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Prof. Dr. Christoph Tebbe* – Thünen Institut für BiodiversitätVortrag an der TiHo H, Nds. Biogasforum
12.11.2014
*Email:christoph.tebbe@ti.bund.de 1
Gefährden Botox‐Bakterien niedersächsische Biogasanlagen?Biogasanlagen?
Thünen Institut für Biodiversität, Braunschweig
12.11.2014Seite 0 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
Tierärztliche Hochschule Hannover
Hannover, den 12.11.2014
Verbundprojekt
„Abundanz und Vielfalt von Clostridien in landwirtschaftlichen Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung von Clostridium botulinum“
• gefördert durch Niedersächsische Ministerium für Ernährung, Landwirtschaft, Verbraucherschutz und Landesentwicklung
• Partner:Thünen Institut für Biodiversität, Braunschweig, Dr. Anja Dohrmann, Prof. Dr. Christoph TebbeHAWK Fakultät Ressourcenmanagement, Göttingen, Ing. Meike Waltz, Prof. Dr. Löwen
• Dr. Anja Dohrmann, M. Eng. Meike Walz
12.11.2014Seite 1 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
Tierärztliche Hochschule Hannover
• Zeitraum: 1.09.2011 – 31.12.2014
• Verbesserte Nachweisgrenzen – erhöhte Sicherheit!
Prof. Dr. Christoph Tebbe* – Thünen Institut für BiodiversitätVortrag an der TiHo H, Nds. Biogasforum
12.11.2014
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Warum Clostridien?
anaerobe Bakterien
bilden Sporen – überall verbreitet
häufig dominante Bakterien in Biogasanlagen
zersetzen Proteine und Kohlenhydrate (Hydrolyse & Säurebildung)
bilden Acetat als Gärungsprodukt
12.11.2014Seite 2 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
Tierärztliche Hochschule Hannover
Acetat: wichtige Vorstufe für Methanbildung
einige Clostridien bilden Gifte, andere sind pathogen
Vielfalt der Clostridien
Sammelbegriff für viele Bakterien
ca. 152 gültige Arten
ca. 72 Arten fallen in das sog. Cluster I, d.h. Clostridium sensu stricto
Cluster I beinhaltet die pathogenen Clostridien
12.11.2014Seite 3 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
Tierärztliche Hochschule HannoverAlle Clostridien
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12.11.2014
*Email:christoph.tebbe@ti.bund.de 3
Vielfalt der Clostridien
Sammelbegriff für viele Bakterien
ca. 152 gültige Arten
Cluster I
ca. 72 Arten fallen in das sog. Cluster I, d.h. Clostridium sensu stricto
Cluster I beinhaltet die pathogenen Clostridien
Wie hoch ist ihr Anteil in Biogasanlagen?
12.11.2014Seite 4 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
Tierärztliche Hochschule HannoverAlle Clostridien
Clostridien Abundanz in einer Praxis‐Anlage
Neue Erkenntnisse dank Metagenomik
0,3%g
75,0%
24,7% Bacteria
Clostridia
Cluster I
Direkt extrahierte DNA aus Biogas‐
Reaktoren
DNA direkt sequenziert (alle Gene)
DNA‐Sequenzen mit Bioinformatik
identifiziert und nach Verwandtschaft
12.11.2014Seite 5 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
Tierärztliche Hochschule Hannover
Jaenicke et al., 2011, PLoS One
identifiziert und nach Verwandtschaft
geordnet …
Ein Viertel aller Gene kamen von Clostridien,
aber nur 0,3% aus Cluster I
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Clostridium botulinum
verursacht Botulismus durch Neurotoxine
kann als Sporenbildner fast überall vorkommen:
In Böden, Sedimenten, Pflanzenresten, …
… in Tierexkrementen, Rinder‐ oder Schweinegülle
Sporen sind inaktiv – Auskeimung bei „guten“ Bedingungen
12.11.2014Seite 6 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
Tierärztliche Hochschule Hannover
C. botulinum ist nicht eine Art, sondern ein Sammelbegriff für Neurotoxin‐bildende „Arten“ im Cluster I
Clostridium botulinum
BoNT‐Symptome (Einzelfälle)
Clostridium butryricumClostridum baratii
Gruppe IINicht proteolytischTyp B, E und F
Cluster I
Gruppe IIINicht proteolytischTyp C und D
Gruppe IV Sieben BoNT Typen
12.11.2014Seite 7 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
Tierärztliche Hochschule Hannover
Typ G
Gruppe IProteolytischTyp A, B und F
Sieben BoNT TypenA, B, C, D, E, F, G
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Nachweis von Clostridium botulinum
Nachweis über Mause‐Toxizitätstests, z.B. durch RIPAC Labor, Potsdam
Für die umfangreiche Untersuchungen von Umweltproben ethisch nicht vertretbar
Kulturelle Verfahren in Nährmedien technisch aufwendig und teuer: Anaeroben‐Kammer, Sicherheitslabor, etc.
