3 Biochemische und klinische Analyse

~ S ~ F a � 9 3 Biochemical and clinical analysis

Das Muskelrelaxans Baclofen reagiert bei pH 9 - 9,5 und 60~ mit 4- Chlor-7-nitrobenzofurazan bei etwa 20fachem Reagensiiberschul3 unter Bildung eines Derivates, das nach Extraktion mit Ethylacetat fluorimetrisch bestimmt werden kann ()~e, = 436 nm; %era = 525 rim). Eine lineare Eichfunktion ergab sich fiir 250-1250 ng/ml. Beim Vergleich mit der Ninhydrin-Methode wurden bei der Bestimmung yon Baclofen in Tabletten Unterschiede beobachtet, die der t-Test als signifikant auf dem 95%-Niveau auswies. - Analyst 110, 881 - 882 (1985). Fac. Pharm. Univ. Istanbul (TR) B. Seifert

Simultaneous analysis of estradiol dienanthate, estradiol 3-benzoate and testosterone enanthate benzylic acid hydrazone in oily formulations by gradient-HPLC. G. Carignan, B.A. Lodge and W. Skakum.

The multi-step gradient reversed phase ion-pairing HPLC method uses 1-pentane sulfonic acid sodium salt (0.0025 M in 0.1% acetic acid methanolic solution): acetonitrile and water (55 : 30 to 45:15 to 0) mobile phase gradient and a 250 • 4.6 mm, 5 g octadecyl silane colum, with 1,2,4,5-tetraehlorobenzene as internal standard. The time required for chromatography is 31 min. The method gives relative standard deviations of 0.94% or better for the assay of active ingredients in commercial formulations. - J. Liquid Chromatogr. 8, 2567-2577 (1985). Bur. Drug Res., Health Prot. Branch, Ottawa, Ont. (CDN)

A chloroquine membrane electrode with low detection limit. V.V. Cosofret and R.P. Buck.

Verff. beschreiben eine PVC-Membranelektrode ffir die Bestimmung des Antimalariamittels Chlorochin. Sie basiert auf dem Ionenpaar Chlorochin/Dinonylnaphthalinsulfonsfiure (DNNS) als elektroaktivem Material. Die Herstellung erfolgt, wie yon V.V. Cosofret und R.P. Buch (Analyst 109, 1321 (1984); vgl. diese Z. 321, 305 (1985)) beschrieben, auBer der Membranzusammensetzung, die wie folgt angegeben ist: 4% DNNS, 32,0% PVC und 64,0% o-Dinitrophenyloctylether. DNNS wird in der Poylmermembran durch Eintauchen der Elektrode in eine 10- 2 M ChlorochindiphosphatlSsung (24 h) in die Chlorochin-Form umgewandelt. Die inhere Elektrolytl6sung ist 10-3 M Chlorochindiphosphat pH 4,2. Die Elektrode weist im Konzentrationsbereich 10 -2 bis 10 -6 M Chlorochin nahezu Nernstsches Verhalten auf; Nachweisgrenze 2 • 10 -7 M. Die Selektivit/it gegeniiber verschiedenen anorganischen Ionen, Aminos/iuren, Neurotransmittern, Arzneistoffen uud Fiillmate- rial wird dutch die jeweiligen Selektivit~itskoeffizienten (Tabelle) charakterisiert. - Anal. Chim. Acta 174, 2 9 9 - 303 (1985). Inst. Chem. Pharm. Res., Bukarest (R); Dept. Anal. Chem., State Univ., Chapel Hill, NC (USA) W. Czysz

Studies on the chemical behaviour of two anti-herpes uridines. L.G. Chatten and L. Amankwa.

(E)-5-(2-Bromvinyl)-(BVDU) und 5-Iod-2-'-desoxyuridin (IDU) werden an einer Hg-Tropfelektrode in einem irreversiblen ProzeB reduziert. Das bei der Differentialpulspolarographie erhaltene Peakpotential fiir BVDU in Tetraethylammoniumbromid-LSsung (pH 5,85) liegt bei - 1,8 V (gegen SCE), dasjenige f/Jr IDU in Phosphatpuffer (pH 7) bei - 0,97 V. Bei beiden Substanzen wird die C-Halogen-Bindung gespalten, bei BVDU zus/itzlich die Vinyl-Doppelbindung. Ffir 10 -4 bis 5 x 10-4 M LSsungen ergaben sich fiir beide Verbindungen Eichgeraden. Ein Verfahren zur IDU-Bestimmung in ophthalmischen L6sungen und Balsamen mit einer Nachweisgrenze von 2 rag/1 wird angegeben. Geringe Verfinderungen in der Formulierung eines Pr/iparates k6nnen einen gro- Ben EinfluB auf das Verfahren haben, so dab seine Giiltigkeit ffir jedes Produkt neu gepriift werden muB. - Analyst 110, 1369-1372 (1985). Fac. Pharm. Pharmaceut. Sci., Univ., Edmonton, Alberta (CND)

B. Seifert

Determination of cardiac glycosides by adsorptive stripping voltammetry. J. Wang, J.S. Majmoud and P.A.M. Farias.

Auf der Grundlage der Beobachtung, dab Herzglykoside innerhalb von wenigen Minuten an einer stationfiren Hg-Elektrode adsorptiv gebunden werden, wird ein differentialpulspolarographisches Verfahren ausgearbeitet, mit dem noch Subnanomol-Konzentrationen yon Digo- xin, Digitoxin und Digitoxigenin bestimmt werden kSnnen. Eine Ab- scheidedauer von 5 min liefert Verst~irkungsfaktoren von 32, 11 bzw, 31. Wenn die L6sung gerfihrt wird, ergibt sich eine weitere Verst/irkung

232

um den Faktor 4. Unter den Versuchsbedingungen ist der EinfluB von oberfl/ichenaktiveu Substanzen wie Campher, Albumin oder Cholesterin sowie yon CI- minimal, so dag das Verfahren auch fiir die Analyse yon biologischen Flfissigkeiten geeignet sein sollte. - Analyst 110, 8 5 5 - 859 (1985). Dept. Chem., N.M. State Univ., Las Cruces, N.M. (USA)

B. Seifert

Determination of methyl nicotinate in pharmaceutical creams by high- performance thin-layer chromatography. B. De Spicgeleer, W. Van den Bossche, P. De Moerloose and H. Stevens.

Methylnicotinat kann yon anderen Nicotinsfiureestern, Nicotinsfiure, Mephenesin, Benzocain, Methyl- und Ethylparaben sowie yon Zerset- zungsprodukten gut getrennt und fiber die Peakflfichen bestimmt werden. Die statistische Auswertung zeigt, dab eine Eichkurve der Form x = ay a + by + c (x = ng Methylnicotinat/Fleck, y = Peakfl/iche Methylnicotinat/Peakfl/iche innerer Standard) zu den genauesten Ergeb- nissen fiihrt. Arbeitsweise. Cremeproben in CHCla (1 g in 5 ml) mit 3-Pyridinaldehyd als innerer Standard auf 10 x 10 cm HPTLC-Platteu (Kieselgel 60F254) auftragen, mit Fliegmittel Diethylether/CHzC12/n- Hexan (5:3:2) trennen und densitometrisch (Reflexion bei 263 nm) durch Peakflfichen auswerten. Danach zur Trennung der anderen Kom- ponenten (Polyethylenglykol, Cetylalkohol) mit Methanol/CHC13 (3 : 2) entwickeln und mit 0,1%iger Ammonium-l-(N-phenyl)-naphthylamin- 8-sulfonatl6sung oder mit I2-Dampf sichtbar machen. - Chromatogra- phia 20, 249-252 (1985). Dept. Pharm. Chem., State Univ., Gent (B)

W. Schmidt

3 BIOCHEMISCHE UND KLINISCHE ANALYSE

Microwave-aided dissolution of a biological matrix in AAS sample cups prior to graphite furnace analysis. R. Blust, A. van der Linden and W. Decleir.

Zum Aufschlug geringer Mengen biologischer Proben (Gewebepro- ben) werden diese in mit HNO3/HCI gereinigten Polyethylen- oder Poly- propylenbecherchen im Mikrowellenofen getrocknet, nach W/igen mit 100 gl HNO3 versetzt und die Becherchen in einem verschlossenen Be- halter 5 min bei 700 W im Mikrowellenofen bei 24,50 MHz in LSsung gebracht. Die fast trockenen Proben werden dann mit je 1 ml ultrapurem Wasser versetzt, wobei eine klare gelbe LSsung entsteht. Da in den einzelnen Bechern nach der Mikrowellenofen-Behandlung nicht mehr als 5 - 1 0 gl Sfiure zurfickbleiben, ist keine Korrektur erforderlich; die LSsungen kSnnen direkt zur Analyse (Graphitofen-AAS) verwendet werden. Beispiele mit Bestimmungen yon Fe, Cu und Cd werden beschrieben. - Atom. Spectrosc. 6, 163--165 (1985). Lab. Biochem., Univ., Antwerpen (B) W. Czysz

Quantitative determination by derivative spectrophotometry of triton X- 100 in solubilized preparations of membrane proteins. H. Terada, H. Seki, K. Yamamoto and F. Kametani.

Ffir die Bestimmnng yon Triton X-100 in Protein-Proben wird eine spektrophotometrische Methode vorgeschlagen, bei der kein vorheriger Abtrelmungsschritt erforderlich ist. Im normalen Spektrum fiberlappen sich die Banden yon Protein und Triton X-100. Unter Verwendung der 4. Ableitung gelingt durch Messung der Differenz zwischen positivem und negativem Peak bei 277,5 und 281 nm die Bestimmung der Triton X-100-Konzentration. Die Absorptions-Differenz steigt oberhalb yon 0,03% Triton X-100, der kritischen Micellkonzentration, linear mit der Triton X-100-Konzentration an. Die Protein-Konzentration ist auf die Bestimmung yon geringem Einflug. Der Wiederfindungsgrad yon Triton X-100 betrfigt praktisch 100%. - Anal. Biochem. 149, 501 - 506 (1985). Fac. Pharm. Sci., Univ. Tokushima (J) J.B.

A gel transfer tank for immunoblotting and its application for analysis of nuclear protein antigens. D.I. Stott, J. McLearie and H.S. Marsden.

3 Biochemische und klinische Analyse ~ f e ~ N ~ e

Es wird eine einfache und billige selbst zu bauende Apparatur zum Geltransfer ffir Immunoblotting beschrieben, die die Nachteile kommer- zieller Apparaturen weitgehend vermeidet. Die Apparatur kann der Gr6Be des zu bearbeitenden Gels angepaBt werden, wobei sowohl Na- Dodecylsulfat-Polyacrylamidgele als auch isoelektrisch fokussierte Gele elektrotransferiert werden k6nnen. Die aus Graphit gefertigten Elektro- den gew/ihrleisten eine gleichm/igige Feldst/irke fiber das gesamte Gel. Die mit Nicht-Histon-Chromatinproteinen mit der beschriebenen Appa- ratur erhaltenen Resultate sind den mit kommerziellen Apparaturen erhaltenen vergleichbar. - Anal. Biochem. 149, 454-460 (1985). Dept. Bacteriol. Immunol., Univ. Glasgow, Scotland (GB) J.B.

Enzymatic method for continuous monitoring of inorganic pyrophosphate synthesis. P. Nyr~n and A. Lundin.

A sensitive method for the analysis of inorganic pyrophosphate (PPI) which utilizes the enzymes ATP sulfurylase and firefly luciferace is described. The assay is based on continuous monitoring of the ATP formed in the ATP sulfurylase reaction using purified firefly luciferase. The assay can be completed in less than 2 s and is not affected by inorganic phosphate. The method has been used for continuous monitoring of formation of PPi in Rhodospirillum rubrum chromatophores. The assay is extremely sensitive, the linear range of the assay being 1 • 10 - 9 - 5 x 10-7 M PPi. It is suitable for routine applications. It is also possible to use the method for determination of low amounts of adenosine 5'- phosphosulfate. - Anal. Biochem. 151, 504-509 (1985). Dept. Bio- chem., Arrhenius Lab., Univ. Stockholm (S)

Phosphate determination by enzymatic colorimetric assay. P. Fossati. Die Probe wird mit einer Reagensmischung, bestehend aus s/imtlichen

zur Farbreaktion erforderlichen Enzymen und Substraten inkubiert, wobei das anorganische Phosphat zuniichst mit Inosin, katalysiert durch Purinnucleosidphosphorylase, unter Bildung yon Hypoxanthin und Ri- bose-l-phospat umgesetzt wird. Hypoxanthin wird durch Xanthinoxi- dase zu Xanthin und welter zu Harns~ure umgewandelt unter gleichzeiti- get Bildung von H202. Letzteres reduziert 2 Mol 3(4',5'-Dimethyl-2- thiazolyl)-2,4-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid unter Mitwirkung yon 1- Methoxyphenazinmethosulfat zu einem gef'~irbten Formazan, das bei 578 nm anhand der Absorption bestimmt wird. Bis 49 mMol/1 ist die Absorption der Phosphat-Menge linear. - Anal. Biochem. 149, 6 2 - 65 (1985). Ames Res. Developm. Lab., Miles Italiana SpA, Milan (I)

J.B.

Kinetic determination of selenium in biological materials. O.A. Efremen- ko, I.I. Krasnyuk, B.A. Rudenko and A.N. Kudrin.

Zur Bestimmung von Se in biologischem Material wird ein kinetisches Verfahren vorgeschlagen, das auf der mit Se(IV) katalysierten Oxidation des Fe(II)-EDTA-Komplexes mit NaNO3 beruht. Diese Indicatorreak- tion wurde ffir die Se-Bestimmung schon frfiher verwendet, die Auswer- tung des Se-Gehaltes anhand der Tangentenmethode bewghrte sich jedoch besser als diejenige auf der Messung der Extinktions~nderung in bestimmten Zeitintervallen (cf. S.P. Klochkovskii, L.P. Neimishcva: Zh. Anal. Khim 29, 929 (1974)). Nach dem Verfahren wird 1,0 ml Probe (z.B. Rattenblut) mit HC104/HNO3/HzO2 aufgeschlossen, Se(IV) auf Dowex 50X8 in H+-Form yon den Begleitbeimengungen getrennt und bei pH 2 dutch die erwfihnte Indicatorreaktion (~max = 440 rim) kinetisch bestimmt (ausfiihrliche Arbeitsweise s. Original). Die Eichkurve verl/iuft linear im Konzentrationsbereich 0,005-0,04 pg Se(IV)/ml. Bei tier Se- Konzentration yon 0,4 pg/ml entspricht der sr-Wert 0,04. - Zh. Anal. Khim 40, 2012-2016 (1985) (Russisch, mit engl. Zus.fass.). Sechenov Mediz. Inst., Moskau (SU) F. Jancik

The gas chromatographic separation of anaesthetic agents and aerosol propellants in operating room air using serially packed columns. J.M. Thompson, W.I. Stephen and B. Sithamparanadarajah.

Ffir die gas-chromatographische Analyse der Luft in medizinischen Operationsr/iumen hinsichtlich NzO, Halothan, Trichlorethylen, Enflu- ran, Freon-ll und Freon-12 wurden Pyrexglass/iulen (4 mm i.D.) mit hintereinander angeordneter doppelter Packung aus Molekularsieb (Zeolith) 5 A und Porapak Q, beide 5 0 - 80 mesh, verwendet. Es wurden verschiedene Packungsverh/iltnisse geprfift; am gfinstigsten war eine Ver- teilung 2,75 m Porapak Q und 0,29 m MS 5 A. S/iulentemperatur 250~

die h6chste Empfindlichkeit ffir NzO in einem Elektroneneinfangdetek- tor wurde bei einer ECD-Temperatur von 350~ erreicht. Tabellen mit Retentionszeiten und ein Chromatogramm sind in der Arbeit enthalten. - Anal. Chim. Acta 178, 341-345 (1985). Dept. Chem., Univ., Birmingham (GB) W. Czysz

Determination of malondialhyde by ion-pairing high-performance liquid chromatography. A.W. Bull and L.J. Marnett.

Fiir die Bestimmung von Malondialdehyd (Produkt der Lipid-Peroxi- dation bzw. der Prostaglandin-Biosynthese) in Rattenleber-Mikrosomen (nach Initiierung der Lipid-Peroxidation durch Inkubation mit Na-As- corbat in Gegenwart yon ADP und Fe(NO3)3) bzw. im Urin werden die partikelfreien L6sungen direkt der HPLC an einer Whatman CO:Pell ODS-S/iule und Elution mit 14% Acetonitril in 50 mM Myristyltrime- thylammoniumbromid + 1 mM Phosphat, pH 6,8 unterworfen. Malon- dialdehyd kann anhand der Absorption bei 254 nm bzw. mit h6herer Empfindlichkeit bei 267 nm bestimmt werden. Als innerer Standard wird Phenylmalondialdehyd verwendet (s-Methyl- und ~-Ethylmalondialde- hyd werden nur ungenfigend abgetrennt). Im Bereich yon 5 pMol (Be- stimmungsgrenze) und 4 nMol besteht Linearitfit zwischen Absorption und Menge. - Anal. Biochem. 149, 284--290 (1985). Wayne State Univ., Dept. Chem., Detroit, MI (USA) J.B.

Determination of uric acid in biological solutions using bienzyme electrodes. J.J. Kulys, M.V. Pesliakiene, V.-S. A. Laurinavicius, S.Sh. Tatikyan and A.L. Simonyan.

Die bienzymatische hochstabile Elektrode auf der Basis der immobili- sierten Uricase und Peroxidase (eingehende Beschreibung ihrer Herstel- lung s. Original) erlaubt, den Harnsiiuregehalt in biologischen Flfissig- keiten (Blut, Serum, Ham) schnell zu bestimmen. Man migt dabei entweder den stationfiren Strom des Gemisches Probe/Hexacyanoferrat(II) oder man nimmt den Strom in kinetischem Regime auf; unter Verwen- dung des erstgenannten Verfahrens erzielt man eine bessere Reproduzier- barkeit. Als Vergleichselektrode benutzt man gesfitt. Ag/AgC1. Arbeits- weise. 0,1 ml Probe wird mit 0,1 ml Boratpuffer pH 9,0 und 0,8 ml (Blut, Serum) bzw. 9,8 ml (Ham) gepufferter und auf25~ temperierter 1 mM K3Fe(CN)a-L6sung vermischt; man migt danach unter Verwendung des angegebenen Elektrodensystems entweder den maximalen Wert der Stromerh6hungsgeschwindigkeit um 12-15 sec oder den konstanten Wert des stationfiren Stroms innerhalb 2 - 3 rain. Der Harnsiiuregehalt wird n-fit Hilfe der unter denselben Bedingungen unter Verwendung von zwei L6sungen (16,8 rag%, d.i. I retool/1 ffir die Blut- und Serum- Analyse bzw. 101 rag%, d.i. 6 retool/1 •r die Harnanalyse) aufgestellten Eichkurven ermittelt, 13 Zitate. - Zh. Anal. Khim 40, 2077-2080 (1985) (Russisch, mit engl. Zus.fass.). Inst. f. Biochemie, Akad. Wiss., Vilnius (SU) F. Jancik

Carbon-13 NMR characterization of an O-alkylated derivative of the theophylline metabolite 1,3-dimethyluric acid. P.S. Callery, M. Stogniew, M.F. Kaiser and R.M. Dennin, Jr.

