This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Die bisherigen Untersuchungen haben gezeigt, daß an den Kristallen Prismen- und oft Pyramiden-Flächen aus-gebildet sind und daß die Kristallite durch gegenseitige Berührung in den Flächen dicht zusammengelagert sind. Es ist zu erwarten, daß auch Erkenntnisse über die An-

ordnung der Kristallite im größeren Verband gewonnen werden können. Dann lassen sich Vergleiche mit dem von HELMCKE entworfenen Anordnungsschema durchführen.

Uber diese Fragen wird in Kürze ausführlicher be-richtet.

Zur Anwendung fluorometrischer Verfahren bei der papierchromatographischen Analyse

von Pflanzenstoffen

V o n F . EBERHARDT F

Botanisches Institut der Universität Tübingen (Z . Naturforschg. 15 b, 61—62 [1960] ; e ingeg. am 28. September 1959)

Die Eigenschaft chemischer Verbindungen, im ultra-violetten Licht zu fluoreszieren, tritt bei so vielen Pflan-zenstoffen auf, vgl. 1. c. daß die Tatsache der Fluores-zenz und die Farbe des emittierten Lichtes allein nur selten brauchbare Merkmale für die Identifizierung der Substanzen abgeben können. Als gutes analytisches Hilfsmittel dient aber die Abhängigkeit der Fluores-zenzintensität vom pH-Wert. Die pH-Fluoreszenzkurven sind in vielen Fällen, ähnlich wie Absorptionsspektren, für die betreffenden Verbindungen charakteristisch. GOODWIN und KAVANAGH 2 haben für eine große Zahl von Verbindungen, insbesondere für Cumarin-Abkömmlinge, derartige Kurven aufgenommen und mit Erfolg bei der Analyse von Pflanzenstoffen anwenden können. Die Messungen wurden an der gelösten Substanz in Puffern von verschiedenem pH-Wert durchgeführt. Eine Anwen-dung dieses Verfahrens auf die Papierchromatographie würde die Reindarstellung der fluoreszierenden Verbin-dungen für die Gewinnung von pH-Fluoreszenzkurven erübrigen und damit vor allem bei geringen Mengen von Material wesentliche Vorteile bieten.

Die Versuche, die hier zunächst mit reinen Substan-zen auf dem Papier durchgeführt wurden, lassen die Brauchbarkeit dieser Methode für papierchromatogra-phische Untersuchungen erkennen. Wesentlich ist, daß von jeder geprüften Verbindung, bzw. von jedem Stoff-gemisch, eine Reihe von Flecken mit gleicher Substanz-menge auf das Papier aufgetragen wird. Diese Menge braucht nicht bekannt zu sein. Man schneidet die Flek-ken so aus, daß ein ausreichend breiter Rand für die Bestimmung der Papierfluoreszenz übersteht und be-sprüht oder betupft sie mit Pufferlösungen von verschie-denem p//-Wert. Es empfiehlt sich, die Puffermenge innerhalb einer Reihe möglichst konstant zu halten. Die Fluoreszenzintensität der noch feuchten Papierstreifen wird nun in einem von KORTÜM entwickelten und von HADORN und KÜHN 3 für die quantitative Auswertung von Papierchromatogrammen verwendeten Photometer

1 R. H. GOODWIN. Annu. Rev. Plant Physiol. 4, 283 [1953], 2 R . H. GOODWIN U. F . KAVANAGH, Arch. Biochemistry 2 0 , 3 1 5

[ 1 9 4 9 ] ; 2 7 , 1 5 2 [ 1 9 5 0 ] ; 3 6 , 4 4 2 [ 1 9 5 2 ] , 3 E . HADORN U. A . KÜHN, Z . Naturforschg. 8 b, 5 8 2 [ 1 9 5 3 ] , 4 K . SEMM U. R . FRIED, Naturwissenschaften 3 9 , 3 2 6 [ 1 9 5 2 ] .

gemessen. Das Meßgerät entspricht in der Anordnung seiner Teile der von SEMM und FRIED 4 angegebenen Apparatur. Die einzelnen Meßwerte, die man bei milli-meterweisem Vorschub des Papierstückes am Spalt vorbei erhält, ergeben addiert den relativen Fluoreszenzwert des Fleckes. Die pH-Fluoreszenzkurve wird aus den ein-zelnen Fluoreszenzwerten bei den verschiedenen ph-Werten gebildet.

