Klinik und Poliklinik für UrologieUniversitätsklinikum Carl Gustav Carus

Technische Universität Dresden

Institut für BiochemieFakultät Mathematik und Naturwissenschaften

Technische Universität Dresden

Untersuchungen zur Multitarget-Geninhibierung durch Nukleinsäurekonstrukte

an humanen Harnblasenkarzinomzelllinien

Yvonne Burmeister

Dresden, 21.07.2005

in Kooperation

mit

• Einleitung:BCa,

Targets: hTERT, SVV, VEGF

siRNA & AS-ODN

• Ziel- und Aufgabenstellung

• Ergebnisse

• Zusammenfassende Bewertung und Ausblick

- Überblick -

2

• Vierthäufigster Tumor bei Männern

• Siebthäufigste Krebstodesursache in Deutschland

• Männer sind ca. 3 häufiger betroffen als Frauen

• 17.500 Neuerkrankungen pro Jahr in Deutschland

• Gehäuftes Auftreten im Alter

(Durchschnittsalter zum Diagnosezeitpunkt: 65 J.)

- Das Harnblasenkarzinom -

3Einleitung

- Therapie des Harnblasenkarzinom (BCa) -

4

Oberflächliches BCa Transurethrale Resektion des Rezidivhäufigkeit (50-70%)

Blasentumors (TURB) Progressionsrisiko (10-20%)

Muskelinvasives BCa Zystektomie (Blasenentfernung) geringe Überlebensrate

Zusätzlich: Chemo-, Strahlen-, Immuntherapie,

Kombinationsbehandlungen

Suche nach alternativen oder/und additiven Therapieformen

1 carcinoma in situ2/3 papilläres Karzinom4 Infiltration in die

oberflächliche Muskulatur5 Befall der tiefen Muskulatur6/7/8 Ausdehnung durch die

Blasenwand

http://www.cytochemia.de/HomePage_CC/Pat_Ind/Carcinome/carcinome.html

Einleitung

- Tumor- und BCa-relevante Targets -

Humane Verlängerung - in > 90% aller Tumore, Telomerase Reverse und einschließlich des BCas, kann eine Transkriptase Stabilisierung Telomeraseaktivität nachgewiesen (hTERT) der Telomere werden

Survivin Apoptose- - vierthäufigstes Transkript in (SVV) inhibitor malignen Tumoren

- Korrelation mit Tumorgrad, Rezidivierung und Überleben

Vaskulärer Angiogenese- - VEGF-Überexpression in endothelialer faktor zahlreichen TumorenWachstumsfaktor - Korrelation mit Tumorprogression(VEGF)

5Einleitung

- Techniken der Geninhibierung -

Antisense-Oligodesoxynukleotide(AS-ODN)

small interfering RNA (siRNA)

Einleitung 6

1. AS-ODN-Kombinationstherapie in vitro

hTERT + SVV + VEGF

2. Entwicklung einer siRNA gegen VEGF

3. siRNA-Kombinationstherapie in vitro

hTERT + SVV + ?

4. siRNA gegen VEGF + Chemotherapeutika

- Aufgaben- & Zielstellung -

Erhöhung der Wirkung der Behandlung mit Einzelkonstrukten?

Steigerung der Effektivität herkömmlicher Chemotherapeutika?

7

- Behandlungs- und Bewertungsschema für die Kombinationen -

SVV + VEGF

VEGF + NS-K

Nonsense-Konstrukt (NS-K) unbehandelte Zellen

8

hTERT + VEGF

SVV + NS-K

hTERT + SVV

hTERT + NS-K

hTERT SVV VEGF

0

20

40

60

80

100

120

140

160

rela

tive

Via

bilit

ät

[ % N

S-K

1 ]

500 nM je 250 nM

24 h post Trf

48 h post Trf

72 h post Trf

- Kombination der AS-ODN gegen hTERT, SVV und VEGF -

WST-1-Viabilitätstest kombinationsbehandelter EJ28-Zellen

keine Verstärkung der Wirkeffekte9Ergebnisse

Apoptoseraten

Zellzahl

Langzeitproliferation

Zellzyklusverteilung

EJ28

- Kombination der AS-ODN gegen hTERT, SVV und VEGF -

Behandlung Gesamtapoptose

ASt2331 33,0 %

ASsvv286 21,3 %

ASvegf857 30,9 %

NS-K1 12,1 %

ASt2331 + NS-K1 30,1 %

ASsvv286 + NS-K1 24,0 %

Asvegf + NS-K1 24,8 %

ASt2331 + ASsvv286 29,3 %

ASt2331 + ASvegf857 27,4 %

ASsvv286 + ASvegf857 24,1 %

unbehandelte Zellen 7,1 %

keine zunehmenden antiproliferativen Effekte in keiner der beiden Zelllinien bei keiner Methodik

zweite Zelllinie (5637)

10Ergebnisse

nachgewiesene Wirksamkeit

bis zu 72h bereits bei 200nM

Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit siVEGF203 Takei et al., 2004

siVEGF437 Filleur et al., 2003

siVEGF865

siVEGF865Systematische Charakterisierung in drei BCa-Zelllinien

Zelllinie EJ28 5637 RT112

VEGF-mRNA -65 % -75 % -70 %

VEGF-Protein -50 % -70 % -70 %

keinen Einfluss auf das Zellwachstum(Viabilität, Langzeitproliferation, Apoptose, Zellzyklusverteilung)

- Testung und Charakterisierung einer siRNA gegen VEGF -

effektive, reproduzierbare Inhibierung von VEGFjedoch keine wachstumsinhibitorischen Effekte

