1/37 Pharmakogenomik Dr. Peter Ahnert [email protected] ahnert 07.11.2007

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Pharmakogenomik

Dr. Peter Ahnert

[email protected]

http://www.uni-leipzig.de/~ahnert

07.11.2007

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Übersicht

• Definition “Pharmakogenomik”

• Pharmakogenomik und Wirkstoffentwicklung

• Identifizierung der genetischen Komponente einer Erkrankung

• Assoziationsstudien

• Genetische Variabilität

• Struktur von Assoziationsstudien

• Kandidatengen-Selektion

• SNP-Auswahl

• Genotypisierung

• Datenanalyse

• Genomweite Studien

• Beispiele

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Pharmakogenomik – Eine Definition

• Pharmakogenomik verbindet Pharmakologie mit (genomweiter) Genetik (Genomik).

• Verbindet die Erbanlagen von Individuen mit deren Suszeptibilität für Erkrankungen und ihrer Reaktion auf Wirkstoffe und Behandlungsmethoden um die Entwicklung und Anwendung neuer Wirkstoffe und Therapien zu unterstützen.

• Krankheitsätiologie and Pathogenese• Wirkstoff - Target Interaktionen• Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen• Wirkstoffmetabolismus

Basiert auf humaner genetischer Variabilität in:

http://www.ornl.gov/hgmis/medicine/pharma.html

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Pharmakologie zu Pharmakogenomik

• Wirkstoffentwicklung ist teuer• Rationale Wirkstoffentwicklung ist schwierig• Wirkstoffe werden für

“Durchschnittsbürger”entwickelt– 10 - 70% non-responders– ~ 100.000 Todesfälle in den USA pro Jahr– Frauen– Kinder

Probleme:

Pharmakologie: Entwicklung und Bereitstellung von Wirkstoffen, die es ermöglichen gesund zu werden oder zu bleiben.

Pharmakogenomik!?

Lösung: Wirkstoffe für bestimmte Gruppen von Individuen

entwickeln und anwenden; Verlangt die Zuordnung

von Individuen zu diesen Gruppen.

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Pharmakogenomik & Wirkstoff Entwicklung

Ziele:

• Verständnis von Krankheitsmechanismen

Drug Targets

• Biomarker

• Marker für Toxizität und Wirksamkeit

• Marker für Differentielle Diagnostik

Unterstützung von Therapie-Entscheidungen

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Pharmakogenomik & Wirkstoff Entwicklung

Phase I Phase II Phase III Phase IV

Sicherheit, Wirksamkeit, Dosisfindung

Klinische Studien:

Wirkstoff-Screening & Kandidaten-Identifikation

in vitro Validierung in vivo Validierung

Toxikologische Analyse

Präklinische Forschung:

Biologie & Medizinische Forschung

Identifizierung von Drug Targets

Klinische & Biologische Krankheitsmodelle

Identifizierung von „Krankheitsgenen“ & -mechanismen

Grundlagen- & Pharmazeutische Forschung:

Individualisierte Medizin

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Rationale für Pharmakogenomik

Alle Erkrankungen beruhen zumindest

teilweise auf Veranlagung …

Erbanlagen

Umwelteinflüsse

HämophilieDown-SyndromHFI

LungenkrebsMotorradunfallKnochenbrüche

Diabetes Asthma

Rheumatoide Arthritis Infektionskrankheiten

...

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Spielen Genetische Ursachen eine Rolle?

• Zwillings und Geschwisterstudien

• Genomweite Kartierungsstudien

• Mechanistische Studien

• Kandidaten-Gen Assoziationsstudien

• Tiermodelle

Zur Identifizierung von:

- Im Krankheitsgeschehen implizierten biologischen Prozessen

- Wirkstoff Targets

- Diagnostischen Markern

- Toxikologischen Markern

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Zwillingsstudien

1 … Einfluss der Umweltbedingungen

2 … Einfluss zufälliger Größen

3 … Einfluss von Umwelt und Genen

4 … Einfluss der Veranlagung

Durch den Vergleich der Häufigkeit des Auftretens der Krankheit bei Geschwistern unter verschiedenen Bedingungen lässt sich die Rolle der Veranlagung abschätzen.

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2

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4

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Genomweite Kopplungskartierung

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Mechanistische Untersuchungen

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Kandidatengen-Assoziationsstudien

Spielen Varianten eines Gens eine Rolle in einer Erkrankung?

