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Gentherapie und Genomics. Konteptvorlesung 17 Themenblock 7 Beda M. Stadler Institut für Immunologie. Diese Folien stehen auch als PPT Files zum download bereit unter: http://www.iib.unibe.ch/teaching/immed.htm. Einige der Folien werden als Illustration verwendet und sind nicht Lernstoff. - PowerPoint PPT Presentation
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KV 8.18 1
Gentherapie und Genomics
Konteptvorlesung 17
Themenblock 7
Beda M. Stadler
Institut für Immunologie
Einige der Folien werden als Illustration verwendet und sind nicht Lernstoff.Sie sind so wie hier entweder orange unterlegt oder umrandet
Diese Folien stehen auch als PPT Files zum download bereit unter:http://www.iib.unibe.ch/teaching/immed.htm
KV 8.18 2
Inhalt / Lernziele
• Genomics• Begriffe: Transcriptomics,
Proteomics, Structural Genomics, Knockout / transgene Tiemodelle, Comparative Genomics
• Krankheitsallele aufspüren• Pharmacogenomics
• Gentherapie• Keimbahn vs somatische
Gentherapie• Vektoren der Gentherapie• Gentherapie Strategien und
Beispiele
KV 8.18 3
Es werden immer weniger Gene...
~5000–1Viroid
1,000–23,0001–25RNA virus
5,000–800,00010–900DNA virus
580,000500Mycoplasma genitalium
5×105–107500–6,000Bacterium
1.3×1076,000Fungus
9.7×10719,000Worm
3×10815,000Honey bee
1.6×10812,000Fly
3×10925,000Human
<1011<50,000Plant
base pairsgenesorganism
Viel Genome sind sequenziert
Superkindom Kindom page How many genomes
Last update
Archeabacteria . arch 16 jul-09-02
Bacteria . bac 89 jan-13-03
Eukaryote Fungi yeast 2 apr-14-02
Eukaryote Protozoa protozoan 1 jan-13-03
Eukaryote Plant plants 2 apr-15-02
Eukaryote Animalia worm 1 apr-14-02
Eukaryote Animalia insect 1 apr-14-02
Eukaryote Animalia Mouse
rat2 jan-18-06
Eukaryote Animalia Domestic animals
2 jan-19-06
Eukaryote Animalia Human
chimpanzee2 jan-18-06
KV 8.18 4
KV 8.18 5
GENOMICS
Sequenzierung& Analyse
KV 8.18 6
Commonly Used DNA Markers
• RFLPs, or restriction fragment length polymorphisms, were among the first developed DNA markers. RFLPs are defined by the presence or absence of a specific site, called a restriction site, for a bacterial restriction enzyme. This enzyme breaks apart strands of DNA wherever they contain a certain nucleotide sequence.
• VNTRs, or variable number of tandem repeat polymorphisms, occur in non-coding regions of DNA. This type of marker is defined by the presence of a nucleotide sequence that is repeated several times. In each case, the number of times a sequence is repeated may vary.
• Microsatellite polymorphisms are defined by a variable number of repetitions of a very small number of base pairs within a sequence. Oftentimes, these repeats consist of the nucleotides, or bases, cytosine and adenosine. The number of repeats for a given microsatellite may differ between individuals, hence the term polymorphism--the existence of different forms within a population.
• SNPs, or single nucleotide polymorphisms, are individual point mutations, or substitutions of a single nucleotide, that do not change the overall length of the DNA sequence in that region. SNPs occur throughout an individual's genome.
KV 8.18 7
SSingle ingle NNucleotide ucleotide PPolymorphism olymorphism ((SNPs)
im menschlichen Genom > 2 Millionen SNPs93% der Gene enthalten SNP(s)
98% der Gene nahe bei SNP
SNP Fact Sheet
KV 8.18 8
Beispiele genetischer Krankheiten
• vererbt• X-linked
• hemophilia A/B, Duchenne’s muscular dystrophy
• autosomal rezessiv • Gaucher’s disease, cystic fibrosis
• kausal • Huntington’s chorea, retinoblastoma
• polygenetisch • diabetes mellitus, gout
• erworben• Krebs
• p53 mutations, BRCA-1, other tumor oncogenes
• Atherosclerose • FHC, plaque disruption
• Autoimmunerkrankungen
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Genomics: verwandte Gebiete
• Transcriptomics involves large‑scale analysis of messenger RNAs to follow when, where, and under what conditions genes are expressed.
