KV 8.18 1

Gentherapie und Genomics

Konteptvorlesung 17

Themenblock 7

Beda M. Stadler

Institut für Immunologie

Einige der Folien werden als Illustration verwendet und sind nicht Lernstoff.Sie sind so wie hier entweder orange unterlegt oder umrandet

Diese Folien stehen auch als PPT Files zum download bereit unter:http://www.iib.unibe.ch/teaching/immed.htm

KV 8.18 2

Inhalt / Lernziele

• Genomics• Begriffe: Transcriptomics,

Proteomics, Structural Genomics, Knockout / transgene Tiemodelle, Comparative Genomics

• Krankheitsallele aufspüren• Pharmacogenomics

• Gentherapie• Keimbahn vs somatische

Gentherapie• Vektoren der Gentherapie• Gentherapie Strategien und

Beispiele

KV 8.18 3

Es werden immer weniger Gene...

~5000–1Viroid

1,000–23,0001–25RNA virus

5,000–800,00010–900DNA virus

580,000500Mycoplasma genitalium

5×105–107500–6,000Bacterium

1.3×1076,000Fungus

9.7×10719,000Worm

3×10815,000Honey bee

1.6×10812,000Fly

3×10925,000Human

<1011<50,000Plant

base pairsgenesorganism

Viel Genome sind sequenziert

Superkindom Kindom page How many genomes

Last update

Archeabacteria . arch 16 jul-09-02

Bacteria . bac 89 jan-13-03

Eukaryote Fungi yeast 2 apr-14-02

Eukaryote Protozoa protozoan 1 jan-13-03

Eukaryote Plant plants 2 apr-15-02

Eukaryote Animalia worm 1 apr-14-02

Eukaryote Animalia insect 1 apr-14-02

Eukaryote Animalia Mouse

rat2 jan-18-06

Eukaryote Animalia Domestic animals

2 jan-19-06

Eukaryote Animalia Human

chimpanzee2 jan-18-06

KV 8.18 4

KV 8.18 5

GENOMICS

Sequenzierung& Analyse

KV 8.18 6

Commonly Used DNA Markers

• RFLPs, or restriction fragment length polymorphisms, were among the first developed DNA markers. RFLPs are defined by the presence or absence of a specific site, called a restriction site, for a bacterial restriction enzyme. This enzyme breaks apart strands of DNA wherever they contain a certain nucleotide sequence.

• VNTRs, or variable number of tandem repeat polymorphisms, occur in non-coding regions of DNA. This type of marker is defined by the presence of a nucleotide sequence that is repeated several times. In each case, the number of times a sequence is repeated may vary.

• Microsatellite polymorphisms are defined by a variable number of repetitions of a very small number of base pairs within a sequence. Oftentimes, these repeats consist of the nucleotides, or bases, cytosine and adenosine. The number of repeats for a given microsatellite may differ between individuals, hence the term polymorphism--the existence of different forms within a population.

• SNPs, or single nucleotide polymorphisms, are individual point mutations, or substitutions of a single nucleotide, that do not change the overall length of the DNA sequence in that region. SNPs occur throughout an individual's genome.

KV 8.18 7

SSingle ingle NNucleotide ucleotide PPolymorphism olymorphism ((SNPs)

im menschlichen Genom > 2 Millionen SNPs93% der Gene enthalten SNP(s)

98% der Gene nahe bei SNP

SNP Fact Sheet

KV 8.18 8

Beispiele genetischer Krankheiten

• vererbt• X-linked

• hemophilia A/B, Duchenne’s muscular dystrophy

• autosomal rezessiv • Gaucher’s disease, cystic fibrosis

• kausal • Huntington’s chorea, retinoblastoma

• polygenetisch • diabetes mellitus, gout

• erworben• Krebs

• p53 mutations, BRCA-1, other tumor oncogenes

• Atherosclerose • FHC, plaque disruption

• Autoimmunerkrankungen

KV 8.18 9

Genomics: verwandte Gebiete

• Transcriptomics involves large‑scale analysis of messenger RNAs to follow when, where, and under what conditions genes are expressed.

• Proteomics—the study of protein expression and function

• Structural genomics generate the 3‑D structures of one or more proteins from each protein family, thus offering clues to function and biological targets for drug design.

