Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Technische Universität...

Klinik und Poliklinik für UrologieUniversitätsklinikum Carl Gustav Carus

Technische Universität Dresden

Institut für BiochemieFakultät Mathematik und Naturwissenschaften

Technische Universität Dresden

Untersuchungen zur Multitarget-Geninhibierung durch Nukleinsäurekonstrukte

an humanen Harnblasenkarzinomzelllinien

Yvonne Burmeister

Dresden, 21.07.2005

in Kooperation

mit

• Einleitung:BCa,

Targets: hTERT, SVV, VEGF

siRNA & AS-ODN

• Ziel- und Aufgabenstellung

• Ergebnisse

• Zusammenfassende Bewertung und Ausblick

- Überblick -

2

• Vierthäufigster Tumor bei Männern

• Siebthäufigste Krebstodesursache in Deutschland

• Männer sind ca. 3 häufiger betroffen als Frauen

• 17.500 Neuerkrankungen pro Jahr in Deutschland

• Gehäuftes Auftreten im Alter

(Durchschnittsalter zum Diagnosezeitpunkt: 65 J.)

- Das Harnblasenkarzinom -

3Einleitung

- Therapie des Harnblasenkarzinom (BCa) -

4

Oberflächliches BCa Transurethrale Resektion des Rezidivhäufigkeit (50-70%)

Blasentumors (TURB) Progressionsrisiko (10-20%)

Muskelinvasives BCa Zystektomie (Blasenentfernung) geringe Überlebensrate

Zusätzlich: Chemo-, Strahlen-, Immuntherapie,

Kombinationsbehandlungen

Suche nach alternativen oder/und additiven Therapieformen

1 carcinoma in situ2/3 papilläres Karzinom4 Infiltration in die

oberflächliche Muskulatur5 Befall der tiefen Muskulatur6/7/8 Ausdehnung durch die

Blasenwand

http://www.cytochemia.de/HomePage_CC/Pat_Ind/Carcinome/carcinome.html

Einleitung

- Tumor- und BCa-relevante Targets -

Humane Verlängerung - in > 90% aller Tumore, Telomerase Reverse und einschließlich des BCas, kann eine Transkriptase Stabilisierung Telomeraseaktivität nachgewiesen (hTERT) der Telomere werden

Survivin Apoptose- - vierthäufigstes Transkript in (SVV) inhibitor malignen Tumoren

- Korrelation mit Tumorgrad, Rezidivierung und Überleben

Vaskulärer Angiogenese- - VEGF-Überexpression in endothelialer faktor zahlreichen TumorenWachstumsfaktor - Korrelation mit Tumorprogression(VEGF)

5Einleitung

- Techniken der Geninhibierung -

Antisense-Oligodesoxynukleotide(AS-ODN)

small interfering RNA (siRNA)

Einleitung 6

1. AS-ODN-Kombinationstherapie in vitro

hTERT + SVV + VEGF

2. Entwicklung einer siRNA gegen VEGF

3. siRNA-Kombinationstherapie in vitro

hTERT + SVV + ?

4. siRNA gegen VEGF + Chemotherapeutika

- Aufgaben- & Zielstellung -

Erhöhung der Wirkung der Behandlung mit Einzelkonstrukten?

Steigerung der Effektivität herkömmlicher Chemotherapeutika?

7

- Behandlungs- und Bewertungsschema für die Kombinationen -

SVV + VEGF

VEGF + NS-K

Nonsense-Konstrukt (NS-K) unbehandelte Zellen

8

hTERT + VEGF

SVV + NS-K

hTERT + SVV

hTERT + NS-K

hTERT SVV VEGF

0

20

40

60

80

100

120

140

160

rela

tive

Via

bilit

ät

[ % N

S-K

1 ]

500 nM je 250 nM

24 h post Trf

48 h post Trf

72 h post Trf

- Kombination der AS-ODN gegen hTERT, SVV und VEGF -

WST-1-Viabilitätstest kombinationsbehandelter EJ28-Zellen

keine Verstärkung der Wirkeffekte9Ergebnisse

Apoptoseraten

Zellzahl

Langzeitproliferation

Zellzyklusverteilung

EJ28

- Kombination der AS-ODN gegen hTERT, SVV und VEGF -

Behandlung Gesamtapoptose

ASt2331 33,0 %

ASsvv286 21,3 %

ASvegf857 30,9 %

NS-K1 12,1 %

ASt2331 + NS-K1 30,1 %

ASsvv286 + NS-K1 24,0 %

Asvegf + NS-K1 24,8 %

ASt2331 + ASsvv286 29,3 %

ASt2331 + ASvegf857 27,4 %

ASsvv286 + ASvegf857 24,1 %

unbehandelte Zellen 7,1 %

keine zunehmenden antiproliferativen Effekte in keiner der beiden Zelllinien bei keiner Methodik

zweite Zelllinie (5637)

10Ergebnisse

nachgewiesene Wirksamkeit

bis zu 72h bereits bei 200nM

Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit siVEGF203 Takei et al., 2004

siVEGF437 Filleur et al., 2003

siVEGF865

siVEGF865Systematische Charakterisierung in drei BCa-Zelllinien

Zelllinie EJ28 5637 RT112

VEGF-mRNA -65 % -75 % -70 %

VEGF-Protein -50 % -70 % -70 %

keinen Einfluss auf das Zellwachstum(Viabilität, Langzeitproliferation, Apoptose, Zellzyklusverteilung)

- Testung und Charakterisierung einer siRNA gegen VEGF -

effektive, reproduzierbare Inhibierung von VEGFjedoch keine wachstumsinhibitorischen Effekte