Gegenstand der Untersuchung war die Aufklfirung der Struktur des Derivates, das bei der Reaktion von 1,3-Dimethylharns~.ure, dem Haupt- metaboliten des Thcophyllins im menschlichen Organismus, mit Iodpro- pan entsteht. Das Ergebnis einer GC-MS-Analysc war so zu interpretie- ren, dab ein einzelnes dipropyliertes Produkt auftrat, obwohl drci Posi- tionsisomere m6glich sin& Die Stabilitfit dieses Produktes war jedoch geringer als erwartet, da eine der eingeffihrten Alkylgruppen leicht durch Siiurehydrolyse wieder abgespalten wurde. Ffir die Ermittlung der Posi- tionen der Alkylierung erwies sich die 13C-NMR-Spektroskopie als brauchbarste Methode. Die Zuordnung der 13C.Resonanzen erwies sich best/indig, wenn man ffir die Propylgruppen die Position N-7 und ffir den Sauerstoff bei C-8 annahm. Die Gesamtstruktur des Produktes wurde als 1,3-Dimethyl-7-0-propyl)-8-(1-propyloxy)xanthin ermittelt. - Anal. Lett. 18, 2537--2549 (1985). Dept. Med. Chem., School Pharm., State Univ., Baltimore, MD; Dev. Dept., Pharm. Div., Ciba- Geigy Corp., Suffern, NY (USA) W. Czysz

Measurement of the formation of menthol glucuronide in vitro, by reversed- phase high-performance liquid chromatography after pre-column labelling with 4-hromo-methyl-7-methoxycoumariu. P. Leroy, S Chakir and A. Nicolas.

233

~ g ~ s ~ a @ ~ 8 3 Biochemical and clinical analysis

Glucurons/iurekonjugate k6nnen mit 4-Brom-methyl-7-methoxycou- marin und Kaliumcarbonat und ]8-Krone-6-ether in Aceton an der Carboxylgruppe verestert werden. Die entstehenden Ester k6nnen auf einer LiChrospher CH-18 Reversed-Phase S~iule mit Methanol/Wasser (75:25) durch HPLC getrennt und bei 328 nm im UV nachgewiesen werden. Die Empfindlichkeit fiir jedes der injizierten Glucuronide in derivatisierter Form liegt bei 10-1 t Mol. Die Derivatisierungsmethode wird optimiert. Bei dem Verfahren wird Borneolglucuronid als interner Standard verwendet. Die Methode kann zur Bestimmung der Glucuro- nyltransferase-Aktivitfit gegeniiber Menthol w/ihrend in vitro Bestim- mungen eingesetzt werden. - J. Chromatogr. 351, 267-274 (1986). Lab. Chim. Anal. Bromatol., Fac. Sci. Pharm. Biolog., Nancy (F)

R.H.S.

Simple HPLC-EC method for the simultaneous determination of biogenic amines and their main metabolites in small rat brain regions. R. Duran, M. Aldegunde and J. Marco.

Dopamin, Serotonin und deren saure Metaboliten 3,4-Dihydroxyphe- nylessigsfiure und 5-Hydroxyindolessigs~iure werden durch HPLC mit elektrnchemischer Detektion bestimmt. ]Man benutzt Stahls/iulen von Waters mit 30pm ttBodapak C-18 und zur Detektion eine Glaskohlen- stoffelektrode (Bioanal. Systems), dessen Potential auf +0,70 V vs. Ag/ AgC1 eingestellt wird. Die isokratische Elution bei Raumtemperatur erfolgt mit einem Gemisch aus Acetatpuffer pH 4,45, 1 mM EDTA und 5% Methanol (2 mi/min). Bei geringer Probenanfbereitung (Enteiwei- Ben des Homogenats mit Perchlors/iure, 0,1 M, + 0,4 M Natriumsulfit; der klare I~berstand wird in die S~iule injiziert) liegen die Wiederfindcns- raten bei 85 -90%. Die Trennungen sind scharf (Chromatogramm- Abb.). Das Verfahren eignet sich fiir Bestimmungen im ng/g Bereich; lineare Standardkurven yon 200 pg bis 10 n g . - Anal. Lett. 18, 2173- 2181 (1985). Dept. Anita. Physiol., Fac. Biol., Univ., Santiago de Com- postela (E) W. Czysz

Determination of the biogenic amines and their major metabolites in single human brain tissue samples using a combined extraction procedure and high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. P. Herregodts, Y. Michotte and G. Ebinger.

Ein kombiniertes Extraktionssystem zur selektiven und quantitativen Isolierung und Bestimmung der Monoamine Norepinephrin, Epineph- rin, Dopamin, Serotonin und ihren Metaboliten 3-Methoxy-4-hydroxy- phenylethylenglykol, 3,4-Dihydroxyphenylessigs/iure, 5-Hydroxyindol- essigs~ure, Homovanillins/iure und 3-Methoxytyramin aus Hirngewebe wird beschrieben. Die Metabolite mit Ausnahme des 3-Methoxytyr- amins kgniaen mit Ethylacetat extrahiert werden. AnschlieBend werden in einem ersten Schritt die Catecholamine mit Heptan/Octanol (99:1) + 0,25% Tetraoctylammoniumbromid als Ionenpaarnngsreagens in Ge- genwart yon 0,2% Diphenylborat isoliert. Anschliel~end werden in einem zweiten Schritt 3-Methoxytyramin und 5-Hydroxytyramin aus der w~ig- rigen Phase mit Di(2-ethylhexyl)phosphors/iure als Gegenion in Chloro- form abgetrennt. Dihydroxybenzylamin, Isohomovanillinsfiure und 5- Hydroxy-N-methyltryptamin werden als interne Standards verwendet. Die anschliegende Analyse erfolgt durch HPLC mit elektrochemischer Detektion. - J. Chromatogr. 345, 3 3 - 4 2 (1985). Pharm. Inst., Vrije Univ. Briissel (B) R.H.S.

Quantitative determination of methylamines using mieroelectrodes. S. Bagnasco.

Fiir die Bestimmung von Methylamino-Verbindungen z.B. Cholin, Trimethylamin, Trimethylamin-N-oxid, Betain, Carnitin und Dimethyl- amin wird eine chromatographische Methode vorgeschlagen. Die Auf- trennung erfolgt an einer Kationenaustauschers/iule (AG 50W-X8, Bio- Rad in 0,4 N HC1). Die Detektion erfolgt mit Hilfe einer Glas-Mikro- elektrode im Bereich von 0,1 - 1 0 mMol. Die Linearit/it der Anzeige ist auch bei hohen Ionen-Konzentrationen gew~ihrleistet. - Anal. Bio- chem. 149, 572-574 (1985). Nat. Heart, Lung Blood Inst., Nat. Inst. Health, Bethesda, MD (USA) J.B.

Determination of [~-phenylethylamine concentrations in human plasma, platelets, and urine and in animal tissue by high-performance liquid chromatography with fluorometric detection. M. Tsuji, K. Ohi, C. Taga, T. Myojin and S. Takahashi.

234

Ein hochempfindliches HPLC-Verfahren zur Bestimmung von [3-Phe- nylethylamin (PEA) in Humanplasma, Blutpl/ittchen und Harn sowie in M/iusegewebe wird beschrieben. Die Isolierung des Phenylethylamins aus der biologischen Probe erfolgt zweistufig erst auf einer Dowex-50 x 8 Kationenaustauscher-S/iule (NH4+-Form) und anschliel3end auf einer Cosmosil C18-P-S/iule nach Enteiweil3ung der Probe. Von der Kationen- austauscher S/iule wird das PEA nach Waschen mit Wasser, 6 M HC1 und Ethanol in 6 M HC1 in 50% Ethanol eluiert. Der Riickstand des Eluats wird fiber eine Amberlit GC-50-S/iule gereinigt, die mit NIt4OH eluiert wird. Der Riickstand dieses Eluats wird in 50 mM Citratpuffer, 100 gM EDTA und 5% Acetonitril (pH 4,5), der mobilen Phase, gel6st und aufdie HPLC-S/iule gegeben. Das HPLC-Effluat wird mit o-Phthal- aldehydreagens gemischt und fluorimetrisch bei 340/440 nm ausgewertet. Die Wiederfindensrate liegt zwischen 99-101%. Im Bereich von 50-5000 pg/Injektion erhfilt man eine lineare Eichkurve fiir Phenyle- thylamin. - Anal. Biochem. 153, 116-120 (1986). Dept. Psych., Shiga Univ. Med. Sci., Seta Tsukinowa-cho, Otsu (J) R.H.S.

Determination of free choline in plasma and erythrocyte samples and choline derived from membrane phosphatidyleholine by a chemilumines- cence method. I. Das, J. de Belleroehe, C.J. Moore and F.C. Rose.

Ein empfindliches Chemiluminescenzverfahren zur Bestimmung yon Cholin in Erythrocyten und in Plasma wird beschrieben. Nach einer Reinigung der mit Chloressigs~iure enteiweiBten Diethylethere• tiber Aktivkohle (Norit OL) erh~ilt man •r beide Matrices gleiche Ergeb- nisse. Cholin aus Membran-Phosphatidylcholin kann nach AufschluB mit Phospholipase D ebenfalls bestimmt werden. Cholin wird durch Kopplung zweier enzymkatalysierter Reaktionen bestimmt, der Konver- sion yon Cholin zu Betain durch Cholinoxidase und der Oxidation yon Lurninol durch Peroxidase. Die entstehende Chemiluminescenz wird gemessen. Das Verfahren wird zur Cholinbestimmung im Blut von Kopf- schmerzpatienten eingesetzt. - Anal. Biochem. 152, 178-182 (1986). Dept. Biochem., Charing Cross Westminster Med. School, London (GB)

R.H.S.

Simultaneous determination of histamine and N*-methylhistamine with high-performance liquid chromatography using electrochemical detection. K. Mine, K.A. Jacobson, K.L. Kirk, Y. Kitajima and M. Linnoila.

Zur gleichzeitigen quantitativen Bestimmung yon Histamin und N ~- Methylhistamin wird ein HPLC-Verfahren mit elektrochemischer Detek- tion entwickelt. Die Amine werden mit wasserl6slichem Bolton-Hunter- Reagens (Sulfo B-H) derivatisiert. Die Perchlorsfiureextrakte yon Rat- tenhirn werden auf einer S/iule Dowex 50W-X-S/iule als starkem Katio- nenaustauscherharz chromatographiert. Das Eluat wird eingedampft und bei Zimmertemperatur und pH 9,8 mit Sulfo B-H-Reagens umgesetzt. Nach 30 sec ist die Derivatisierung vollstfindig und die Reinigung der Derivate erfolgt fiber eine Cellulose-Phosphat-Kationenaustauscher- sfiule. Die Elution erfolgt mit 03 M HC1. Die HPLC-Trennung erfolgt auf Ultrasphere ODS-S~iulen unter Vorschaltung einer gBondapak C18/ Corasil-S~iule mit 0,14 M Natriumacetat/Methanol (17:73) unter Zusatz yon 3,89 M 1-Octansulfons~iure und 56 mg EDTA als mobiler Phase (pH 3,48). Der Nachweis erfolgt elektrochemisch bei 0,56 V nach Oxidie- rung der Probe bei 0,47 V. Die Derivate yon Histamin, N~-Methylhista - rain und N~-Methylhistamin k6nnen vollst/indig ohne st6rende Peaks mit dem Verfahren getrennt werden. N~-Methylhistamin, welches in den Hirnproben nicht vorhanden ist, wird als interner Standard verwendet. Die Genauigkeit liegt zwischen 2 und 7% und die Linearit/it bei 0,999. Dis Verfahren ist empfindlich genug, den Histamin- und N~-Methyl - histamingehalt in einzelnen Nuclei yon Ratten-Hypothalamus routine- m/il3ig quantitativ bestimmen zu k6nnen. - Anal. Biochem. 152, 127- 135 (1986). Lab. Cli. Studies, DICBR, Nat. Inst. Health, Bethesda, MD (USA) R.H.S.

Complete high-performance liquid chromatographic separation of N,N- dimethylaminoazobenzene-4-'-thiohydantoin (DABTH) and 4-dimethylaminoazobenzene-4-'-suffonyl (DABS) chloride amino acids utilizing the same reversed-phase column at room temperature. V. Stocchi, L. Cucchiarini, G. Piccoli and M. Magnani.

Die vollst/indige HPLC-Trennung der DABTH- und der DABS-Ami- nos/iurederivate auf derselben Supelcosil LC-18-Sfiule bei Zimmertempe- ratur wird beschrieben. Fiir die Trennung der DABS-Aminos~iuren wird

3 Biochemische und klinische Analyse ~ e f ~ f ~

ein Gradientenprogramm zwischen folgenden zwei mobilen Phasen verwendet: Acetonitril/2-Propanol (80:20) und 25 mM KHzPO~ (pH 6,8) und ffir die DABTH-Aminos/iuren zwischen 35 mM Natriumacetatpuf- fer (pH 5,1) und Acetonitril. Der Nachweis aller Derivate kann bei 436 nm durchgefiihrt werden. Mit dem Verfahren k6nnen Aminosiiure- analysen bei Konzentrationen unter 1 pMol mit stabiler Grundlinien- trennung durchgef/ihrt werden. - J. Chromatogr. 349, 7 7 - 8 2 (1985). Ist. Chim. Biolog., Univ. Urbino (I) R.H.S.

The separation of o-phthalaldehyde derivatives of amino acids by reversed- phase chromatography on octylsilica columns. H,W. Jarrett, K.D. Cooksy, B. Ellis and J.M. Anderson.

Aminos/iuren, die mit o-Phthalaldehyd in Gegenwart yon 2-Mercap- toethanol derivatisiert worden sind, k6nnen mit einem einfachen linearen Gradienten von 1 0 - 6 5 % Methanol (15 rain) aufeiner Octyl-Silica (Cs)- S/iule dutch Reversed-Phase HPLC getrennt werden. Die Trennung ist dutch den pH-Wert, die lonenst/irke und die Tetrahydrofurankonzentra- tion des w/iBrigen L6stmgsmittelbestandteils beeinfluBbar. Aufgrund der Ergebnisse wird ein schnelles Trennverfahren fiir Aminos~uren aus sauren Proteinhydrolysaten entwickelt, bei dem die Aminos/iurederivate in weniger als 20 min getrennt werden. Es wird mit dem linearen 1 0 - 65%igen Gradienten von Methanol in 45 mM Natriumacetat/Tetrahy- drofuran (96: 4) (pH 5,7) gearbeitet. Der Nachweis erfolgt fluorimetrisch bei 280/465 nm. Mit einem etwas verbesserten Verfahren k6nnen aufih die komplexeren Aminos/iuregemische aus enzymatischen Proteinhydro- lysaten oder physiologischen F1/issigkeiten getrennt werden. Dabei erfolgt die Trennung in 40 rain auf einer Adsorbosphere C8-S/iule mit einem Gradienten zwischen 25 mM Natriumacetat (pH 5,9)/Isopropyl- alkohol/Dioxan (925:30:45) und Methanol/Isopropylalkohol/Dioxan (960:15:25). - Anal. Biochem. 153, 189-198 (1986). Dept. Biol., Pur- due Univ. School Sci., Indianapolis, IN (USA) R.H.S.

Analysis of problems encountered in the determination of amino acid enantiomeric ratios by gas chromatography. I.L. Payan, R. Cadilla- Perezrios, G.H. Fisher and E.H. Man.

Bei der Bestimmung des Enantiomeren-Verh/iltnisses von Aminos/iuren mit niedrigen D/L-Verhgltnissen ( _< 0,1) durch Derivatisierung zu den entsprechenden N-Trifluoracetyl-L-prolyl-D/L-aminosfiureestern (mit N-Trifluoracetyl-L-propylchlorid in Gegenwart von Triethylamin) und Auftrennung durch GC (Quarzcapillare, 30 m, Chirasil-Val III) werden bei Standardsubstanzen widersprechende und nicht reproduzierbare Ergebnisse erhalten. Es wird gefunden, dab das im OberschuB verwendetes Triethylamin zu einer Racemisierung des chiralen Reagen- ses ffihrt. Dadurch entstehen bei der Derivatisierung vier Dipeptide. Die durch partielle Racemisierung entstandenen Dipeptide koeluieren mit den beiden anderen und ffihren zu fehlerhaften Resultaten. Bessere Er- gebnisse werden bei Derivatisierung durch Veresterung mit Isopropanol und nachfolgender Umsetzung mit Trifluoracetanhydrid und GC auf der genannten S/iule erzielt. - Anal. Biochem. 149, 484-491 (1985). Dept. Chem., Univ. Miami, Coral Gables, FL (USA) J.B.

Single-step, quantitative derivatization of amino, carboxyl, and hydroxyl groups in iodothyronine amino acids with ethanolie pivalic anhydride containing 4-dimethylaminopyridinc. M. Joppich, R. Joppich-Kuhn, A. Scntissi and R.W. Giese.

Thyroxin kann in Ethanol mit Pivalinsiiureanhydrid in Gegenwart yon 4-Dimethylaminopyridin quantitativ zum N,O-Dipivalylthyroxin- ethylester umgesetzt werden. Die Reaktion erfolgt bei 75~ in 45 rain. Die Ester k6nnen aus dem eingedampften Reaktionsgemisch durch pr/i- parative HPLC gereinigt werden. Andere Iodthyroxine reagieren/ihnlich. Das Verfahren ist feuchtigkeitsunempfindlich, lm Gegensatz zu anderen Derivatisierungsverfahren fiir ~-Aminos~iuren treten bei dieser Reaktion keine Schwierigkeiten mit Oxazolonzwischenprodukten auf. - Anal. Biochem. 153, 159-165 (1986). Dept. Med. Chem., Coll. Pharm,, Northeastern Univ., Boston, MA (USA) R.H.S.

High-performance liquid chromatographic determination of D-aminoiso- butyric acid in the picomol range. F.L. Buschman, G. Apeli and O.K. Sharma.

Die nichtproteinische Aminos/iure 13-Aminoisobutters/iure (13-AEBA), welche ein Abbauprodukt von Thymin in DNA ist, kann in Serum oder

Urin (vor oder nach Hydrolyse) innerhalb von 20 min mit einem HPLC- Verfahren in Mengen bis hinunter zu 5 - 10 pMol nachgewiesen werden. Dazu werden die hydrolysierten und nichthydrolysierten Proben mit Sulfosalicyls/iure versetzt, zentrifugiert und der Oberstand auf einer Radial-Pak C18-Patrone mit einem Gradienten aus 0,10 M NaH2PO4 (pH 2,5)-Puffer und 0,4 M Natriumcitrat (pH 4,20) chromatographiert. Das Effluat wird mit o-Phthalaldehydreagens in Kaliumborat (pH 10,4) versetzt trod der Nachweis der Derivate fluorimetrisch bei 365/410 nm durchgeffihrt. Das Verfahren ist auch ohne aufwendigen Aminos/iure- analysator durchfiihrbar. - J. Chromatogr. 374,129 - 136 (1985). Dept. Mol. Biolog., AMC Cancer Res. Center, Denver, CO (USA) R.H.S.

Method for rapid determination of hydroxyproline by high-performance hquid chromatography and its exploitation for the study of collagen formation. J. Macek and M. Adam.

Ein neues HPLC-Verfahren zur Bestimmung yon Hydroxyprolin wird beschrieben, mit welchem noch 20 ng Hydroxyprolin pro Injektion oder 200 ng/ml nachgewiesen werden k6nnen. Das Verfahren arbeitet mit einer S/iulenrfickschlagtechnik und isokratischer Elution. Eine Analyse dauert nur 10 rain. Dazu wird mit HC1 hydrolysiertes Dialysat eingedampft, in Wasser aufgenommen und auf cine mit Spheri-5- RP-8 gepackte Patrone gegeben. Eluiert wird mit Wasser/n-Propanol (97,4:2,6) + 3 g/1 SDS und 1 M Trichloressigsiiure aufpH 2,6. Das Eluat wird bei 440 nm registriert. Das Verfahren kann auch zur schnellen Isolierung radioaktiv markierten Hydroxyprolins eingesetzt werden. - J. Chroma- togr. 374, 125-128 (1986). Res. Inst. Rheumatic Diseases, Prag 2 (CS)

R.H.S.

