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Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am MainFachbereich 15: Biologie und InformatikJunior Prof. Dr. Dirk Metzler

Sebastian Bremm

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Größenbestimmung bei MicroarrayexperimentenKlassenvergleiche und Classifier

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Microarrays

• Dienen zur Erkennung von Expressionsprodukten.

• Platten aus Glas, Silizium etc.• Enthalten die Gene des Organismus.• Position jedes Gens auf Platte ist bekannt.

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Versuchsablauf• Transkriptionsprodukte (Targets) werden

auf das MA gegeben. Diese sind mit Fluoreszenz-Markern versehen.

• Binden der Targets an den komplementären Strängen auf dem MA.

• Waschen um nicht oder unzureichend gebundene Targets zu entfernen.

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Auswertung• Farbstoffe werden durch Laser zum

Leuchten gebracht. • Scannen des Bildes.• Normalisierung. • Fehlerbeseitigung• Erstellen der Genexpressionsmatrix.

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Warum Versuchsgrößenbestimmung?

• Beschränkungen durch:– Finanzmittel– Zeit– Vorhandene Proben

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Klassen-Vergleiche

• Vergleich von zwei Gewebetypenz.B.:

- Krebsgewebe normales Gewebe- histologisch verschiedene Krebsgewebe

• Ziel ist es, unterschiedliche Gen-Expressionen zu identifizieren.

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Verschiedene MA-Versuchstypen

• Single Label/ Double Label– Pooling– Dye Swap– Nutzen von technischen Replikaten

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Single Label Arrays

• DNA – Oligonukleotid MAs (Affymetrix)• Nur Targets einer Zelle• Hohe Spotdichte• teuer

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Notation• Floureszens-Intensität: Ygadvfs

– g :1,2,...G | Gen– a :1,...,n | Array– d : 1 = Single Label; 2 = double Label | Farbe– v : 1,2 | Phänotypen– f : 1,2,...F | Individuen– s : 1,2,...m | Unterprobe/technisches Replikat

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Single Label MAs

• Log (Ygadvfs) = Gg + GVgv + (GF)gf(v) + gadvfs

– Gg = Genexpression von g in der Population

– GVgv = Effekt der Klasse oder des Typs

– (GF)gf(v) = individueller Effekt gadvfs = unabh. Fehler mit Normal(0, )

2x

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),σNormal(

Normaly

mlnkyw

Normal

Normalx

mjnixz

kl

xk

klkykl

ij

xi

ijixij

2

2

2

2

fsg2fsfsg1fs

0~

),0(~

..1;...1;

),0(~

),0(~

..1;...1;

w Y , z Y

Single Label MAs

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Varianz e technisch

Varianz ebiologisch

Entdeckte negativfalsch Entdeckte positvfalsch zchschnitteKlassendurder Distanz

Sample pro Replikateer technischAnzahl msMicroarray benötigtenan Anzahl totalen

)(][4

2

2

/2

2222/

g

g

gg

z

mzz

mn

Single Label MAs

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Single Label MAs

Samplesdlichen unterschie biologischder Anzahl /

)(][4/2

222/

mnm

zzmn g

g

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Dual Label Arrays

• cDNA MAs• Targets von 2 Zellen. Dies erleichtert einen

direkten Vergleich• Teilweise geringe Spotdichte

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Dual Label MAs

• Log (Ygadvfs) = Gg + GAga + GDgd + GVgv+ (GF)gf(v) + gadvfs

– Gg = Genexpression von g in der Population– GAga = Spot auf Array– GDgd = Effekt des Färbemittels– GVgv = Effekt der Klasse oder des Typs – (GF)gf(v) = individueller Effekt gadvfs = unabh. Fehler mit Normal(0, )

2x

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Dual Label MAs

• Referenz Design:

A1

R

A2

R

B1 B2

R R

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Dual Label MAs

• Reference Design

Muss aus vorherigen Daten geschätzt werden.

Klassen.der einer innerhalb Varianz 2

)2(][4

22

2222/

gg

gg

zzn

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Dual Label MAs

• Design mit technischen Replikaten und Dye Swap:

)2

(][42

222/

mzz

mn gg

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Dual Label MAs

α = 0,001β = 0,05δ = 1

VarianzVerhältnis

technische Replikate /Sample

Anzahl benötigter Arrays

Anzahl benötigter Samples 

2 1 49 49  2 74 37  3 99 33  4 124 314 1 49 49  2 82 41  3 114 38  4 148 37

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Dual Label Mas

.Replikatenhnischen keinen tec bei n Anzahl zur Verhältnis im Replikaten m bei

Arrays Benötigtender Anzahl dieist n

]2)/(2)/(

[

1

m

22

22

1

gg

ggm

mnn

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Dual Label MAs

• Block Design:

A2 A3

B2

A1

B1

A4

B3 B4

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Dual Label MAs

• Balanced Block Design– Leichter Vergleich von 2 Klassen.– Weniger Arrays benötigt.– unflexibel

)2()( 22

2,2

1,

2

22/

ggg

zzn

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Dual Label MAs

• Single Paired Design– Natürliche biologische Paarungen ( z.B. von

Individuum vor und nach einer Behandlung).– Je eine Seite mit einer Farbe pro Probe.

– η an Stelle von τ. Varianz des veränderten Gewebes (z.B. Tumor) zum normalen Gewebe.

)2()( 22

2

22/

ggbalanced

zzn

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Dual Label MAs

• Dye-Swap Paired Design– Die gleichen Targets wie Single Paired Design.– Die gleichen Arrays werden nocheinmal mit

dem jeweils anderen Fluoreszensstoff ausgewertet.

)2()( 22

2

22/

ggdyeswap

zzn

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Prognostic Markers• Finden von Genen oder Genklassen, die bei

einer Krankheit exprimiert werden.

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Prognostic Markers

• Effekt von Pooling

• Mehr Samples weniger Arrays

Samplesen biologischen unabhängigan Anzahl

)2

()(

4222

22/

kmk

zzmn gg

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Prognostic Markers

• α = Wahrscheinlichkeit für falsch positive Entdeckung.

• 1-β = Wahrscheinlichkeit richtig positive Entdeckung.

• Problem: Wie wählt man α?

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Prognostic Markers

Genenan Anzahl GGeneen exprimiert andersder Anteil

)1(1

Entdeckte richtig #Entdecktefalsch #

]##

#[

GE[#TD]

π)Gα(E[#FD] FDFD

TDFDFDEFDR

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Prognostic Markers

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Prognostic Markers

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Training eines Classifiers

• Ein Classifier soll Gene als Prognostic Marker erkennen.

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Training eines Classifiers

• Bedingung: Solle wenige Samples brauchen• Lösung: Sequentielle Bestimmung• Vorteile

– Lernt durch eigene Erfahrung.– Stopp-Kriterium wird bei jedem Schritt

überprüft.– Erzielen der gewünschten Signifikanz garantiert– Mit jeder Klassifikationsmethode einsetzbar.

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Training eines Classifiers

N

ii

N

N

ii

N

QN

k

NQN

kzN

1

1

^

0

2

1

1

^

1

0

0

,min