Seminar BT GL SS08 - TU Graz

BiotechnologieProdukte mit lebenden Organismen

oder Teilen davon herstellen

Enge Definition♦ Industrielle Produktion in Bioreaktoren - Mikroorganismen, Zellkulturen ♦ Enzymtechnik und Biokatalyse - Enzyme

Breitere Definition♦ Spezifisch modifizierte Pflanzen und Tiere als Produzenten (Transgene Organismen)♦ Direkte medizinische Applikationen (z.B. Gentherapie) ♦ Bio-Nanostrukturen

Molekulare BiotechnologieEngineering von Biosystemen

Zell-EngineeringStoffwechsel-Engineering

Protein-Engineering

BioprozesstechnikEngineering von Produktionsverfahren

ProzessentwicklungReaktionstechnik

Aufarbeitungstechnik

BIOTECHNOLOGIE

Integrierte Vernetzung

Natur

Breite Biodiversität

1. Schritt zur Etablierung eines Biotechnologischen ProzessesSuche nach geeigneten Organismen in der Biodiversität der Natur

Beispiel:

Isolierung eines Antibiotikaproduzenten

2. Schritt zur Etablierung eines Biotechnologischen Prozesses

Entwicklung des biologischen Systems

Aus der Natur isolierte Stämme sind zwar fähig, gewünschtes Produkt herzustellen

aber meist sind viele Parameter nicht zufriedenstellend

z.B.:WachstumsverhaltenProduktbildungVerwertung von NährstoffenBildung von NebenprduktenGenerelle Prozesseigenschaften

Physiologische Bedingungen Genetische Optimierung

Substrate(Futter z.B. Zucker)

Gene

Produkt(z.B. Penicillin)

Enzyme

S CBA D

G

F

Zelle - Funktion

E1

E7

E5

E2 E3

E6

E8

E4

P

MetaboliteProteine

E

Umwelt

Zellbauteile

Zellbau-teile+/-

+/-

Wachstum von Mikroorganismen Produktion der Biomasse

Biomasse Produkt Biomasse biokatalytische Kapazität

Produktbildung

Für den Bioprozess wichtige Phasen im Biosystem

Metabolische FähigkeitenGenexpression

Wachstum von Mikroorganismen

Wachstum von Mikroorganismen

Exponentielles Wachstum Substrat-limitiertes Wachstum

Wachstum von Mikroorganismen

Monod

X = Biomasse N = Zellzahlµ = spez. Wachstums-

rate

dNdt = µ N

dX dt = µ X

dX dt = µX

1*

Zuwachs - Absterben

α = spez. Absterberate

Wachstum –Temperaturabhängigkeit

dX dt = µ X α X-

ln µ

1/ T

µ = A . e RT

Ea

α = A‘ . e RT

Ea‘

Absterben Wachstum

F V = D [h-1]

F = ZuflussrateV = Reaktorvolumen

dX dt = µ X – D.X

steady state

dX dt = µ X – D.X = 0

µ = D

Kontinuierliche Kultur - Chemostat

Produktbildung

Wachstumsassoziiert

dPdt =

µ X

YP/S

Nicht assoziiert

Wachstum von Mikroorganismen

Experimentelle Bestimmung

Zellzahl (nur einzellige Organismen)Thoma Zählkammer (mikroskopisch)Cell CounterCFU (colony forming units)

Biomasse (direkte Verfahren)ZTM (Zelltrockenmasse) ZFM (Zellfeuchtmasse)Frischvolumen (Zentrifugation)

Probleme: Feststoffe in Medium

Biomasse (indirekte Verfahren)Optische Dichte (Trübungsmessung)Stoffwechselparameter (z.B. dO2/dt, dCO2/dt, dpH/dt etc.)Zellinhaltstoffe (z.B. DNA, RNA, ATP, N-Gehalt, Proteingehalt etc.)

Probleme: Abhängigkeit von physiolg. Zustand der Biomasse

Substrate

Zentrale MetaboliteZellbestandteileGrundbausteinePolymere

EnergieATP

O2H2 hν

Kat

abol

ism

us

Anabolismus

NADH2

Stoffwechsel

Nährstoffansprüche

HauptelementeC-QuelleKohlenhydrateorg. SäurenKohlenwasserstoffeCO2

N-QuelleAmmoniumNitratorg. N-Verb.N2

Nebenelemente

O-QuelleO2SO4NO3

P-QuellePO4org. P-Verb.

S-QuelleSO4org. S-Verb.Me-Sulfide

Spurenelemente Wuchsstoffe/VitamineCa, Mg, Na, K, .... Mn, Fe, Ni, Co, Mo, Se....