Sensitive determination of tyrosine metabilltes, p-hydroxy phenyl acetic acid, 4-hydroxy-3-methoxyphenylaeetic acid and 4-hydroxy-3-methoxy- mandelic acid, by gas chromatography-negative-ion chemical-ionization mass spectrometry. Application to a stable isotupe-labelled tracer exper- iment to investigate their metabolism in man. M. Shimamura, S. Kamada, T. Hayashi, H. Naruse and Y. Iida.

Nach Eingabe yon Phenylalanin-d~ wird im Harn der Gehalt an p- Hydroxyphenylessigs/iure-d4, 4-Hydroxy-3 -methoxyphenylessigsgure- da und 4-Hydroxy-3-methoxymandelsfiure-d3 durch ein GLC/MS-Ver- fahren bestimmt. Zur Analyse werden die Harnproben mit Kreatinin und deuterierten Analogen der Verbindungen als internen Standards versetzt, die S/iuren mit Ethylacetat extrahiert, durch HPLC gereinigt (NS-Gel Cs-S/iule mit einem Gradienten aus 0,01 M Essigs/iure + Na2EDTA und 50% w/iBrigem Acetonitril), dann mit 5% Pentafluoro- benzylbromid in Aceton unter Zusatz von Na2SO4 und Na2CO3 (1 : 1) 1 h bei 40~ derivatisiert. Dann wird trimethylsilyiert und die Derivate auf einer OV-101 FS-WCOT Capillars/iule mit Methan als Trgger- und Ionisierungsgas durch GLC/MS analysiert. - J. Chromatogr. 374, 1 7 - 26 (1986). Nat. Centre Nervous Disorder, Kodaira, Tokyo (J) R.H.S.

Chromatographic determination of N-acetyl-DL-tryptophan and oetanoic acid in human albumin solutions. H.J.C.F. Nelis, M.F. Lefevere, E. Baert, W. D'Hoore and A.P. de Leenheer.

Der Stabilisator N-Acetyl-DL-tryptophan kann in Humanalbuminl6- sungen nach Deproteinisierung und Extraktion mit Methanol mit einem HPLC-Verfahren bestimmt werden. N-Formyl-DL-tryptophan wird als interner Standard verwendet. Die Trennung erfolgt auf einer Zorbax ODS-Reversed-Phase Sfiule mit Wasser/Methanol-Phosphors/iure (72:28:0,1) und der Nachweis wird bei 280 nm im UV durchgeftihrt. Im Bereich von 4,9 mM erh/ilt man Extraktionsausbeuten von 92,5 _+ 2,5%. Octans/iure wird als Methylester unter Einsatz von Nonans/iure als internem Standard bestimmt. Hierbei muB die Probe nach Ans/iuern mit Hexan extrahiert werden und die Derivatisierung mit Methanol/ Schwefels/iure durchgefiihrt werden. Die Ausbeute liegt bei 89,7 + 5,8%. - J. Chromatogr. 333, 381-387 (1985). Lab. Med. Biochem., Klin. Anal., Rijksuniv. Gent (B) R.H.S.

Determination of eysteine and glutathione in plasma and blood by liquid chromatography with electrochemical detection using a chemically modi- fied electrode containing cobalt phthaioeyanine. M.K. Halbert and R.P. Baldwin.

Cystein und Glutathion k6nnen nach HPLC-Trennung aus Plasma- und Blutproben amperometrisch mit einer Kohlepasteelektrode, die Co- Phthalocyanin enth/ilt, nachgewiesen werden. Die elektrokatalytische

235

} ~ S ~ a � 9 3 Biochemical and clinical analysis

Aktivitit dieser chemisch modifizierten Elektrode gestattet bei einem Potential yon +0,75 V gegen Ag/AgC1 eine optimale Anzeige, die verwendete Spannung liegt damit einige hundert Millivolt unter der Span- nung, die fiir konventionelle Kohleelektroden ben6tigt wird. Die untere Nachweisgrenze liegt bei weniger als 4 pMol der Verbindungen bei nut minimaler Probenvorbereitung. Dazu wird die Probe nur mit o-Pho- sphorsilure angesiuert und mit 1 g/1EDTA versetzt, die Trennung erfolgt auf einer Reversed-Phase C18-S/iule mit Methanol/KH2PO, (5:95) (pH 2,4) + 2,5 mM Natriumoctansulfonat als Ionenpaarungsreagens. Die Beschichtung der Elektrode mit Co-Phthalocyanin wird beschrieben. - J. Chromatogr. 345, 43 - 4 9 (1985). Dept. Chem., Univ. Louisville, KY (USA) R.H.S.

Determination of histidine, 1-methylhistidine and 3-methylhistidine in biological samples by high-performance liquid chromatography. Clinical application of urinary 3-methyllfistidine in evaluating the muscle breakdown in uraemic patients. G.A. Qureshi, A. Gutierrez and J. Bergstr6m.

Ein schnelles Verfahren zur Bestimmung von 21 Aminosiuren in proteinfreien biologischen Proben wird beschrieben. Optimale Bedin- gungen zur Auftrennung yon Histidin (HIS), 3-MethylHIS und ]-Me- thylHIS durch HPLC und zur Abtrennung yon anderen Aminosiluren werden ermittclt. Das Verfahren beruht auf der precolumn-Derivatisie- rung mit o-Phthalaldehyd in Gegenwart von 3-Mercaptopropionsilure. Die Trennung der Derivate erfolgt auf einer Hypersil ODS unter Vor- schaltung einer Waters Schutzs~iule. Eluiert wird mit einem Gradienten- programm zwischen 20 mM Phosphatpuffer/Tetrahydrofuran (99:1) und 20 mM Phosphatpuffer/Methanol (30: 70). Der Nachweis wird fluorimetrisch bei 340/450 nm durchgefiihrt. Das Verfahren gestattet die gleichzeitige quantitative Bestimmung von Tyrosin, Phenylalauin und 16 anderen Aminosiluren. - J. Chromatogr. 374, 363 - 3 6 9 (1986). Dept. Renal Med., Karolinkska Inst., Huddinge Univ. Hosp., Huddinge (S)

R.H.S.

separation of some peptides and related isopeptides by high-performance liquid chromatography: structure-retention time relationships. H. Gaert- ner and A. Puigserver.

Eine Reihe yon Peptiden und verwandten Isopeptiden k6nnen gut durch Reversed-Phase HPLC unter verschiedenen experimentellen Be- dingungen getrennt werden. Die Retentionszeiten werden auf einer Li- Chrosorb Cls Reversed-Phase S/iuie mit mobilen Phasen aus 0,1% H3PO4 (pH 2,2); 0,1 M NaC104/0,1% H3PO4; 0,05% Trifluoressig- silure (pH 2,3); 0,01 M Ammoniumacetat (pH 5,7); oder 0,005 M Na3PO, (pH 7,4) unter Zugabe yon Acetonitril als organischem Zusatz ( 0 - 6 0 % in 40 ruin) mit I ml/min ermittelt. Der Nachweis kann bei 214 nm im UV durchgefiihrt werden, Die erhaltenen Retentionszeiten der einzelnen Peptide oder Isopeptide werden ihrer Struktur zugeordnet und zur Voraussage der Aminosilurezusammensetzung eingesetzt. - J. Chromatogr. 350, 279-284 (1985). Centre Biochim. Centre Nat. Rech. Sci., Marseille (F) R.H.S.

High performance liquid chromatography of proteins and peptides on an octadecyl-bonded glass support. T. Ichimura, Y. Amano, T. Isobe and T. Okuyama.

Reversed phase liquid chromatography of proteins and peptides was performed on an octadecyl-bonded glass support having a mean particle diameter of 5 Ixm and a pore size of 350 ~. The mobile phase was the mixture of acetonitrile and water containing 0.1% (v/v) trifiuoroacetic acid. The content of acetonitrile was increased linearly (gradient mode). Sixteen test proteins having molecular weights of 10000-190000 Dalton were eluted within 40 rain with considerably high resolution. The recoveries were dependent on the molecular weights of the samples. The recoveries of the proteins having molecular weights of 190000 were about 30%. The retention time of proteins showed a linear relationship to the molecular weight of the proteins. - Bunseki Kagaku 34, 653--658 (1985) (Japanisch, mit engl. Zus.fass.). Dept. Chem. Fac. Sci., Tokyo Metropol. Univ., Setagaya-ku, Tokyo (J)

A spectrophotometric method for quantitation of earboxyl group modifica- tion of proteins using Woodward's reagent K. U. Sinha and J.M, Brewer.

236

Die Reaktion mit Woodward's Reagens in (0,05 M Ionenstilrke) Tris- HC1 (pH 7,8) fiihrt zu kovalent gebundenen Chromophoren, deren Ab- sorptionsmaximum bei 340 nm liegt und die einen Extinktionskoeffizien- ten yon 7000 M - 1 cm - 1 aufweisen. Die Reaktionsprodukte mfissen yon iiberschiissigem Reagens durch Chromatographic auf Sephadex G-25 im Tris-HC1-Puffer (wie oben) abgetrennt werden. Das Verfahren kann zur quantitativen Bestimmung yon Carboxylgruppen in Proteinen eingesetzt werden. Sulfhydrylgruppen reagieren nicht mit Woodward's Re- agens. Das Chromophor weist auch spezifisch carboxyl-modifizierte Peptide nach, beispielsweise bei chromatographischer oder elektropho- retischer Trennung. - Anal. Biochem. 151, 327-333 (1985). Dept. Biochem., Univ. Georgia, Athens, GA (USA) R.H.S.

A convenient S-2-aminoethylation of cysteinyl residues in reduced proteins. K. Okazaki, H. Yamada and T. Imoto.

Die bisher zur Vorbereitung der Sequenzanalyse yon Proteinen durch Abbau mit proteolytischem Enzym und Umkehrphasen-HPLC ange- wandte Methode der Reduzierung der Disulfid-Briicken und nachfolgender Umsetzung der Cysteinyl-Reste mit Ethyleuimin unter Bildung der hydrophilen S-2-Aminoethylderivate kann, da das Ethyleuimin wegen seiner hohen Carcinogenit/it uicht mehr im Handel ist, nicht mehr angewandt werden. Es wird stattdessen die S-2-Aminoethylierung mit 2- Bromethylamin unter milden Bedingungen empfohlen, wobei Reduktion und Derivatisierung durch gquimolare Mengen an 2-Mercaptoethanol und 2-Bromethylamin bei 25~ als optimal gefunden wurden. - Anal. Biochem. 149, 516-520 (1985). Fac. Pharm Sci., Kyushu Univ., Mai- dashi, Higashi-ku, Fukuoka (J) J.B.

A sensitive speetrofluorimetrie determination of human serum albumin with chrome azurol S. Y. Saito, Y. Inden-Okazaki, S. Wada-Yano, A. Kanetsuna, K.-i. Miyazaki, M. Mifune and Y. Tanaka.

Auf der Grundlage der Bindung yon Chromazurol S durch Albumin und Messung der Fluorescenzintensit/it des gebildeten Komplexes bei 616 nm gegen eine Reagentienblindl6sung (Anregung bei 493 nm; Spalt- breite 2 0 - 40 nm) kann Humanserumalbumin noch in Mengen yon 5 - 80 Ixg erfal3t werden. Das reicht z.B. aus, Albuminbestimmungen noch in 20-100 gl Spinalfliissigkeit durchzufiihren. Die Empfindlichkeit ist dreigigmal besser als die der Bromkresolgrfinmethode, die St6rungen durch Bilirubin und Gammaglobulin sind etwa gleich. Bei der Bestim- mung yon 40 gg HSA liegt die rel, Standardabweichnng bei 1,3 %. 500 gg Ca-Ion oder Phosphat ver/indern die Intensit/[t um weniger als 3 %. Die St6rung dureh AI(III) und Fe(III) kann vernachlilssigt werden, wenn diese Ionen in nicht gr6Berer Menge als 5~tg anwesend sin& - Anal. Chim. Acta 178, 337-339 (1985). Fac. Pharm. Sci., Okayama Univ., Tsushima-Naka, Okayama (J) W. Czysz

Electrophoretic separation of histones and high-mobility-group proteins on acid-urea-triton gels. T. Bouiikas.

Es wird ein modifiziertes Polyacrylamid-Gelsystem nach Bonner u.a, Eur. J. Biochem. 109, 17 (1980) beschrieben, das mit Ammoniumpersul- fat anstelle Photopolymerisation polymerisiert wird und kein Stapelgel enthillt. Die Glycerin-Konzentration im Elektrodenpuffer ist yon 0,1 auf 0,2 M erh6ht, die der Essigs[iure yon 1 auf 0,5 M und die yon Harnstoff von 8 M auf 3 bzw. 6 M herabgesetzt. Bci extrem niedrigen Triton-X- 100-Konzentrationen k6nnen eiuige Histon-Varianten (H3.1) durch ihre geringe Wanderungsgeschwindigkeit yon den iibrigen abgetrennt werden. Mit steigender Triton-Konzentration wird die Geschwindigkeit von H2A.1, H3.2, H2.A.2, H4 und H2B sequentiell herabgesetzt. Die Mobili- tilt von H1 und High-Mobility-Group-Nicht-Histonproteinen bleibt unter allen Bedingungen unverfindert. Mit diesem Gelsystem k6nnen la- dungsmodifizierte Histon-Formen getrennt werden. - Anal. Biochem. 149, 379--386 (1985). Swiss Inst. for Exp. Cancer Res., 1066 Epalinges (CH) J.B.

Photoacoustic determination of glucose using multilayered film. M. Yaegashi, F. Itoga and Y. Sugitani.

Photoacoustic determination of the glucose concentrations was conducted by using a multilayered film as a probe material for dyeing. A small amount (about 2.5 gl) of glucose solution with various concentrations (0~4 g/l) was dropped on one side of the film. The glucose solution permeated through the layers of the film to reach the reagent

3 Biochemische und klinische Analyse ~ e ~ f ~ g ~ a ~

layer where the dyeing reaction occured. The dyestuff showed a characteristic absorption peak at 500 nm, and light from xenon lamp with wavelengths between 460 ~ 800 was used for exciting the dyestuff. The photoacoustic signal from the other side of the film was detected. The signal intensity was found to be linear in the range from 0 to 2 g/1. This method was applied to the measurement of the glucose concentration of human blood, and was found to give somewhat higher values compared to those by mutarotase GOD method, the standard method for glucose determination. It can serve, however, as a rapid and simple diagnosis of diabetes. - Bunseki Kagaku 34, 772-776 (1985) (Japanisch, mit engl. Zus.fass.). Inst. Chem. Univ. Tsukuba, Niihara- gun, Ibaraki (J)

Analysis of hyulurouic acid and chondroitin by high-performance liquid chromatography of the constituent disaccharide units. K. Muruta and Y. Yokoyama.

Unges~ittigte nicht-sulfatierte Disaccharide, die aus Hyalurons/iure und Chondroitin gewonnen wurden, werden durch ein verbessertes HPLC-Verfahren auf einem Ionenaustauscher aus sulfoniertem Styrol/ Divinylbenzol-Copolymeren (Shodex RS, Typ DC-613) analysiert. Es wird isokratisch mit Acetonitril/Methanol/0,5 M Ammoniumformiat- puffer (pH 4,5) (65:15:20) als mobiler Phase bei 70~ gearbeitet. Der Nachweis erfolgt bei 232 nm im UV. Mit dem Verfahren werden genaue und reproduzierbare Retentionszeiten ffir diese unges/ittigten Disaccha- ride erhalten. Das Verfahren ist im Bereich bis hlnunter zu 1 - 8 gg einsetzbar. - J. Chromatogr. 374, 3 7 - 4 4 (1986). Dept. Med., Phys. Therapy, Univ. Tokyo School Med., Bunkyo-ku, Tokyo (J) R.H.S.

Simultaneous separation and sensitive determination of free fatty acids in blood plasma by high-performance liquid chromatography. I. Yanagisawa, M. Yamane and T. Urayama.

Die quantitative Bestimmung ges/ittigter und unges/ittigter Fetts/iuren (von C 2 - C24) in biologischen Proben wird beschrieben. Dazu wird die sekundfire Amingruppe yon 5-(Dimethylamino)-l-naphtalinsulfonylse- mipiperazid (Dansyl-Semipiperazid) mit der Carboxylgruppe der Fett- s/iuren unter Bildung einer Amidbindung umgesetzt. Die erhaltenen fluorescierenden Derivate k6nnen dutch HPLC auf einer Hitachi CI8- S~iule mit einem stufenweisen Gradienten zwischen Methanol/Wasser oder Acetonitril/Wasser getrennt werden. Der Nachweis erfolgt fluorimetrisch bei 350/530 nm. Als interne Standards bei der Analyse yon Blutserum werden Cls- und 2C7:1-Fetts/iuren eingesetzt. Die Derivate k6nnen auch diinnschichtchromatographisch getrennt werden. - J. Chromatogr. 345, 229-240 (1985). Dept. Biochem., Tokyo Med. Coll., Tokyo (J) R.H.S.

The use of the iatroscan TH-10 analyzer to quantify total lipids in a variety of sample types and lipid classes in human gallbladder bile. H.R. Harvey, M.W. Rigler and J.S. Patton.

Verff. beschreiben zwei Verfahren: I) Trennung der Gesamtlipide auf Chromarods mit Chloroform/Methanol (1 : 1) und Bestimmung mit FID und II) Bestimmung von Cholesterin, Phospholipiden und Gallens/iuren im Iatroscan-Analyzer mit zwei L6sungsmittelsystemen. -- Arbeitsweise. I) Lipidproben in Chloroform/Methanol (1 : 1) 16sen und unter Stickstoff bei -20~ aufbewahren. 5 ~1 auf akt. Chromarod S-II-Silicagel auftragen, trocknen und mit Chloroform/Methanol (1:1) auftrennen. Dann 5 min bei 100~ trocknen, Auswertung im Hewlett-Packard 3390 A Integrator. II) Galle-Proben in Komponenten nach R. Beke, O.A. De Weerdt und F. Barber (J. Chromatogr. !93, 504 - 510 (1980)) auftrennen, falls erforderlich zentrifugieren. Je 5 pl auftragen und 1) mit Chloroform/ Petrolether/Methanol/Aceton (60: 20:10:10) chromatographieren, Wegstrecke 8 - 10 cm. Nach Trocknen 5 min bei 100~ mit 2) Aceton/ Wasser (50:50) chromatographieren (Wegstrecke 5 cm). - Lipids 20, 542-545 (1985). Dept. Microbiol., Univ. Athens, GA (USA)

D. Rittweger

Determination of higher fatty acids in phospholipid subtractions of human platelets using thin-layer chromatography and gas chromatography. A. Ozawa, H. Jinbo, H. Takahashi, T. Fujita, A. Hirai, T. Terano, Y. Tamura arts S. Yoshida.

In order to investigate the distribution of eicosapolyenoic fatty acids in phospholipid subfractions of human platelets, we established an

improved method using thin-layer chromatography (TLC) for the separation of phospholipid subfractions and gas chromatography equipped with a solvent-less sample injector for the determination of fatty acids. Lipids of sonicated human platelet suspensions were extracted with chloroform/methanol solution (2:1, v/v) in the presence of butylated hydroxytoluene (BHT) at room temperature for 60 min. Phospholipid subfractions extracted from platelets were separated by one-dimensional TLC on silica gel plates with a solvent system consisting of chloroform/ methanol/acetic acid/formic acid (50: 30:4, 5: 6.5, by volume). The areas corresponding to the phospholipid subfractions were detected with the spray of 8-anilinonaphthalenesulphonie acid ammonium salt (ANS). Phospholipids were extracted from the silica gel plates with chloroform/ methanol (1:4, v/v) once and methanol twice. Methyl esters of fatty acids in phospholipid subfractions were prepared with boron trifluoride and methanol. The fractions of the esters were analyzed by gas chromatography using a Shimadzu GC-7APTF gas chromatograph with a hydrogen flame ionization detector. C2a:o was used as an internal standard. - Bunseki Kagaku 34, 707-711 (1985) (Japanisch, mit engl. Zus.fass.). Centr. Res. Lab., Nippon Suisan Kaisha, Hachioji-shi, Tokyo (J)

Visualization method for suffolipids and its application to the determination of nanomole quantities of lipid sulfur. K. Murakami-Murofushi, K. Nakamura, I. Ishizuka and J. Ohta.

