an Tumoren mit einer schlechteren
Differenzierung. Interessant wäre in diesem Zusammenhang aufgrund der Größe
der Fallzahl die Unterteilung der Differenzierung G1 und G2 bei Mc Bride et al., die
jedoch nicht vorgenommen wurde. Der Differenzierungsgrad von
Vergleichskollektiven ist Tabelle 24 zu entnehmen.
Studie G1 G2 G3 n Gesamtkollektiv Land eigenes Kollektiv 18% 57% 25% 143 143 Deutschland Göhring et al., 1996 15% 54% 30% 311 311 Deutschland Gonzalez et al., 1999 21% 42% 37% 127 127 Spanien Look et al., 2002* 7% 27% 33% 5606 8377 Europa Engel et al., 2003 7% 56% 37% 12432 12432 Deutschland Offersen et al., 2007 19% 34% 31% 370 438 Dänemark Mc Bride et al., 2007 51,5% 33,1% 216637 256174 USA
Tab. 24: Histologisches Grading in verschiedenen Mammakarzinomkollektiven (n = Studienumfang/Fallzahl, * = In dieser Metaanalyse war das Grading bei einem Drittel der Patienten
unbekannt.).
4.1.6 Hormonrezeptorstatus Die Hormonrezeptoren zeigen für dieses Kollektiv folgende Verteilung: 71,3% der
Tumore sind östrogenrezeptorpositiv und 69,9% haben einen positiven
Progesteronrezeptorstatus. Wertet man den Hormonrezeptorstatus gesamt als
positiv, sobald einer der beiden Rezeptoren positiv ist, dann sind in diesem
Kollektiv 81,9% der Tumore positiv. Diese Werte sind vergleichbar mit Angaben
anderer Studien (siehe Tab. 25). Der vergleichsweise niedrige Wert bei Mc Bride
et al. von 64% ist möglicherweise dadurch erklärbar, dass in diesem Kollektiv bei
20% der Rezeptorstatus unbekannt war.
Studie PR + ER + ER oder PR +
n Gesamtkollektiv Land
eigenes Kollektiv 69,9% 71,3% 81,9% 138 143 Deutschland Friedrichs et al., 1993 60% 69% 156 156 Deutschland Göhring et al., 1996 69% 301 311 Deutschland Gonzalez et al., 1999 53,5% 69,3% 127 127 Spanien Look et al., 2002 80% 8377 8377 Europa Yousef et al., 2002 51,7% 60% 170*/169** 178 Italien Mc Bride et al., 2007 64,3% 204853 256174 USA Offersen et al., 2007 71,9% 438 438 Dänemark
Tab. 25: Prozentualer Anteil hormonrezeptorpositiver Tumore (n= Studienumfang/Fallzahl, *bezieht sich auf den Progesteronrezeptorstatus, **bezieht sich auf den Östrogenrezeptorstatus).
Diskussion
63
4.1.7 Tumorprogredienz Bei einer medianen Nachbeobachtungszeit von 62 Monaten (Spannweite 4 - 120
Monate) erlitten 28% der Patientinnen unseres Kollektivs ein Lokalrezidiv. Dies ist
zunächst weniger als in der Literatur angegeben, allerdings muss angemerkt
werden, dass diese Erhebungen im Median auch eine längere
Nachbeobachtungszeit haben, was diesen Unterschied erklärt. Die
Metastasierungsereignisse scheinen in dieser Studie mit 41% recht hoch. Offersen
et al. zeigen über einen fast doppelt so langen Nachbeobachtungszeitraum fast
die gleiche prozentuale Rate an Metastasierungen und weniger Rezidive. Da
Yousef et al. nicht zwischen Metastase und Rezidiv differenzieren, bleibt die
Frage, inwiefern, man diese Studie zum Vergleich heranziehen kann. Es bleibt
jedoch zu bedenken, dass es sich um zwei Studien relativ kleiner Fallzahlen
handelt (siehe Tab. 26). Potentielle Erklärungsmöglichkeit für den hohen Anteil an
Metastasierungsereignissen ist der bereits bei Diagnosestellung hohe Anteil
großer Tumore (pT4-Tumore: 15,4%), welcher gegebenenfalls durch den bereits
oben erwähnten Bias beim Patienteneinschluss bedingt ist (siehe dazu auch
4.1.3).
Viele Autoren betrachten den Todesfall als wesentliches Ereignis zur
Beschreibung eines Patientenkollektivs. Im Rahmen dieser Studie lagen dazu
jedoch nicht hinreichend Daten vor.
Studie medianes Follow-up [in Monaten]
Metastasierungs-ereignis [in %]
Rezidivereignis [in %]
n Land
eigenes Kollektiv 62 (4-120) 41 % 28% 143 Deutschland Göhring et al., 1996 62 34% 301 Deutschland Look et al., 2002 79 (46-120*) 35% 8377 Europa Offersen et al., 2007 123 (0-174) 39% 8% 438 Dänemark Yousef et al., 2002 76 36%’’ 164 Italien Harbeck et al., 2002 83 (1-183) 38,5% 3424 Europa
Tab. 26: Anteil der Patientinnen mit Rezidiv oder Fernmetastasierung im medianen Nachbeobachtungszeitraum (n= Studienumfang/Fallzahl, *Median der 18 betrachteten Kollektive und Medianspannweite, ’’ keine Differenzierung innerhalb der Studie zwischen Metastase und Rezidiv).
Diskussion
64
4.2 Färbeverfahren Die Färbemethodik wurde in Anlehnung an ein in der Arbeitsgruppe etabliertes
Verfahren (Protokoll I) und ein in der Laborroutine angewandtes Verfahren
(Protokoll II) mit entsprechenden Qualitätskontrollen, Negativ- wie
Positivkontrollen, durchgeführt. Die Immunhistochemie gilt als eine einfache und
gut reproduzierbare Methode, hat jedoch den Nachteil, dass die Ergebnisse
dadurch, dass sie vom Untersucher ausgewertet werden, mit einer gewissen
Subjektivität behaftet sind. Diesen Fehler könnte man durch eine möglichst große
Anzahl von Untersuchern mit gemittelten Untersuchungsergebnissen minimieren.
Bei dieser Studie wurde die Auswertung von nur einem erfahrenen Untersucher in
Unkenntnis der histologischen Tumordaten (Primärtumorgröße, Nodalstatus,
Grading, Hormonrezeptorstatus) durchgeführt.