MilieuansprüchepH Temperatur Sauerstoff Ionenstärke (osmot.)Druck

psychrophilmesophilthermopil

aerobanaerob

Definierte MedienMinimalmedien

Komplexe Medien

Sterilität – steriles Arbeiten

Sterilität: KeimfreiheitNur gewünschte Organismen im System vorhandenabsolute Sterilitätkeimarme BedingungenBedingungen die bestimmte Organismen bevorzugen/ausgrenzen

Methoden: Abtöten von Organismen in einem SystemAbschluss von Systemen gegen Eindringen und EntweichenMethoden zum sterilen Transfer von Organismen

von einem System in ein anderes

Verfahren: Hitze (feucht, trocken)chemisch (Flüssigkeiten, Gase)Filtration (Absolutfilter, Tiefenfilter)Strahlung (UV, Gamma, Mikrowellen)

Sterilisation

Hitze Chemisch Mechanisch - FiltrationStrahlung

Chemische Methoden zurVerhinderung von Zellwachstum

Systeme zum Züchten von Mikroorganismen

Wachstum auf Oberfächen Stammhaltung

AgarkulturenSchrägagarPetrischale

Wachstum auf TrägermaterialienTropfkörper

Wachstum in Submerskulturen

Schüttelkulturen - RollerkulturenMikrotiterplattenEprouvetten Erlenmayer Kolben

Gerührte KulturenFermentoren

Deep Well Mikrotiterplatten

Quelle: A.Glieder

Schüttelkolben

Steriles Arbeiten

Steriles Arbeiten

Petrischale

Genetische Grundlagen

5‘ – PO4

3‘ – OH 5‘ – PO4

3‘ – OH

DNA Stränge liegen im Doppelstrang inantiparalleler Orientierung vor

Lineare DNA – Zirkuläre DNA

Zirkuläre DNA

Bakterielle Chromosomen PlasmideViren - PhagenMitochondriale DNA

lineare DNA

Eukaryontische Chromosomen Spezielle PlasmideViren - Phagen

Supercoiling – Unterwindung von DNA

Plasmide

Extrachromosomale Elemente

Replikation, Maintenance

Transfer

Gene für spez.Funktionen

Transposition,Integration

Isolierung von Plasmid DNA

Plasmid _DNA Isolierung

Lyse der Zellen – schonendDenaturieren der DNARenaturieren in Gegenwart hoher IonenstärkenChromosomale DNA zusammen mit Proteinen abtrennen (ZEntrifugationReinigung der Plasmid-DNA durch Chromatographie

Agarose-Gelelektrophorese von DNA

Transkription

Translation

DNA

mRNA

Protein

Protein A Protein CProtein B

RibosomeBinding Site(Shine Dalgarno)

P Promoter

R Regulatory Region (e.g. Operator)

start startstartstop stop stop

P RR Gen A Gen B Gen C

initiation termination

Genexpression (in Prokaryonten)

Prokaryoten: Transkription und Translation laufen simultan

lac -Operon

lac -Operon

Negative Kontrolle durch Lac-Repressor

Induktor:LaktoseIPTG

Positive Kontrolle durchcAMP-CRP

pMS470d85366 bp

bla

tac Promoter

d8lacI

AvaI (18)

BamHI (23)

EcoRI (2)

HindIII (1454)

Sma I (20)

XmaI (18)

BglI (2648)

XbaI (29)

Sac I (12)

Sph I (1452)

NdeI (69)

ApaLI (2094)ApaLI (3340)

ApaLI (4656)

ApaLI (5134)

Platzhalterfragment

E.coli Expressionsvektor

Regulatorprotein

Selektionsmarke

Transkription - Termination

oriVReplication

Shine - Dalgarno SequenzTranslation Initiation

Esterase Gen (EP6)Bg_estA

Promoter

Shine - Dalgarno SequenzTranslation Initiation

Transkription - Termination

RepressorLacI

Replication Selection

GTG - Geltung (§2)

• Gentechnische Anlagen• Arbeiten mit GVO• Freisetzung von GVO• Inverkehrbringen und Kennzeichnung von Erzeugnissen• Genanalyse, Gentherapie am Menschen• gilt nicht für

in vitro Befruchtungungerichtete MutageneseZellfusion (wie z.B. Hybridomherstellung)Arzneimittel

GTG – Einstufung

Sicherheitseinstufung von Arbeiten mit GVO:

S1: kein oder vernachläßigbares RisikoS2: geringes RiskoS3: mäßiges RiskoS4: hohes Risiko

Kriterien :

WirtVektorInsertrekombinater Organismus

Sicherheitsmaßnahmen

Biologische SicherheitsmaßnahmenOrganisatorische / Technische Sicherheitsmaßnahmen

GTG – Maßstab

• kleiner Maßstab:- S1 bis 600 Liter- S2 bis 100 Liter- S3 und S4 bis 10 Liter

• großer Maßstab: - alles, was nicht kleiner Maßstab ist