Zur Sichtbarmachung yon Sulfolipiden auf einem Dfinnschichtchro- matogramm wird die Platte mit einer L6sung von Azure A in verdfinnter H2SO4 bespriiht, in CH3OH getaucht, um fiberschiissigen Farbstoff zu entfernen und anschlieBend einige min auf 100~ erhitzt. Zwischen dem anionischem Sulfolipid und dem kationischen Farbstoff bildet sich ein Komplex, der sieh als dunkelblaue Bande auf hellblauen Untergrund darstellt und densitometrisch oder colorimetrisch (nach Extraktion mit CHC13/CH3OH) bei 640 nm bestimmt werden kann. Sulfolipide mit langen Kohlenhydratketten miissen vor der Anf~rbung mit Acetanhy- drid auf der Platte behandelt werden, um Verluste bei der Anffir- bungsprozedur zu vermeiden. Andere Gewebe-Lipide, die keine Sulfat- ester enthalten, werden nicht angef'~irbt. Im Bereich von 1 - 8 nMol Sulfolipid ist der Detektorresponse linear der Menge. - Anal. Biochem. 149, 480--483 (1985). Dept. Biol., Fac. Sci., Ochanomizu Univ., Oht- suka, Bunkyo-ku, Tokyo (J) J.B.

Quantitation of lipid peroxidation products by gas chromatography-mass spectrometry. H. Hughes, C.V. Smith, J.O. Tsokos-Kuhn and J.R. Mitchell.

Ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Lipidperoxidations- produkten in hepatischen Gesamtlipiden wird beschrieben. Dazu werden die Lipidextrakte reduziert und anschlieBend mit Natriummethoxid transmethyliert. Die Hydroxyfettsfiuren werden durch Kieselsfiurechro- matographle auf einer PorasiMiule mit Hexan/Isopropanol/Essigsfiure (995:4:1) isoliert und in die entsprechenden TMS-Derivate umgewandelt. Diese k6nnen gaschromatographisch auf einer Sfiule mit 5% SE- 30 auf Gas-Chrom Q (80 - 100 mesh) temperaturprogrammiert getrennt werden. Der Nachweis erfblgt mit einem FID oder durch angeschlossene Massenspektrometrie. 11-, 12- und 15-Hydroxyeicosatetraenonsfiure k6nnen quantitativ durch SIM relativ zu Methyl-15-hydroxyarachidat als internem Standard bestimmt werden. - Anal. Biochem. 152, 107- 112 (1986). Dept. Med. Inst. Lipid Res., Baylor Coll. Med., Houston, TX (USA) R.H.S.

Simple capillary gas chromatographic method for the quantitation of phytanic acid in serum. K. Jacob, S. Mehlin, M. Knedel and W. Vogt.

Phytansfiure (3,7,11,15-Tetramethylhexadecansfiure) ist eine Spuren- verbindung in Humanlipiden und kann aus Serumproben mit einem Capillar-GLC-Verfahren bestimmt werden. Dazu werden die anges~iuer- ten Serumproben mit Chloroform/Methanol (2:1) extrahiert, die untere Phase konzentriert, mit Pentadecans~iure in Isopropanol versetzt, mit Dichlormethan extrahlert und zur Trockne eingedampft. Der Rfiekstand wird in Toluol aufgenommen und mit 0,2 M methanolischer L6sung von m-Trifluormethylphenyltrimethylammoniumhydroxid 30 min bei Zim- mertemperatur derivatisiert. Das Gemisch wird zusammen mit Methyl- propionat auf einer 25 m SP-1000 Glascapillars~iule mit einem Tempera- turprogramm von 100-235~ analysiert. Der Nachweis wird mit einem

237

~ a ~ S 3 Biochemical and clinical analysis

FID durchgeffihrt. Die Eichkurve ist von 20-800 gg Phytansfiure/ml linear und die Nachweisgrenze liegt bei Probenvolumina yon 200 ixl bei 5 - 10 pg/ml. Das Verfahren kann bei der Untersuchung von Stoffwech- selerkrankungen eingesetzt werden. - J. Chromatogr. 374, 354-357 (1986). Inst. Klin. Chem., Klinikum Grol3hadern, Univ. Mtinchen (D)

R.H.S.

Determination of vitamins A und E in serum and plasma using simplified clarification method and high-performance liquid chromatography. W.W. Nierenberg and D.C. Lester.

Ein einfaches, schnelles, empfindliches und genaues HPLC-Verfahren zur Bestimmung yon Retinol und ~-Tocopherol in 0,5 ml Serum- oder Plasmaproben wird beschrieben. Dazu werden die Serumproteine dutch Acetonitril denaturiert, c~-Tocopherolacetat wird als interner Standard zugegeben. Die Extraktion erfolgt mit Ethylacetat/Butanol (1 : 1). Ohne Eindampfschritt kann der Extrakt auf einer C18-Reversed-Phase S~iule isokratisch mit Methanol/Wasser (95: 5) getrennt und im UV bei 280 nm nachgewiesen werden. Die Wiederfindensraten liegen fiber 98%. Die Nachweisgrenzen ffir Retinol und c~-Tocopherol liegen bei 60 ng/ml bzw. 0,9 ~tg/ml. Eine Trennung dauert ca. 12 min. - J. Chromatogr. 345, 2 7 5 - 284 (1985). Div. Clin. Pharmacol. Dept. Meal. Pharmacol., Norris Cotton Cancer Center, Hanover, NH (USA) R.H.S.

Measurement of plasma pyridoxal 5'-phosphate by combination of an enzymatic assay with high-performance liquid chromatography/electro- chemistry. B. Lequeu, J.-C. Guilland and J. Klepping.

Die Plasma-Probe wird mit einer Tyrosinapodecarboxylase-L6sung pr~inkubiert und nach Zusatz von L-Tyrosin inkubiert, wobei die Pyri- doxyl-5'-phosphat-abMngige Decarboxylierung yon L-Tyrosin zu L- Tyramin stattfindet. Nach Abstoppen der Reaktion mit HC1 wird der Ubcrstand dutch HPLC an einer Merck Lichrosorb RP-710B-Kolonne in Phosphat-Puffer (10% Acetonitril) aufgetrennt und das Tyramin mit einem elektrochemischen Detektor bestimmt. Die Peakflfiche ist der Pyridoxyl-5'-phosphat-Menge im Bereich von 1,3 nMol (Bestimmungs- grenze) - 80 nMol proportional. Der Variationskoeffizient betr/igt bei 60 nMol Pyridoxyl-5'-phosphat 1,9%. - Anal. Biochem. 149, 296-300 (1985). Lab. de Physiol., Fac. de M~d., Dijon (F) J.B.

Quantitation of B6 vitamers in rat plasma by high-performance liquid chromatography. T.E. Hefferan, B.M. Chrisley and J.A. Driskell.

Bin Reversed-Phase Ionenpaar-HPLC-Verfahren zur Bestimmung yon Bt-Vitaminen wird beschrieben und mit Ergebnissen, die durch mikrobiologische Bestimmung erhalten wurden, verglichen. Die HPLC wird auf einer ODS C18-S/iule mit einem Gradienten zwischen Methanol/ Wasser (850:150) und 0,005 M Heptansulfons/isure in 1% Essigs/iure durchgeftihrt. Der Nachweis erfolgt fluorimetrisch bei 300/375 nm. Das Verfahren wird zur Bestimmung von B6-Vitaminen in Humanmilch eingesetzt, zur Extraktion wird ein leicht modifiziertes Verfahren nach L.A. Morrison mad J.A. Driskell (J. Chromatogr. 337, 249 0985)) eingesetzt. An dieser Stelle ist auch das mikrobiologische Verfahren beschrieben. - J. Chromatogr. 374, 155-161 (1986). Dept. Human Nutrition Foods, Virginia Polytechn. Inst., State Univ. Blacksburg, VA (USA) R.H.S.

Amperometric assay of total and free chiolesterols in serum by the combined use of immobilized cholesterol esterase and cholesterol oxidase reactors and peroxidase electrode in a flow injection system. T. Yao, M. Sato, Y. Kobayashi and T. Wasa.

Ftir die Besfimmung yon freiem und Gesamt-Cholesterin (freiem + Ester) wird ein FlieB-Injektionssystem beschrieben. Die Apparatur besteht aus einer S/iule mit auf Silica immobilisierter Cholesterinoxidase sowie Cho~esterinesterase (zur Besfimmung yon freiem Cholesterin nur Cholesterinoxidase) sowie einer amperometrischen Peroxidase-Elek- trode. Die Probel6susng wird auf die mit Phosphat-Puffer, Triton X-100 und K4 Fe(CN)6 durchflossene S/iule gegeben. Das bei der Enzymreak- tion gebildete H202 oxidiert Fe(CN)64- zu Fe(CN)63-, das amperometrisch gemessen wird. Der Peakstrom ist im Bereich von 0 ,2 -16 mg/ml beztiglich Cholesterin und ftir Gesamt-Cholesterin im Bereich yon 0,3 - 30 mg/ml linear. 80 Proben k6nnen in einer Stunde auf freies und 40 Proben auf Gesamt-Cholesterin untersucht werden. -- Anal. Biochem. 149, 387--391 (1985). Dept. Appl. Chem., Coll. Engin., Univ. Osaka Prefecture, Mozu-Umemachi, Sakai (J) J.B.

238

Capillary column gas-liquid chromatographic resolution of oxidized cholesterol derivatives. S.W. Park and P.B. Addis.

Es wird die GC-Auftrennung yon einigen der Hauptoxidationspro- dukte des Cholesterins auf drei Quarzcapillaren (DB-I-, DB-5 und DB- 1701) untersucht. Diol-derivate, die epimeren 7c~- und 713-Hydroxy-, 4[3- Hydroxy- und 25-Hydroxycholesterine, ersetzen sich teilweise w/ihrend der GC-Analyse. Nach Derivatisierung zu den entsprechenden Trime- thylsilyl-Derivaten konnten die genannten Diole, c~-Epoxid, Cholestan- triol, 7-Ketocholesterin und Cholesta-3,5-dien-7-on auf einer DB-I- S/iule vollst/indig aufgetrennt werden (Basislinienauftrennung mit Aus- nahme yon 7[3- und 4[3-Hydroxycholesterin sowie Cholestantriol/7-Ke- tocholesterin). Mit 5~-Cholestan als innerem Standard wird eine Lineari- t/it zwischen Menge und Peakfl/iche gefunden und erlaubt die quantitative Bestimmung. Die Struktur der derivatisierten Sterine wurde durch MS-Analyse bestfitigt. - Anal. Biochem. 149, 275--283 (1985). Dept. Food Sci. Nutrition, Univ., St. Patti, MN (USA) J.B.

Simultaneous quantitative measurement of fourteen adrenal steroids by capillary column gas chromatography-mass spectrometry, and its clinical application. K. Ichimura, H. Yamanaka, K. Chiba, T. Shinozuka, Y. Shiki, K. Saito, S. Kusano, S. Ameniya, K. Oyama, T. Nozaki and K. Kato.

Zur Besfimmung yon 14 nativen Nebennierenrinden-Steroiden wird ein Capillargaschromatographie-Verfahren entwickelt. Die Serumste- roide werden aus den Serumproben auf einer Extrelut Mini-S/iule ange- reichert und gereinigt. Von dort werden sie mit Dichlormethan extrahiert und mit 10% n-Butylbors//ure in Ethylacetat 10 -15 min bei Zimmer- temperatur cyclisiert. Dann wird mit 10% Methyloximhydrochlorid in Pyridin dutch 2 h Reaktion bei 100~ in die Methyloximderivate umgewandelt und anschlieBend trimethylsilyliert. Dazu wird ein Gemisch yon Trimethylchlorsilan / N,O - Bis - (trimethylsilyl) - tfifluoracetamid / Trimethyl - silylimidazol (3:3:1) sowie l0 rain Reaktionszeit bei I00~ ausgew/ihlt. Die Derivate werden auf einer Capillars/iule mit einem vernetzten Me- thylsiliconfilm mit einem Temperaturprogramm von 100--290~ analysiert. Der Nachweis erfolgt massenspektrometrisch. Die Steroide k6nnen durch Molekfilionen im Bereich m/z 344 bis m/z 558 nachgewiesen werden. Die Empfindlichkeit des Verfahrens wird mit 0 ,1-1,0 ng/ml Serum f/ir die verschiedenen Steroide angegeben, bei Variafionskoeffi- zienten unter 19%. Die Analyse dauert ca. 4 h. - J. Chromatogr. 374, 5 - 1 6 (1986). Dept. Paediatrics, School Med., Keio Univ., Shinjuku-ku, Tokyo (J) R.H.S.

A simple method for separating unbound and bound cortisol in a radioimmnnoassay. R.W. Purchas, S.A. Zinn and H.A. Tucker.

Die zu untersuchende Probe wird mit Antiserum-3H-Corfisol inkubiert und nachfolgend mit Szintillationsfl/issigkeit gemischt. Das unge- bundene Cortisol verbleibt in der organischen Phase, das am Antik6rper gebundene in der w/issrigen Phase. Da das Flfissigszinfillationsspektro- meter nur die von 3H-Cortisol in der organischen Phase produzierten Photonen detekfiert, vermag das System einwandfrei zwischen gebunde- nem und freiem Cortisol zu unterscheiden. Die Kreuzreaktivit/it betr/igt mit Ausnahme yon Corfison (16%) und Prednison (12%), bei 11 anderen untersuchten Steroiden nur 3% oder weniger. Die Bestimmungsgrenze der Methode liegt bei 1,4 ng/ml, der Wiederfindungsgrad betr/igt 97,5%. Die Variationskoeffizienten yon Inter- und Intraassay sind 8 bzw. 13%. - Anal. Biochem. 149, 399-403 (1985). Dept. Animal Sci., State Univ., East Lansing, MI (USA) J.B.

Bioluminescent enzyme immonuassay for estriol. Use of reversibly in- activated bacterial luciferase as labd. F.S. Yein, C.K. Marschke, P.C. Deming, T.F. Holzman and P.S. Satoh.

Zur Bestimmung yon C)striol wird die Probe mit einem Ostriol-Deri- vat, das tiber eine Disulfid-Bindung an das Cysteinyi-SH von Luciferase gebunden ist (wodurch das Enzym inaktiviert wird), Kaninchen-Anti- 6striol-Antik6rper und einem 2. Antik6rper inkubiert. Nach Zentrifugie- ten wird die im Immunopr[izipitat gebundene Luciferace durch Inkuba- tion mit Dithiothreit reaktiviert und durch einen Oxidoreduktase-gekop- pelten Assay entsprechend der Reaktionsfolge: NADH + H + + FMN

Oxidoreduktas~ NAD + + FMNH2; FMNH2 + R-CHO + 02 Luciferase

FMN + R-COOH + H20 + Licht, das Licht mit Hilfe eines Lumino- meters gemessen. Das Luciferase-markierte Ostriol konkurriert mit dem

3 Biochemische und klinische Analyse ~ e f ~ g ~ l ~ e

freien Ostriol in der Probe um eine begrenzte Zahl von Bindungsstellen am Ostriol-Antik6rper. Das am Antik6rper gebundene markierte Ostriol nimmt mit steigender Konzentration an freiem Ostriol ab und bewirkt eine entsprechende Abnahme des Luciferase-Response. Die Kalibrier- kurve ist im Bereich von 50-6000 pg Ostriol linear. - Anal. Biochem. 149, 309-315 0985). Upjohn Diagnostics, Kalamazoo, MI (USA)

J.B.

Specific and sensitive determination of medroxyprogesterone acetate in human serum by gas chromatography-mass spectrometry. L.D. Dikkeschei, H. van Veclen, G.T. Nagel, P.H.B. Willemse and B.C. Wolthers.

Das oral wirksame Progestagen Medroxyprogesteronacetat (MPA), welches wegen seiner Wirkung als Verhfitungsmittel auf seine Krebsun- schfidlichkeit untersucht wird, kann naeh Zusatz von Medroxyprogeste- ronpropionat (MPP) als internem Standard aus Serumproben mit einem GC-MS-Verfahren bestimmt werden. Die Seren werden auf Sep-Pak C 18-Patronen extrahiert, die nach Waschvorgfingen mit Methanol eluiert werden. Nach Zusatz von Cyelohexan zum Eluat wird mit NaC1 und NaOH gewaschen und die organische Schicht eingedampfi. Der Riick- stand wird in Trifluoressigs~ureanhydrid gei~st und 45 min auf 45~ erwfirmt. Die 3-Enol-Trifiuoroacylester werden mit Hexan extrahiert und auf einer CP-Sil-5-Quarzcapillarsfiule mit einem Temperaturpro- gramm yon 200-280~ analysiert. Der Nachweis erfolgt massenspek- trometriseh dutch die Ionen m/z = 482,2 und 496,2 fiir MPA-TFAA bzw. MPP-TFAA. Die Ergebnisse des Verfahrens stimmen gut mit sol- chen fiberein, die mit einem Radioimmunassay erhalten wurden. Das Verfahren wird zur Analyse von Patienten nach Eingabe von Medroxy- progesteronacetat eingesetzt. - J. Chromatogr. 345, 1 - 1 0 (1985). Centr. Lab. Clin. Chem., Univ. Hosp., @roningen (NIL,) R.H.S.

Quantitative methodology for corticosteroids based on chemical oxidation to electrophilic products for electron-capture-negative chemical ionization using capillary gas chromatography-mass spectrometry. I. Assessment for feasibility in the analysis of horse urine for dexamethasone. G.R. Her and J.T. Watson.

Empfindliche und spezifische Methoden zur quantitativen Bestim- mung yon Corticosteroiden in biologischen Flfissigkeiten sind Capillar- GLC/ECD/NCI-MS. Die Einsatzm6glichkeiten dieses Verfahrens zur quantitativen Analyse von Dexamethason in Pferdeharu wird getestet. 6~-Methylprednisolon wird dem Harn als interner Standard zugesetzt. Das freie Dexamethason und der interne Standard werden mit Methy- lenchlorid extrahiert, der Extrakt eingedampft, der Rtickstand in Pyridin aufgenommen und mit CrO3 3 h bei Zimmertemperatur oxidiert. Die Oxidationsprodukte, 1,4-Androstadien-3,11,17-trion-Strukturanaloge, werden mit Ethylacetat extrahiert und auf einer 25 m SE-54 Capillar- sfiule mit einem Temperaturprogramm von 200-300~ gaschromatographisch analysiert. Der Nachweis wird erst mit einem ECD durchgeffihrt und anschlieBend wird noch dutch Massenspektrometrie mit NC1 identifiziert. Das Verfahren weist eine gute Empfindlichkeit und Selekti- vit/it auf. Durch die Verwendung des oxidierten Produktes erhfilt man ktirzere Retentionszeiten und eine verbesserte Stabilit/it. - Anal. Bio- chem. 151, 2 9 2 - 2 9 8 (1985). Dept. Bioehem., Michigan State Univ., East Lansing, MI (USA) R.H.S.

