Abschlußbericht - cleaner-production.de · Insektizids Carbaryl, und 2.) gegen Isoproturon, ein häufig verwendetes Herbizid. Beim letzteren Beim letzteren handelt es sich um jüngste

Abschlußbericht

Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH Die Verwendung dieses Berichts unterliegt den vertraglichen Vereinbarungen der Vertragspartner. Als vertraulich gekennzeichnete Berichte sind grundsätzlich Verschlußsache. Dateiname: Immunofiaabschlußbericht.doc Version-Nr.: 1 Seite 1 von 61

VERTRAULICH

BMBF Verbundvorhaben:

Entwicklung eines miniaturisierten, immuno-chemischen Fließinjektionssystems für die schnelle Vor-Ort-Analytik von TNT, TNT-Meta-boliten und Pestiziden in Wässern und Böden

Projektlaufzeit: 30.10.2000 – 30.06.2004

Verfasser: Dr.P. Krämer (IÖC)

Dr. G. Kolb (IMM)

Förderkennzeichen: 02 WU 0101, 02 WU 0102 Zuwendungsgeber: BMBF, Bonn Projektträger: Wassertechnologie und Entsorgung,

Außenstelle Dresden

Verteiler extern: Fr. Dipl.-Chem. Iris Bernhardt (Projektträger) Dr. P. Krämer (IÖC) Dr. A.Gerth (WASAG DECON)

Datum: 31.01.2005

IMM Kurzname / PNr: ImmunoFIA / P 98129

Verteiler IMM: Lö, VH, TD, DT, KSD, IFr, GK

Freigegeben von/am:

Abschlußbericht


Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ......................................................................................................................... 2 Kurzzusammenfassung................................................................................................................ 3 Eingehende Darstellung der Projektarbeiten............................................................................. 6 1 AUFBAU UND „“PROOF OF PRINCIPLE“ EINES MIKRO-FIAA-DEMONSTRATORS.......... 7

1.1 Auswahl der Detektionsmethode.............................................................8 1.2 Entwicklung der optischen Messzelle.........................................................11 1.3 Entwicklung des Einwegchips ....................................................................15

1.3.1 Optimierung der Zellengeometrie ........................................................16 1.3.2 Fluidik ...................................................................................................21 1.3.3 Weitere Optimierung der Einwegechips ..............................................22

1.4 Entwicklung des Laborgerätes ...................................................................22 1.4.1 Entwicklung einer Thermostatisierung für das Laborgerät .................25

1.5 Entwicklung des Feldgerätes (Demonstrator) ............................................28 1.6 Handhabung des Laborgerätes und des Feldgerätes ...............................31 Anhang 1.1 Immunofia – Datenblatt und Betriebsanleitung Feldgerät-Demonstrator.....................................................................................................32

2. : ENTWICKLUNG DER IMMUNOREAGENZIEN ................................................................... 35 2.1 Einleitung und Ziel ......................................................................................36 2.2 Die wichtigsten wissenschaftlich-technischen Ergebnisse und andere wichtige Ergebnisse ..........................................................................................37

2.2.1. Entwicklung von mAk für TNT, 2-ADNT und 4-ADNT und Aufbau konven-tioneller ELISAs................................................................................37 2.2.2. Charakterisierung der in-Haus entwickelten mAk für TNT und Amino DNTs..............................................................................................................40

2.3. Arbeiten mit dem Feldgerät - Optimierungen............................................47 2.3 Zielerreichung .............................................................................................53

Zusammenfassender Vergleich des Stands des Vorhabens mit der ursprünglichen (bzw. mit Zustimmung des Zuwendungsgebers geänderten Arbeits-, Zeit und Ausgabenplanung - Teilprojekt 2 .....................................54

Anhang 2.1: Arbeitsanweisung für den Prototypen des Feldgerätes ..............56 3. Bekannt gewordene F&E-Ergebnisse Dritter ...................................................................... 59 5. Angemeldete Schutzrechte ................................................................................................... 59 5. Gesamtliste der Veröffentlichungen, Poster und Vorträge ............................................... 59

