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Plus strand RNA viruses and their host interactions

Birke A. Tews

Merkmale von Plusstrang-RNA-

Viren

Life cycle of plus strand RNA viruses

1. Eintritt

2. Genomfreisetzung

3. Translation und

Polyproteinprozessierung

4. RNA Replikation

5. Partikelzusammenbau

6. Freisetzung

Merkmale von Plusstrang RNA-Viren

Einzelsträngiges RNA-Genom, das direkt als mRNA fungieren kann.

-> das virale Genom ist bereits infektiös (Abgrenzung Retrovirus)

5‘ Ende:

Cap -> Flaviviren, Coronaviren

VPg -> Caliciviren, Picornaviren

Unmodifiziert -> Pestiviren, Hepaciviren

3‘ Ende

Poly-A -> Coronaviren

Unmodifizierte Enden -> Pestiviren, Flaviviren, Hepaciviren

Subgenomische RNAs

Ja: -> Coronaviren, Caliciviren, Ateriviren, Astroviren, Togaviren

Nein: -> Flaviviren, Picornaviren

Picornaviridae – kleine RNA-Viren

Source: ViralZone:www.expasy.org/viralzone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics

- Nicht-umhüllt

- 7-9kb

- 5‘ Vpg & 3‘ poly-A-tail

- IRES

- Ein Polyprotein

Realm: Riboviria

Order: Picornavirales

Family: Picornaviridae

Genus: Aphthovirus

Species: Foot-and-mouth disease virus

Genus: Enterovirus

Species: human enterovirus C (polio)

Coronaviruses – die größten RNA-Viren

- umhüllt

- 27-32kb

- 5‘ Cap & 3‘ poly-A tail

- Zwei Polyproteine (ribosomal frameshift)

- Subgenomische RNAs für (Struktur-)Proteine

Realm: Riboviria

Order: Nidovirales

Suborder: Cornidovirineae

Family: Coronaviridae

Subfamily: Orthocoronavirinae

Genus: Alphacoronavirus

Species: Human coronavirus 229E

Genus: Betacoronavirus

Species: Severe acute respiratory

Syndrome-related coronavirus

Source: ViralZone:www.expasy.org/viralzone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics

Flaviviridae

Source: ViralZone:www.expasy.org/viralzone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics

- Umhüllt

- 10-12kb

- Ein Polyprotein

- Flaviviruses:

- 5‘cap & 3‘ loop

- Hepaciviruses, Pestiviruses

- Naktes, strukturiertes 5‘ &

strukturiertes 3‘ Ende

- IRES

Realm: Riboviria

Order: Unassigned

Family: Flaviviridae

Genus: Flavivirus -> Species: Yellow fever virus

Genus: Hepacivirus -> Species: Hepacivirus C (Hepatitis C virus)

Genus: Pestivirus -> Species: Pestivirus A (Bovine viral diarrhea virus)

Caliciviridae

- Nicht-umhüllt

- 7-8kb

- 5‘ VPg & 3‘ poly-A-tail

- Subgenomische RNA

Realm: Riboviria

Order: Unassigned

Family: Caliciviridae

Genus: Norovirus

Species: Norwalk virus

Source: ViralZone:www.expasy.org/viralzone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics

Revers-genetische Systeme

Revers-genetische Systeme

„einfacher“ als für Negativstrang RNA-Viren.

Einbringen viraler RNA in die Zelle reicht theoretisch aus, um infektiöse Viren zu

bilden.

Klassischer Ansatz:

Klonierung der kompletten cDNA hinter einen Promotor

In vitro Herstellung der genomischen RNA durch T7 oder SP6-Polymerasen

Einbringen der RNA in Zielzellen

Revers-genetische Systeme

Klassischer Ansatz:

Klonierung der kompletten cDNA hinter einen Promotor

In vitro Herstellung der genomischen RNA durch T7 oder SP6-Polymerasen

- Für Viren mit VPg oder Cap muss dieses in der Reaktion mit eingefügt werden

- Für Viren mit Poly-A-Schwanz muss dieser vom Plasmid kodiert sein, oder

durch Poly-A-tailing angefügt werden

- Für Viren mit „nackten“ Enden ist meist das definierte Ende wichtig.