Für uPA und PAI-1 gibt es kein standardisiertes etabliertes
immunhistochemisches Verfahren. Es wurden zwar bisher immunhistochemische
Färbungen mit Antikörpern zum Nachweis von uPA und PAI-1 durchgeführt
[Dublin et al., 2000; Ferrier et al., 1999; Constantini et al., 1996; Jankun et al.,
1993], allerdings wurden bisherige Untersuchungen mit dem Ziel der
prognostischen und prädiktiven Aussagefähigkeit dieser Marker hauptsächlich an
Frischgewebe mittels ELISA vorgenommen [Pedersen et al., 2003; Harbeck et al.,
2002; Jänicke et al., 2001]. Vergleiche beider Verfahren zeigten inzwischen, dass
die Ergebnisse nicht zwangsläufig miteinander korrelieren und ihre Wertigkeit für
die klinische Aussagefähigkeit unterschiedlich ist [Ferrier et al., 1999]. Bisher gilt
daher die Untersuchung mittels ELISA als Standard. Nur diese Methodik ist bisher
in den Leitlinien der American Society of Clinical Oncology (ASCO) sowie der
Arbeitsgemeinschaft für Gynäkologische Onkologie anerkannt [AGO, 2010].
Da es sich beim Untersuchungsgut dieser retrospektiven Studie ausschließlich um
Paraffinmaterial handelt, steht in diesem Fall für die Untersuchung von uPA und
PAI-1 nur die Immunhistochemie als Untersuchungsmethode zur Verfügung. Bei
Planung dieser Arbeit war die Dominanz durch die bessere
Standardisierungsmöglichkeit der ELISA-Technik noch nicht abzusehen, so dass
es zu diesem Zeitpunkt als sinnvoll erachtet wurde, diese beiden Marker ebenfalls
immunhistochemisch zu färben. Diese Methodik gibt zwar gute Informationen über
Diskussion
65
die Verteilung der Marker in den einzelnen Gewebszellen, ist jedoch weniger
sensitiv als der ELISA. Problematisch ist ebenfalls, dass es eine semiquantitative
Methode ist, die bisher kein einheitliches Auswertungsverfahren hat. Sie wurde
noch nicht standardisiert und stellt somit im Vergleich zum ELISA für diese Marker
die schlechtere Methodik dar. Diese beiden Methoden kann man demzufolge auch
nicht als austauschbar, sondern nur als ergänzend ansehen.
Diskussion
66
4.3 Analyse der Studienergebnisse Das primäre Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung von Rad51 hinsichtlich seiner
Bedeutung als Prognoseparameter für das Mammakarzinom.
Tabelle 27 zeigt die Qualitätskriterien für prognostische Parameter nach den
aktuellen Qualitätskriterien der AGO-Empfehlungen [AGO, 2010].
Biologische Hypothese
Einfache und qualitätsgesicherte Bestimmungsmethode
Prospektive statistische Evaluierung
Validierung der klinischen Bedeutung nach Evidenzniveau
Klinische Relevanz für Therapieentscheidungen
Tab. 27: Qualitätskriterien für Prognoseparameter [AGO, 2010].
In den letzten Jahren zeigt sich eine Erweiterung der klassischen
histopathologischen Prognoseparameter durch die Hinzunahme tumorbiologischer
Faktoren, u. a. auf der Ebene der Molekularbiologie. Zu Parametern wie Protein-
und Methylierungs- und Genprofilen liegen bislang noch wenige Daten vor, sie
sind jedoch erstmalig im vergangenen Jahr in die Leitlinien aufgenommen worden.
Die aktuellen prognostischen Parameter sind mit entsprechendem Evidenzniveau
in Tab. 28 aufgeführt.
Diskussion
67
Prognostischer Faktor Evidenzniveau Tumorgröße 1a Nodalstatus 1a Metastasierung 1a Histologischer Tumortyp 2b Grading (Elston-Ellis) 2a Alter 2a Peritumorale Lymphgefäß- und Gefäßinvasion 2b Östrogen-/Progesteronrezeptorstatus 2a uPA/PAI-1 (ELISA) 1a Triple-negative/ basal cell-like tumor 2b HER-2 (IHC, FISH) 2b Tumorzellen im Knochenmark 1a Proliferationsmarker:
Thymidin-labeling Index S-phase fraction Ploidy Ki-67
2b 1b 2b 2b 2b
seit kurzem erhältliche Gen- Methylierungs- oder Proteinprofile
2b
Computer gesteuerte Entscheidungshilfen 2b Lebensstil 2ba BMI > 25 kg/m2 2ba
Tab. 28: Überblick der prognostischen Faktoren des Mammakarzinoms mit entsprechendem Evidenzniveau [AGO, 2010].
Weitere mögliche prognostische Marker sind Parameter der DNA-
Reparaturmechanismen der Zelle, die die Integrität der Erbinformation wahren
sollen. Exogene Einfüsse, wie UV-Strahlung, ionisierende Strahlung oder
chemische Noxen als auch endogene Einflüsse wie DNA-schädigende
Stoffwechselmetabolite und Hypoxie stellen hohe Anforderungen an die DNA-
Integrität jeder Zelle. Die Funktionsfähigkeit des DNA-Reparaturprozesses führt
optimalerweise entweder zu integerer Zell-DNA oder bei Irreparabilität langfristig
zur Apoptose.
Tritt dieser Idealfall nicht ein, so resultieren nicht integere DNA bzw.
überlebensfähige Vorstufen zur Apoptose, die an Tochterzellen weitergegeben
werden.
Die Funktionalität und auch das Aktivitätsmaß des Reparaturmechanismus einer
Zelle könnte ein Zugangsweg sein, den Ist-Zustand dieses veränderten
Zellzustandes zu erfassen. Je exakter dieses gelingt, umso wahrscheinlicher kann
daraus eine prognostische Aussagefähigkeit abgeleitet werden.
Diskussion
68
4.3.1 DNA-Reparatur Es werden zwei wesentliche Reparatursystemgruppen unterschieden: diejenigen,
die auf Doppelstrangbruchreparatur spezialisiert sind und alle weiteren
Reparatursysteme.
Zu letzteren gehört das Mismatchreparatursystem (MMR), welches für die
Korrektur falsch eingebauter Nukleotide und für die Korrektur von Mismatches in
Heteroduplexbereichen verantwortlich ist [Knippers, 2001]. Beispielhaft für die
Relevanz der Intaktheit dieser Reparatursysteme sei das hereditäre nicht-
polypöse Kolonkarzinom (HNPCC) genannt, welches als Folge von Mutationen
dieser Enzymsysteme oder durch Mikrosatelliteninstabilität entstehen kann [Sheng
et al., 2009; Rustgi, 2007].