Genetische Variation

Komplexe Phänotypen

Morphologie

Expression: Gene, ncRNA

Umwelt

Proteom

Epigenetik

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• Chromosomenaberrationen

• Mutationen

• Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)

• Insertionen und Deletionen

• Copy Number Variation

• Repeats (meist nicht kodierend)

- Megasatelliten (mehrere kbp, Blocks bis 100e kbp)

- Satelliten (5-171 bp, Blocks 100 kbp bis Mbp)

- Minisatelliten (6-64 bp, Blocks 0,1 – 20 kbp)

- Microsatelliten (1-4 bp, Blocks bis 150bp)

• Repetitive kodierende DNA

• “Variable Number Tandem Repeats” (VNTRs)

• “Transposable Elements”

Variable Elemente des Genoms

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SNPs und Humane Genetische Variabilität

~ 3 Mrd. Basenpaare

~ 99.9 % Identität zwischen

Individuen

~ 3 Millionen Basenunter-

schiede zwischen Individuen

SNP... Single Nucleotide Polymorphism

ACGTCTATGCATAGCTAGTGCAGATACGTATCGATC

ACGTCTATTCATAGCTAGTGCAGATAAGTATCGATC

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Clinical Data

Aufbau Genetischer Assoziationsstudien

Statistics / Data MiningPattern Recognition

Associations

Researchinto Causations

Drug TargetsVerification

Studies

PersonalizedMedicine

Diagnostics

VerificationStudies

Clinical ProblemClinical Study

Clinical-BiologicalSystem

Candidate Genes

Analysis & Gene Selection

Candidate SNPs

SNP Evaluationand Selection

SNP Short List

Genotype Data

Assay Design & Genotyping

SNP Retrieval

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Kandidatengene

Genfunktion

Genetische KartierungFunktionelle Biologie/Biochemie

Genexpression

“Krankheits Loci”Proteomik

Studien in Tiermodellen

Identifizierung von Kandidatengenen

Datenbanken mit Information zu Gen-Eigenschaften

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IL1AIL2IL10

IL4TN F

IL6

IFN GIL8

IL2R A

PTG S 1

PTG S 2

IC AM 1

VC AM 1

SF

M M P1

M M P3 C R P

TIM P1

C SF2IL13

SE LE

M M P16

ITG AL

IL5

KITLG

TIM P2

TN FR SF1A

SA A1

TN FR SF5TN FSF5

ES R1

TN FR SF1B

M M P2

M M P9 M M P13

ID D M 2IN S

C D 44H SM C R 30

IG F1

ITG AM

C D 80

C D 86

IG FBP 3

IL15

C D 69

G Y PB

H LA-D Q A1H LA-D R B1

PLGSE RP IN E1

TN FR SF11B

TN FSF11

SE LL

C SF3

R C D -8

M TX1

IL3

C D 4C D 8A

M PO

PRTN 3

C 3

C 5

C D 58

FC ER 2IL18

IL17

SE LP

C D 14

C D 68

C D 28

C R 1

SE RP IN A3

FU T2

H LA-D Q B1

PLA 2G 1B

ITG AX

SS A1

SS B

ALB

B2M

C 9

C SF1

C XC R 4

SD F1

H LA-A

H LA-B

IC AM 2

PR O C

IL11

C C R 3

C C R 5

C TLA4

PE CA M 1

LIF

TFR CO S M

VE G F

IL7

SC YB 5

ITG A4

ITG B1

M M P14

SA A2

C P

C 2

C AT

C C R 2

C C R 4

C XC R 3

C D R 3

IC AM 3

ITG B2

IG F2

SR -BP1

IL1R N

IL6R

KP NB 2

M M P8

TAP 1TAP 2

A2M

C C L5

C C R 1

C C R 6

C D 19

C D 38C D 59

D AF

C R H PO M C

C TSB

C TSD

C TSL

C TSG

C XC L12

H TATIP

IL1R 1

ITG A1

LTA

N XF1

SU LT2A 1

SE RP IN B2

T IM P3

AC P5

H N R PCPTPR C

N C AM 1

C D 2

C D 57

TN FSF6

SIA SD

C ST3

FLG

FN 1

FPR 1

H LA-D PB1

IL18B P

SLC 3A 2

IL4R

M AP K14

VTN

ITG A6

M AP K8

SA A4

TN FR SF11A

TN FR SF6

C ALC R

ALP P

AN PE P

C D 33

LO C64167

ATM

LYZ

BC G F1

C 6

C ALR

C AST

C C L2C C R 7

C R 2

M M E

C D 22

M C P

C D R 1

TR B@

C R AT

C XC L10

C XC L9

D PP4PE PD

EG F

EP O

G A D 1

G U S B

H FE

TN FR SF12

H LA-D PA1

IC A1

SC YB 10

IG FBP 2

IL10R A

IL1B

IL5R AM IF

IL2R B

PTG D R

PR L

SLC 25A 4

M AP K1

SC YA2

SC YA5

LEP

ITG A5

SP N

LAP 3

N O VA2

PO LA2

U BTF

PO LG

TR H

SE RP IN C1

SE RP IN A1

Umfassende (automatisierte) Literatur Analyse

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Clinical DataStatistics / Data Mining