Revers-genetische Systeme

Genom hat häufig ausgeprägte Sekundärstrukturen -> toxisch/instabil in

Bakterien

-> cDNA auf mehrere Plasmide aufgeteilt.

Die einzelnen Sequenzen werden vor der in vitro Transkription zu einem DNA-

Molekül zusammengefügt.

Revers-genetische Systeme

In vivo Herstellung der „genomischen“ RNA durch transfizierte Zellen

- Durch Wahl eines RNA-Polymerase II Promotors wird die RNA mit einem Cap

modifiziert (gut für Viren mit einem VPg oder Cap-Genom)

- Ein Poly-A-Schwanz kann durch entsprechende Signale und die zellulären

Enzyme dafür angehängt werden.

- Für Viren mit exakten Genomenden kann hier durch die Klonierung eines

Ribozyms das exakte 3‘ Ende generiert werden.

Interaktion mit dem Wirt:

essentielle Wirtsfaktoren

Life cycle of plus strand RNA viruses

1. Entry ->

Receptors/proteases

2. Uncoating -> pH-shift,

endocytotic pathways,

enzymes

3. Translation and

polyprotein processing

-> ribosome, initiation

factors, elongation

factors, proteases,

chaperones

4. RNA replication

5. Assembly

6. Release/Maturation ->

proteases

Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor

Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen

Poliovirus: CD155

Anfällige Spezies: Mensch (experimentell auch

Affen)

Realm: Riboviria

Order: Picornavirales

Family: Picornaviridae

Genus: Aphthovirus

Species: Foot-and-mouth disease virus

Genus: Enterovirus

Species: human enterovirus C (polio)

Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor

Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen

Poliovirus: CD155

Anfällige Spezies: Mensch (experimentell auch

Affen)

DNA

Sequenzierung

Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor

Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen

MERS-Coronavirus: Dipeptidyl peptidase 4

(DPP4, CD26)

Anfällige Spezies: Cameliden, Fledermäuse,

Menschen…Realm: Riboviria

Order: Nidovirales

Suborder: Cornidovirineae

Family: Coronaviridae

Subfamily: Orthocoronavirinae

Genus: Alphacoronavirus

Species: Human coronavirus 229E

Genus: Betacoronavirus

Species: Middle eastern respiratory

syndrome-related coronavirus

Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor

Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen

MERS-Coronavirus: Dipeptidyl peptidase 4

(DPP4, CD26)

Anfällige Spezies: Cameliden, Fledermäuse,

Menschen…

Protein Massenspektrometrie

Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor

Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen

MERS-Coronavirus: Dipeptidyl peptidase 4

(DPP4, CD26)

Anfällige Spezies: Cameliden, Fledermäuse,

Menschen…

+

Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor

Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen

MERS-Coronavirus: Dipeptidyl peptidase 4

(DPP4, CD26)

Anfällige Spezies: Cameliden, Fledermäuse,

Menschen…

Jan-Berend Bosch et al. Cell Res 2013 23:9-169-70

Eintritt ist mehr als nur Rezeptoren

MERS (und andere Coronaviren) brauchen Proteasen für die Aktivierung

der Membranfusion. Wirtsfaktor TMPRSS2

Alexandra C. Walls et al. PNAS 2017;114:42:11157-11162

Eintritt ist mehr als nur Rezeptoren

„Scaffolding“-Funktion

MERS (und andere Coronaviren) brauchen Proteasen für die Aktivierung

der Membranfusion

Protease und Virus müssen zusammenkommen

Earnest et al, Plos Pathogens 2017

ZellkulturMaus

Eintritt ist mehr als nur Rezeptoren

MERS (und andere Coronaviren) brauchen Proteasen für die Aktivierung

der Membranfusion

Hepatitis C: ein Virus – viele Rezeptoren

Source: ViralZone:www.expasy.org/viralzone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics

Realm: Riboviria

Order: Unassigned

Family: Flaviviridae

Genus: Hepacivirus

Species: Hepacivirus C (Hepatitis C virus)

1 2 3

Hepatitis C is a viral infection, which is

chronic in 80% of the cases (1) and can lead

to cirrhosis (2) and hepatocellular

carcinoma (3)

Rezeptoren: Ein Virus – viele Rezeptoren

Hepatitis C Virus

Anfällige Spezies: Mensch (experimentell Schimpansen)

- „Attachment factors“: LDL-R & Glykosaminoglykane

- Rezeptoren: SR-BI & CD81

- Notwendige Eintrittsfaktoren: Claudin-1 & Occludin

Model by Sophana Ung

Rezeptoren: Ein Virus – viele Rezeptoren

Hepatitis C Virus

Anfällige Spezies: Mensch (experimentell Schimpansen)

- Nur die humane Isoform möglich: CD81 & OCLN

- SR-BI hochexprimiert in Leberzellen

- Weitere nicht-essentielle Faktoren fördern die Aufnahme

Model by Sophana Ung

Nicht alle Wirtsfaktoren sind Proteine

Lebertropismus bei Hepatitis C Infektionen – bedingt durch miRNA?

Exkurs: miRNA

Winter et al. Nature Cell Biology, 2009

Nicht alle Wirtsfaktoren sind Proteine

Lebertropismus bei Hepatitis C Infektionen – bedingt durch miRNA?

- HCV hat zwei Bindestellen für miR-122 im 5‘ Ende des Genoms

- miR-122 ist hochkonzentriert in der Leber und reguliert Lipid- und

Cholesterolstoffwechselfunktionen und wirkt als Tumorsuppressor

Erica S. Machlin et al. PNAS 2011;108:8:3193-3198

HCV ist miR-122 abhängig

Mutierte Bindungsstellen

Details der Interaktion

Erica S. Machlin et al. PNAS 2011;108:8:3193-3198

Details der Interaktion

Erica S. Machlin et al. PNAS 2011;108:8:3193-3198

Stabilisierung der IRES

Chahal J et al, Nucleic Acid Research 2019 Volume 47, Issue 10, 04 June 2019, Pages 5307–5324

miR-122 & HCV

- Stabilisierung der IRES

- Steigerung der Translation

- Schutz der RNA vor Abbau durch Xrn1/2

Kincaid et al, PNAS 2018

Chahal J et al, Nucleic Acid Research 2019

Wirtsfaktoren zur Persistenzetablierung - Pestiviren

Realm: Riboviria

Order: Unassigned

Family: Flaviviridae

Genus: Pestivirus

Species: Pestivirus A (Bovine viral diarrhea virus)

Fig: M. Jörn (Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015)

BVDV

• Zwei Biotypen: nicht-zytopathogen (ncp), zytopathogen (cp)

– Unterscheiden sich durch ihren Effekt in Zellkultur

– Was ist die biologische Relevanz?

Pathogenese: BVD / “Mucosal Disease”

• Infektion

– Meist klinisch inapparent

– Fieber

– Durchfall

– Schleimhautläsionen

– Tod

• Infektion in trächtigen Kühen

– Infektion mit ncp Virusen zwischen Tag 40

und 120 führt zur Infektion des Fetus und zur

Geburt persistent infizierter (PI)Tiere

• PI Tiere:

– Haben keine adaptive Immunantwort

– Haben hohe virale Titer im Blut

– Sind das Virusreservoir

• Überinfektion der PI-Tiere mit einem cp

Virus führt zur “Mucosal Disease”.

Was ist der genetische Unterschied zwischen ncp und cp

Isolaten?

• Marker für cp Viren ist freies NS3 in infizierten

Zellen.