Weitere wichtige Reparatursysteme dieser Art sind die Basen-Exzisions-
Reparatur, vor allem für endogene DNA-Schäden durch Hydrolyse,
Hydroxylradikale und Methylierungen, und die Nukleotid-Exzisions-Reparatur,
eingesetzt bei DNA-Schäden durch polycyclische Kohlenwasserstoffe und
ultraviolettes Licht [Knippers, 2001]. Xeroderma pigmentosum ist beispielsweise
auf eine defekte Nukleotid-Exzisions-Reparatur zurückzuführen.
Zur Reparatur von Doppelstrangbrüchen steht das „non-homologous-end-joining“
(NHEJ), die Verbindung nicht homologer DNA-Enden und die homologe
Rekombination (HR), ein potentiell fehlerfreier Reparaturmechanismus, zur
Verfügung.
Der im Zusammenhang mit Rad51 wichtigste Reparaturprozeß der Zelle ist die
homologe Rekombination zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen. Es
werden verschiedene Abläufe unterschieden: dobble-strand break repair (DSBR),
das synthesis-dependent-strand-annaeling (SDSA), single-strand annealing (SSA)
und die break-induced replication (BIR) [Sung und Klein, 2006]. DSBR und SDSA
sind abhängig vom „strand-invasion process“, somit abhängig von Rad51. SSA
verläuft unabhängig von Rad51 [Pohl und Nickoloff, 2008; Storici et al., 2006;
Ivanov et al., 1996; Malkova et al., 1996] und BIR wird als von Rad51 abhängig
beschrieben, kann jedoch auch bei Abwesenheit von Rad51 stattfinden [Malkova
et al. 2005; Davis und Symington, 2004; Malkova et al., 1996].
Diskussion
69
4.3.2 Das biologische Modell von Rad51 Rad51, das Äquivalent zum prokaryotischen RecA Protein, ist ein zentraler Faktor
der homologen Rekombination. Es ist eine Rekombinase, die die Möglichkeit hat,
ATP zu binden und zu hydrolysieren [Sung und Klein, 2006; Sung et al., 1994].
Ungebunden liegt Rad51 als Proteinring vor. Es besteht aus 6 bis 7 Monomeren.
Nach Einzelstrangbindung wird über eine hochstrukturierte rechtsgedrehte
Polymerstruktur das sogenannte „presynaptic filament“ gebildet [Sung und Klein,
2006; Yu et al., 2001]. Auf diese Weise wird das Paaren der homologen DNA
Sequenzen ermöglicht, was auch essentiell für den „strand-invading Prozess“ der
homologen Rekombination ist [Turner et al., 2004]. Rad51 ist als zentrales Protein
in ein komplexes Reparaturenzymsystem, die Rad52 epistasis group,
eingebunden.
Die homologe Rekombination verläuft in mehreren Schritten. Voraussetzung ist
zunächst die DNA-Schädigung mit der Folge eines DNA-Doppelstrangbruchs
durch exogene Einflüsse oder durch endogene Prozesse wie beispielsweise das
Abreißen der Replikationsgabel während versuchter Replikation über einem
Einzelstrangbruch [Henning und Stürzbecher, 2003]. Dieser Prozess beginnt
zunächst mit regulierter 5’-3’ Einzelstrangresektion durch den MRX-Komplex
(bestehend aus Mre11, Rad50, Xrs2) und Bindung der Einzelstrang-DNA durch
das Replication Protein A (RPA) [Pohl und Nickoloff, 2008]. RPA wird
anschließend durch Rad51 ersetzt, um das präsynaptische Filament zu bilden. Auf
diese Weise entsteht das katalytische Zentrum für die HR, das die örtliche Nähe
des Einzelstrangs mit dem zu rekombinierenden Doppelstrang bildet.
Unterstützende und stabilisierende Wirkung bei der presynaptic filament-Bildung
haben Rad52, Rad55 und Rad57 [Symington, 2002]. Rad54 interagiert ebenfalls
mit Rad51 und verbessert nach erfolgreicher präsynatischer Filamentbildung
möglicherweise durch Minimierung von Inhibitoren den Reparaturprozess
[Henning und Stürzbecher, 2003]. Nach erfolgter „strand-invasion“ und DNA-
Synthese kann es bei der Doppelstrangbruchreparatur über zwei
Holidaystrukturen, nach DNA-Lückenschluss, zu einer Komplexauflösung mit oder
ohne Crossover kommen. Verläuft der Reparaturprozess über den SDSA-Weg,
kommt es im Verlauf nicht zum Crossover [Sung und Klein, 2006].
Diskussion
70
Rad51 kann als Bestandteil des katalytischen Zentrums der homologen
Rekombination möglicherweise als Marker für das Maß der DNA-Schädigung
dienen. Damit gibt es potentiell eine Möglichkeit, über den Aktivitätszustand der
homologen Rekombination Rückschlüsse auf das Maß der Zellschädigung zu
schließen.
4.3.3 Rad51 – seine übergeordnete Regulation Inwieweit Rad51 als Maß der DNA-Schädigung dienen kann, hängt unter anderem
von übergeordneten regulativen Prozessen ab, die die Funktion von Rad51
beeinflussen können.
Die Frage, welche Faktoren wesentlich dafür sind, welcher Reparaturprozeß bei
DNA-Doppelstrangbrüchen erfolgt, ist nicht endgültig geklärt. Abhängig vom
Zellzyklus kommen einzelne Reparaturmechanismen stärker zum tragen: In der
G1 Phase findet sich hauptsächlich NHEJ und wenig HR, während in der S- und
G2 Phase schwerpunktmäßig die HR stattfindet [Turner et al., 2004; Henning und
Stürzbecher, 2003]. Maligne Zellverbände haben im Gegensatz zu benignem
Gewebe einen höheren Anteil von Zellen, die sich in der S- und G2-Phase des
Zellzyklus befinden [Choudhury et al. 2006].
Es gibt Hinweise in der Literatur, dass Reparaturprozesse um Doppelstrangbrüche
konkurrieren, so zum Beispiel NHEJ und HR [Henning und Stürzbecher, 2003].
Nach erfolgter Sättigung des NHEJ-Prozesses kommt es zur vermehrten HR
[Saintigny et al., 2001].
