24.04.2008 Versuchsprotokoll 14

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8. Einfache physikalisch-chemische Versuche• 8.5. Stofftrennung durch Dünnschichtchromatographie (DC)

o 8.5.2. DC I: Trennung von Farbstoffeno 8.5.3. DC II: Trennung von Aminosäuren

Einführung

Unter einer Chromatographie versteht man ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von Substanzgemischen. Ihre Wirkungsweise basiert auf den Prinzipien der Stoffverteilung zwischen nicht mischbaren Phasen. Im Falle der Dünnschichtchromatographie handelt es sich hierbei um eine mobile Phase, die auch als Laufmittel bezeichnet wird, und eine stationäre Phase, bzw. ein Träger, auf dem die mobil Phase entlang wandert. Dabei muss vor Versuchsbeginn eine Startlinie eingezeichnet werden, auf die ein Tropfen der zu analysierenden Lösung gegeben wird und eine Linie zur Begrenzung der Lösungsmittelfront.Die verschiedenen zu trennenden Stoffe trennen sich hierbei deshalb, weil sie entweder eine höhere Affinität zur stationären oder zur mobilen Phase haben. Je größer die Affinität zur mobilen Phase, desto näher kommt ein Stoff am Ende der Chromatographie der Laufmittelfront oder verbleibt am Startpunkt, wenn höhere Affinität zur stationären Phase besteht. Unter genormten Versuchsbedingungen legt jede Substanz, die auf eine DC-Platte aufgetragen wird, einen bestimmten Weg zurück (Bei veränderten Bedingungen müssen die Abweichungen beispielsweise in Temperatur, Trägermaterial, etc. angegeben werden). Es kann eine Konstante errechnet werden, indem man das Verhältnis des Weges der Substanz zur Laufstrecke der Lösungsmittelfront angibt. Diese Information nutzt man zur Identifizierung einer Substanz, sowie zum Vergleichen verschiedener Stoffe, wodurch unbekannte Substanzen ermittelt werden können (siehe 8.5.3.)

RF = Entfernung der Substanz zur StartlinieEntfernung der Laufmittelfront zur Startlinie

8.5.2. Experimentelle Durchführung

Chemikalien: Bromkresolgrün, Fuchsin, Fluoreszein, Malachitgrün, Methylrot, Methylenblau à alle 0,05% in Ethanol, Aceton (CH3COCH3), Ethanol (C2H5OH), Essigsäureethylester (CH3CO2C2H5), 100%ige Essigsäure (CH3CO2H), konz. Ammoniaklsg. (NH3)Materialien: DC-Platten, Flachtanks, Filterpapier, Kapillaren

Drei Flachtanks werden an den Seiten mit Filterpapier ausgelegt.In den ersten Flachtank (1) wird ein Laufmittelgemisch gegeben, bestehend aus Ethanol, Aceton und Essigsäureethylester im Verhältnis 1:1:1 (gesamt 20ml).In den zweiten Flachtank (2) wird ein Laufmittelgemisch gegeben, bestehend aus Ethanol, Wasser und Essigsäure im Verhältnis 1:1:1 (gesamt 20ml).In den dritten Flachtank (3) wird ein Laufmittelgemisch gegeben, bestehend aus Ethanol, Wasser und konz. Ammoniak im Verhältnis 1:1:1 (gesamt 20ml).Es werden 3 identische DC-Platten hergestellt, auf welche die 6 Farbstoffe aufgetragen werden, die anschließend in die unterschiedlichen Flachtanks gestellt werden. Auf den Platten muss sowohl die Startlinie, als auch die Lösungsmittelfront, eingezeichnet werden, welche zur Bestimmung der RF-Werte von Nöten sind.Erreicht die Lösungsmittelfront die eingezeichnete Linie werden die DC-Platten herausgenommen, skizziert und die RF-Werte berechnet.

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8.5.2 Ergebnis

Flachtank (1)

Flachtank (2)

Flachtank (3)

Farbstoff RF-Werte1 Methylrot 0,1332 Malachitgrün nicht sichtbar3 Methylenblau nicht sichtbar4 Bromkresolgrün 0,9335 Fuchsin 0,8506 Fluoreszein 0,842

Farbstoff RF-Werte1 Methylrot 0,8332 Malachitgrün 0,8423 Methylenblau 0,6174 Bromkresolgrün 0,9755 Fuchsin 0,9336 Fluoreszein 0,917

Farbstoff RF-Werte1 Methylrot 0,8002 Malachitgrün nicht sichtbar3 Methylenblau 0,0834 Bromkresolgrün 0,7925 Fuchsin 0,6926 Fluoreszein 0,550

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8.5.2 Schlussfolgerung

Besitzt ein zu chromatographierender Stoff ähnliche Polaritäten wie ein Stoff des Laufmittels, so löst er sich gut darin in wandert mit der mobilen Phase. Dies ist der Fall bei Laufmittelgemisch (2), bestehend aus Wasser, Ethanol und Essigsäure. Es besitzt polare Eigenschaften. Hier gilt: Ähnliches löst sich in Ähnlichem. Polare Farbstoffe sind Malachitgrün (C+, Cl-) und Methylenblau (S+, Cl-). Wasser, welches polar ist, kann die Ionenverbindungen der beiden Farbstoffe lösen, es kommt zu Ion-Dipol-Anziehungskräften. Positive und negative Ionen treten in Wechselwirkung. Im Vergleich zu Laufmittel (1), welches polare, aber auch unpolare Eigenschaften hat wandern die polaren Farbstoffe nicht. Im Versuch sind sie nicht sichtbar geworden.