High-performance liquid chromatographic separation and determination of prostaglandins, oxidized by pryridiuium dichromate. Optimization and applications. J. Doehl and T. Greibrokk.

Eine einstufige Derivatisierung, bei tier die Prostaglandine mit Pyridi- niumdichromat in Acetonitril in ihre entsprechenden 15-Oxoderivate umgewandelt werden, wird beschrieben. Die erhaltenen Derivate lassen sich gut auf Ct 8-S/iulen (micro-bore) mit Acetonitril/w~iBr. 10 mM Phos- phorsfiure (pH 2,7) als mobiler Phase trennen. Der Nachweis wird bei 230 nm durchgeffihrt. Dutch die Derivatisierung werden Nachweisgren- zen erreicht, die vergleichbar denen sind, die bei fluorimetrischem Nach- weis erzielt werden. PGE kann mit einer Empfindlichkeit von 0,14 pMol (50 pg) nachgewiesen werden. Dumh eine einstufige Ethylacetatextrak- tion der Derivate erreicht man Ausbeuten von fiber 95%. - J. Chroma- togr. 349, 431-438 (1985). Dept. Chem., Univ. Oslo (N) R.H.S.

Selective trimethylsilylation for the determination of 16(S)-amino-PFG2~ methylester by gas-liquid chromatography. F. Szerderk6nyi, G. Horvfith, (3. Ambrus, E. T6th-Sarudy, G. Czira and J. Tamfis.

Das Prostaglandin 16(S)Amino~PGF2~-Methylester kann in Pyridin nach Zusatz yon Squalan als interuem Standard mit HMDS und TMCS dutch l J rain Reaktion bei Zimmertemperatur in das entsprechende Trimethylsilyletherderivat iiberfiihrt werden. Dieses kann gaschromatographisch auf S/iulen mit 3% OV-17, 3% OV-101 und 3% OV-210 auf Gas-Chrom Q (80-100 mesh) isotherm bei Temperaturen zwischen 255 und 265~ bestimmt werden. Die Derivate k6nnen anschlieBend massenspektrometrisch untersucht werden. Im Bereich yon 0,085 - 1,55 gg/gl erh/ilt man eine lineare Eichkurve. - J. Chromatogr. 333, 4 0 4 - 411 (1985). Inst. Drug. Res., Budapest (H) R.H.S.

Determination of nucleo amino acids by ion chromatography. N.A. Voskova, O.N. Rybtseva, L.A. Baratova and Yu. P. Shvachkin.

[~-(Uracilyl-N1)-~-alanin (I), ~-(Thyminyl-N~)-~-alanin (II), [~-(Cyto- sinyl-NX)-~-alanin (III) und [3-(Adeninyl-Ng)-~-alanin (IV) werden durch Ionenaustausch-Chromatographie bestimmt. Die Bestimnmng von I, II, III und IV kann neben den EiweiBaminosfiuren durchgefiihrt werden. Gearbeitet wurde mit dem Aminosfiurenanalysator Hitachi, Modell 835 (Japan). Die genannten Verbindungen wurden aufgrund ihrer Reaktionen mit Ninhydrin bei 440 bzw. 570 nm photometrisch bestimmt, nachdem sic auf der mit Kationenaustauscher C1ER-2619 (Hitachi) geffillten S/iule (15 x 0,26 era) unter Verwendung der auf der Basis yon Na-Citrat zusammengesetzten Pufferl6sung (0,2 M - pH 3,2; 0,2 M - pH 3,3; 0,2 M - pH 4,3 und 1,2 M - pH 4,9) getrennt wurden. Als praktisches Beispiel wird die Bestimmung von I, II, III und IV in EiweiB- sowie Peptidhydrolysaten (6 M HC1; 105~ 24 h) angefiihrt. Die Retentionszeiten in min: I - 11,75; II - 13,80; III - 63,05; IV - 61,70. Nachweisgrenze 30 pmol; sr-Wert h6chstens 0,04. Analysendauer in einem Standardgemisch mit 20 Eiweil3aminos/iuren h6chstens 1 h. - Zh. Anal. Khim. 40, 1518-1520 (1985) (Russisch, mit engl. Zus.fass.). Lomonosov Univ., Moskau (SU) F. Jancik

Use of a fundamental elution protocol for the development of reversed- phase high-performance liquid chromatography enabling rapid simultaneous determination of purines, pyrimidines and allied compounds commonly found in human biological fluids. G.S. Morris and H.A. Simmonds.

Many HPLC methods for the analysis of nucleosides and bases have been developed for a specific requirement. Most are not directly appii- cable to the separation of all the purines and pyrimidines found in biological fluids. A method has been developed to separate a wide range of compounds found in human urine and plasma in a single run without unduly long run times. Special attention has been paid to sample prepara- tion. Isocratic systems derived from this method for the analysis of specific compounds and enzyme assay mixtures over even shorter periods are described. - J. Chromatogr. 344, 101-113 (1985). Purine Lab., Clin. Sci. Labs., Guy's Hosp., London Bridge (GB)

Determination of adenosine and S-adenosyl derivatives of sulfur amino acids in rat liver by high-performance liquid chromatography. D. Yell, L.E. Benjamin and R.D. Steele.

Das Verfahren yon A. Gharib, N. Sarda, B. Chabannes, L. Cronenber- ger und H. Pacheco (J. Neurochem. 38, 810 (1982)) zur Bestimmung von Adenosin und schwefelhaltigen Metaboliten von Schwefelaminosfiuren wird modifiziert, so dab Adenosin, S-Adenosylhomocystein und S-Ade- nosylmethionin in Leberproben bestimmt werden k6nnen. Das Verfah- ren kann auch zur Bestimmung von S-Adenosylethionin eingesetzt wet- den. Dazu werden die mit Perchlors/iure enteiweiBten Proben mit NaOH aufpH 6,5-7,5 eingestellt, fiber eine C~8-Sep Pak Patrone gegeben, die mit Wasser gewaschen wird. Die Adenosinderivate werden mit 0,175 M Essigs~ure und anschlieBend mit Methanol/0,175 M Essigs/iure (1:3) eluiert. Diese L6sung wird auf einer gBondapak C~8-S/iule isokratisch mit 5 mM Octansulfonsfiure in 5% Methanol (pH 4) getrennt. Der Nachweis wird im UV bei 254 nm durchgefiihrt. - J. Chromatogr. 345, 150-156 (1985). Dept. Nutrit. Sci., Univ. Wisconsin-Madison, Madison, WI (USA) R.H.S.

Retention mechanism of nucleotides, nucleosides and their bases on polyvinyl alcohol. H. Wada.

The basic chromatographic properties of a polyvinyl alcohol (PVA) column material were investigated. By pH titration, it was found that

239

~ 8 ~ F ~ @ ~ S 3 Biochemical and clinical analysis

the PVA gel surface was negatively charged. The chromatographic behaviour of nucleotides on the gel was compared with that on an ODS column and found to be similar. However, the behaviour of nucleosides and bases were quite different from that on the ODS column. Since the retention characteristics of both types of solutes on the PVA column could be explained reasonably by the solvophobic theory, this result may suggest that the behaviour of these solutes on the ODS column is un- usual. The difference in retention between AMP isomers and cAMP can be explained by the differences in their conformations. - J. Chromatogr. 322, 255-263 (1985). Dept. Polymer Sci. Engin., Fac. Textile Sci., Inst. Technol., Kyoto (J)

Flow injection analysis for nucleotides. Y. Baba, Y. Yamamoto, N. Yoza and S. Ohashi.

A flow injection system interchangeable as a high performance liquid chromatographic detector, was designed for the rapid determination of nucleotides (AMP, GMP, IMP, CMP, and UMP) as well as inorganic phosphates. A sample solution was injected into a carrier stream of water and then mixed with an acidic molybdenum(V)-molybdenum(VI) reagent solution. In a reaction coil (150~ phosphorus compounds were hydrolyzed and the resultant orthophosphate was allowed to react with the molybdenum reagent to produce a heteropoly blue complex�9 The absorbance of the blue complex was monitored at 830 nm. The hydrolytic process determined the detection sensitivities of phosphorus compounds. The sensitivities of nucleotides and diphosphate relative to the maximal sensitivity (100%) of orthophosphate were ca. 15% for purine nucleotides, ca. < 2 % flit pyrimidine nucleofides, and 100% for diphosphate, respectively. Sampling rate was 78 samples/h. The precision (R.S.D.) was between 0.4 and 4.3%. The flow injection method was found to be useful for the purine nucleotides analysis. - Bunseki Kagaku 34, 692-694 (1985) (Japanisch, mit engl. Zus.fass.). Dept. Chem., Fac. Sci., Kyushu Univ., Higashi-ku, Fukuoka (J)

Reversed-phase high-performance liquid chromatography of protected oligodeoxynucleotides. D.J. Anderson, A.J. Taylor and R.J. Reischer.

Teilweise geschiitzte Oligodesoxynucleotide mit Phosphodiesterbin- dungen ktnnen auf einer pBodapak C1 s-Sfiule mit einem linearen Gra- dienten von 25 -100% Acetonitril in w~iBr. Ammoniumacetat (pH 6,8) getrennt werden. Der Nachweis wird bei 260 nm durchgefiihrt. Die erhaltenen Retentionszeiten sind ffir eine Reihe yon Verbindungen angegeben. Das Verfahren kann bei der Analyse enzymatischer Abbaupro- dukte yon Oligonucleotiden eingesetzt werden. - J. Chromatogr. 350, 313-316 (1985). Res. Lab., Upjohn Comp., Kalamazoo, MI (USA)

R.H.S.

Analysis of oxidized and reduced pyridine dinucleotides in rat liver by high- performance liquid chromatography. T.F. Kalhorn, K.E. Thummel, S.D. Nelson and J.T. Slattery.

NADP +, NAD +, NADPH und NADH k6nnen durch selektive Ex- traktion und isokratische Reversed-Phase HPLC bestimmt werden. Dazu werden die Rattenleberproben schockgefrostet und unter fliissigem Stickstoff pulverisiert. Die Extraktion der basischen Dinucleotide mit reduzierten Species und der sauren Dinucleotide mit oxidierten Species wird mit eiskaltem Ethanol vorgenommen. Die Trennung erfolgt auf einer gBondapak C18-S/iule mit einer mobilen Phase aus 0 ,2M Ammoniumphosphat/Methanol/Tributylamin (82:17,87: 0,13). Ffir die oxidierten Species wird mit einem pH yon 5,25 und f/Jr die reduzierten bei pH 6,0 in der mobilen Phase gearbeitet. Der Nachweis wird bei 254 nm im UV durchgefiihrt. Ira Bereich von 0,016--2,0 nMol erh/ilt man fiir die reduzierten und von 0,005-0,8 nMol f/ir die oxidierten Pyridindinucleotide eine lineare Eichkurve. Die Ausbeuten liegen bei 94,5% ffir NAD + bis 99,3% fiir NADPH mit Standardabweichungen yon 2,5% (NADP + hat eine Standardabweichung yon 10,4%). - Anal. Biochem. 151, 343 - 3 4 7 (1985). Dept. Pharm. Med. Chem., Univ. Wash- ington, Seattle, WA (USA) R.H.S.

Rapid determination of adenine nucleotides in brain tissue by ion-paired reversed-phase column liquid chromatography under isocratic conditions. J. Kehr and M. Chavko.

Ein sehnelles Vcrfahren zur Analyse der Adeninnucleotide AMP, ADP and ATP in Nervengewebe wird beschrieben. Zur Extraktion wird ein

240

leicht modifiziertes Verfahren nach Z. Olempska-Beer and E.B. Freese (Anal. Biochem. 140, 236 (1984)) eingesetzt. Die Trennung erfolgt nach Optimierung der Trennparameter auf einer Separon 6 Cts-Reversed- Phase S/iule isokratisch mit einem Elutionspuffer aus 25 mM Kalium- phosphat und 4% Triethylamin (pH 6,5 mit Phosphors/iure eingestellt). Der Nachweis wird wie/iblich bei 254 nm im UV durchgeffihrt. Mit diesem Trennsystem dauert eine Trennung nicht mehr als 10 rain, wenn man eine ca. 10 cm lange mit 5 gm Silicagel C18 gepackte Glassfiule verwendet. - J. Chromatogr. 345, 267-273 (1985). Inst. Neurobiolog., Slovak Acad. Sci., Ko~ice (CS) R.H.S.

Procedures for two-dimensional electrophoretic analysis of nuclear proteins. T. Rabilloud, M. Hubert and P. Tarroux.

A series of methods designed for electrophoresis of nuclear proteins is described. They deal with the low solubility of many nuclear proteins and with the presence of large amounts of nucleic acids. These were eliminated by enzymatic digestion, centrifugation, partition or precipitation. A combination of RNAse digestion and centrifugation is the method of choice when proteolysis is low. In the opposite case, precipitation or partition methods are preferred, at the expense of precipitation of some proteins. When the nuclear RNA content is low, centrifugation in an Airfuge is the simplest and the most efficient method, superseding the widely used $1 nuclease method. - J. Chromatogr. 351, 7 7 - 8 9 (1986). Lab. Zool., Ecole Normale Sup., Paris (F)

Separation of single-stranded oligonucleotides on puiyvinyl alcohol gel column. K. Makino, H. Wada, H. Ozaki, T. Takeuchi, H. Hatano, F. Fukui, K. Noguchi and Y. Yanagihara.

Separation mechanisms for single-stranded oligodeoxyribo- or oligoribonucleic acid fragments were explored on an Asahipak polyvinyl alcohol gel column (GS-320) by use of sequential isomers of such molecules�9 Substrates having different base numbers were found to be separated by size-exclusion chromatography while those having the same numbers with different base sequences were isolated by use of the reversed-phase mode. By using those dual modes, a limit for the separation of the samples was found to arise because one mode shifted the peaks of the substrates in the sense opposite to the shift resulting from the other mode and it was found that when substrates had less than nine bases, the solutes eluted separately. - Chromatographia 20, 713- 716 (1985). Dept. Polymer Sci. Engin., Fac. Text. Sci., Kyoto Inst. Technol., Matsugasaki, Sakyo-ku, Kyoto (J)

A radiochemical assay for acetoacetyl-CoA synthetase. J.D. Bergstrom and J. Edmond.

Zur Bestimmung yon Acetoacetyl-Co A-Synthetase in Cytosol-Ex- �9 1 4 trakten wird die Probe mlt C(3)-Acetoacetat, dessen Synthese beschrie-

ben wird, inkubiert, wobei Acetyl-Co A gebildet wird, das durch endo- gene Acetoacetyl-Co A-Thiolase gespalten und die 14C-markierte Ace- tyl-Gruppe durch exogene Carnitinacetyltransferase in Carnitin eingc- baut wird. Das gebildete 14C-Acetylcarnitin wird durch Kationenaustausch-Chromatographie an Dowex 50WX8 abgetrenut (Elution des gcbildeten Acetylcarnitin dutch 2 M NH4OH und Bestim- mung durch Flfissigszintillationsmessung). Weniger als 10 pMol Acetyl- carnitin k tnnen noch bestimmt werden. Die Acetylcarnitin-Bildung ist der Zeit (bis 20 rain) und der Cytosol-Proteinmenge (bis 60 gg) proportional. - Anal. Biochem. 149, 358-364 (1985). Dept. Biol. Chem., UCLA School Med., Los Angeles, CA (USA) J.B.

Assay for aromatic L-amino acid decarboxylase based on fluorescence derivatization with 1,2-diphenylethylenediamine. Iv[. Lee, H. Nohta, Y. Ohkura and B. Yoo.

Es wird ein Vcrfahren fiir eine sehr empfindliche Bestimmung yon aromatische L-Aminosfiuren-Decarboxylase (I) beschrieben, bei der HPLC und fluorimetrische Detektion kombiniert sind. Demonstriert wird die Methode an L-Dopa (L-Dihydroxyphenylalanin), das als Sub- strat enzymatisch zu Dopamin umgewandelt wird. Nach Trennung an einer Kationenaustauschersfiule (bier Toyopak SP, ein Sulfopropylharz, Na+-Form), mobile Phase Acetonitril + 50 mM Tris/HC1-Puffer pH 7,0 (11 + 9), 1,0 ml/min, wird das Dopamin durch Reaktion mit 1,2- Diphenylethylendiamin zu einer fluorescierenden Verbindung derivatisiert, die nach Anregung bei 350 nm bei 480 nm gemessen wird. Eine

3 Biochemische und klinische Analyse ~ e f ~ e

weitere methodische Variante wird beschrieben, bei der noch eine weitere Trennung durch eine RP-HPLC-S/iule erfolgt. Die Nachweisgrenzen fiir die direkte und RP-tlPLC-Methode sind 15 und 1 pmol I je Reaktions- ansatz. Das Verfahren wird auf I-Bestimmungen in verschiedenen tieri- schen Geweben und Seren angewendet. - Anal. Chim. Acta 177, 9 3 - 101 (1985). Fac. Pharm. Sci., Kyushu Univ., Fukuoka 812 (J)

W. Czysz

Continuous-flow potentiometric determination of a-amylase activity in serum and urine. E.P. Diamandis, A. Papanastasiou-Diamandis, T.K. Christopoulos and T.P. Hadjiioannou.

An automated saccharogenic potentiometric method for serum or uninary s-amylase is described. Amylase is allowed to act on a buffered at pH 6.9 starch solution under controlled continuous-flow conditions and the reducing sugars produced are left to react with periodate. The consumption of periodate is monitored continuously with a newly constructed periodate-sensitive flow-through electrode. The endogenous reducing substances of serum or urine are measured with the same system by incubation of the sample with the same starch solution, at pH 4.7, in the presence of sodium fluoride as an amylase inhibitor. The difference in the reducing power (as glucose) is used to calculate the amylase activity of the samples. Values obtained with this assay correlate fairly well with those obtained with an amyloclastic method (r = 0 .90- 0.96). - Microchem J. 32, 183-190 (1985). Lab. Anal. Chem., Univ. Athens (GR)

An immunochemical method for detecting an inactive enzyme (hisphospho- glyceromutase) after Cellogel electrophoresis. M.C. Calvin, M.O. Pr6hu, D. Kechemir, J.L. Villeval and R. Rosa.

A new method is described for detecting inactive enzymes or other proteins after Cellogel electrophoresis. The proteins were blotted from the Cellogel strip to a nitrocellulose membrane and then the blot was blocked before incubation in a specific antibody solution. The antigen- antibody complex was located by a second antibody staining procedure employing peroxidase-linked goat anti-rabbit IgG. The method described is sensitive and could be of general use for the detection of proteins after Cellogel electrophoresis. - Electrophoresis 6, 567-568 (1985). INSERM U-91, H6pital Henri Mondor, Crbteil (F)

Method of enzymatic determination of pyrroloquinoline quinone. M. Ameyama, M. Nonobe, E. Shinagawa, K. Matsushita and O. Adachi.

An improved enzymatic method for the determination of pyrroloquinoline quinone, a novel prosthetic group of some important oxidorednctases, has been developed with cytoplasmin membrane of Escherichia coli K-12, in which D-glucose dehydrogenase (EC 1.1.99.17) was completely resolved to apo-enzyme by EDTA treatment. Incubation of the EDTA-treated membrane with exogenous pyrroloquinoline quinone in the presence of magnesium ions gave a quantitative determination of pyrroloquinoline quinone by assaying the restored D-glucose dehydrogenase activity. This novel enzymatic method was confirmed to be highly reproducible up to 10 ng of pyrroloquinoline quinone and could be applied to a routine assay of pyrroloquinoline quinone. - Anal. Biochem. 151, 263-267 (1985). Lab. AppL Microbiol., Dept. Agricult. Chem., Univ. Yamaguchi (J)

New fiuorogenic substrate for esterase activity of a--chymotrypsin and related enzymes. K. Kuromizu, Y. Shimikawa, O. Abe and N. Izumiya.