Das Tumorsuppressorgen p53 scheint in diesem Zusammenhang eine große
Rolle zu spielen: Einerseits steuert es den Zellzyklus und die Apoptose über seine
Transkriptionsaktivität. Andererseits beeinflusst es die HR in Früh- und
Spätphasen dieses Prozesses über Interaktion mit Intermediärstrukturen wie auch
über Interaktion mit an der HR beteiligten Proteine, so auch durch Interaktion mit
Rad51 [Bertrand et al., 2004]. Im Zusammenhang mit dem Arrest der
Replikationsgabel wird ein Einfluss von p53 auf die Regulation der HR in diesem
Rahmen angenommen [Saintigny und Lopez, 2002].
Es kommt über p53 zu einer Verminderung der HR mit dem Ziel, die genomische
Integrität durch ein zu hohes Maß an Rekombination zu wahren. p53 agiert nach
durch DNA-Strukturveränderung bedingtem Recruitment der ATM- und ATR-
Diskussion
71
Kinasen, welche Zielproteine der Zellykluskontrolle phosphorylieren, wozu auch
p53 gehört [Choudhory et al., 2006].
Die Brustkrebssuszeptibilitätsgene BRCA I und BRCA II stehen ebenfalls im
Zusammenhang mit Rad51. Bei BRCA I handelt es sich um ein hauptsächlich
nukleär lokalisiertes Protein mit Tumorsuppressorfunktion. Es übernimmt
einerseits Aufgaben im Transkriptionsprozess [Chapman und Verma, 1996], im
Zellzykluswechsel [Larson et al., 1997], aber auch im Rahmen der DNA-Reparatur
[Scully et al., 1997]. Maximale Expression findet sich in der S-Phase des
Zellzyklus [Ruffner und Verma, 1997]. Es konnte gezeigt werden, dass in
genetisch veränderten BRCA I defizienten Zellen im Vergleich zu den paternalen
Zellen weniger homologe und vermehrt nicht homologe Rekombination stattfindet
[Snouwaert et al., 1999]. Eine direkte Interaktion von Rad51 mit BRCA I im
Reparaturprozess ist relativ unwahrscheinlich [Venkitaraman 2002], angenommen
wird ein indirektes Interagieren bei nachgewiesener Interaktion von Rad51 mit
BRCA II [Venkitaraman 2002; Chen et al., 1998; Marmorstein et al., 1998]. Beide
Proteine sind notwendig für eine effiziente HR, wobei der genaue Mechanismus
weiter unklar ist [Venkitaraman, 2002]. Es wurde gezeigt, dass BRCA II über seine
BRC Wiederholungssequenzen im Exon 11 direkt mit Rad51 interagiert [Chen et
al., 1998] und so eine regulative Funktion über Rad51 ausübt [Wong et al., 1997].
Wahrscheinlich ist, dass BRCA II Einfluss auf die Aktivität und Verfügbarkeit von
Rad51 hat [Venkitaraman, 2002]. Bei Patientinnen mit einer Mutation von BRCA I
und/oder BRCA II ist somit mit einer Veränderung der Rad51 Aktivität wie
Verfügbarkeit und folglich mit einer abweichenden Reparaturenzymaktivität der
Zelle zu rechnen. Die genetische Belastung der Patientinnen ist bei diesem
Kollektiv jedoch nicht bekannt.
4.3.4 Rad51 als Prognoseparameter Die Hypothese dieser Arbeit ist, dass eine hohe Rad51 Expression mit einer
kürzeren Überlebensrate korreliert.
Dafür spricht, dass im Tumorgewebe im Vergleich zu Normalgewebe eine
Verlagerung des Zellzyklus zur S- und G2-Phase stattfindet, in denen die
Reparatur nicht schwerpunktmäßig durch NHEJ, sondern durch die HR
Diskussion
72
durchgeführt wird. Es müssten also vermehrt Enzyme der HR nachgewiesen
werden können, so auch Rad51.
Im Mammakarzinomgewebe konnte im Vergleich zu benignem Mammagewebe
eine höhere Rad51 Expression nachgewiesen werden [Opitz, 2001; Hebenbrock,
2009].
Rad51 wurde bereits als unabhängiger prognostischer Parameter im
Zusammenhang mit dem kleinzelligen Bronchialkarzinom detektiert [Qiao et al.,
2005]. Höhere Rad51 Expressionen konnten im Zusammenhang mit dem
Pankreaskarzinom [Han et al., 2002; Maacke et al., 2000a] und dem
Mammakarzinom [Maacke et al., 2000b] nachgewiesen werden. Die Expression
des Mammakarzinoms korrelierte mit etablierten prognostischen Parametern wie
dem Grading [Maacke et al., 2000b].
Andererseits zeigen andere Arbeiten abweichende Ergebnisse: Søderlund et al.
fanden bei prämenopausalen Patientinnen mit einem früh erkannten
Mammakarzinom eine Korrelation zwischen einer niedrigen Expression des
BRCAI/BRCAII/Rad51-Komplex, wie auch von Rad51 mit einem hohen Grading
[Søderlund et al., 2007]. Die Wahrscheinlichkeit, dass eine BRCA-Mutation
vorliegt, war allerdings aufgrund des Alters der Frauen höher als in unserem
Kollektiv, auch wenn explizit bei den untersuchten Patientinnen kein Hinweis für
eine familiäre Genese vorlag. Bei Patientinnen mit einer Mutation im BRCA-Gen
wäre eine verminderte BRCAI/BRCAII/Rad51-Komplex Expression dadurch
erklärbar, dass in BRCA I defizienten Zellen weniger homologe und vermehrt nicht
homologe Rekombination stattfindet [Snouwaert et al., 1999]. Damit wäre auch
eine niedrigere Rad51 Expression zu erwarten.
Würde sich dieses bestätigen, so hätte Rad51 im Zusammenhang mit BRCA I und
BRCA II eine inverse prognostische Aussagefähigkeit für Rad51. Selbiges würde
bei diesen Patientinnen auch für Rad51 und das Grading gelten.
Yoshikawa et al. zeigen ein reduziertes Rad51-Niveau bei 30% der in ihrem
Kollektiv untersuchten Brustkrebstumore [Yoshikawa et al., 2000]. Dieses Kollektiv
zeigt einen hohen Anteil an hereditären Karzinomen von fast 37% und der Anteil
der sporadischen Karzinome zeigt zu 67% eine abnormale BRCA I Expression, so
dass hier ggf. die reduzierte Rad51 Expression auf Veränderungen im BRCA-
Proteinstoffwechsel zurückzuführen ist.
