Bioorganische ChemieEnzymatische Katalyse 2011

Prof. Dr. A. Jäschke

INF 364, Zi. 308, Tel. 54 48 51 jaeschke@uni-hd.de

Ringvorlesung Chemie B - Studiengang Molekulare Biotechnologie

4. Beispiel: Nucleosidmonophosphat-Kinasen

Enzymfamilie

Die Core-Domäne der NMP-Kinasen

Gly-X-X-X-X-Gly-Lys

Die P-Schleife interagiert mit der Phosphorylgruppe des ATP

Komplexe von NTPs mit Mg2+

sind die eigentlichen Substrate für alle NTP-abhängigen Enzyme

Rolle: 1. Neutralisation, unspez. Wechselwirkungen2. definierte Konformation3. Zusätzliche Kontaktstellen - Bindungsenergie

Rolle der gebundenen Wassermoleküle

Die Bindung von ATP induziert starke Konformationsänderungen

Mechanismus

• Deckel klappt zu

• 2. Substrat (NMP) wird gebunden – weitere Konformationsänderung - Triphosphat in direkter Nähe zum Monophosphat

• Aktive Enzymkonformation entsteht nur, wenn beide Substrate gebunden sind – Verhinderung der Konkurrenz durch Wasser

• Katalyse durch Annäherung

Zusammenfassung

• Zentrales Thema: Stabilisierung des Übergangszustandes

• 5 grundlegende Strategien:– Verwendung der Bindungsenergie– Kovalente Katalyse– Allg. Säure-Base-Katalyse– Metallionenkatalyse– Katalyse durch Annäherung

Zusammenfassung

• Proteasen ermöglichen eine schwer durchführbare Reaktion

• Carboanhydrasen machen eine schnelle Reaktion noch schneller

• Restriktionenzyme führen hochspezifische Spaltungsreaktionen aus

• NMP-Kinasen katalysieren den Austausch von Phosphorylgruppen ohne vorübergehende Hydrolyse

Hammerhead ribozyme(RNase)

Synthetic variation(cleaves in trans)

You are in charge of what it will cleave

Molecular Scissors

Ribozymes- history

1982 Cech: Tetrahymena rRNA intron is self-spliced out

Altman and Pace: Ribonuclease P RNP: RNA component alone can process the 5’ ends of tRNAs

Mitochondrial group I introns also can self-splice

Then group II introns in mitochondria (lariat-formers)

Mutations (100’s):Internal guide sequencesecondary structure

Conserved base analysis (100’s) confirms structure

X-ray diffraction: a few 3-D structures

Free guanosine

Self-cleavage viathe hammerhead motif

Hammerhead ribozyme (self-cleavage): plant viroids and human delta virus (with Hepatitis C)

Ribozyme mechanisms

Zum Vergleich: RNase A

Katalytische Strategien

• Architektur des katalytischen Zentrums

• Aktivierung des Nukleophils

• Stabilisierung des Übergangszustandes

• Protonierung der Abgangsgruppe

Weitere katalytische Aktivitäten –künstliche Ribozyme

Rationales

• Exporation of the catalytic bandwidthof RNA

• Understand structural and mechanisticprinciples

• Compare with protein enzymes, deducegeneral governing principles

Catalysis of C-C bond formation by ribozymes

Diene

Dienophile

Otto Diels Kurt Alder(1876-1952) (1902-1958)

The Diels-Alder reaction

Ose et al. Nature 2003

Catalysis of Diels-Alder reactions in Nature

Mevinolin(Aspergillus terreus)

Alflabene(Alpinia flabellata)

Carpanone(Cinnamomum sp.)

•Secondary metabolites thought to be biosynthesized via Diels-Alder reaction:

First solved structure of an enzyme which is assumedto catalyze a Diels Alder Reaktion by Ose et al.:

•Macrophomate Synthase (MPS)

To date, there is no solid proof for the existence ofDiels-Alderases in Nature.

Solanapyrones A(Alternaria solani)

HJ Kim et al. Nature 473, 109-112 (2011) doi:10.1038/nature09981

The spinosyn aglycone biosynthetic pathway.

Artificial biopolymeric Diels-Alder catalysts

catalytic antibodies(Abzymes)

catalytic RNA(Ribozymes)

Abzyme1E9

1.– SO22. [Ox.]

1E9 + TSA

+

+

Ribozyme

•hydrophobic interactions•1 hydrogen bond

Involved Interactions:

structure and mechanism ?

Seelig & JSeelig & Jääschke, schke, Chem. Biol.Chem. Biol. 19991999 (6) 167(6) 167--176176

Seelig & JSeelig & Jääschke, schke, Chem. Biol.Chem. Biol. 19991999 (6) 167(6) 167--176176

Catalytic minimal motiv

The hallmarks of enzymaticcatalysis – saturation behaviour &

multiple turnovers

Seelig, B., Keiper, S. Stuhlmann, F. & JSeelig, B., Keiper, S. Stuhlmann, F. & Jääschke, A. schke, A. AngewAngew. Chem.. Chem. 20002000 (112) 4764(112) 4764--4768.4768.

The hallmarks of enzymatic catalysis - Stereoselectivity

R,R product S,S product

Seelig, B., Keiper, S. Stuhlmann, F. & JSeelig, B., Keiper, S. Stuhlmann, F. & Jääschke, A. schke, A. AngewAngew. Chem.. Chem. 20002000 (112) 4764(112) 4764--4768.4768.

The crystal structure of the Diels-Alderase ribozyme

RNA – product interactions

Serganov, A., Keiper, S., Malinina, L., Serganov, A., Keiper, S., Malinina, L., TereschkoTereschko, V., , V., SkripkinSkripkin, E., , E., HHööbartnerbartner, C., , C., PolonskaiaPolonskaia, A., , A., PhanPhan, A. T. , Wombacher, R., Micura, R., , A. T. , Wombacher, R., Micura, R., DauterDauter, Z., J, Z., Jääschke, A., Patel, D. J.: schke, A., Patel, D. J.: Nature Nature StructStruct. . Mol. Biol.Mol. Biol. 20052005 (12) 218(12) 218--224.224.

Comparison with Protein Diels-Alderases

Hugot et al. PNAS 2002 (99) 9674-9678.

Architecture

Mechanistic considerations

• Catalysis by „approximation“ in a hydrophobic pocket

• Stabilisation of the transition state by shape complementarity

• Destabilisation of diene substrate towards the transition state

• Electronic effects

G9

U17

RNA mutationsSubstrate mutations

RNA-product interactions

A3

Atomare Mutagenese