5.1 Veröffentlichungen......................................................................................59 5.2 Poster ..........................................................................................................59 5.3 Vorträge.......................................................................................................60

6. Vorstellung des Feldgerät-Demonstrators auf Messen und Pressearbeit (IMM)............ 61

Abschlußbericht


Kurzzusammenfassung

Aufgabenstellung Die schnelle, einfache, umweltverträgliche und kostengünstige Analyse von 2,4,6-Trinitrotoluol (TNT), TNT-Metaboliten und Pestiziden in Wässern (z.B. Grund-, Oberflächenwasser) und Böden ist eine wichtige Aufgabe im Bereich ‘Fieldscreening’. Daher war es das Ziel dieses Projektes, ein miniaturisiertes Fließinjektionssystem auf immunochemischer Basis für die schnelle Analyse dieser Substanzen zu entwickeln. Das Gerät sollte aus einer Systemplatte (Basis) und einem Einwegchip zusammengesetzt sein. Die Systemplatte sollte Mikropumpen, Kanäle und einen mikrooptischen Detektor enthalten, sowie eine Temperierung der Immunoaffinitätssäule ermöglichen. Der Einwegchip, vorzugsweise aus Polymer sollte Strukturen enthalten, welche mit Antikörpern beschichtet die Immunoaffinitätssäule bilden. Außerdem sollte je ein Reservoir für Enzym-Tracer und Probe integriert werden. Dieser Sensorchip sollte kostengünstig, in größeren Mengen produzierbar und lagerstabil sein, d.h. seine Herstellung musste im Hinblick auf Immobilisierung, Stabilisierung und Realisierung in größeren Stückzahlen optimiert werden. Voraussetzungen Dieses Ziel wurde durch die Kooperation der drei Projektpartner, Technische Universität München (TUM), Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH (IMM) und WASAG DECON GmbH erreicht. Während die TUM für die Entwicklung der Immunoreagenzien zuständig war, entwickelte das IMM zunächst – zusätzlich zu den im Projektantrag vorgesehenen Arbeiten –einen Laborprototypen des Analysengerätes und schließlich den Demonstrator eines Feldgerätes. Beide Geräte wurden an der TUM mit den dort entwickelten Reagenzien erfolgreich im Labor betrieben und kamen gegen Ende des Projektes auch beim Industriepartner zum Einsatz. Planung und Ablauf des Vorhabens Während TUM bereits unmittelbar zu Projektbeginn mit den Arbeiten zu den Immunoreagenzien begann, wurde am IMM zunächst das Herzstück des Analysengerätes – die optische Messzelle - entwickelt. Verschiedene Designs dieser Messzelle wurden in Zusammenarbeit mit der TUM vom IMM gefertigt und von der TUM getestet. Ein Laborprototyp des Gerätes wurde am IMM entwickelt und zusammen mit der TUM optimiert. Schließlich wurde ein Feldgerät-Demonstrator realisiert, der zunächst bei der TUM in Betrieb genommen wurde und gegen Ende des Projektes auch noch beim Industriepartner zum Einsatz kam. Stand der Wissenschaft und Technik, an den bei Projektbeginn angeknüpft wurde; Immunochemische Analyseverfahren Immunochemische Methoden zur Bestimmung von Schadstoffen in Wässern haben in den letzten Jahren an Bedeutung für die Umweltanalytik gewonnen. Die Vorteile dieser Methoden gegenüber etablierten, chromatographischen Verfahren liegen in deren hoher Selektivität und Sensitivität bei vergleichsweise geringen Kosten. Letztere erlaubt es, beispielsweise Pestizide direkt in Wässern, ohne Anreicherungsschritte, bestimmen zu können. Als konventionelle Methoden zur Analytik von TNT, TNT-Metaboliten und Pestiziden in Wässern werden derzeit vor allem chromatographische Methoden, wie HPLC, TLC, GC / MS oder GC / ECD, eingesetzt, die routinemäßig in Wasserlabors angewendet werden. Zur Kontrolle der Einhaltung der Europäischen Trinkwasser Richtlinie von 0,1 µg/l für Pestizide sind jedoch Probenanreicherungs- (Faktor 1000) und Derivatisierungsschritte notwendig, die die Analysezeit erhöhen und den Automatisierungsgrad herabsetzen.