Diskussion
73
4.3.5 Rad51 – Ergebnisse der Arbeitsgruppe im Vergleich Die Spannweite der Rad51-PCI-Werte unseres Kollektivs zeigt sich mit 0,2% bis
56,7% vergleichbar mit bisherigen Ergebnissen der Arbeitsgruppe: Hier lagen die
Werte von 0% bis 68% [Opitz, 2001], bzw. 0,5% bis 88% [Hebenbrock, 2009]. Der
Median von 16,5% [Opitz, 2001] ist ebenfalls mit dem Median dieser Studie von
18,9% vergleichbar.
Auf die Untersuchung von benignem Gewebe wurde verzichtet, weil unsere
Arbeitsgruppe bereits mehrfach hier eine niedrigere Expression von Rad51
verglichen mit Tumorgewebe nachweisen konnte [Opitz, 2001; Hebenbrock 2009].
Es finden sich weitere Angaben zu einer vermehrten Rad51-Foci-Expression in
menschlichen Tumorzelllinien, unter anderem in CML-, AML-, Cervixkarzinom-,
Mammakarzinom-, Adenokarzinomzelllinien des Kolons und Rektums wie auch bei
Melanom- und Glioblastomzelllinien [Klein, 2008].
Rad51 wurde im Hinblick auf seine prognostische Aussagefähigkeit untersucht:
Rad51 stellt sich als abhängiger Parameter für das rezidiv- und metastasenfreie
Überleben heraus, dabei korrelierte es im Rahmen dieser Studie jedoch mit Ki-67,
dem Alter, dem Progesteronrezeptorstatus, dem Nodalstatus und dem Grading.
Es wurde eine positive Korrelation zwischen Rad51 und Ki-67 bzw. dem Grading
nachgewiesen, wie auch eine negative Korrelation mit dem
Progesteronrezeptorstatus. Dies deckt sich mit den Ergebnissen voriger Studien
[Opitz, 2001]. Der Nodalstatus korreliert in dieser Studie ebenfalls mit Rad51,
ebenso zeigt sich eine signifikant vermehrte Expression bei jüngeren Patientinnen.
Diese beiden Abhängigkeiten konnten in vorherigen Studien nicht gefunden
werden.
Zu unseren Ergebnissen kontrovers konnten Søderlund et al. Rad51 wie auch den
BRCAI/BRCAII/Rad51-Komplex als unabhängigen Parameter nachweisen. Dies
wurde für das Lokalrezidiv, nicht aber für die Fernmetastasierung gefunden. Eine
niedrige Rad51 Expression wird mit einer schlechten Prognose in Verbindung
gebracht [Søderlund et al., 2007]. Unter 4.3.4 wurde jedoch bereits auf das
unterschiedliche Patientinnenkollektiv zu dieser Studie hingewiesen, so dass keine
direkte Vergleichbarkeit gegeben ist. Für eine zum Teil verminderte Expression
Diskussion
74
von Rad51 beim Mammakarzinom sprechen auch die Ergebnisse von Yoshikawa
und Kollegen [Yoshikawa et al., 2000].
Dem eigenen Ergebnis kontrovers zeigt sich weiter eine negative Korrelation im
Grading anderer Autoren [Søderlund et al., 2007; Hebenbrock, 2009]. Da
Søderlund et al. eine niedrigere Expression mit einer schlechteren Prognose in
Verbindung gebracht haben, entspricht diese Korrelation mit dem Grading den
Erwartungen dieser Studie, die jedoch kontrovers zu unserer Hypothese sind.
Eine positive Korrelation mit Ki-67, dem Nodalstatus, dem Grading sowie eine
negative Korrelation mit dem Östrogenrezeptorstatus kann das biologische Modell
von Rad51 als potentiell prognostischen Parameter unterstreichen.
4.3.6 Rad51 und Ki-67 - prognostische Aussagekraft Ki-67 hat sich im Rahmen vieler Studien am Mammakarzinom als unabhängiger
prognostischer Parameter herausgestellt [Colozza et al., 2005; Trihia et al., 2003;
Scholzen und Gerdes, 2000; Jansen et al., 1998; Railo et al., 1997; Brown et al.,
1996; Domagala et al., 1996; Querzoli et al., 1996; Seshadri et al., 1996; Pinder et
al., 1995; Gaglia et al., 1993; Railo et al., 1993]. Auch in unserem Kollektiv
korrelierte Ki-67 in der univariaten Analyse hochsignifikant mit einem schlechteren
rezidiv- und metastasenfreien Überleben (p-Wert: 0,0001, log-rank Test). In der
multivariaten Analyse zeigte sich Ki-67 als unabhängiger prognostischer
Parameter in Bezug auf das rezidivfreie Überleben, nicht jedoch in Bezug auf das
metastasenfreie Überleben. Betrachtet man jedoch nur die nodalnegativen
Patientinnen dieses Kollektivs, stellt sich Ki-67 sowohl für das rezidiv-(p-Wert:
0,0001) als auch für das metastasenfreie Überleben (p-Wert: 0,005) als ein
unabhängiger Parameter dar.
Interessant scheint die Expression von Ki-67 und Rad51 im direkten Vergleich. Im
Chi-Quadrattest nach Pearson zeigt sich mit einer Signifikanz von 0,0001 bei
hohem Ki-67 Index eine entsprechend große Wahrscheinlichkeit, auch eine hohe
Rad51 Expression aufzuweisen. Damit würde Rad51 ebenfalls als
Prognoseparameter dienen, bisher jedoch nur in Abhängigkeit.
Zur weiteren Validierung des Proliferationsmarkers Ki-67 müssten randomisierte,
prospektive Studien durchgeführt werden, außerdem ein allgemein optimierter
Diskussion
75
einheitlicher Cut-off-Wert gefunden werden. Verschiedene Cut-off-Werte einzelner
Arbeiten können Tabelle 29 entnommen werden und liegen zwischen 7 und 34%.
Auch eine Standardisierung des verwendeten Antikörpers könnte zu einer
besseren Vergleichbarkeit der Ergebnisse führen. Bisherige Ergebnisse im
Rahmen einer Metaanalyse zeigten für Ki-67 eine signifikante Assoziation mit dem
Rezidivrisiko wie auch dem Gesamtüberleben [de Azambuja et al., 2007].
Insgesamt gilt Ki-67 noch nicht hinreichend validiert.