• Knockout and transgenic studies are one experimental method for understanding the function of DNA sequences and the proteins they encode.

• Comparative genomics—analyzing DNA sequence patterns of humans and well‑studied model organisms side‑by‑side.

• Metabolomics - the analysis of small molecules, or metabolites, in biological samples

Human Genome Program, U.S. Department of Energy, Genomics and Its Impact on Medicine and Society: A 2001 Primer, 2001

KV 8.18 10

Transcriptomics

mRNA Analyse (Genexpression) mit Methoden wieNorthern Blotting oder Microarrays (siehe KV 2)

KV 8.18 11

Proteomics

RNARNA ProteinsProteins Modified Modified ProteinsProteinsDNADNA

Bio

log

ical

Fu

nc

tio

nB

iolo

gic

al F

un

cti

on

30'000 Gene30'000 Gene > 500'000 Proteine> 500'000 Proteine

Genome/Transcriptome Proteome

x 5 bis 50x 5 bis 50funktionalefunktionaleBeziehungenBeziehungenpro Proteinpro Protein

KV 8.18 12

Structural Genomics

Antikörperbindungsstelle mit und ohne Antigen (Hapten)

KV 8.18 13

Knockout / transgene Tiemodelle

KV 8.18 14

Comparative Genomics

A. Cholesterol biosynthesisB. Cell cycleC. Immediate-early responseD. Signalling and angiogenesisE. Wound healing & tissue remodelling

“Eisen results from Yeast”

KV 8.18 15

Metabolomics

KV 8.18 16

Krankheitsallele aufspürenAmniozentese

Problem• Sensitivität• Spezifität

KV 8.18 17

Krankheitsallele aufspürenSouthern blotting

bekanntePunktmutation

BeispielSichelzellanämie

drei Schnittstellen

Restriktions-analyse

Auftrennungnach Grösse

Southern blot(Hybridisierungmit mark. Probe)

KV 8.18 18

Krankheitsallele aufspüren

Condition Chromosome Location and Inheritance Pattern

Gaucher Disease 1, recessive Achondroplasia 4, dominant Huntington's Disease 4, dominant Juvenile Onset Diabetes 6,11,7, others Hemochromatosis 6, recessive Cystic Fibrosis 7, recessive Friedreich's Ataxia 9, recessive Best Disease 11, dominant Sickle Cell Disease 11, recessive Phenylketonuria 12, recessive Marfan Syndrome 15, dominant Tay-Sachs Disease 15, recessive Breast Cancer 17, 13 Myotonic Dystrophy 19, dominant Familial Hypercholesterolemia 19, imcomplete dominance Severe Combined Immune Deficiency ("Bubble Boy" Disease) 20, recessive Adrenoleukodystrophy X Duchenne Muscular Dystrophy X Hemophilia A X Rett Syndrome X Leber's Hereditary Optic Neuropathy mitochondria, maternal inheritance

Mitochondrial Encephalopathy, Lactic Acidosis, and Stroke (MELAS) mitochondria, maternal inheritance

KV 8.18 19

Pharmacogenomics

Genomics und eine neue Medizin

KV 8.18 20

• bessere Diagnose • frühere Entdeckung

genetischer Prädispositionen

• rationales Drug Design • Gentherapie und

Kontrollsysteme für Medikamente

• personalisierte Medikamente

Human Genome Program, U.S. Department of Energy, Genomics and Its Impact on Medicine and Society: A 2001 Primer, 2001

Auf die Gendiagnostik folgt die Gentherapie

KV 8.18 21

Definition und Ziel der Gentherapie

• Expression eines neuen Gens in einer Körperzelle damit die erworbenen Eigenschaften zu einen therapeutischen Erfolg beim Patienten führen

• Mit einer einzelnen Administration eine lebenslange Rekonstitution des genetischen Defekts erreichen

• Absolute Heilung

Vektor(Therapeutisches

Gen)

KV 8.18 22

Keimbahn vs somatische Gentherapie

Keimbahntherapie II

Somatische Gentherapie

Keimbahntherapie I

KV 8.18 23

:

Gentherapie und Verfassung

• Keimbahntherapie• Die DNA der Gameten

verändern • alle Nachkommen erhalten

das veränderte Gen

• Somatische Gentherapie• Nur die DNA von

somatischen Zellen wird verändert

• Nicht vererbar

KV 8.18 24

Noch in den Kinderschuhen

KV 8.18 25

Ernüchterung?