Fig: M. Jörn (Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015)

Regulierung der NS2-3-Spaltung

• Ncp Viren produzieren NS3 zu

frühen Zeiten der infektion

• Cp Viren produzieren NS3 zu

jedem Zeitpunkt der Infektion

• NS2 ist eine Autoprotease, die

sich selbst abspaltet

• Schlußfolgerung: NS3-

Produktion ist in ncp Viren

streng geregelt

• Was sind die molekularen

Grundlagen für die strenge

Regelung in ncp und die

konstitutive Spaltung in cp

Viren?

T. Lackner et al. J. Virol. 2004;78:10765-10775

Molekulare Grundlagen – cp Virusgenome

cp Viren enthalten (zelluläre) Sequenzen, die zur NS2-NS3-Spaltung

führen

Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015

Molekulare Grundlagen – cp Virusgenome

Ausnahme

Regel

Vollständige NS2-3-Spaltung -> kein infektiöses Virus

Insertion einer IRES oder Ubiquitins zwischen NS2 und NS3 -> kein

infektiöses Virus

Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015

Ubiquitin verwandte

Proteine -> Spaltung

durch zelluläre Proteasen

Molekulare Grundlage – cp Virusgenome

Einige cp Viren haben ungewöhnliche Insertionen

- 90as des 699as „J-domain protein“ (Jiv = J-domain protein interacting

with viral protein, oder DNAJ-C14)

- Jiv ist ein zelluläres Chaperon, das zur Hsp40 Familie gehört

- Die 90as Sequenz hat keine Proteaseaktivität

Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015

Jiv/Jiv90 erlaubt die Spaltung

- NS2 ist eine Autoprotease

- Jiv90 ein essentieller Kofaktor

Rinck et al. A Cellular J-Domain Protein Modulates Polyprotein Processing and Cytopathogenicity of a Pestivirus, J Virol 2001

Jiv-negative Zellen sind resistent

- CRISPR/Cas9 induzierte Zerstörung von Jiv90

- Cp-Viren können sich gleichermaßen in ko Zellen und WT Zellen

vermehren

- Ko Zellen sind resistent gegenüber ncp Viren

O. Isken et al. J. Virol. 2019; doi:10.1128/JVI.01714-18

Die Spaltung in der Infektion

NS3 wird für die Replikation benötigt

NS2-3 wird für den Partikelbau benötigt

Warum? – Adaptierung an NS2/NS3 alleine

Chimäre aus ncp7 und Ossloss

Je ein Aminosäureaustausch in NS2 und NS3 nötig

Sowohl NS2-3 als auch NS3 bilden einen Komplex mit NS4A

Dubrau et al. Plos Pathogens 2017

NS4A interagiert unterschiedlich mit NS3 und NS2-3

Einfluss auf Interaktion mit NS4A

Dubrau et al. Plos Pathogens 2017

Kompakte Interaktion

NS3/NS4A -> RNA

Replikation

Depletion von Jiv in der

Infektion -> keine Spaltung

NS2-3

Veränderte Interaktion

NS2-3/NS4A ->

Partikelzusammenbau

Zeitliche Regulierung der

Infektion

Jiv Depletion reguliert Replikation und Zusammenbau

Dubrau et al. Plos Pathogens 2017

Warum die zeitliche Regulierung?

Ncp Virus IFN-Antwort unterdrückt -> Foetus

überlebt

Cp Virus IFN-Antwort vorhanden -> Abort

RNA

Npro/Erns

RNA

Npro/Erns

Take Home?

- Bei Plus-strang RNA Viren ist schon die RNA infektiös

- Wirtsfaktoren sind z.T. verantwortlich für den (Spezies-/Zell-)

Tropismus von Viren

- Und/oder können die Replikation/Partikelproduktion regulieren

- Rezeptoren

- Essentielle Kofaktoren

- Wirtsfaktoren können ganz unterschiedlich sein

- Proteine

- Nukleinsäuren

- Lipide (?? Evtl einen Abschnitt zu Lipoproteinen und HCV

einbringen?

• Xrn und HCV ausbauen

• NS2-3 und NS4A kürzen Evtl DNAJ14C und Flaviviren?

• Lipoproteine und HCV einbauen?

• Ansonsten anderes Bsp für weitere Kofaktornutzung

FRAGEN?