Studie Cut-off-Wert
n Signifikanz univariat Signifikanz multivariat rez. met. OS rez. met. OS
vorliegende Studie < 25 % 142 0,0001 0,0001 0,0001 0,173 Railo et al., 1997 < 10 % 212 0,008* 0,008*
Seshadri et al., 1996
< 10 % 740 0,0001 0,0001 0,0002 0,0001
Pinder et al., 1995 <17 %/ >34 %
177 0,003 s
Jansen et al., 1998 < 7 % 341 <0,0001*,
0,05 0,004*;
0,598 Callagy et al., 2006 25% 646 < 0,0001 ns
Tab. 29: Beispielhaft ausgewählte Studien verschiedener Autoren zur prognostischen Aussagefähigkeit des Proliferationsmarkers Ki-67, dargestellt ist die Signifikanz des rezidiv- [rez.], des metastasenfreien
[met.] Überlebens sowie das Gesamtüberleben [OS] des jeweils untersuchten Kollektivs. Weiterhin findet sich der für jede Studie gewählte Cut-off-Wert zur Unterteilung zwischen niedriger und hoher Expression von Ki-67. Bei kursiv gedruckten Werten mit * handelt es sich um das krankheitsfreie und
nicht um das Gesamtüberleben. ns = nicht signifikant, s = signifikant.
4.3.7 PAI-1, uPA und Rad51 - prognostische Aussagekraft Stellvertretend für das Enzymsystem der Serinproteasen wurde der
Uroplasminogenaktivator (uPA) und einer seiner Inhibitoren PAI-1 untersucht.
Ausgehend von der Annahme, dass der Aktivitätszustand als Maß für die
Metastasierungsbereitschaft eines Tumorgewebes gesehen werden kann [Han et
al., 2005], wurde erwartet, bei Tumoren mit hoher uPA und PAI-1 Expression auch
eine hohe Rad51 Expression zu finden. Diese Hypothese wurde jedoch in unserer
Arbeit nicht bestätigt. Im Chi-Quadrattest nach Pearson zeigte sich keine relevante
Korrelation zwischen diesen Parametern mit Rad51. Auch in den durchgeführten
univariaten Analysen des Gesamtkollektivs sowie bei Subgruppenanalysen des
Gesamtkollektivs zeigt sich keine annähernd vergleichbare Signifikanz wie in
anderen Studien. Auf der Basis immunhistochemischer Analysen konnten somit
keine signifikanten Korrelationen mit uPA und PAI-1 gefunden werden.
Diskussion
76
4.3.8 PAI-1 und uPA im Zusammenhang mit dem nodalnegativen Kollektiv Andere Autoren haben herausgearbeitet, dass nodalnegative Patientinnen mit
niedriger Expression von uPA und PAI-1 eine sehr gute Prognose haben und eine
adjuvante Chemotherapie somit nicht indiziert scheint [Jänicke et al., 2001]. Aus
diesem Grund haben wir die nodalnegativen Patientinnen gesondert ausgewertet.
Weder in der uni- noch multivariaten Analyse zeigten sich für PAI-1 signifikante
Ergebnisse. uPA jedoch stellt sich bezüglich des rezidivfreien Überlebens univariat
als signifikant im log-rank Test heraus (p-Wert: 0,0001), in der univariaten Cox-
Regressionsanalyse jedoch nicht als signifikant dar (p-Wert: 0,078). Die erwartete
klare Aussagefähigkeit der Serinproteasen bezüglich der nodalnegativen
Patientinnen findet sich in dieser Studie somit nicht.
uPA und PAI-1 finden sich in den aktuellen Empfehlungen der AGO als
Prognoseparameter, allerdings mit dem Hinweis, dass die Bestimmung mittels
ELISA erfolgt. Eine Übersichtsarbeit von Duffy stellt bereits das Potential dieser
beiden Faktoren besonders für nodalnegative Patientinnen heraus: Die
Serinproteasen könnten helfen, nodalnegative Patientinnen mit niedrigem Risiko
zu identifizieren, für die eine adjuvante Chemotherapie nicht notwendig ist [Duffy,
2002]. Die klinische Validierung dieser Parameter ist mit Studien der
Evidenzklasse 1a belegt [Jänicke et al., 2001; Look et al., 2000], ebenso wie auch
eine Validierung der Methodik mittels ELISA bereits erfolgt ist [Sweep et al., 1998].
Problematisch bei den Ergebnissen unserer Studie ist die angewandte Methodik
der Immunhistochemie. Offen bleibt, wie die Ergebnisse mittels ELISA ausgefallen
wären, da kein Frischgewebe zur Verfügung stand.
4.4 Ausblick Rad51 könnte langfristig einen Prädiktivparameter darstellen und damit eine
Entscheidungshilfe sein, ob eine Chemotherapie notwendig ist. Ein
Zusammenhang mit der Strahlensensitivität und Pharmakoresistenz ist
beschrieben: eine geringe Expression von Rad51 wird mit erhöhter
Strahlensensitivität in Verbindung gebracht [Søderlund et al., 2007; Collis et al.,
2001; Ohnishi et al., 1998; Vispé et al., 1998], im Zusammenhang mit
Diskussion
77
alkylierenden Chemotherapeutika wird eine Rad51 Induktion und somit
zunehmende Resistenz beschrieben [Christodoulopoulos et al., 1999]. Rad51 wird
dadurch für das „molecular targeting“ interessant: Tumorzellen könnten, indem
Rad51 gezielt blockiert wird, für Rad51 bedingte Resistenzmechanismen wieder
sensibilisiert werden und für neue Therapiestrategien zugänglich werden.
Aktuelle Forschungsergebnisse zeigen bei BRCA-defizienten Zellen und Zellen mit
defizienten HR-Reparaturenzymen eine erhöhte Sensitivität für Poly-ADP-Ribose-
Polymeraseinhibitoren (PARP-Inhibitoren) [Rottenberg et al., 2008; McCabe et al.,
2006; Bryant et al., 2005; Farmer et al., 2005]. Hieraus können sich langfristig
erfolgreiche Therapieansätze ergeben: Durch selektive PARP-Inhibition kommt es
zu ineffizienter Einzelstrangreparatur und letztlich persistierenden
Einzelstrangbrüchen. Potentielle Folge sind letzlich vermehrte
Doppelstrangbrüche [Farmer et al., 2005]. Bei defekter homologer Rekombination
bedingt durch BRCA-Mutationen oder gegebenenfalls durch Mutation von Rad51
mit resultierender Fehlfunktion kann dieses bei Akkumulation zu einem letalen
Zellschaden führen. Es konnte auch gezeigt werden, dass Zellen ohne
entsprechende Mutation nicht in gleicher Weise von der PARP-Inhibition betroffen
sind [Bryant et al., 2005]. Dieses könnte in Zukunft ein selektiver Therapieansatz
für ausgewählte Mammakarzinompatientinnen sein und zu einer weiteren
Therapieindividualisierung führen.