• Proteomics—the study of protein expression and function
• Structural genomics generate the 3‑D structures of one or more proteins from each protein family, thus offering clues to function and biological targets for drug design.
• Knockout and transgenic studies are one experimental method for understanding the function of DNA sequences and the proteins they encode.
• Comparative genomics—analyzing DNA sequence patterns of humans and well‑studied model organisms side‑by‑side.
• Metabolomics - the analysis of small molecules, or metabolites, in biological samples
Human Genome Program, U.S. Department of Energy, Genomics and Its Impact on Medicine and Society: A 2001 Primer, 2001
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Transcriptomics
mRNA Analyse (Genexpression) mit Methoden wieNorthern Blotting oder Microarrays (siehe KV 2)
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Proteomics
RNARNA ProteinsProteins Modified Modified ProteinsProteinsDNADNA
Bio
log
ical
Fu
nc
tio
nB
iolo
gic
al F
un
cti
on
30'000 Gene30'000 Gene > 500'000 Proteine> 500'000 Proteine
Genome/Transcriptome Proteome
x 5 bis 50x 5 bis 50funktionalefunktionaleBeziehungenBeziehungenpro Proteinpro Protein
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Structural Genomics
Antikörperbindungsstelle mit und ohne Antigen (Hapten)
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Knockout / transgene Tiemodelle
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Comparative Genomics
A. Cholesterol biosynthesisB. Cell cycleC. Immediate-early responseD. Signalling and angiogenesisE. Wound healing & tissue remodelling
“Eisen results from Yeast”
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Metabolomics
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Krankheitsallele aufspürenAmniozentese
Problem• Sensitivität• Spezifität
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Krankheitsallele aufspürenSouthern blotting
bekanntePunktmutation
BeispielSichelzellanämie
drei Schnittstellen
Restriktions-analyse
Auftrennungnach Grösse
Southern blot(Hybridisierungmit mark. Probe)
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Krankheitsallele aufspüren
Condition Chromosome Location and Inheritance Pattern
Gaucher Disease 1, recessive Achondroplasia 4, dominant Huntington's Disease 4, dominant Juvenile Onset Diabetes 6,11,7, others Hemochromatosis 6, recessive Cystic Fibrosis 7, recessive Friedreich's Ataxia 9, recessive Best Disease 11, dominant Sickle Cell Disease 11, recessive Phenylketonuria 12, recessive Marfan Syndrome 15, dominant Tay-Sachs Disease 15, recessive Breast Cancer 17, 13 Myotonic Dystrophy 19, dominant Familial Hypercholesterolemia 19, imcomplete dominance Severe Combined Immune Deficiency ("Bubble Boy" Disease) 20, recessive Adrenoleukodystrophy X Duchenne Muscular Dystrophy X Hemophilia A X Rett Syndrome X Leber's Hereditary Optic Neuropathy mitochondria, maternal inheritance
Mitochondrial Encephalopathy, Lactic Acidosis, and Stroke (MELAS) mitochondria, maternal inheritance
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Pharmacogenomics
Genomics und eine neue Medizin
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• bessere Diagnose • frühere Entdeckung
genetischer Prädispositionen
• rationales Drug Design • Gentherapie und
Kontrollsysteme für Medikamente
• personalisierte Medikamente
Human Genome Program, U.S. Department of Energy, Genomics and Its Impact on Medicine and Society: A 2001 Primer, 2001
Auf die Gendiagnostik folgt die Gentherapie
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Definition und Ziel der Gentherapie
• Expression eines neuen Gens in einer Körperzelle damit die erworbenen Eigenschaften zu einen therapeutischen Erfolg beim Patienten führen
• Mit einer einzelnen Administration eine lebenslange Rekonstitution des genetischen Defekts erreichen
• Absolute Heilung
Vektor(Therapeutisches
Gen)
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Keimbahn vs somatische Gentherapie
Keimbahntherapie II
Somatische Gentherapie
Keimbahntherapie I
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:
Gentherapie und Verfassung
• Keimbahntherapie• Die DNA der Gameten
verändern • alle Nachkommen erhalten
das veränderte Gen
• Somatische Gentherapie• Nur die DNA von
somatischen Zellen wird verändert
• Nicht vererbar
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Noch in den Kinderschuhen
KV 8.18 25
Ernüchterung?