Ein neues fluorogenes Substrat, der Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin-4-methylcoumaryl-7-ester, wird zur Bestimmung der Esterasewir- kung yon ~-Chymotrypsin und verwandten Enzymen eingesetzt. Die Synthese des Substrats erfolgt dutch Carbodiimidkondensation von Ben- zyloxycarbonyl-L-phenylalanin und 7-Hydroxy-4-methylcoumarin in 86%iger Ausbeute. Die Esteraseaktivit/it kann durch Zunahme der Fhio- rescenzintensit/it bei 352/465 nm bestimmt werden. Mit dem Verfahren k6nnen bis hinunter zu 2 ng ~-Chymotrypsin bestimmt werden. - Anal. Biochem. 151 ,534-539 (1985). Lab. Biochem., Fac. Sei., Kyushu Univ., Higashi-ku, Fukuoka (J) R.H.S.

Fhiorometric assay for coproporphyrinogen oxidase and protoporphyrino- gen oxidase. P. Labbe, J.-M. Camadro and H. Chambon.

Koproporphyrinogenoxidase (KO) und Protoporphyrinogenoxidase (PO), zwei Enzyme des H~im-Stoffwechsels, k6nnen fluorimetrisch mit

Koproporphyrinogen III als Substrat anhand der Fluorescenz des durch aufeinander folgende Reaktion durch beide Enzyme gebildeten Proto- porphyrin IX bestimmt werden (Anregung bei 410, Emission bei 632 nm). Zur Bestimmung von KO wird die Probe in Gegenwart von EDTA (das den weiteren Stoffwechsel yon Protoporphyrin IX dureh Hemmung der Ferrochelatase verhindert) sowie Dithiothreit (zur Ver- hinderung der nichtenzymatischen Oxidation yon Protoporphyrin IX zu Porphyfin) mit einem UberschuB an PO (aus B/ickerhefe) und Kopro- porphyrinogen, zur Bestimmung yon PO die Probe mit Protoporphyri- nogen inkubiert und die Fhiorescenz gemessen. Aktivit/iten yon 0 ,1 - 5 nMol gebildeten Protoporphyrin IX/h k6nnen nach dieser Methode noch gemessen werden. - Anal Biochem. 149, 248-260 (1985). Lab. Biochim. Porphyrines, Univ. Paris VII, Paris (F) J.B.

Sensitive quantification of isoforms of canine MM ereatine kinase with an immunoblot procedure suitable for large numbers of samples. A.M. Grace, A.W. Strauss and B.E. Sobel.

Es wird eine Methode zur Bestimmung der individuellen Isoformen yon Hunde-Myocard-MM-Kreatinkinase (KK) entwickelt, die die nach Myoeard-Infarkten im Plasma freigesetzte KK dutch Agarose-Elektro- phorese isoliert und auf Nitrocellulose immobilisiert. Zur Lokalisierung und Quantifizierung der MM-KK wird der Nitrocelhilosestreifen mit MM-KK-Antiserum und nachfolgend mit 1 z 5i_markiertem Affen-Anti- kaninchen-Immunoglobulin inkubiert. Durch Belichtung mit einem R6ntgenfilm bzw. Ausmessen der Radioaktivit/it wird die KK sichtbar gemacht bzw. bestimmt. Der Variationskoeffizient f/Jr diese Methode betrfigt 5,9% (n = 18). Jede der drei Isoformen der MM-KK ist zu 33,3% an der Gesamtaktivit/it beteiligt. - Anal. Biochem. 149, 2 0 9 - 217 (1985). Cardiovascular Div., Washington Univ. School Med., St. Louis, MS (USA) J.B.

pH-Stat titration method for the dihydrofolate reduetase activity measure- ments: Application to determination of substrate Michaelis constant and antifolate inhibition constant. R. Gilli, LC. Sari, L. Sica, M. Bourdeaux and C. Briand.

Ein pH-Stat Titrationsverfahren zur Bestimmung der Aktivit/it von Dihydrofolatreduktase (DHFR) wird entwickelt. Das Verfahren beruht auf der durch DHFR katalysierten Reaktion von Dihydrofolat zu Tetra- hydrofolat unter Einwirkung yon NADPH und H+-Ionen, dabei wird augerdem NADP + gebildet. Eine Enzymeinheit wird definiert als die Menge, die ben6tigt wird, tun ein Mikromol Substrat pro min bei 28~ zu reduzieren. Mit dem Verfahren k6nnen auch noch sehr niedrige Kon- zentrationen yon DHFR nachgewiesen werden, Bestimmungen in rohen Gewebeextrakten sind m6glich. Die Empfindlichkeit ist zehnmal besser als die yon spektralphotometrischen Verfahren. Mit der Methode wird auch die Michaelis-Konstante und die Antifolat-Inhibierungskonstante bestimmt. Anal. Biochem. 152, 1 - 5 (1986). Lab. Phys. Pharm., Fac. Pharm., Marseille (F) R.H.S.

Solid-phase radioimmunoassay for human neutrophil elastase: A sensitive method for determining secreted and cell-associated enzyme. L. Dunn, W.D. Blackburn, W.J. Koopman and L.W. Heck.

A solid-phase radioimmunoassay for measuring neutrophil elastase in the range 0 .08-4 ng/ml has been developed. A monospecific, pre- cipitating antibody capable of inhibiting elastinolysis was produced by repeated immunizations of a goat. The IgG fraction and affinity-purified antibodies of this serum were then obtained and used to develop this radioimmunoassay. Although serum influences the measurement of cata- lytically active neutrophil elastase when compared to diisopropylfluoro- phosphate-treated neutrophil elastase, antigenic elastase may still be measured in body fluids. Furthermore, this assay is more sensitive than commercially available substrates used for quantitating neutrophil elastase by functional activity. - Anal. Biochem. 150, 18--25 (1985). Dept. Med. Mierobiol., Univ. School Med., Birmingham, AL (USA)

Determination of estradiol 2- and 16ct-hydroxylase activities in rat liver microsomes using high-performance liquid chromatography. M. Numa- zawa, S. Satoh, Y. Ogura and M. Nagaoka.

Rattenlebermikrosomen werden mit NADPH, 1,3,5(10)-Ostratrien- 3,1713-diol inkubiert. Naeh Zusatz von 3-Methoxy-l,3,5(10)-6stratrien- 2,16e,17[3-triol und 3,4-Dihydroxy-1,3,5(10)-6stratrien-I 713-on als innere

241

~ ~ � 9 3 Biochemical and clinical analysis

Standards werden die Reaktionsprodukte mit Ethylacetat extrahiert und in CH3OH an einer QAE-Sephadex A 25-Borat-Kolonne (Ehition mit CH3OH, gefolgt yon 0,05 M Essigs/iure in CH3OH) in eine Catechol- und eine phenolische Fraktion aufgetrennt. Die Fraktionen werden durch HPLC an einer Cls-Umkehrphasen-Kolonne in NH4H2PO, + H3PO, (pH 3)/CH3OH (1:1), bei Detektion mit einem voltammetri- schen Detektor, in die Komponenten aufgetrennt, wobei noch 0,5 - 1 ng der Metaboliten bestimmt werden k6nnen. Die scheinbaren K,, und Vm,x beider Enzyme sind angegeben. - Anal. Biochem. 149, 409 - 4 1 4 (1985). Tohoku Coll. Pharm., Komatsushima, Sendal (J) J.B.

Use of N-acetyl-2'-O-methyllactosamine as a specific acceptur for the determination of c~-L-(l~3)-fucosyltransferase in human serum. R. Madiyalakan, S. Yazawa, S.A. Abbas, J.J. Barlow and K.L. Matta.

Ein synthetisches Substrat, das N-Acetyl-2'-O-methyllactosamin, wird als spezifischer Akzeptor ffir ct-L-(1 ~ 3)Fucosyltransferase in Humanse- rum eingesetzt. Die Fucosylbindung des Produktes aus diesem Substrat wird durch die Hydrolyse mit einer spezifischen s-L-(/~3)/(1 --,4)-Fuco- sidase charakterisiert. Bei Verwendung dieses Akzeptors ist der optimale pH-Wert ffir Serum ~-L-(1 ~3)-Fucosyltransferase bei 6,5. Das Enzym wird durch Mangan- und Magnesiumionen aktiviert und durch EDTA inhibiert. - Anal. Biochem. 152, 2 2 - 2 8 (1986). Dept. Gyneocol. On- col., Roswell Park Mem. Inst., Buffalo, NY (USA) R.H.S.

Determination of gamma glutamyltransferase in completely haemolysed blood samples. H. Gjede and J. Mvrland.

Haemolysed blood was incubated in the presence of gamma glutamyl- p-nitroanilide and glycylglycine at 37~ for 15 rain, and the enzyme reaction was terminated by adding trichloroacetic acid. The pH in the supernatant was adjusted to 7.5 by using a buffer, and the amount ofp- nitroaniline formed was measured spectrophotometrically. The correlation between this method and the GGT activity in serum as determined by the standard kinetic method was good, r = 0.982. The blood GGT activity (y) was related to the serum activity (x) as follows: y = 0.415x § 3.8. The effect of storage of blood at room temperature on the GGT activity was studied. The enzyme activity did not change during the first 12 days of storage. - Scand. J. Clin. Lab. Invest. 45, 661-664 (1985). Nat. Inst. Forensic Toxicol, Oslo (N)

Automatic analysis of serum lactate dehydrogenase isoenzymes by high- performance ion-exchange chromatography. S. Kawaguchi, Y. Marui, K. Arisue, K. Koda, C. Hayashi and K. Miyai.

Durch Einlagerung yon Diethylaminoethylgruppen in TSK-Gel G5000 PW erh/ilt man einen schwachen Ionenaustauscher (TSK-Gel DEAE-5PW), auf dem Lactatdehydrogenase-Isoenzyme aus Serumpro- ben getrennt werden k6nnen. Dabei werden L6sungsmittel mit pH- Werten fiber 8 verwendet. Es wird mit einem stufenweisen Gradienten zwischen 10 mM Tris/HC1-Puffer (pH 8) und 0,5 M NaC1 in diesem Puffer als mobiler Phase ehiiert. Das Effiuat wird mit einem Gemisch aus Tris/HC1-Puffer + 70 mM l(+)-Lactat, 4 mM [3-NAD + und 0,1 Brij-35 umgesetzt und 3 rain bei 37~ inkubiert. Die Bestimmung erfolgt dann fluorimetrisch bei 370/465 nm. Mit dem Verfahren k6nnen Albu- min und Laetatdehydrogenaseisoenzym vollst/indig getrennt werden. Der Variationskoeffizient bei Verwendung eines Autosamplers liegt ffir 10 aufeinander folgende Bestimmuug unter 0,90%. - J. Chromatogr. 3"/4, 4 5 - 50 (1986). Centr. Lab. Clin. Invest., Osaka Univ. Hosp., Fukus- hima, Osaka (J) R.H.S.

Difference in monoamine oxidase activity measured by either liquid ion exchange or ion exchange resin chromatography in rat and cat brain. M. Johnson and A.G. Roberge.

Bei der Bestimmung yon Monoaminooxidase (MAO) aus Katzen- oder Rattenhirn mit 14C-Tyramin, [3-Phenylethylamin oder -Serotonin als Substrat und Aufirennung der Reaktionsprodukte fiber einen flfissigen Ionenaustauscher bzw. ein Ionenaustauschharz werden mit dem flfissigen Ionenaustauscher unabhfingig vom Substrat crheblich niedri- gere MAO-Aktivit~iten gefunden, vermuflich wegen Extraktion von in- termedi-~iren Zwischenprodukten wie Aldehyden in die CHCl3-Phase. Dieser Minderbefund konnte bei MAO aus Katzenhirn durch Zusatz von NAD oder durch eine Pause von 2 h zwischen Inkubation und Extraktion bzw. durch Zusatz yon fiquimolaren Mengen von NAD-

242

NADPH bei Pr/iparaten aus Rattenhirn vermieden werden. Die Ionen- austausch-Chromatographie mit einem Harz ist somit spezifischer und genaner. - Anal. Biochem. 149, 183-190 (1985). Dept. Biochem. (Meal.) and Dept. Nutrition (F.S.A.A.), Univ. Laval, Quebec (CDN)

J.B.

High-performance liquid chromatography of aldehydes and acids formed in monoamine oxidase-cataiyzed reactions, P,H. Yu, B.A. Bailey and D.A. Durden.

Ein schnelles, empfindliches und spezifisches Verfahren zur Bestim- mung von Monoaminoxidase (MAO)-Aktivitfit gegenfiber verschiedenen Substraten wird beschrieben. Das Verfahren beruht auf der HPLC- Trennung yon Aldehyden oder sauren Produkten und deren elektrochemischer Detektion. Es wird auf C-18 Reversed-Phase S/iulen mit einer mobilen Phase aus 75 mM monobasischem Natriumphosphat, I mM Natriumoctylsulfat, 500 lxM EDTA, 12,5% Acetonitril (pH 2,75) gearbeitet. Es wird eine amperometrische Dfinnschichtelektrode eingesetzt. Die metabolischen Zwischenprodukte aldehydischen Charakters sind in 0,1 N HC104 unter Zusatz von Antioxidans und EDTA ziemlich stabil. Eine unvollstfindige Oxidation zu S/iuren tritt bei Verwendung bestimm- ter Substrate mit ungereinigten Enzympr/tparaten auf. Dann mug durch Zusatz yon Hefealdeyddehydrogenase und I3-NAD wieder oxidiert werden. - Anal. Biochem. 152, 160-166 (1986). Psych. Res. Div., Saskat- chewan Health Res. Building, Univ. Saskatchewan, Saskatoon (CDN)

R.H.S.

DNA methyltransferases: activity minigel analysis and determination with DNA covalently bound to a solid matrix. U. Hfibscher, G. Pedrali-Noy, B. Knust-Kron, W. Doerfier and S. Spadari.

We describe two methods that facilitate detection and characterization of DNA methyltransferases: activity gel analysis and the use of DNA- cellulose or DNA-sepharose in DNA methylation reactions. The first permits identification of catalytic subunits, determination of the influence of proteolysis and evolutionary or developmental studies. The second allows accurate and fast determination of DNA methyltrans- ferase activities in crude extracts and during purification. - Anal. Bio- chem. 150, 442-448 (1985). Inst. Pharm. Biochem., Univ. Zfirich (CH); Ist. Genet. Biochim., Pavia (I); Inst. Genetic, Univ. K61n (D)

Selective adsorption of 2'-O-anthraniloyl-AMP on DEAE-sephadex: the basis of a direct, fluorescent assay for cyclic nueleotide pbospbodiesterase. N. Karuppiah and B. Mutus.

Die selektive Adsorption yon 2"-O-Anthraniloyl-AMP (ANT-AMP) an DEAE-Cellulose in Gegenwart von Zirkonylchlorid in Citrat-Puffer wird zur Entwicklung einer schnellen und empfindlichen Methode zur Bestimmung von cyclischer Nucleotidphosphodiesterase verwendet. Rohe oder gereinigtere Enzym-Pr/iparate (aus Rinderhirn) werden mit Calmodulin und ANT-AMP inkubiert, die Reaktion durch Erhitzen abgestoppt, Zirkonylchlorid zugesetzt und die Mischung auf eine DE- AE-Cellulose-Kolonne gegeben. Nach dem Waschen der Kolonne wird ANT-AMP mit 2 M NaC1 enthaltendem Citrat-Puffer eluiert und die Fluorescenz bei 425 nm (Anregung bei 330 nm) gemessen. Die enzymati- sche Hydrolyse yon ANT-AMP ist fiber einen Zeitraum yon 10 rain linear. 0.1 nMol ANT-AMP k6nnen noch bestimmt werden. - Anal. Biochem. 149, 202-208 (1985). Dept. Chem., Univ. Windsor, Ontario (CDN) J.B.

A continuous speetrophotometrie assay for pyrimidine-5'-nueleotidase. C.R. Zerez and K.R. Tanaka.

Ein einfaches Verfahren zur Bestimmung der Wirkung yon Pyrimidin- 5'-nucleotidase wird beschrieben, welches auf der Umwandlung yon Cytidinmonophosphat oder Uridinmonophosphat dutch das Enzym in Cytidin bzw. Uridin und anorganisches Phosphat beruht. Das anorganische Phosphat wird in Gegenwart yon Inosin und Purinnucleosidphos- phorylase zu Ribose-l-phosphat und Hypoxanthin umgesetzt. Hypoxan- thin bildet in Gegenwart yon Sauerstoff und Wasser unter Einwirkung yon Xanthinoxidase Harns/iure und H202. Gemessen werden k6nnen sowohl HzOz als auch die Harns~ture. Harns~iure wird bei 300 nm fort- laufend bestimmt. Das Verfahren wird mit anderen Methoden verglichen. Es weist wegen seiner kontinuierlichen Registrierung der Harn- s/lure Vorteile gegenfiber Endpunktverfahren auf. - Anal. Biochem. 151,282-285 (1985). Dept. Med., Harbor-UCLA Med. Center, UCLA School Med., Torrance, CA (USA) R.H.S.

3 Biochemische und klinische Analyse ~ @ f f @ ~ a ~ @

Detection of femtomole quantifies of proteases by high-performance liquid chromatography. J.D. Green.

Kleine Mengen (Femtomol) yon Proteasen, wie sic in Zellextrakten oder Absonderungen vorhanden sein k6nnen, k6nnen durch Reversed- Phase HPLC nachgewiesen werden. Dazu werden carboxymethyliertes Lysozym und Cytochrom c mit Trypsin und Chymotrypsin inkubiert. Die Peptidpeaks werden mit Glycyl-L-tryptophan als internem Standard auf einer gBondapak C~8-S/iule, die mit einem linearen Acetonitrilgra- dienten (30 rain 0--60%) unter Zusatz yon 0,08% Trifluoressigs~iure eluiert wird, bei 206 nm nachgewiesen. Bis hinunter zu 0,1 tMol Chymo- trypsin und 5 fMol Trypsin k6nnen mit dem Verfahren nachgewiesen werden. Bei Verwendung yon 14C-markiertem Lysozym als Substrat ist die Empfindlichkeit nicht so gut wie beim UV-Nachweis. Das Yerfahren wird als empfindliche Indikationsmethode f/ir das Vorhandensein von Proteasen in Zellen oder Gewebeprfiparaten empfohlen. - Anal. Bio- chem. 152, 8 3 - 88 (1986). Dept. Anatomy, Louisiana State Univ. Med. Center, New Orleans, LA (USA) R.H.S.

A sensitive assay for proteolytie activity using fluorescein-labeled gelatin coupled to Sepharose 413 as substrate. U. Tisljar and H.-W. Denker.

Ein Verfahren zur Bestimmung der proteolytischen Aktivit~it unter Verwendung von mit Fluoresceinmarkierter Gelatine, die an Sepharose 4B gekoppelt ist, als Substrat wird beschrieben. Die Herstellung des Substrats wird nach bekannten Methoden (P. Cuatrecasas, M. Wilchek und C.B. Anfinsen (Proc. Natl, Acad. Sci. USA 61, 636-643 (1968)) durchgef/ihrt. Zur Bestimmung wird das Substrat und das Enzym mit Tris-/HC1-Puffer (pH 8) 60 rain auf 37~ inkubiert. Die Fluorescenz des Oberstandes wird bei 480/518 nm gemessen. Das Verfahren wird anf Gewebehomogenate angewandt. Man kann i ng Trypsin noch nachwei- sen. - Anal. Biochem. 152, 39-41 (1986). Abt. Anatomie, RWTH Aachen (D) R.H.S.