Zusammenfassung
78
5. Zusammenfassung
Das Mammakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung der Frau in Deutschland
– jede 9. Frau ist in ihrem Leben betroffen. Verbesserte Früherkennungsmethoden
und Therapiemöglichkeiten haben zu einer erhöhten Heilungsrate geführt. Durch
verbesserte Kenntnis der Tumorbiologie könnte eine weitere Senkung der
Mortalität durch eine individualisierte Therapie erreicht werden. Neue
Ansatzpunkte in der Therapie bilden Veränderungen der Reparaturenzymsysteme,
wie beispielsweise das der homologen Rekombination, als deren wesentlicher
Bestandteil Rad51 gilt.
In verschiedenen Tumorentitäten konnte eine erhöhte Expression von Rad51
nachgewiesen werden. Für das nicht kleinzellige Bronchialkarzinom wurde Rad51
als unabhängiger prognostischer Marker gefunden [Qiao et al., 2005]. Am
Mammakarzinom wurde eine Korrelation der Rad51 Expression mit dem Grading
detektiert [Maacke et al., 2000b]. Hauptfragestellung dieser retrospektiven Studie
ist die prognostische Bedeutung von Rad51 für das Mammakarzinom. Rad51 wird
dafür mit 3 weiteren Parametern (Ki-67, uPA und PAI-1) hinsichtlich seiner
Aussagekraft in Bezug auf Fernmetastasierung und Lokalrezidive überprüft.
Zusätzlich werden bewährte Prognoseparameter wie der Nodalstatus am Kollektiv
überprüft. Dafür werden 143 Paraffinschnitte von Mammakarzinompatientinnen
immunhistochemisch gefärbt und ausgewertet. Die Rad51 Expression lag
zwischen 0,2% und 56,7% (Median: 18,9%). Ein Schwellenwert von < 31%
unterteilte das Patientinnenkollektiv in 108 Karzinome niedriger und 33 Karzinome
hoher Rad51 Expression (ohne zwei nicht auswertbare Fälle). Rad51 zeigte sich
in dieser Studie als abhängiger prognostischer Parameter, eine unabhängige
prognostische Aussagefähigkeit konnte nur für Ki-67 nachgewiesen werden. uPA
und PAI-1 zeigten keine prognostische Aussagekraft, was vermutlich darauf
zurückzuführen ist, dass die Immunhistochemie nicht die geeignete Methode
darstellt.
Die in der vorliegenden Studie gefundenen Ergebnisse erfordern weitere
Untersuchungen zu Rad51 und dem Mammakarzinom. Vor allem prospektive
Studien, auch unter dem Aspekt der prädiktiven Aussagefähigkeit von Rad51 im
Zusammenfassung
79
Zusammenhang mit BRCA I und BRCA II, könnten langfristig weitreichende
Erkenntnisse zur Chemotherapie und Strahlensensitivität, wie auch zum
„molecular targeting“ und somit zur Therapieindividualisierung geben.
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Anhang
97
7. Anhang
7.1 TNM Klassifikation pT-Primärtumor pTX Primärtumor kann nicht beurteilt werden pT0 Kein Anhalt für Primärtumor pTis Carcinoma in situ: intraduktales Karzinom oder lobuläres Carcinoma oder Morbus
Paget der Mamille ohne nachweisbaren Tumor pT1 Tumor max. Durchmesser < 2,0 cm
a.) max. Durchmesser < 0,5 cm b.) max. Durchmesser < 0,5 bis 1 cm c.) max. Durchmesser < 1 bis 2 cm
pT2 Tumor max. Durchmesser > 2,0 bis 5 cm pT3 Tumor max. Durchmesser > 5 cm pT4 Tumor jeder Größe mit direkter Ausdehnung auf Brustwand und Haut
a.) mit Ausdehnung auf die Brustwand b.) mit Ödem (einschließlich Apfelsinenhaut), Ulzerationen der Brusthaut oder
Satellitenmetastasen der Haut der gleichen Brust c.) Kriterien T4a und T4b d.) Entzündliches Karzinom
pN-Regionäre Lymphknoten pNX Keine Lymphknotenbeurteilung möglich pN0 Keine regionären Lymphknotenmetastasen pN1 Metastasen in beweglichen ipsilateralen axillären Lymphknoten
a.) nur Mikrometastasen (< 0.2 cm) b.) Metastasen in Lymphknoten, zumindest eine > 0,2 cm,
• bi) Metastasen in 1-3 Lymphknoten, > 0,2 bis < 2 cm • bii) Metastasen in > 4 Lymphknoten, > 0,2 bis < 2 cm • biii) Ausdehnung der Metastasen über die Lymphknotenkapsel hinaus,
max. Durchmesser < 2 cm • biv) Metastasen in Lymphknoten, max. Durchmesser > 2 cm
pN2 Metastasen in ipsilateralen axillären Lymphknoten, untereinander oder an andere Strukturen fixiert
pN3 Metastasen in Lymphknoten entlang der A. mammaria interna pM-Fernmetastasen pMX Vorliegen von Fernmetastasen kann nicht beurteilt werden PM0 Keine Fernmetastasen PM1 Fernmetastasen
Tab. 30: pTNM-Klassifikation des Mammakarzinoms, aus Remmele [Remmele, 1997], entspricht der bei Diagnosestellungen gültigen pTNM Klassifikation.