KV 8.18 26
Krankheiten im Fokus der Gentherapie
KV 8.18 27
Arten der Gentherapie
Virus
DNA
ZelleGen
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in vivo und ex vivo Gentherapie
• ex vivo (ausserhalb des Körpers)
• transduzierte somatische or hämatopoietische Zellen
• in situ (lokalisiert)
• direkte Administration (z.B. In den Tumor, s/c Depot)
• in vivo (ganzer Körper)
• systemische Administration
ex vivoin vivo
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Vektoren
• Jeder Carrier, der die Aufnahme der verändeten DNA oder ähnlicher Agentien in Zellen steigert
• Virale Vektoren• Retroviren• Adenoviren• andere Viren
• Nicht-Virale Vektoren• Liposomen• Genkanone• Injektion
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Anatomie eines Vektors
Promotor
induzierbare Elemente
Stabilisierungs undoptimisierungs Elemente
Beginn derDNA Replikation
Affinitäts Reinigungs Tag multiple Klonierungsstellen
selektierbare Marker
Viraler Vektor
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Adenovirus Vektor
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Injektion von “nackter” DNA
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Nicht-Virale Vektoren: Liposomen
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Gen-Targetting muss gelöst werden(Beipiele)
Krankheit Zielzellen Gen Defekt• Thallassemie Erythrocyten -Hämoglobin• Haemophilie A Hepatocyten Faktor VIII• SCID Lymphocyten ADA Defizienz• CGD Mono/Neutro Cytochrome b, • LAD Mono/Neutro CD18 -subunit• Gaucher's Makrophagen Glucocerebrocidase• Hunter’s Makrophagen Iduronate Desulfatase• musculäre Dyst. Muskelz. Dystrophin• Zystische Fibros. Atemwegepithel CFTR
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Retrovirale Vektoren
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Beispiel: SCID (ADA)
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To integrate or not to integrate?
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Andere Vektoren am Horizont
• Adeno-assozierte Viren• Vaccinia / Geflügelpocken• Herpesvirus• Lentivirus (HIV-attenuiert)
Vektoren: Zusammenfassung
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verwendete Vektoren
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Gentherapie Strategien
• Ersatz Gentherapie• Knockout Gentherapie• Selbstmord Gentherapie • Immunomodulatorische
Gentherapie• RNA Interferenz Therapie
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Ersatz Gentherapie
TumorsuppressorGen (TSG)
Wachstumsstop
Bystandereffekt
Apoptose
norm. Zelle: kein Effekt
Tumorzelle
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Knockout (antisense) Gentherapie
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Selbstmord Gentherapie
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Beispiel: Selbstmord Gentherapie
Thymidine kinase is introduced into tumor cells using a viral vector. Treatment with ganciclovir kills the tumor cells expressing thymidine kinase selectively.
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Immunomodulatorische Gentherapie1. Zytokine
• The basic idea of immunotherapy is to
• modify tumor cells outside the body with a cytokine gene
• transplant the cytokine-gene modified cells back into the patient (after the cells have been irradiated to prevent further cell division)
• let the host's system create an antitumor immune response
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Immunomodulatorische Gentherapie2. "altered self"
Injection of a cell surface protein attracts immune system’s cytotoxic T cells to the site of a tumor.
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Immunutherapie mit nackter DNA
KV 8.18 50
RNA Interferenz Therapie• Inhibition of HIV
infection• Cessation or
lowering of antiviral chemotherapy!
• Control of T-cell reduction
• Restoration of T cell immunity• Clearance of HIV
infected cells• Protection from OI
Anti Virus
Anti Rezeptor
KV 8.18 51
Zusammenfassung: verwendete Gene
KV 8.18 52
Gentherapie Zusammenfassung
Recommended