Separation of nuclear cAMP independent protein kinases NI and Ni l from their chromosomal protein substrates and enzym iuifibitors by the use of a casein-phosvitin-Sepharose column. M. Delpech, F. Leby-Favatier and J. Kruh.

Nucleare Proteinkinasen k6nnen von ihren chromosomalen Phospho- pro teinsubstraten und einigen Proteinkinaseinhibitoren dutch ein einstu- figes Verfahren auf einer Casein-Phosvitin-Sepharose-S/iule abgetrennt werden. Die Herstellung des S/iulenmaterials wird beschrieben. Die S~iulen werden mit einem linearen NaC1-Gradienten von 0,15-2,0 M in 10 mM Tris(pH 7,5) eluiert. Durch einen zus/itzlichen Trennschritt auf einer partiell hydrolysierten und dephosphorylierten Casein-Sepharose- S~[ule k6nnen die Protein NI- und NII-Kinasen voneinander getrennt werden. Die Fraktionen werden ebenfalls mit einem linearen NaC1- Gradienten von 0 ,15- 2,0 M eluiert. Der Nachweis erfolgt durch Mes- sung der a2P-Aktivit/it. - Anal. Biochem. 152, 100-106 (1986). Inst. Pathol. Mol., Fac. Med. Cochin-Port-Royal, Unit6 Assoc. CNRS, Paris (F) R.H.S.

A method for assaying the rhamnosidase activity of naringinase. C. Romero, A. Manj6n, J. Bastida and J.E. Iborra.

Ffir die spezifische Messung der ~-Rhamnosidase-Aktivit/it von Na- ringinase wird p-Nitrophenyl<(-L-rhamnopyranosid als Substrat vorgeschlagen. Das bei der Reaktion entstehende p-Nitrophenol wird anhand der Absorption bei 400 nm bestimmt. Temperatur- und pH-Optimum sowie die optimale Ionenst/irke werden durch das synthetische Substrat nicht ver/indert, die Michaelis-Konstante des Enzyms herabgesetzt. Die Verwendung des synthetischen Substrats erlaubt die schnelle und preis- werte Bestimmung auch geringer Naringinase-Mengen. Die Empfind- lichkeit der Methode entspricht der HPLC-Methode bei geringerem Zeitbedarf und iibertrifft die anderer colorimetrischer Methoden. - Anal. Biochem. 149, 566-571 (1985). Dept. Bioquim, Fac. Ci. Quire., Univ. Murcia (E) J.B.

Chrumogenic substrates for suifurtransferases. M.R. Burrous and J. Westley.

4-(Dimethylamino)-4'-azobenzol-(DAB)-thiosulfat-Anion wird als Schwefel-Donator-Substrat zur Bestimmung von Rhodanese (Thiosul-

fat-Cyanid-Sulfurtransferase)-Aktivit/it sowie von Thiosulfatreduktase- Aktivitfit als Akzeptor-Substrat mit Cyanid sowie GSH vorgeschlagen. In beiden F/illen entsteht DAB-Sulfinat, das anhand des Differenzspek- trums bei 500 nm bestimmt wird. Das DAB-Sulfinat kann dariiber hin- ans als Schwefel-Akzeptor-Substrat bei der Rhodanese-Reaktion mit anorganischem Thiosulfat oder einem farblosen Thiosulfonat-Anion als Donator dienen. - Anal. Biochem. 149, 6 6 - 71 (1985). Dept. Biochem., Univ. Chicago, IL (USA) J.B.

Quantitative determination of alizapride in human plasma by high-performance liquid chromatography. Y. Coulais, G. Campistron, C. Caillard and G. Houin.

Das anti-emetisch wirkende Alizaprid, N-[(1-Allyl-2-pyrrolidinyl)- methyl]-6-methoxy-lH-benzatriazol-5-carboxamid, kann aus Plasma- proben nach Zusatz yon Griseofulvin als internem Standard sowie Tris- Puffer (pH 8,1) mit Chloroform extrahiert werden. Die organische Phase wird zur Troekne eingedampft, in mobiler Phase aufgenommen und auf einer LiChrosorb RP-18-S/iule mit Methanol/0,05 M KH2PO4/Triethyl- amin (77:20:1) als mobiler Phase unter Zusatz yon 2,6 M HC1 (pH 7,6) analysiert. Der Nachweis wird fluorimetrisch bei 323/370 nm durchgeffihrt. Die Wiederfindensrate f/Jr Alizaprid liegt um 70% und f/Jr den internen Standard um 94%. Die untere Nachweisgrenze wird mit 2 ng angegeben (entsprechend 15 ng/ml) bei 20 gl injizierter Probe. - J. Chromatogr. 374, 425-429 (1986). Unit. Pharmacocin., Clinique, Fac. Sci. Pharm., Toulouse (F) R.H.S.

Enantiospecific high-performance liquid chromatographic analysis of 2- pheuylpropionie acid, ketoprofen and fenoprofen. B.C. Sallustio, A. Abas, P.J. Hayball, Y. J. Purdie and P.J. Meffin.

Ein HPLC-Verfahren zur Bestirmnung der R- und S-Enantiomeren der nichtsteroidischen entziindungshemmenden Wirkstoffe Ketoprofen, Fenoprofen und 2-Phenylpropions/iure wird beschrieben. Dazu werden die biologischen F1/issigkeiten (Plasmaproben) mit trans-Zimts/iure als internem Standard mit Dichlormethan extrahiert. Die organischen Pha- sen werden eingedampft, in mobiler Phase aufgenommen und auf einer Reversed-Phase LiChrosorb RP-18-S/iule mit Methanol/0,05 M Phos- phatpuffer einmal aufdie Gesamtkonzentration an R- und S-Enantiome- ren analysiert. Diese Fraktion wird erneut mit Dichlormethan extrahiert mit SOClz und R-2-Phenylethylamin derivatisiert und diese Derivate auf einer LiChrosorb Si-60-S/iule mit Acetonitril/Dichlormethan analysiert. Die Zusammensetzungen der mobilen Phase richten sich nach der zu analysierenden 2-Arylpropions/iure. Der Nachweis der Derivate wird bei 254 nm im UV durchgef/ihrt. Die Nachweisempfindlichkeiten liegen bei 6 mg/12-Phenylpropions/iure, 0,2 mg/1 Ketoprofen und 2,5 mg/1 Fe- noprofen. - J. Chromatogr. 374, 329 - 337 (1986). Dept. Clin. Pharma- col., Flinders Univ. South Australia, Bedford Park (AUS)

R.H.S.

Highly sensitive determination of ketoprofen in human serum and urine and its application to pharmacokinetic study. K. 0ka, S. Aoshima and M. Noguchi

Ein genaues HPLC-Verfahren mit zwei S/iulen wird zur Bestimmung yon Ketoprofen in Serum und Urin entwickelt. Dazu werden die Proben mit Naproxen als intemem Standard versetzt und mit 1 M HC1 anges/iuert. Die Extraktion erfolgt durch Rapid-Flow-Fraktionierung nach K. Oka, N. Ohki, M. Noguchi, Y. Matsuoka, S. Irimajiri, M. Abe und T. Takizawa (Anal. Chem. 56, 2614 (1984)). Die Proben werden erst auf eine Silicagel-SSmle (Urin und h6here Serumkonzentrationen) gegeben, die mit Essigs/iure/2-Propanol/Dichlormethan/n-Hexan (0,2:0,8:4:95) eluiert wird. Bei Konzentrationen unter 200ng Ketoprofen/ml wird das Eluat der Silicagelsfiule eingedampft, in 10% Methanol in Dichlormethan aufgenommen und auf einer Finepack Sil C18-Reversed Phase Sfiule mit 60% Methanol + 0,2% Essigs/iure chromatographiert. Der Nachweis wird bei 254 nm im UV durchgefiihrt. Die Nachweisgrenze liegt bei 2 ng/ml, bei h6lieren Konzentrationen wird jedoch nur das Verfahren auf der ersten S~iule verwendet, wodurch k/irzere Vorbereitungszeiten erzielt werdeu. - J. Chromatogr. 345, 419-424 (1985). Clin. Pharmacol. Lab., Tokyo Colt. Pharm., Tokyo (J)

R.H.S.

243

~ F a ~ 3 Biochemical and clinical analysis

Determination of diclofenac in synovial fluid by high performance liquid chromatography. K.K.H. Chan and K.H. Vyas.

Wegen des begrenzten Zugangs zu fiir Blindl6sungen ausreichenden Mengen an Synovialfliissigkeit gibt es bei der Erstellung yon Eichkurven fiir die Bestimmung yon Pharmaka, hier yon Diclofenac-Natrium, in dieser Matrix Schwierigkeiten. Deshalb wird versucht, durch Vergleich von Linearit/it und der Korrelation des Peakh6henverh/iltnisses zwischen Diclofenac in Blutplasma und in Synovialflfissigkeit eine Bezie- hung herzustellen. Dabei konnte festgestellt werden, dab eine ausgezeich- nete lineare Beziehung zwischen den Eichkurven in beiden biologischen Flfissigkeiten besteht, und dab auch die Peakh6hen (bei jeweils gleichen Diclofenac-Konzentrationen) sehr gut korrelieren. Daraus ergibt sich, dab die in Blutplasma erstellten Eichkurven auch fiir die Bestimmung des Diclofenac-Natrium in Synovialfliissigkeit benutzt werden k6nnen. Anwendungsbeispiele werden beschrieben. - Anal. Lett. 18, 2507- 2519 (1985). Developm. Dept., Pharm. Div., Ciba-Geigy Corp., Ardsley, NY (USA) W. Czysz

Influence of the chain length of chemically bonded phases on the behaviour of several thiazide, potassium-sparing and loop diuretics in high-performance liquid chromatography. F. de Croo, W. van den Bossche and P. de Moerloose.

20 verschiedene Diuretika werden vergleichend auf LiChrosorb RP C1s-, Ca- oder C2-S/iulen (5 gm, 150x 4,6 mm) in Acetonitril/Wasser (40: 60) oder Acetonitril/0,05 M Phosphatpuffer (40: 60) (pH 3) getrennt. Der Nachweis kann bei 275 nm im UV ffir die Diuretika und bei 238 nm fiir Spironolacton und Canrenon erfolgen. Die Thiaziddiuretika verhalten sich auf allen Sgulen ~ihnlich, ffir die kaliumschonenden Diuretika wird jedoch eine groBe Abh/ingigkeit der Selektivitfit der S/iule yon der Lgnge der Kohlenstoffkette der station/iren Phase gefunden. - J. Chromatogr. 349, 301-304 (1985). Dept. Pharm. Chem., State Univ., Ghent (B) R.H.S.

Rapid, isothermal gas-liquid chromatographic determination of nitroglyce- rine in plasma using an electron-capture detector. II. K. Langseth-Man- rique, I.E. Bredesen and T. Greibrook.

Das von den Autoren in A. Frigerio (Editor) Chromatography and Mass Spectrometry in Biomedical Sciences 2, Elsevier, Amsterdam, Ox- ford, New York, 1983, p. 97 beschriebene Verfahren zur Bestimmung yon Nitroglycerin in Plasma wird modifiziert. Gute Ergebnisse werden nach einem einstufigen Extraktionsscllritt mit Hexan und Einengen des Extraktes bis fast zur Trockne erzielt. Die Analyse erfolgt gaschromatographisch auf einer S~iule mit 3% SP-2550 auf Supelcoport + 3% OV- 225 auf Gas-Chrom Q (80-100 mesh) bei einer Sfiulentemperatur yon 135~ Gute Nachweisergebnisse werden mit einem 63Ni-ECD erzielt, Mit dem modifizierten Verfahren wird eine Nachweisempfindlichkeit yon 0,05 nMol/1 erreicht. - J. Chromatogr. 349, 421 - 4 2 4 (1985). Div, Clin. Pharmacol. Toxicol., Centr. Lab., Ullevaal Hosp., Oslo (N)

R.H.S.

Direct derivatization of alprenolol and its 4-hydroxy metabolite in urine with phosgene and methanol prior to analysis by capillary column gas chromatography. O. Gyllenhaal.

Ein Verfahren zur Bestimmung von Alprenolol und seinem 4-Hydro- xymetaboliten wird beschrieben. Dazu wird die Harnprobe mit Puffer (pH 12) alkalisch gemacht und mit 60 gl 2 M Phosgen in Toluol dutch Schfitteln derivafisiert. In Gegenwart yon 2,5% Methanol wird das Oxazolidinonmethylcarbonat aus dem OH-Metaboliten gebildet. Die Derivate werden mit Dichlormethan extrahiert. Nach Eindampfen der organischen Phase wird der Rtickstand in wenig Ethylacetat aufgenommen und auf einer CP-Sil 8 Capillars/iule mit einem Temperaturpro- gramm yon 100-280~ gaschromatographisch analysiert. Der Nach- weis wird mit einem FID und einem stickstoffempfindlichen Detektor durchgeffihrt. AuBerdem k/Snnen die Derivate anschlieBend auch massenspektrometrisch untersucht werden. Die Genauigkeit des Verfahrens wird im Konzentrationsbereich yon 3,3 gg/ml mit 2,1% ffir den Metabo- liten angegeben. Als interner Standard kann das Isopentylamino-Ana- loge eingesetzt werden. - J. Chromatogr. 349, 447-456 (1985). Anal. Chem., AB H/issle, M61ndal (S) R,H.S.

244

Analysis of amiodarone and desethylamiodaronc in serum and tears by reversed-phase high-performance liquid chromatography. K.T. Muir, K.A. Kook, C. Stern and K.M. Gardner.

Das antiarrhythmisch wirkende Amiodaron und sein Desethyl-Meta- bolit k6nnen aus Serum und Tr/inen mit einem wirkungsvollen HPLC- Verfahren bestimmt werden. Die biologischen Proben werden nach Zu- satz von Trifluoperazindihydrochlorid als internem Standard und Puffer (1,0 M; pH 5,5) mit Hexan extrahiert. Nach Eindampfen der organischen Phase wird in Methanol aufgenommen und auf einer Ultrasphere Octyl-Sgule mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4; 10%) und einem Ge- misch aus Methanol/Acetonitril (1 : 1) analysiert. Der Nachweis wird bei 240 nm im UV durchgefiihrt. Die Wiederfindensraten liegen ffir die Wirkstoffe fiber 90%. Die Empfindlichkeit wird mit 20 ng/ml angegeben. - J. Chromatogr. 374, 394-399 (1986). School Pharm., Univ. Southern Calif., Los Angeles, CA (USA) R.H.S.

High-performance liquid chromatographic determination of diltiazem and four of its metabolites in plasma. Application to pharmaeokinetics. K.-J. Goebel and E.U. K611e.

Ein selektives und sehr empfindliches HPLC-Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung des Calcinmblockers Dilfiazem und vier seiner Metabo- lite in Plasma wird entwickelt. Das strukturell verwandte Propionyldes- acetyldiltiazem wird als interner Standard zugegeben und Bromid als Ionenpaarungsion. Die Plasmaproben werden mit Methyl-tert.-butyl- ether extrahJert, in 0,01 M HCI rfickextrahiert und zur Trockne eingedampft. Die HPLC wird auf einer Cls-Reversed-Phase S/iule mit Methanol/0,04 M Ammoniumbromid/Aeetonitril/Triethylamin (40: 36: 24 + Triethylamin pH 8,5) durchgefiihrt. Der UV-Nachweis erfolgt bei 237 nm, die untere Nachweisgrenze liegt bei 0,1 -0 ,2 ng/ml Plasma. Im Bereich von 1 -- 800 ng/ml erhglt man lineare Eichkurven. - J. Chroma- togr. 345, 355-363 (1985). Dept. Bioehem., G6decke Res. Inst., Frei- burg (D) R.H.S.

Determination of pentopril, an angiotensin converting enzyme inhibitor, and its active metabolite in urine. V. Tipnis and A. Rakhit.

Zur Bestimmung von Pentopril und seinem aktiven Metaboliten in Harn werden die Proben mit einem Strukturanalogen als internem Stan- dard versetzt, 10% NaHCO3 zugegeben (pH 9 - 10) und mit Dichlorme- than extrahiert. Die w/iBrige Phase wird aufpH 2 - 3 mit HC1 angesfiuert und mit Dichlormethan extrahiert. Der Extrakt wird eingedampft, der Riickstand in Aceton aufgenommen und Cs2CO3 und Methyliodid zugesetzt. Es wird 2 h auf 75~ erwfirmt und die Reaktionsmischung eingedampft. Der Riickstand wird in Wasser aufgenommen, mit 2% Aceton in Hexan extrahiert und die organische Phase eingedampft. Der R/ickstand wird in Ethylacetat auf einer S/iule mit 3 % OV-101 auf Chromosorb W HP (80-100 mesh) bei 190~ unter Verwendung eines FID analysiert. Das Verfahren wird mit guter Ausbeute und Reproduzierbarkeit zur Analyse yon Pentopril in Harnproben eingesetzt. - J. Chromatogr. 345, 396-401 (1985). Develop. Dept., Pharm., Div., Ciba-Geigy Corp., Ardsley, NY (USA) R.H.S.

Determination of SQ 27,519, the active phosphiuic acid-carboxylic acid of the prodrug SQ 28,555, in human serum by capillary gas chromatography with nitrogen-phosphorus detection after a two-step derivatization. M. Jemal, E. Ivashkiv, M. Ribick and A.I. Cohen.

Ein Verfahren zur Bestimmung yon SQ 27,519 (II), der aktiven Phos- phins/iure-Carboxylsgure des Wirkstoffs SQ 28,555 (I), einem Inhibitor des Angiotensin-konvertierenden Enzyms, wird beschrieben. I und II werden aus anges/iuertem Serum in Ethylacetat extrahiert, II wird in w~igriges Natriumbicarbonat zuriickextrahiert. I kann anschliegend hy- drolysiert werden und als II bestimmt werden. Die zwei sauren Gruppen von II werden selektiv verestert, erst durch Methylierung der Carboxyl- s/iure mit methanolischer HC1 und dann durch Bildung des Hexafluor- isopropylesters der Phosphins/iure. Das Derivat wird durch Capillargas- chromatographic und NP-selektive Detektion bestimmt. Lineare Eich- kurven mit einer Nachweisgrenze von 10 ng/ml Serum werden erhalten. - J. Chromatogr. 345, 299-307 (1985). Squibb Inst. Med. Res., New Brunswick, NJ (USA) R.H.S.

Assay of mephenytoin metabolism in human liver microsomes by high- performance liquid chromatography. U.T. Meier, T. Kronbach and U.A. Meyer.

3 Biochemische und klinische Analyse ~ e g ~ O

Mit Hilfe eines Reversed-Phase HPLC-Verfahrens wird der Stoffwech- sel des antikonvulsiv wirkenden Mephenytoins (3-Methyl-5-phenyl-5- ethylhydantoin) zu 4-OH-Mephenytoin (OH-M) und 5-Phenyl-5-ethylhydantoin (Nirvanol) beobachtet. Dazu werden die Mikrosomproben getrennt mit S- und R-Mephenytoin inkubiert. Nach Zusatz von Pheno- barbital als internem Standard wird das Inkubationsgemisch mit Di- chlormethan extrahiert. Der Riickstand der eingedampften organischen Phase wird in Wasser geltst und auf eine 60 x 4,6 mm Reversed-Phase Siiule (5 g-C-18) injiziert. Eluiert wird mit Acetonitril/Methanol/Natri- umperchlorat (20 raM, pH 2,5). Quantitative Auswertungen k6nnen bei 204 nm im UV durchgefiihrt werden. Mit dem Verfahren wird der Stoffwechselmechanismus des Mephenytoins untersucht. -- Anal. Bio- chem. 151, 286-291 (1985). Dept. Pharrnacol., Biocenter Univ. Basel (CH) R.H.S.