Die im vorliegenden Beispiel verwendeten Cumarin-derivate wurden so gewählt, daß chemisch sehr nahe ver-wandte Verbindungen verglichen werden können. Bei der Betrachtung der pH-Fluoreszenzkurven einer größeren Zahl von Stoffen tritt die Mannigfaltigkeit im Kurven-verlauf weit deutlicher hervor2. Die in der Abb. 1

100

80

60

W

20

2 V 6 8 10 12 pH

Abb. 1. pH-Fluoreszenzkurven von Äsculetin (6.7-Dioxy-cumarin) ( ) , Scopoletin (6-Methoxy-7-hydroxycuma-rin) ( ) , Äsculin (6-Glucoxy-7-hydroxycumarin) ( ) . Gemessen auf Papier Nr. 2043 a (Schleicher & Schüll). Ordinate: Relative Fluoreszenzintensität (das jewei-lige Fluoreszenzmaximum jeder Substanz = 100). Im vorlie-genden Fall verhielten sich die Fluoreszenzintensitäten in den jeweiligen Maxima für Scopoletin/Äsculin/Äsculetin wie 52/33/9. Fluoreszenzfarbe: blau, bei Scopoletin oberhalb PH 8 blaugrün, PH 2,9 ra/10-CH3COOH, PH 3,2 — 5,6 Acetat-puffer, ph 6 ,2 -11 ,2 Phosphatpuffer, pH 12,6 n/lO-NaOH. Äsculetin wurde durch saure Hydrolyse aus Äsculin (Fa. Merck) gewonnen; Scopoletin (Wellcome Laboratories of Tropical Medicine, London) wurde freundlicherweise vom Institut, für Pflanzenschutz, Landwirtschaftliche Hochschule

Hohenheim, zur Verfügung gestellt.

aufgezeichneten pH-Fluoreszenzkurven zeigen im Gegen-satz zu den UV-Absorptionsspektren der gleichen Ver-bindungen noch bemerkenswerte Unterschiede. Äsculetin weist oberhalb von pn 10,7 einen starken Fluoreszenz-

5 R . H. GOODWIN U. B. M . POLLOCK, Arch. Biochemistry 4 9 , 1 [1954].

6 R. H. GOODWIN U. F. KAVANAGH, Bull. Torrey Bot. Club 7 6 , 255 [1949],

7 F. KAVANAGH, Analytic. Chem. 2 4 , 1966 [1952].

abfall auf, der bei Methoxylierung oder Glucosidierung in 6-Stellung ausbleibt. Scopoletin und Äsculin sind sich verhältnismäßig ähnlich, jedoch sind zwei Unterschiede vorhanden, die audi bei den an Lösungen durchgeführ-ten Messungen hervortraten2-6: 1. Im Bereich zwischen PH 3 und ph 5,5 wird die Fluoreszenzintensität von Äsculin relativ mehr geschwächt als die von Scopoletin. 2. Der Anstieg der Fluoreszenzintensität beim Ubergang nach höheren pH-Werten erfolgt bei Äsculin früher (unterhalb pH 6) als bei Scopoletin (oberhalb pH 6). Die abgebildeten Kurven stimmen weitgehend mit den

Über den Einfluß von Kochsalz auf die Ribonuclease und ihre Hemmung durch Heparin

V o n B R U N O LORENZ, R I T A LORENZ u n d NEPOMUK ZÖLLNER

Medizinische Poliklinik der Universität München, (Direktor: Prof. Dr. W . SEITZ)

(Z . Naturforschg. 15 b, 62—63 [1960] ; e ingeg. am 26. Oktober 1959)

Heparin hemmt die Ribonuclease des Pankreas in einer qualitativ gut zu beschreibenden Weise1 ; die Ribonuclease-Hemmung ist demgemäß zur Heparin-bestimmung prinzipiell brauchbar. Die Anwendung entsprechender Methoden auf eiweißhaltige Versuchs-ansätze stößt jedoch auf Schwierigkeiten, da unter den Bedingungen der K u n i t z sehen Ribonuclease-Methode2 dabei Trübungen durch Nucleoprotein-Bil-dung auftreten, welche die Durchführung dieses opti-schen Tests verhindern. Diese Trübung kann durch Zu-satz von Kochsalz hintangehalten werden, doch beein-flußt der Salzzusatz sowohl die Aktivität der Ribo-nuclease als audi ihre Hemmung durch Heparin.

CARTER und GREENSTEIN 3 und seither eine Reihe von Autoren4 - 7 haben mit verschiedenen Methoden beob-achtet, daß Salze die Ribonuclease aktivieren. Wir selbst haben mit einer Methode, bei der die Spaltprodukte vom Ansatz abgetrennt und ihre Extinktion gemessen wird 8

durch 0,04-ra. Kochsalzzusatz eine Aktivierung auf das Dreifache der Reaktionsgeschwindigkeit in salzfreier Lösung erreicht; die Wirkung einiger anderer Chloride, Sulfate und Phosphate von Alkalien und Erdalkalien war quantitativ ähnlich.