KV 8.18 26

Krankheiten im Fokus der Gentherapie

KV 8.18 27

Arten der Gentherapie

Virus

DNA

ZelleGen

KV 8.18 28

in vivo und ex vivo Gentherapie

• ex vivo (ausserhalb des Körpers)

• transduzierte somatische or hämatopoietische Zellen

• in situ (lokalisiert)

• direkte Administration (z.B. In den Tumor, s/c Depot)

• in vivo (ganzer Körper)

• systemische Administration

ex vivoin vivo

KV 8.18 29

Vektoren

• Jeder Carrier, der die Aufnahme der verändeten DNA oder ähnlicher Agentien in Zellen steigert

• Virale Vektoren• Retroviren• Adenoviren• andere Viren

• Nicht-Virale Vektoren• Liposomen• Genkanone• Injektion

KV 8.18 30

Anatomie eines Vektors

Promotor

induzierbare Elemente

Stabilisierungs undoptimisierungs Elemente

Beginn derDNA Replikation

Affinitäts Reinigungs Tag multiple Klonierungsstellen

selektierbare Marker

Viraler Vektor

KV 8.18 31

KV 8.18 32

Adenovirus Vektor

KV 8.18 33

Injektion von “nackter” DNA

KV 8.18 34

Nicht-Virale Vektoren: Liposomen

KV 8.18 35

Gen-Targetting muss gelöst werden(Beipiele)

Krankheit Zielzellen Gen Defekt• Thallassemie Erythrocyten -Hämoglobin• Haemophilie A Hepatocyten Faktor VIII• SCID Lymphocyten ADA Defizienz• CGD Mono/Neutro Cytochrome b, • LAD Mono/Neutro CD18 -subunit• Gaucher's Makrophagen Glucocerebrocidase• Hunter’s Makrophagen Iduronate Desulfatase• musculäre Dyst. Muskelz. Dystrophin• Zystische Fibros. Atemwegepithel CFTR

KV 8.18 36

Retrovirale Vektoren

KV 8.18 37

Beispiel: SCID (ADA)

KV 8.18 38

To integrate or not to integrate?

KV 8.18 39

Andere Vektoren am Horizont

• Adeno-assozierte Viren• Vaccinia / Geflügelpocken• Herpesvirus• Lentivirus (HIV-attenuiert)

Vektoren: Zusammenfassung

KV 8.18 40

KV 8.18 41

verwendete Vektoren

KV 8.18 42

Gentherapie Strategien

• Ersatz Gentherapie• Knockout Gentherapie• Selbstmord Gentherapie • Immunomodulatorische

Gentherapie• RNA Interferenz Therapie

KV 8.18 43

Ersatz Gentherapie

TumorsuppressorGen (TSG)

Wachstumsstop

Bystandereffekt

Apoptose

norm. Zelle: kein Effekt

Tumorzelle

KV 8.18 44

Knockout (antisense) Gentherapie

KV 8.18 45

Selbstmord Gentherapie

KV 8.18 46

Beispiel: Selbstmord Gentherapie

Thymidine kinase is introduced into tumor cells using a viral vector. Treatment with ganciclovir kills the tumor cells expressing thymidine kinase selectively.

KV 8.18 47

Immunomodulatorische Gentherapie1. Zytokine

• The basic idea of immunotherapy is to

• modify tumor cells outside the body with a cytokine gene

• transplant the cytokine-gene modified cells back into the patient (after the cells have been irradiated to prevent further cell division)

• let the host's system create an antitumor immune response

KV 8.18 48

Immunomodulatorische Gentherapie2. "altered self"

Injection of a cell surface protein attracts immune system’s cytotoxic T cells to the site of a tumor.

KV 8.18 49

Immunutherapie mit nackter DNA

KV 8.18 50

RNA Interferenz Therapie• Inhibition of HIV

infection• Cessation or

lowering of antiviral chemotherapy!

• Control of T-cell reduction

• Restoration of T cell immunity• Clearance of HIV

infected cells• Protection from OI

Anti Virus

Anti Rezeptor

KV 8.18 51

Zusammenfassung: verwendete Gene

KV 8.18 52

Gentherapie Zusammenfassung