Pattern Recognition

Associations



Candidate Genes


Candidate SNPs


SNP Short List

Genotype Data


SNP Retrieval

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Identifizierung, Bewertung und Auswahl von SNPs

Ausgewählte SNPs sollten:

- Die häufigsten Varianten eines Gens detektieren

- Mit hoher Wahrscheinlichkeit Einfluss auf die Funktion des

Genproduktes haben

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Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics. 2004 Aug 5

SNPs zur Detektion Wichtiger Genvarianten

Die Haplotyp-Struktur des Genoms:

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Pattern Recognition

Associations



Candidate Genes


Candidate SNPs


SNP Short List

Genotype Data


SNP Retrieval

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Genotypisierungsmethoden

• Sequenzierung

• Minisequenzierung

• Pyrosequenzierung

• Single Base Extension (SBE)

• TaqMan

• Invader

• MLPA

• Hoch- und niedrigdichte Oligo-DNA

Hybridiserungsarrays

AllelspezifischePrimerextension

AllelspezifischeEnzymreaktion

AllelspezifischeHybridisierung

Die verschiedenen Detektionsmethoden basieren vor allem auf:- Fluoreszenz- Massenspektrometrie- Chemolumineszenz- Fluoreszenzpolarisation

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ddNTPs

CT

A

PCR productSBE primer

BiotinG

Single base Extension

SBE primer G

Streptavidin

Product Purification

G

UV

SBE primerPhotocleavage

+G

MALDI-TOF MS

Genotypisierung - Single Base Extension

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Pattern Recognition

Associations



Candidate Genes


Candidate SNPs


SNP Short List

Genotype Data


SNP Retrieval

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Klinische DatenP

ati

en

t

Dru

g E

ffic

ac

y

Sid

e-e

ffe

ct

1

Sid

e-e

ffe

ct

2

Sid

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ffe

ct

3

Clin

ica

l B

ac

kg

rou

nd

1

Clin

ica

l B

ac

kg

rou

nd

2

1 4 6 5 1 0 12 10 5 3 3 0 13 3 3 7 2 0 04 2 8 5 8 1 05 4 2 8 8 1 06 10 7 2 8 1 17 1 3 9 3 0 1

Pa

tie

nt

SN

P 1

SN

P 2

SN

P 3

SN

P 4

SN

P 5

SN

P 6

1 A A A AB A A2 A A B B A A3 A A AB B A B4 B AB A B A B5 A A B AB A B6 B AB B B A A7 A A B B A B

Genetische Daten

Daten Analyse – Wie sehen die Daten aus?

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Analyse Einzelner Polymorphismen

• Vergleich von Allelfrequenzen mit Chi-Quadrat Analyse

• Vergleich von Genotypfrequenzen mit Chi-Quadrat

• Test auf Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (HWE)

• Vererbung berücksichtigende Tests

• Transmission Disequilibrium Tests (TDT)

• Affected Family Based Controls (AFBAC)

• Genetisches Relatives Risiko (GRR)

• ...

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“Clinical Bar Codes” “Genetic Bar Codes”

Patient 1

Patient 2

Patient 3

• Schrittweise Progressive Regression

• Klassifikation (Support Vector Machines,

Neuronale Netze)

• Mustererkennung

Musteranalysen

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Herausforderungen bei der Analyseder Genetik Polygener Phänotypen

• Phänotyp-Bestimmung

• Sehr geringe Penetranz einzelner Genvarianten

(Common Disease – Common Variant

vs. Common Disease – Rare Variant )

• Geringe Penetranz von Haplotypen

• Genomweite Variantenmuster (GVPs)

• GVP-Subgruppen für einen Phänotyp

• Erreichen genomweiter statistischer Signifikanz

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Genomweite Studien

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Bekannte Assoziationen

Gene Disease/Field Effect/Comment Literature

Coagulation factor 5 Deep-vein thrombosis, etiology

Activated protein C (APC) limits clot formation by inactivating factor V. The phenotype heterozygosity or homozygosity for a single point mutation in the factor V gene (at nucleotide position 1,691, G-->A substitution), synthesis of a factor V molecule (FV Q506, or FV Leiden) that is not properly inactivated by APC

Nature 1994 May;369(6475):64-7

Thiopurine S-methyltransferase

Leukemia, drug response

Adverse drug reactions, metabolism, Three mutant alleles, TPMT(*)2, TPMT(*)3A and TPMT(*)3C, more adverse effects in TPMT-deficient heterozygous patients on thiopurine medications (e.g. 6-mercaptopurine against childhood acute lymphoblastic leukemia, lowering dose 15-fold works!)