Die Durchtestung verschiedener NaCl-Konzentratio-nen mit der K u n i t z - Methode ergab zunächst ein scheinbares Maximum der Aktivierung bei 0,05-m. NaCl, NaCl-Konzentrationen über 0,2-m. schienen sogar hemmend zu wirken. Mit dem Kochsalzzusatz nimmt je-doch auch die Extinktion sowohl des Ribonucleates als auch der Spaltprodukte erschöpfender Ribonuclease-Einwirkung ab, die Veränderungen der Lichtabsorption

1 N. ZÖLLNER U. J . FELLIG, Amer. J . Physiol. 1 7 3 , 223 [1953]; Naturwissenschaften 39, 523 [1952].

2 M. KUNITZ, J. biol. Chemistry 1 6 4 , 563 [1946]. 3 C. E . CARTER U. J. P . GREENSTEIN, J. nat. Cancer Inst. 7 , 2 9

[ 1 9 4 6 / 4 7 ] . 4 C. LAMANNA U. M . F. MALLETTE, Arch. Biochemistry 24, 451

[1949].

an Lösungen gewonnenen überein2-6. Es muß jedoch allgemein beachtet werden, daß für einen strengen Ver-gleich derartiger Kurven auch eine gleiche Versuchs-anordnung erforderlich ist, da Faktoren wie z. B. Art des Puffers, Fluoreszenzlöschung durch Verunreinigun-gen, spektrale Empfindlichkeit der Photozelle, Art des Sperrfilters und anderes die Meßergebnisse beeinflus-sen 7.

Herrn Professor Dr. A. KÜHN. Max-Planck-Institut für Bio log ie , Tübin-gen, bin ich für die freundliche Erlaubnis zur Benutzung des Fluorometers zu Dank verpflichtet.

Abb. 1. Der Einfluß von Kochsalz auf die Lichtabsorption von Ribonucleat (obere Kurve) und ihres Ribonuclease-Abbauproduktes (untere Kurve). Der Ansatz enthielt 2 mg Ribonucleat und Kochsalz, um die angegebene Molarität zu erreichen, in 5 cm3 eines 0,04-m. Natriumacetat-Puffers von PH 5,0. Zum erschöpfenden Abbau wurden 5 y Ribonuclease

verwendet. Ordinate: Extinktion• 103 (1-cm-Küvette) bei 300 m/u. Abszisse: NaCl-Konzentration.

laufen aber nicht parallel (Abb. 1). (Der Abfall der Extinktion des Ribonucleates bei steigender NaCl-Kon-zentration stimmt quantitativ überein mit Befunden von S H A C K , JENKINS u n d THOMPSETT 9 , d i e a n D e s o x y r i b o -

nucleinsäure aus Kalbsthymus ebenfalls einen Abfall der Lichtabsorption mit steigender Salzkonzentration fanden.) Die für die Berechnung der Ribonuclease-Aktivität wesentliche Differenz zwischen Extinktion der Ribonucleinsäure und ihrer Spaltprodukte (E0 — Ef) nimmt also im Bereich der geprüften Salzkonzentratio-nen laufend ab. Daraus folgt, daß zwar die erwähnte Beschleunigung des Extinktionsabfalles bei der Einwir-kung von Ribonuclease auf Ribonucleinsäure durch Salze eine echte Aktivierung darstellt, daß aber in Ver-suchen, in denen der Extinktionsabfall bei Salzzusatz geringer als ohne diesen ist, geprüft werden muß, ob die Verringerung des Extinktionsabfalles Ausdruck einer Hemmung der Ribonuclease oder die Folge der Verkleinerung von E0 — Ef ist.

Die Berechnung der Aktivierung der Ribonuclease durch Salz ergibt unter Anwendung der K u n i t z sehen

5 H . EDELHOCH U. J . COLEMAN, J . biol. Chemistry 219, 3 5 1 [ 1 9 5 6 ] .

0 S . R. DICKMAN, R. B. KROPF U. J. P. AROSKAR, Biochim. bio-physica acta [Amsterdam] 21, 539 [1956].

7 S . R . D I C K M A N U. B . R I N G , J. biol. Chemistry 231, 741 [1958]. 8 N. ZÖLLNER, Habilitationsschrift, München 1954. 9 J. SHACK, R . J . JENKINS U. J . M. THOMPSETT, J. biol. Chemi-

stry 203, 373 [1953].