Determination of lenperone in dog plasma by high-performance liquid chromatography. M.A. Osman, F.M. Pinchbeck, L.K. Cheng and G.J. Wright.

Der Tranquilizer Lenperon, ein Butyrophenonderivat, kann aus Hun- deplasma nach Zusatz des Piperidinanalogen als internem Standard in Methanol, NH40H mit Hexan extrahiert werden. Die organische Phase wird in H2SO, riickextrahiert, erneut mit NH4OH versetzt und mit Hexan extrahiert. Die organische Phase wird zur Trockne eingedampft, in mobiler Phase aufgenommen und auf eine Bondapak C~s-Reversed- Phase S~iule injiziert, die mit Acetonitril/0,05 M Phosphatpuffer (35: 65) als mobiler Phase eluiert wird. Der Nachweis im Effluat erfolgt bei 254 nm. Im Bereich yon 5 - 160 ng/ml wird eine lineare Eichkurve erhalten, wenn 1 ml Plasmaproben eingesetzt werden. Das Yerfahren ist gut reproduzierbar. - J, Chromatogr. 345, 430-435 (1985). Drug Metabo- lism Dept., A.H. Robins Comp., Richmond, VA (USA) R.H.S.

Sensitive uitrogen-phosphorus capillary gas chromatographic assay for doxapram in premature infants. G.A. Torok-Both, R.T. Coutts, F. Jamali, F.M. Pasutto and K.-J. Barrington.

Zur Bestimmung des gegen Atemschwierigkeiten bei Friihgeborenen eingesetzten Doxaprams wird ein hochempfindliches gaschromatogra- phisches Verfahren ausgearbeitet, um den Wirkstoff auch in 2 - 5 gl Ham- und 20 - 100 gl Plasmaproben bestimmen zu ktnnen. Die Proben werden mit Wasser auf 200 gl verd/innt, Diazepam als interner Standard zugesetzt und mit HC104 enteiweil3t. Der ~berstand des Zentrifugats wird mit KzCOs neutralisiert und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird zur Trockne eingedampft, der Rfickstand in Toluol aufgenommen und auf einer Quarzcapillars~iule mit DB-5 Beschichtung mit einem Temperaturprogramm yon 150-250~ analysiert. Der Nach- weis wird mit einem N-P-empfindlichen Detektor oder massenspektrometrisch durchgefiihrt. Im Bereich you 10 n g - 5 ~tg pro Probe erh/ilt man eine lineare Eichknrve. Die untere Nachweisgrenze liegt bei 100 ng/ 100 gl Plasmaprobe. - J. Chromatogr. 344, 372-377 (1985). Fac. Pharm., Univ. Alberta, Edmonton, Alberta (CDN) R.H.S.

Extractive acylation and mass spectrometric assay of 3-methoxytyramine, normetanephrine, and metanephrine in cerebrospinal fluid. O. Beck and K.F. Fau11.

Die Probe (6 ml Cerebrospinalfliissigkeit) wird mit ZH-3-Methoxytyr- amin, 2H-Nonnetanephfin und ZH-Metanephrin als innerem Standard versetzt, mit Pentafluorpropions/iureanhydrid umgesetzt und mit CH2C12 extrahiert. Die derivatisierte Fraktion wird der GC-MS-Analyse (DB-5, Quarzcapillare, 130-220~ 20~ unterworfen. Dutch An- wendung des ECNCI (electron capture negative-ion chemical ionization)-Modus mit htchster Empfindlichkeit und minimalen Verlusten bei der Extraktion und Derivatisierung k6nnen die Substanzen im pg- Bereich bestimmt werden. Die biogenen Amine kommen in der Cerebro- spinalfltissigkeit im wesentlichen in konjugierter Form vor; die Bestim- mung ist nach enzymatischer Hydrolyse mit Sulfatasen m6glich. - Anal. Biochem. 149, 492-500 (1985). Dept. Psychiatry Behavioral Sci., Stanford Univ. School Med., Stanford, CA (USA) J.B.

Rapid and simple method for the routine determination of dobutamine in human plasma by high-performance liquid chromatography. R. Knoll and M. Brandl.

Das synthetische Catecholamin Dobutamin kann in klinischen Proben empfindlich nach Extraktion auf Bond-Elut CN S/iulen zusammen mit

Buphenin als internem Standard extrahiert werden. Die Elution erfolgt mit mobiler Phase/Methanol (I :1) und die Eluate werden auf einer RP-18 Reversed-Phase S/iule mit 0,1 M K2HPO4 in Wasser/Methanol (80:20) + 9 ml Dibutylamin pro 1 als mobiler Phase analysiert. Der Nachweis wird fluorimetrisch bei 195 nm/330 nm durchgeffihrt. Die Wiederfindensrate liegt bei 67% fiir Dobutamin und bei 77% fiir den internen Standard. Das Verfahren ist fiir Dobutaminkonzentrationen im kritischen 15 - 200 ng/ml Bereich gut einsetzbar. - J. Chromatogr. 345, 425-429 (1985). Inst. Anaestesiolog., Univ. Erlangen-Niirnberg (D)

R.H.S.

Quantitation of antitumor agent aciviein in plasma by gas chromatography/mass spectrometry. J.P. McGovren, M.G. Williams, R.H. Robins and B.L. Roach.

A gas chromatographic/mass spectrometric (GC/MS) method is described for the quantitation of acivicin in plasma. Deproteinized plasma (1 ml) containing the drug and the bromo derivative of acivicin as an internal standard was treated with isobutyl chloroformate and diazomethane to form the acivicin and bromoacivicin N-isobutyloxycar- bonyl methyl esters. The derivatives were then separated by capillary gas chromatography and quantitated by chemical ionization mass spectrometry using methane as the reagent gas. Limit of quantitation was 25 ng/ml acivicin in plasma. Six-point standard curves between 10 and 1000 ng/ml had linear correlation coefficients >0.99. Recoveries ranged from 95.1 to 101.6%. - Anal. Chem. 57, 2046--2049 (1985). Res. Labs., Upjohn Comp., Kalamazoo, MI (USA)

Contemporary detection of 4-demethoxyflaanorubiein and its metabolites 13-dihydro-4-demethoxydannorubicin and 4-demethoxydaanorubieinone by reverse phase high-performance liquid chromatography. G. Pizzorno, F. Trave, A. Mazzoni, O. Russello and A. Nicolin.

The aim of this work was to optimize a simple analytical method f/Jr a complete pharmacological and toxicological follow up of patients treated with a new orally active daunorubicin analog, the 4- demethoxydaunorubicin. For this reason the chromatographic properties of the unchanged drug and its metabolites have been investigated. Extraction of these compounds from biological fluids has been carried out using ethyl acetate and butanol. Separation has been achieved in a Cls reverse phase column by isocratic elution with acetonitrile/ methanol/phosphate buffer (40:10:50, pH 4.7). Drug and metabolites can be quantitated at nanogram level by fluorescence detection. - J. Liquid Chromatogr. 8, 2557-2566 (1985). Ist. Naz. Ricerca Cancro, Genova (I)

Reversed-phase high-performance liquid chromatography of 5-(3,3-dimethyl-l-triazeno)imidazole-4-carboxamide and metabolites. P.S. Tate and H.A. Bride.

Das bei der Hodgkinschen Krankheit und Melanomen zur Behand- lung verwendete Dialkyltriazin 5-(3,3-Dimethyl-l-triazin)imidazol-4- carboxamid wird zusammen mit seinen Metaboliten aus Plasma mit Methanol/Chloroform (3:1) extrahiert. Die Analyse des Oberstandes kann direkt auf einer gBondapak Phenyl-Siliea-Sfiule mit einem Gra- dienten aus Ammoniumformiatpuffer (0,1%, pH 5,5)/Methanol/Wasser (90: 5: 5) bis (40: 30: 30) erfolgen. Der Nachweis wird bei 254 nm durchgeffihrt. Die untere Nachweisgrenze liegt bei 50 ng/ml. - J. Chromatogr. 374, 421-424 (/986). Div. Surgical Oncol., Dept. Surgery, Coll. Med. Univ. Illinois Chicago, Chicago, IL (USA) R.H.S.

High-performance liquid chromatography and preliminary pharmaco- kinetics of enoxaein and its 4-oxo metabolite in human plasma, urine and saliva. T.B. Vree, A.M. Baars and W.J.A. Wijnands.

Das antibakteriell wirkende Enoxacin, ein neues Breitbandbakterizid der Chinolon-/Azachinolon-Klasse, kann neben seinem 4-Oxometaboli- ten in biologischen Flfissigkeiten mit einem HPLC-Verfahren bestimmt werden. Plasma- und Urinproben werden mit [~-Glucuronidase zur Zer- setzung der Konjugate inkubiert, Speichelproben werden direkt analysiert. Die Trennung erfolgt auf einer LiChrosorb RP-2-S~iule unter Vor- schaltung einer Reversed-Phase Schutzsfiule mit 7 mM Phosphorsfiure/ Dimethylformamid/Ethanol (77: 20: 3) als mobiler Phase. Der Nachweis wird bei 342 nm fiir Enoxacin und bei 265 nm ffir den Oxometaboliten durchgeffihrt. - J. Chromatogr. 343, 449--454 (1985). Dept. Clin. Pharm., Sint Radboud Hosp., Nijmegen (NL) R.H.S.

245

~ S ~ f ~ S 3 Biochemical and clinical analysis

Sensitive reversed-phase high-performance liquid chromatographic assay for the antitumor agent benzisoqainolinedione (Nafidimide) employing direct on-column injection of plasma and urine, and its use for pharmacokinetic studies in dog. G. Powis, D.M. Kroschel and D.J. Moore.

Ein empfindliches Reversed-Phase HPLC-Verfahren znr Bestimmung von Nafidimid in biologischen Flfissigkeiten wird beschrieben. Dazu werden die Proben auf pH 5 gebracht und direkt auf eine RP-8 (LiChro- sorb RP-8) S~iule, der eine Perisorb RP-8-Schutzs/iule vorgeschaltet ist, injiziert. Protein wird vonder Vorsfiule gewaschen, die Probe konzentriert und dann anf die analytische Sfiule (LiChrospher II) umgeschaltet, diese wird mit einem 10-min linearen Gradienten von 0-100% Methanol in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 8,1) eluiert. Das Effluat wird fluorimetrisch und im UV ausgewertet. Das Verfahren ist sehr schnell, da es keinerlei Probenvorbereitung ben6tigt. Bei fluorimetrischem Nach- weis erh~ilt man eine Nachweisgrenze von 1 ng Nafidimid/ml Plasma. Die Eichkurve ist bis 1 gg/ml bei fluorimetrischem und bis 5 Ilg/ml bei UV-Nachweis linear. Das Verfahren kann auch zur Bestimmung nicht fluorescierender Metaboliten eingesetzt werden. - J. Chromatogr. 345, 402-407 (1985). Div. Developm., Oncol. Res., Dept. Oncol., Mayo Clinic Rochester, MN (USA) R.H.S.

High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of henzisoquinolinedione (Nafidimide) from biological fluids. K. Lu, N. Savaraj and R.A. Newman.

Die Antitumorverbindung Nafidimid kann in biologischen Flfissigkei- ten nach Extraktion fiber eine Ca8 Sep-Pak Patrone mit Chloroform/ Methanol (1 : 1), Eindampfen des Extraktes und Aufnehmen in 0,02 M Acetatpuffer (pH 4) in 70% Acetonitril auf eine pBondapak C18-S/iule injiziert werden, die mit 0,03 M Acetatpuffer in 15% Acetonitril (pH 4) als mobilder Phase eluiert wird. Der Nachweis wird fluorimetrisch bei 350/550 nm durchgeffihrt. Das Verfahren wird ffir Plasma-, Gallen- und Cerebrospinalflfissigkeitsproben eingesetzt. Die Wiederfindensrate liegt um 80%. Die untere Nachweisgrenze wird mit 30 ng/ml angegeben. - J. Chromatogr. 345, 408-412 (1985). Dept. Chemotherapy Res., Univ. Texas System Cancer Center, MD Anderson Hosp., Houston, TX (USA)

R.H.S.

Determination of ampiciilin in plasma by paired ion high-performance liquid chromatography. A.H. Hikal and A.B. Jones.

A new, accurate, precise, and specific method has been developed for the assay of ampicillin in plasma. No extraction of ampicillin from plasma is called for. Plasma is treated with acetonitrile containing pro- piophenone as the internal standard, vortexed, centrifuged, and the supernate is injected. A C18 reverse phase column is used. The mobile phase consisted of a mixture of methanol and 0.02 M phosphate buffer ofpH 6.00, and contained alkyldimethylamine C10 as an ion pair ligand. Detection was by UV at 220 nm. A linear relationship between concentration and peak area ratio was obtained. Recovery, day-to-day, and within-day variation were determined. - J. Liquid Chromatogr. 8, 1455-1464 (1985). Sch. Pharm., Univ. Mississippi, MS (USA)

High-performance liquid chromatographic assay of ampieiliin, amoxicillin and ciclacillin in serum and urine using a precolumn reaction with 1,2,4- triazole and mercury(lI) chloride. J. Haginaka and J. Wakai.

Acetylierung yon Ampicillin (ABPC), Amoxicillin (AMPC) und Cic- lacillin (ACPC) mit Acetanhydrid bei pH 9 und anschlieBende Reaktion mit 1,2,4-Triazol und HgC12 bei 60~ liefert Derivate, die zur HPLC- Bestimmung der Aminopenicilline geeignet sind. Die Trennung wird an einer C~s-S~ule mit unterschiedlichen Laufmitteln durchgeffihrt, die abet alle Thiosulfat enthalten. Detektiert wird bei 328 nm (ABPC, AMPC) und 327 nm (ACPC). Bei Injektion von 80 pl k6nnen in Serum noch 0,05 und 0,1 gg/ml an AMPC bzw. ABPC oder ACPC bestimmt werden. Ffir Urin liegen die Werte um den Faktor 10 darfiber. Je naeh Verbindung und Matrix wurden Vergleichsstandardabweichungen zwischen 1 und 6% ermittelt. - Analyst 110, 1277-1281 (1985). Fae. Pharm. Sci., Mukogawa Women's Univ., Nishinomiya (J) B. Seifert

Automated determination of amoxycillin in biological fluids by column switching in ion-pair reversed-phase liquid chromatography systems with post-colunm derivatization. J. Carlqvist and D. Westerlund.

246

Das polare Aminopenicillin Amoxycillin, welches in biologisehen Flfissigkeiten ziemlich instabil ist, kann durch schnelle Probenbehand- lung und Lagerung der Probe bei -70~ konserviert werden. Nach Einstellung des pH-Wertes kann die Probe dann sofort mit einem auto- matisierten HPLC-System analysiert werden. Dieses System besteht aus einer kurzen Schutzs/iule mit Spherisorb $ 5 0 D S und zwei analytisehen Sfiulen mit Microspher C18, welche mit einem Mikroventil umgeschaltet werden ktnnen. Die Elufion erfolgt mit unterschiedlichen Methanolge- halten in Phosphatpuffer (pH 7,4) (Ionenst/irke 0,1). Auf der ersten Sfiule wird unter Zusatz von 10- 3 M Na-Hexylsulfat und auf der zweiten unter Zusatz yon 10- 3 M Tetrahexylammoniumhydrogensulfat als Ionenpaar- bildungsreagens eluiert. Das Effluat wird entweder einem UV-Detektor zugeleitet oder nach Reaktion mit Fluorescamin in Acetonitril fluorimetrisch bei 372,5/470 nm nachgewiesen. Die Nachweisgrenzen liegen bei 10 -25 ng/ml Plasma bzw. Urin. - J. Chromatogr. 344, 285-296 (1985). Dept. Bioanal. Chem., Res. Lab., Astra Lfikemedel AB, SSder- t/ilje (S) R.H.S.

Automated high-performance liquid chromatographic determination of spiramycin by direct injection of plasma, using cohimn-switching for sample clean-up. J. Dow, M. Lemar, A. Frydman and J. Gaillot.

Ein vollautomatisiertes HPLC-System zur Bestimmung des Macrolid- Antibiotikums Spiramycin I in Plasma wird beschrieben. Dazu wird erst 1 ml Plasmaprobe mit 1,5 ml 4% Acetonitril, welches Spiramycin 2 als internen Standard enth/ilt, verdfinnt. 1 ml davon wird dann fiber eine automatische Injektionseinheit auf eine Perisorb RP-18-Schutzsfiule injiziert, das Effiuat fiber eine Nucleosil 5 Cs-Analysens/iule geleitet und bei 230 nm nachgewiesen. Die Vors/iule wird mit 4% Acetonitril in 2%0 Perchlors/iure gereinigt und dann mit 26% Acetonitril in 2~ Perchlor- s/iure getrennt und eluiert. Die Automatisierung erfolgt mit einem pneu- matischen Ventil. Das Verfahren wird mit einem mikrobiologischen verglichen und erfolgreich ffir pharmakokinetische Untersuchung eingesetzt. - J. Chromatogr. 344, 275-283 (1985). Dept. Biodynam., Inst. Biopharm., Rh6ne-Poulenc, Antony (F) R.H.S.

High-performance liquid chromatographic method for monitoring lenpeptin in mouse serum and muscle by pre-column fluorescence derivatization with benzoin. M. Kai, T. Miura, J. Ishida and Y. Ohkura.

Ein HPLC-Verfahren zur Bestimmung von Leupeptin, einem Wirk- stoff, der bei der Behandlung von Muskeldystrophie eingesetzt werden k6nnte, in M/iuseserum und Gewebe wird entwickelt. Dabei wird Leu- peptin mit Natriumborhydrid zu Leupeptinot reduziert und dann mit Benzoin in ein fluorescierendes Derivat umgewandelt. Die Derivate werden durch HPLC auf einer LiChrosorb RP-18-S/iule isokratisch mit Methanol/0,5 M Tris-HC1-Puffer (pH 8,5)/40 mM Tetra-n-butylammo- niumchlorid (7:1 : 2) getrennt und fluorimetrisch bei 325/425 nm naehge- wiesen. Die Nachweisgrenze liegt bei 250 pMol Leupeptin/ml Serum bzw. 500 pMol Leupepfin/g Gewebe, was 150 fMol pro Injektion auf das HPLC-Ger/it entspricht. Das Verfahren ist einfach und empfindlich. - J. Chromatogr. 345, 259-265 (1985). Fac. Pharm. Sci., Kyushu Univ., Higashi-ku, Fukuoka (J) R.H.S.

Improved high-performance liquid chromatographic assay of clavulanic acid and sulbactam by postcolumn alkaline degradation. J. Haginaka, J. Wakai, H. Yasuda, T. Uno and T. Nakagawa.

Improved HPLC methods have been developed for plasma and urine. The plasma samples were ultrafiltered using Amicon YMT membranes, and the urine samples were filtered with a 0.45-gm acrylate-copolymer membrane after ten-fold dilution with distilled water. Thereby, they were easily separated from the normal components of plasma and urine on a Cls reversed-phase column using an eluent containing methanol as an organic modifier. The effluent was led to postcolumn alkaline degradation in 0.5-0.75 M sodium hydroxide solution, which had the same methanol content as that of the HPLC eluent. Subsequently, the degradation products were detected at 272 nm for clavulanic acid and at 278 nm for sulbactam. These methods, which are accurate and precise, permit determination of 225 ng/ml of clavulanic acid and sulbactam in plasma. At a clavulanic acid or sulbactam concentration of 0.5 gg/ml in plasma, within- and between-run precisions were of the order of 1.89-5.65% and 1.33- 3.21%, respectively. - J. Liquid Chromatogr. 8, 2531 --2534 (1985). Fae. Pharm. Sci., Mukogawa Women's Univ., Nishinomiya (J)

Documents

3 Biochemische und klinische Analyse