12.11.2014Seite 8 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
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Alternative: Molekulare Verfahren – kein Risiko, Hochdurchsatz, Identifizierung verdächtiger Proben …
Clostridium botulinumEinbindung molekularer Nachweisverfahren
Extraktion von DNA aus Substraten und Gärresten ‐ PCRdann PCR, d.h. Vervielfältigung von Genen
Analyse von Clostridium Cluster I
16S rRNA Gene Cluster I vgl. m. XIVa Nachweis von Toxin‐Genen (A, E, B, F – nicht C, D, G)
12.11.2014Seite 9 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
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Bei Verdacht auf C. botulinum: BoNT Nachweis im Mäuse‐Tests
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Projektaufbau
SubstrateRinder und Schweinegülle, Hühner‐T k k t M i d G fl Sil
Cluster I, Cluster XIVa,
pathogene Clostridien
Trockenkot; Mais oder Ganzpflanzen‐Silage
Fermentation7 Batch‐Versuche, 3 Versuchen mit Quasi‐kontinuierliche Anlagen im Technikum9 Praxis‐Anlagen in Niedersachsen
Was geht rein?
16S rRNA Gene
qPCR,
DNA Sequenzierung
BoNT‐Gene
12.11.2014Seite 10 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
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Nachgärungbei 4 Praxis‐Anlagen
g
Was ist drin?
Was geht raus?
Substrate
Substrat Wdh. Anteil an den Gesamten Bakterien
(16S rRNA Gene, qPCR)
Cluster XIVa Cluster I
Rindergülle (RG) 16 7 1Rindergülle (RG) 16 7 1
Schweinegülle (SG) 12 4 14
Maissilage (MS) 19 2 1
Ganzpfl.silage (GPS) 5 2 2
Zuckerrüben Silage (ZR) 2 0,005 0,03
Hühnertrockenkot (HTK) 6 0,05 0,05
Clostridium Cluster XIVa und I sind überall
weniger in ZR und HTK
12.11.2014Seite 11 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
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weniger in ZR und HTK
zwischen beiden Clustern gibt es keine
quantitative Beziehung
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BatchversucheWichtige Ergebnisse
Fermentation unter standardisierten
Bedingungen
Gleiche Substrate unterschiedlicher Herkunft,
verschiedene Mischungen nach EEG2012,
Hühnertrockenkot
Cluster I niemals mehr als 10% der Bakterien
Abundanz variiert in Abhängigkeit der
Substrate
Batch‐Fermentationen bei der HAWK Göttingen
12.11.2014Seite 12 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
Tierärztliche Hochschule Hannover
Substrate
Im Vergleich zu den Ausgangsmischungen keine
Zunahme von Cluster I in der Fermentation
Mit Zuckerrübe signifikant mehr Cluster I
als beim Einsatz von Rindergülle
Quasi‐Kontinuierliche Anlagewichtige Ergebnisse
kontrollierte Variation der Prozessbedingungen
3 Parallelen
Mischungen: MS+HTK, MS+ZR, RG+MS
Überlastungstest
Cluster I: Abundanz variiert nach Substraten