Des Weiteren müssen Aussagen über die Säure-Base-Eigenschaften des Laufmittels und der Farbstoffe getroffen werden. Laufmittel (2) besitzt zusätzlich zu den polaren noch saure Eigenschaften (Essigsäure). Farbstoffe mit basischem Charakter, wie Fuchsin (NH2-Gruppen) reagieren mit dem sauren Laufmittel, indem sie Protonen abgeben. Das hat zur Folge, dass sie mit dem Laufmittel wandern. Dies steht im Gegensatz zu Laufmittel (3), welches basische Eigenschaften hat (Ammoniak). Saure Farbstoffe wie Floureszein und Methylenrot reagieren mit dem basischen Laufmittel. Auch sie wandern weit.

Polare Eigenschaften, sowie Säure-Base-Eigenschaften dürfen jedoch nie komplett voneinander getrennt betrachtet werden. In Kombination lassen sich so die restlichen Farbstoffe erklären, welche die DC-Platten mitgelaufen sind.

8.5.3. Experimentelle Durchführung

Chemikalien: L-Alanin, L-Glutaminsäure, Glycin, L-Leucin, L-Methionin, L-Serin, L-Valin à alle 0,1% in 0,1N HCl, Ethanol (C2H5OH), Essigsäureethylester (CH3CO2C2H5), konz. Ammoniaklsg. (NH3), Ninhydrin-SprühreagenzMaterialien: DC-Platten, Flachtanks, Filterpapier, Kapillaren

Ein Flachtank wird an den Seiten mit Filterpapier ausgelegt.Es wird ein Laufmittelgemisch hergestellt, bestehend aus Essigsäureethylester, konz. Ammoniaklsg. und Ethanol im Verhältnis 3:1:2 (gesamt 40ml).Auf eine DC-Platte werden vier reine Aminosäurelösungen dünn mit den Kapillaren auf die Startlinieaufgetragen. Auf einer zweiten DC-Platte werden drei reine Aminosäurelösungen aufgetragen, sowie eine unbekannte Aminosäurelösung, die 2 verschiedene Aminosäuren enthalten kann. Sie wird von den Assistenten verteilt. Auf den Platten muss sowohl die Startlinie, als auch die Lösungsmittelfront eingezeichnet werden, welche zur Bestimmung der RF-Werte von Nöten sind. Eine Trennung der Aminosäuren erfolgt, indem ein Teil des Laufmittelgemischs in den Flachtank gegeben wird und die DC-Platten an dessen Seiten angelehnt werden, sodass deren Basis mit dem Gemisch befeuchtet wird.Erreicht die Lösungsmittelfront die eingezeichnete Linie werden die DC-Platten herausgenommen.Um die getrennten Aminosäuren sichtbar zu machen müssen die Chromatogramme getrocknet und mit Ninhydrinlsg. besprüht werden. Diese muss ebenfalls trocknen. Die erscheinenden bordeaux bis lila Flecken werden mit dem Bleistift markiert, da es zum Verblassen, als auch zum Auseinanderlaufen der Farben kommen kann. Es werden die unbekannten Aminosäuren bestimmt und die Reaktionen angegeben, auf denen die Färbung der Aminosäuren durch Ninhydrin beruht.

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8.5.3 Ergebnis

Aminosäurelösung RF-Werte Farbe(1a) Analyselösung(1b)

2,5cm : 6cm = 0,41673cm : 6cm = 0,5

lilahelllila

(2) L-Glutaminsäure 1,3cm : 6cm = 0,2167 hellrosaàlila (Farbübergang)(3) L-Valin 2,4cm : 6cm = 0,4 lila(4) L-Tyrosin 3cm : 6cm = 0,5 helllila(5) L-Alanin 2,1cm : 6cm = 0,35 bordeaux(6) L-Arginin 0,75cm : 6cm = 0,125 lila

8.5.3 Schlussfolgerung

Durch die Dünnschichtchromatographie haben sich die beiden unbekannten Aminosäuren voneinander getrennt und sind als zwei übereinander liegende Flecken erkennbar.

RF1a = 0,4167 ~ 0,4 = RF3

RF1b = 0,5 ~ 0,5 = RF4

à In der unbekannten Aminosäurelösung liegen L-Valin und L-Tyrosin vor. Ein Blick auf das Chromatogramm bestätigt die Rechnungen.

Tyrosin Valin

Reaktionsgleichung:Ninhydrin + Aminosäure à Aminoketon + Aldehyd + CO2

LiteraturPraktikum Chemie für Biologen: Anorganische, Organische und Physikalische Chemie für Biologen, von Holger Fleischer, erschienen WS 2004/05, Institut für Anorganische Chemie und Analytische Chemie Johannes Gutenberg-Universität Mainz