11Ergebnisse

- Kombination der siRNA gegen hTERT, SVV und VEGF -

WST-1-Viabilitätstest EJ28-Zellen 5637-Zellen

12

0

20

40

60

80

100

120

140

rela

tive

Via

bili

tät

[ %

NS

-si ] 400 nM je 200 nM

*

0

20

40

60

80

100

120

140

rela

tive

Via

bili

tät

[ %

NS

-si ]

400 nM je 200 nM

* *** ***

RT112-Zellen - keine Verstärkungseffekte

verstärkende Effekte abhängig von der Zelllinie

Ergebnisse

- Kombination von siVEGF mit Chemotherapeutika -

0

20

40

60

80

100

120

siV

EG

F86

5

siV

EG

F43

7

siV

EG

F20

3

NS

-siR

NA

siV

EG

F86

5

siV

EG

F43

7

siV

EG

F20

3

NS

-siR

NA

siV

EG

F86

5

siV

EG

F43

7

siV

EG

F20

3

NS

-siR

NA

siV

EG

F86

5

siV

EG

F43

7

siV

EG

F20

3

NS

-siR

NA

siV

EG

F86

5

siV

EG

F43

7

siV

EG

F20

3

NS

-siR

NA

siV

EG

F86

5

siV

EG

F43

7

siV

EG

F20

3

NS

-siR

NA

siV

EG

F86

5

siV

EG

F43

7

siV

EG

F20

3

NS

-siR

NA

rela

tiv

e V

iab

ilit

ät

[ %

NS

-siR

NA

]

** * ***

**

***

***** *

*

+ MMC-1 + MMC-2 + CDDP-1 + CDDP-2 + GEM-1 + GEM-2

Chemosensitivierung von BCa-Zellen

WST-1-Viabilitätstest von 5637-Zellen

13Ergebnisse

Zelllinie siRNA MMC-1 MMC-2 CDDP-1 CDDP-2 GEM-1 GEM-2

EJ28siVEGF865 - - ++ +++ - -

siVEGF437 + ++ +++ +++ - +

siVEGF203 - - +++ ++ - +

5637siVEGF865 - + - - - -

siVEGF437 ++ ++ ++ ++ - -

siVEGF203 - - +++ +++ + +

RT112siVEGF865 + - - + - -

siVEGF437 - - + + - -

siVEGF203 - - ++ ++ - -

- Kombination von siVEGF mit Chemotherapeutika -

14

Chemosensitivierende Wirkung aller Konstrukteabhängig von Zelllinie und Chemotherapeutikum

Signifikante Unterschiede der Zellviabilität [p<0,05 (+), p<0,01 (++), p<0,001 (+++)]

Ergebnisse

1. AS-ODN-Kombinationstherapie

hTERT / SVV / VEGF

2. siRNA gegen VEGF

3. siRNA-Kombinationstherapie

hTERT / SVV / VEGF

4. siVEGF + Chemotherapeutika

15

- Zusammenfassende Bewertung -

keine Verstärkung der Wirkeffekte

reproduzierbare Inhibierung von VEGF ohne wachstumsinhibitorische Effekte

Verstärkungseffekte abhängig von der Zelllinie

Chemosensitivierende Wirkung der Konstrukte abhängig von Zelllinie und Chemotherapeutikum

1. AS-ODN- Kombinationstherapie

2. siRNA gegen VEGF

3. siRNA-

Kombinationstherapie

4. Kombination von siVEGF

und Chemotherapeutika

16

- Dreierkombination in vitro

- in vivo-Studien

- ausführliche in vitro-Charakterisierung- in vivo-Studien - Dreierkombination in vitro

- in vivo-Studien

- Ausblick -

Harnblase orthotop subkutan

Xenotransplantatmodell

Vielen Dank an die Mitarbeiter des Urologischen Forschungslabors und alle weiteren Personen, die

mich bei der Anfertigung der Diplomarbeit unterstützten!

O

F

FHO

OH

N N

NH2

O

Pt

NH3H3N

ClCl

O

O

H2N

H3C N

OCH3

NH

CH2OCONH2

Mitomycin C Cisplatin Gemcitabin

- Chemotherapeutika -

- Methoden -

S-Phase37,06 %

G0/G1-Phase59,75 %

G0/G1-Phase47,48 %

G2/M-Phase15,46 %

G2/M-Phase12.37 %

S-Phase 27,89 %

Sub-G0-Peak

NS-K1-behandelte 5637-Zellen

ASt2331+ASvegf857-behandelte 5637-Zellen

A B

CD

- Methoden -

+N

N N

N

SO3Na

SO3Na

NO2I

NADH NAD+

Tetrazoliumsalz

N

N N

HN

SO3Na

SO3Na

NO2I

Formazan

- Methoden -

Target Vergleich der mRNA-Expression Referenzen

SVV-mRNA EJ28 (++++) > 5637 (+++) > RT112 (++) Fuessel et al., 2004

VEGF-mRNA EJ28 (++++) > 5637 (++) > RT112 (++) Krause et al., 2005

hTERT-mRNA EJ28 (++++) > 5637 (+) > RT112 (+) Kraemer, pers. Mitteilung

EJ28 5637

mRNA-Expression hTERT SVV VEGF hTERT SVV VEGF

ASt2331+ASsvv286 ↓ - ↑ - - ↓

ASt2331+ASvegf857 - - - - ↑ ↓

ASsvv286+ASvegf857 - ↓ ↑ ↓ - -