MS+HTK mit Störung*: Zunahme von Cluster IDNA Sequenzierungen in Vorbereitung
12.11.2014Seite 13 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
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DNA‐Sequenzierungen in Vorbereitung
MS+ZR: Abnahme von Cluster I
MS+RG: Cluster I konstant bei ca. 20%
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Praxis‐Anlagen aus NiedersachsenVorstellung der Anlagen (anonym), Substratvielfalt, Umfang der analysierten Proben
BiogasanlageSubstrate
Nachwachsende Rohstoffe Exkremente Säuger Exkremente Geflügel Segment
Anlage
Maissilage
Ganzpflanzenlilage
Futterreste
Zuckerrübe
Rindergülle
Rinderm
ist
Schweinegülle
Sweinemist
Rindergülle,
Schweinegülle
Schweinemist,
Rinderm
ist
Hühnertrocken
kot
Legehennenkot
Hühnertrocken
mist
Ferm
enter
Nachgärer
Gärrestlager
P1 1 5 1 2 0
P2 1 5 5 1
P3 1 0 4 0 33
P4 0 4 1 0 0 74 21
12.11.2014Seite 14 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
Tierärztliche Hochschule Hannover
P5 0 1 0 1 13 7 19
P6 0 3 6 25 6 4
P7 0 0 3 8 6 1
P8 0 5 2 100 62 18
P9 1 0 3 11 3 2
Auswirkung von Rindergülle?Praxis‐Anlagen P1 und P2
Baugleiche Anlagen mit zwei Fermentern in Reihe (A und B)
Anlage 1: Pflanzen‐Silage (MS + WPS) plus Ringergülle (cattle manure; CM) A l 2 MS WPSAnlage 2: nur MS + WPS
A A BB Clostridium Cluster XIVa und I immer dabei
Cluster XIVa besonders hoch in Rindergülle
Immer Abnahme von A zu B
In B: Cluster I > 1 % der gesamten Bakterien
12.11.2014Seite 15 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
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Anlage 1 Anlage 2
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Clostridien Vielfalt mit BioinformatikPraxis‐Anlagen P1 und P2: Hochdurchsatz DNA Sequenzierung
Spezifischer Nachweis für Clostridien (PCR)
ca. 500.000 rRNA Gene von Clostridium Cluster I sequenziert
Diese teilen sich auf ca. 2.500 „Arten“ (OTU) auf
300 Arten so dominant, dass sie > 98 % der gesamten Clostridien repräsentierten
keine eng verwandt mit C. prefringens, C. tetani oder C.chauvoei – aber …
einige OTU mit enger Verwandtschaft zu C. botulinum
12.11.2014Seite 16 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
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C. botulinum aus P1 und P2?
insgesamt 174 Sequenzen
entspricht 0,04 % aller Cluster I Sequenzen
150 in Maissilage (Gruppe III)*
4 Sequenzen in Rindergülle (Gruppe II)*
17 Sequenzen aus Fermentern (Gruppe I)*
2 Sequenzen (MS, Ferm.) aus Gruppe IV
3 Proben mit C. botulinum Sequenzen zum
12.11.2014Seite 17 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
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3 Proben mit C. botulinum Sequenzen zum
BoNT Test (Ripac Labor)
direkt und nach Anreicherung
keine Toxizität ‐ kein C. botulinum!