Pharm Res 1999 Mar;16(3):342-9, Pharmacology 2000 Sep;61(3):136-46

Apolipoprotein EAlzheimer's, susceptibility, drug response

Susceptebility to disease, response to cholinesterase inhibitor, The results strongly support that apoE4 plays a role in cholinergic dysfunction associated with AD, may be a prognostic indicator of poor response to therapy with acetylcholinesterase inhibitors (tacrine)

Proc Natl Acad Sci U S A 1995 Dec;92(26):12260-4

Her2

Breast cancer, susceptibility, drug response

Growth factor receptor, multiple copies lead to overexpression (~30% of breast cancer patients), higher risk for breast cancer and harder to treat traditionally, Trastuzumab (Herceptin, Genentech) is a specific Ab against her2 product

Semin Oncol. 2000 Dec;27(6 Suppl 11):46-52 (Review)

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Pharmakogenetischer TestWarfarin

- “Blutverdünner” z.Bsp. bei Schlaganfallrisiko

- Stärkere Reaktion bei ca. 1/3 der Patienten

- 25 % Varianten im Vitamin K Epoxidreduktase Komplex 1 Gen (VKORC1)

- 10 % Varianten im Cytochrom P450 (CYP2P9)

- Ca. 2 Mill neue Patienten pro Jahr

- Individuelle Anpassung der Dosierung durch “Trial & Error”

- Alter

- Gewicht

- Ernährung

- Medikamente

- Genetik

- FDA: genetische Tests könnten

- Pro Jahr 85.000 Blutungsereignisse verhindern

- Pro Jahr 17.000 Schlaganfälle verhindern

- Am 17.09.2007 durch die FDA in den USA zugelassen

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Phänotyp - Genotyp Analyseder Rheumatoiden Arthritis

• Autoimmunerkrankung: Progressive Gelenkzerstörung

• Etwa 1% der Bevölkerung betroffen

• Lebenserwartung um 5 - 10 Jahre reduziert

• Ätiologie nicht genau bekannt

• Genetische Suszeptibilität 30-60%

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Warum sollte die RA-Genetik untersucht werden?

Frühdiagnose Therapieentscheidungen

Differentialdiagnose

Voraussage der Progression

Verständnis der biologischen Prozesse in Ätiologie und Pathogenese Neue Behandlungsstrategien

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Rheumatoid Arthritis - Etiology and Pathogenesis

TNF IL-1

Dinarello C.A., Moldawer L.L. Amgen 1999, Proinflammatory and Anti-inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis; with Modifications by Ulrich Sack

Synovial membrane

Lining cells

T-cells, M

T-cells & B-cell activation

unknown antigens other risk factorsgenetic predisposition ActivationAdhesion

Permeabilization

Migration of inflammatory cells

Pannus formation

Production of Collagenases (MMPs) by fibroblasts, chondrocytes and osteoclasts

Joint destruction

CytokinesMediators

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Linkage

Possible

Linkage

Likely

No

linkage

Il2

IL6R

PRG4

CD8A

IL18R1

CTLA4

IL5R

CCR5

CSF2;Il4; Il5;

Il13; IRF1

IL6

CRH

HSPA1L; LTA; LTB, MICA

PRL

HLA

Kopplungs-Loci und Kandidatengene in RA

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Unsere Bisherigen Resultate

Suszeptibilitätsanalyse rheumatoide Arthritis:

• ~180 SNPs in ~50 Kandidatengenen

• Genotypisierung in 500 Proben >90.000 Genotypen

• Kapazität: ~3000 Genotypen pro Tag

• >98% erfolgreiche Genotypisierung

• <0.1% falsche Bestimmungen (PedCheck)

• mehrere mögliche Assoziationen einzelner SNPs

• einige Assoziationen konnten bestätigt werden

• Geninteraktionsanalyse läuft

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Genotypisierung - TaqMan

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Genotypisierung - Weitere Techniken …

Invader Assay Pyrosequencing

www.pyrosequencing.comwww.twt.com

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