Anhang
98
T-Primärtumor TX Primärtumor kann nicht beurteilt werden T0 kein Anhalt für Primärtumor Tis Tis (DCIS) Tis (LCIS) Tis (Paget)
Carcinoma in situ duktales Carcinoma in situ lobuläres Carcinoma in situ Paget-Erkrankung der Brustwarze ohne nachweisbaren Tumor
T1 T1 mic T1a T1b T1c
Tumor 2 cm oder weniger in größter Ausdehnung Mikroinvasion von 0,1 cm oder weniger in größter Ausdehnung mehr als 0,1 cm, aber nicht mehr als 0,5 cm in größter Ausdehnung mehr als 0,5 cm, aber nicht mehr als 1 cm in größter Ausdehnung mehr als 1 cm, aber nicht mehr als 2 cm in größter Ausdehnung
T2 Tumor mehr als 2 cm, aber nicht mehr als 5 cm in größter Ausdehnung T3 Tumor mehr als 5 cm in größter Ausdehnung T4 T4a T4b T4c T4d
Tumor jeder Größe mit direkter Ausdehnung auf Brustwand oder Haut mit Ausdehnung auf die Brustwand mit Ödem (einschließlich Apfelsinenhaut), Ulzerationen der Brusthaut oder Satellitenmetastasen der Haut der gleichen Brust Kriterien T4a und T4b gemeinsam Entzündliches (inflammatorisches) Karzinom
N-Regionäre Lymphknoten NX Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden N0 keine regionären Lymphknotenmetastasen N1 Metastase(n) in beweglichen ipsilateralen axillären Lymphknoten der Level I und II N2 N2a N2b
Metastase(n) in ipsilateralen axillären Lymphknoten, untereinander oder an andere Strukturen fixiert Metastase(n) in klinisch erkennbaren ipsilateralen Lymphknoten entlang der Arteria mammaria interna in Abwesenheit klinisch erkennbarer axillärer Lymphknotenmetastasen
N3 N3a N3b N3c
Metastase(n) in ipsilateralen infraklavikulären Lymphknoten Klinisch erkennbare Metastase(n) in ipsilateralen Lymphknoten entlang der Arteria mammaria interna in Anwesenheit axillärer Lymphknotenmetastasen Metastase(n) in ipsilateralen supraklavikulären Lymphknoten
pN-Regionäre Lymphknoten pNx regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden (z. B. bioptisch entfernt) pNx (sn) Schildwächterlymphknoten (Sentinel node) kann histologisch nicht beurteilt werden pN0 keine regionären Lymphknotenmetastasen pN0 (sn) histologisch keine Metastase(n) im Schildwächterlymphknoten pN0(i-) histologisch keine Lymphknotenmetastase(n) und kein morphologischer Nachweis
von isolierten Tumorzellen pN0(i+) histologisch keine Lymphknotenmetastase(n), aber morphologischer Nachweis von
isolierten Tumorzellen pN0(mol-) histologisch keine Lymphknotenmetastase(n) und kein nichtmorphologischer
Nachweis von isolierten Tumorzellen pN0(mol+) histologisch keine Lymphknotenmetastase(n), aber nichtmorphologischer Nachweis
von isolierten Tumorzellen pN1mi Mikrometastase(n) (> 0,2 mm (und/oder mehr als 200 Tumorzellen) und < 0,2 cm) pN1 pN1a pN1b pN1c
Metastase(n) in 1-3 ipsilateralen axillären Lymphknoten, mindestens eine > 0,2 cm Lymphknoten entlang der Arteria mammaria interna mit mikroskopischer(n) Metastase(n), nachgewiesen durch Untersuchung des Schildwächterlymphknotens, aber nicht klinisch erkennbar pN1a und pN1b
pN2 pN2a pN2b
Metastase(n) in 4-9 axillären Lymphknoten, mindestens eine > 0,2 cm Klinisch erkennbare Metastase(n) in Lymphknoten entlang der Arteria mammaria interna ohne axilläre Lymphknotenmetastasen
Anhang
99
pN3 pN3a pN3b pN3c
Metastase(n) in 10 oder mehr ipsilateralen axillären, mindestens eine > 0,2 cm, oder in ipsilateralen infraklavikulären Lymphknoten Metastase(n) in klinisch erkennbaren Lymphknoten entlang der Arteria mammaria interna mit mindestens einer axillären Lymphknotenmetastase oder Lymphknotenmetastasen im mehr als 3 axillären Lymphknoten und in Lymphknoten entlang der Arteria mammaria interna, nachgewiesen durch Untersuchung des/der Schildwächterlymphknoten(s), aber nicht klinisch erkennbar Metastase(n) in ipsilateralen supraklavikulären Lymphknoten
M-Fernmetastasen MX Vorliegen von Fernmetastasen kann nicht beurteilt werden M0 Keine Fernmetastasen M1 Fernmetastasen
Tab. 31: pTNM-Klassifikation des Mammakarzinoms, 7. Auflage UICC, 2010 [Wittekind und Bertolini, 2010; Sauer 2005]. Die wesentliche Neuerung besteht in der Entwicklung und vermehrten
Anwendung der Sentinel Lymph Node Technologie.
Danksagung
100
8. Danksagung
Ich danke Herrn Prof. Dr. Stürzbecher für die Vergabe des Dissertationsthemas
und die Betreuung über den gesamten Zeitraum dieser Studie. Ebenso danke ich
Frau PD Dr. Fischer für die Betreuung der Arbeit von gynäkologischer Seite, die
sie nach abgeschlossener Methodikplanung übernommen hat. Mein Dank für die
Unterstützung von pathologischer Seite gilt Herrn Dr. Jarutat sowie Prof. Dr.
Krüger, dem ich auch für die Unterstützung bei der statistischen Bearbeitung
danke. Für die wissenschaftlichen Denkanstöße und die tatkräftige Betreuung in
allen Bereichen möchte ich Frau Boutou danken.
Besonderer Dank gilt Frau Dr. Peters, Chefärztin des Institutes für Pathologie des
Städtischen Klinikums Lüneburg, sowie Herrn Prof. Dr. Gille, Chefarzt a. D. der
gynäkologischen Abteilung des Städtischen Klinikums Lüneburg, für die
Bereitstellung des Untersuchungsgutes und für die Möglichkeit zur Erhebung von
Krankheitsdaten.
Des Weiteren möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Feller und Herrn Prof. Dr.
Diedrich für die Möglichkeit bedanken, die Räumlichkeiten und Materialien ihrer
Institute für meine Arbeit zu nutzen. Besonderer Dank gilt auch der Unterstützung
duch das gesamte Personal, insbesondere im Rahmen der Methodik gilt mein
Dank den MTAs Frau Thode, Frau Gräff, Frau Nehls sowie Frau Schliephake und
ihrem ganzen Laborteam.
Danken möchte ich ebenfalls meinen Mitdoktorandinnen Frau Dr. Ola und Frau Dr.
Hebenbrock.
Dank gilt meinem beruflichen als auch meinem privaten Umfeld, insbesondere
meinen Eltern.
Lebenslauf
101
9. Lebenslauf
Name: Stefanie Schierholz
Geburtsdatum: 08.06.1982
Geburtsort: Lüneburg
Schulbildung:
1988 -1992 Grundschule Adendorf, Landkreis Lüneburg
1992 –1994 Orientierungsstufe Adendorf, Landkreis Lüneburg
1994 – 2001 Bernhard-Riemann-Gymnasium, Scharnebeck,
Landkreis Lüneburg
06/2001 Abitur
Studium:
2001 - 2007 Medizinstudium an der Universität zu Lübeck
09/2003 Ärztliche Vorprüfung
2005 - 2006 experimenteller Teil dieser Studie
11/2007 Approbation
Beruf:
seit 01/2008 Assistenzärztin in der Klinik für Chirurgie,
Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus
Lübeck
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