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Clostridium botulinum (16S rRNA Gene)
In Praxisanlagen – Analysen noch nicht abgeschlossen
12.11.2014Seite 18 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
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Direkter Nachweis von Botulinum‐Toxin‐Genen
BiogasanlageSubstrate
Praxisanlagen: hier BoNT A und EImmer negativ (< 0,3 Genkopien ng DNA)
Anlage
Maissilage
Ganzpflanzenlilage
Futterreste
Zuckerrübe
Rindergülle
Rinderm
ist
Schweinegülle
Sweinemist
Rindergülle,
Schweinegülle
Schweinemist,
Rinderm
ist
Hühnertrockenkot
Legehennenkot
Hühnertrockenmist
Ferm
enter
Nachgärer
Gärrestlager
P1 1 5 1 2 0
P2 1 5 5 1
P3 1 0 4 0 33
Nachwachsende Rohstoffe Exkremente Säuger Exkremente Geflügel Segment
12.11.2014Seite 19 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
Tierärztliche Hochschule Hannover
P3 1 0 4 0 33
P4 0 4 1 0 0 74 21
P5 0 1 0 1 13 7 19
P6 0 3 6 25 6 4
P7 0 0 3 8 6 1
P8 0 5 2 100 62 18
P9 1 0 3 11 3 2
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BiogasanlageSubstrate
Praxisanlagen: hier BoNT FImmer negativ (< 3 Genkopien ng DNA)
Direkter Nachweis von Botulinum‐Toxin‐GenenAnlage
Maissilage
Ganzpflanzenlilage
Futterreste
Zuckerrübe
Rindergülle
Rinderm
ist
Schweinegülle
Sweinemist
Rindergülle,
Schweinegülle
Schweinemist,
Rinderm
ist
Hühnertrockenkot
Legehennenkot
Hühnertrockenmist
Ferm
enter
Nachgärer
Gärrestlager
P1 1 5 1 2 0
P2 1 5 5 1
P3 1 0 4 0 33
Nachwachsende Rohstoffe Exkremente Säuger Exkremente Geflügel Segment
12.11.2014Seite 20 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
Tierärztliche Hochschule Hannover
P3 1 0 4 0 33
P4 0 4 1 0 0 74 21
P5 0 1 0 1 13 7 19
P6 0 3 6 25 6 4
P7 0 0 3 8 6 1
P8 0 5 2 100 62 18
P9 1 0 3 11 3 2
Zusammenfassung
Clostridien aus Cluster I in allen Substraten und Biogas‐Anlagen
Rindergülle hat keinen besonders hohen Beitrag zur Cluster I Abundanz Rindergülle hat keinen besonders hohen Beitrag zur Cluster I Abundanz
Im Vergleich zu anderen Clostridien, hat Cluster I eher eine untergeordnete Rolle
Mit molekularen Nachweisverfahren können Proben zum definitiven Nachweis von C. botulinum effektiv ausgewählt werden (und Mäuse geschont werden)
Einige Proben im Projekt wiesen Sequenzen von C. botulinum auf – im Mäusetoxizitätstest zeigten dies bisher analysierten Proben aber keine Symptome
Das heißt: Bakterien mit identischen 16S rRNA Genen von C botulinummüssen nicht
12.11.2014Seite 21 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
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Das heißt: Bakterien mit identischen 16S rRNA Genen von C. botulinummüssen nicht unbedingt pathogen sein, ihre Gene könnten fehlen oder inaktiv bleiben.
Prof. Dr. Christoph Tebbe* – Thünen Institut für BiodiversitätVortrag an der TiHo H, Nds. Biogasforum
12.11.2014
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Schlussfolgerungen
Insgesamt weist kein Ergebnis des Projektes auf Risiken durch eine mögliche Anreicherung und damit Gefährdung von Biogas‐Anlagen oder deren Substrate und Gärungsprodukte durch C. botulinum
Störungen des Biogasprozesses können die Abundanz von Cluster I erhöhen
Ob damit auch eine Zunahme von C. botulinum verknüpft ist, wird zur Zeit untersucht
Dank an Anja Dohrmann, Meike Walz, Astrid Näther, Karin Trescher, BrittaMüller nd Jana Usarek
12.11.2014Seite 22 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?
Tierärztliche Hochschule Hannover
Britta Müller und Jana Usareksowie an das Niedersächsische Ministerium für Landwirtschaft
für die finanzielle Unterstützung
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