11Ergebnisse

- Kombination der siRNA gegen hTERT, SVV und VEGF -

WST-1-Viabilitätstest EJ28-Zellen 5637-Zellen

12

0

20

40

60

80

100

120

140

rela

tive

Via

bili

tät

[ %

NS

-si ] 400 nM je 200 nM

*

0

20

40

60

80

100

120

140

rela

tive

Via

bili

tät

[ %

NS

-si ]

400 nM je 200 nM

* *** ***

RT112-Zellen - keine Verstärkungseffekte

verstärkende Effekte abhängig von der Zelllinie

Ergebnisse

- Kombination von siVEGF mit Chemotherapeutika -

0

20

40

60

80

100

120

siV

EG

F86

5

siV

EG

F43

7

siV

EG

F20

3

NS

-siR

NA

siV

EG

F86

5

siV

EG

F43

7

siV

EG

F20

3

NS

-siR

NA

siV

EG

F86

5

siV

EG

F43

7

siV

EG

F20

3

NS

-siR

NA

siV

EG

F86

5

siV

EG

F43

7

siV

EG

F20

3

NS

-siR

NA

siV

EG

F86

5

siV

EG

F43

7

siV

EG

F20

3

NS

-siR

NA

siV

EG

F86

5

siV

EG

F43

7

siV

EG

F20

3

NS

-siR

NA

siV

EG

F86

5

siV

EG

F43

7

siV

EG

F20

3

NS

-siR

NA

rela

tiv

e V

iab

ilit

ät

[ %

NS

-siR

NA

]

** * ***

**

***

***** *

*

+ MMC-1 + MMC-2 + CDDP-1 + CDDP-2 + GEM-1 + GEM-2

Chemosensitivierung von BCa-Zellen

WST-1-Viabilitätstest von 5637-Zellen

13Ergebnisse

 

Zelllinie siRNA MMC-1 MMC-2 CDDP-1 CDDP-2 GEM-1 GEM-2

EJ28siVEGF865 - - ++ +++ - -

siVEGF437 + ++ +++ +++ - +

siVEGF203 - - +++ ++ - +

5637siVEGF865 - + - - - -

siVEGF437 ++ ++ ++ ++ - -

siVEGF203 - - +++ +++ + +

RT112siVEGF865 + - - + - -

siVEGF437 - - + + - -

siVEGF203 - - ++ ++ - -

- Kombination von siVEGF mit Chemotherapeutika -

14

Chemosensitivierende Wirkung aller Konstrukteabhängig von Zelllinie und Chemotherapeutikum

Signifikante Unterschiede der Zellviabilität [p<0,05 (+), p<0,01 (++), p<0,001 (+++)]

Ergebnisse

1. AS-ODN-Kombinationstherapie

hTERT / SVV / VEGF

2. siRNA gegen VEGF

3. siRNA-Kombinationstherapie

hTERT / SVV / VEGF

4. siVEGF + Chemotherapeutika

15

- Zusammenfassende Bewertung -

keine Verstärkung der Wirkeffekte

reproduzierbare Inhibierung von VEGF ohne wachstumsinhibitorische Effekte

Verstärkungseffekte abhängig von der Zelllinie

Chemosensitivierende Wirkung der Konstrukte abhängig von Zelllinie und Chemotherapeutikum

1. AS-ODN- Kombinationstherapie

2. siRNA gegen VEGF

3. siRNA-

Kombinationstherapie

4. Kombination von siVEGF

und Chemotherapeutika

16

- Dreierkombination in vitro

- in vivo-Studien

- ausführliche in vitro-Charakterisierung- in vivo-Studien - Dreierkombination in vitro

- in vivo-Studien

- Ausblick -

Harnblase orthotop subkutan

Xenotransplantatmodell

Vielen Dank an die Mitarbeiter des Urologischen Forschungslabors und alle weiteren Personen, die

mich bei der Anfertigung der Diplomarbeit unterstützten!

       

O

F

FHO

OH

N N

NH2

O

Pt

NH3H3N

ClCl

O

O

H2N

H3C N

OCH3

NH

CH2OCONH2

Mitomycin C Cisplatin Gemcitabin

    

- Chemotherapeutika -

- Methoden -

S-Phase37,06 %

G0/G1-Phase59,75 %

G0/G1-Phase47,48 %

G2/M-Phase15,46 %

G2/M-Phase12.37 %

S-Phase 27,89 %

Sub-G0-Peak

NS-K1-behandelte 5637-Zellen

ASt2331+ASvegf857-behandelte 5637-Zellen

 

A B

CD

 

- Methoden -

 

+N

N N

N

SO3Na

SO3Na

NO2I

NADH NAD+

Tetrazoliumsalz

N

N N

HN

SO3Na

SO3Na

NO2I

Formazan

- Methoden -

Target Vergleich der mRNA-Expression Referenzen

SVV-mRNA EJ28 (++++) > 5637 (+++) > RT112 (++) Fuessel et al., 2004

VEGF-mRNA EJ28 (++++) > 5637 (++) > RT112 (++) Krause et al., 2005

hTERT-mRNA EJ28 (++++) > 5637 (+) > RT112 (+) Kraemer, pers. Mitteilung

 

 

EJ28 5637

mRNA-Expression hTERT SVV VEGF hTERT SVV VEGF

ASt2331+ASsvv286 ↓ - ↑ - - ↓

ASt2331+ASvegf857 - - - - ↑ ↓

ASsvv286+ASvegf857 - ↓ ↑ ↓ - -