Abschlußbericht


Mikrosysteme und -komponenten für die Feldanalytik Der ständig wachsende Zeit- und Kostendruck im Bereich der Umweltanalytik, sowie die wachsende Anzahl von Laborproben fordern die Entwicklung neuer Analysentechniken, die es erlauben, direkt vor Ort, schnell und kostengünstig quantitative, semiquantitative oder auch nur qualitative Aussagen über Schadstoffgehalte in Böden, festen Abfällen, Wasser oder Luft zu machen. Geräte und Hilfsmittel für die Vor-Ort-Analytik (Feldanalytik) müssen demnach portabel und robust sein und bei geringem Energie- und Chemikalienverbrauch schnell das geforderte Analysenergebnis anzeigen. In den letzten Jahren wurden eine Reihe miniaturisierter Komponenten und systeme für analytische Anwendungen entwickelt. Einen Schwerpunkt bildete dabei die Entwicklung von miniaturisierten Detektoren und Sensoren für eine Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen, die nach spektroskopischen (UV/ VIS, IR) bzw. elektrochemischen Methoden (voltammetrisch, amperometrisch) oder Verfahren der Massebestimmung (Quarzmikrowaage) arbeiten. Alle naßchemischen Analyseverfahren basieren auf dem Mischen von Probe und Reagenz mit anschließender Reaktion zu einem einfach nachzuweisenden Derivat. Demnach werden auch miniaturisierte Komponenten zum Fördern von Gasen und Flüssigkeiten durch Mikrokanäle und Strukturen zum Mischen mehrerer Substanzen benötigt. Aufbauend auf dieser Entwicklung von Mikrokomponenten wurden Konzepte entwickelt, um komplexe Analysensysteme, sogennante Micro Total Analysis Systems (µTAS) oder Lab- on- Chip- Systeme, auf kleinstem Raum zu realisieren. Solche Systeme integrieren fluidische Strukturen zur Trennung, Anreicherung oder Derivatisierung der Probe mit entsprechenden Strukturen zur Detektion. Bisher wurden auf diese Weise planare Systeme zur elektrophoretischen Trennung ionischer Verbindungen, wie DNA und Proteine mit anschließender optischer Detektion (Fluoreszenzspektrometrie) in verschiedenen Materialien hergestellt. Immunosensoren für Nitroaromaten Bisher wurde in den USA vom Naval Research Laboratory, Washington, DC., ein Immunosensor für Nitroaromaten entwickelt, der auf Fiberoptik (Transducer) basiert. Hier wurden TNT-Antikörper auf einer Glasfaser (z.B. 600 µm) kovalent immobilisiert. Von Research International, Woodinville, WA, USA wurde ein Gerät gebaut (Analyte 2000), das mit 4 Fasern gleichzeitig messen kann. Als Anregungslicht wird dabei ein Diodenlaser verwendet und ein Photodiodendetektor dient zur Detektion. Das System wird mit einem Laptop Computer kontrolliert und basiert auf einer Evaneszenz- Feld- Messung, wobei der Farbstoff Cy5 als Marker eingesetzt wird (Cy5-EDA-TNB als fluoreszenz-markiertes Hapten; Cy5-EDA, Cyanin 5-ethylendiamin; TNB Trinitrobenzol). Die Grundlage des Meßverfahrens ist die Konkurrenz des freien Analyten in der Probe mit dem Cy5-EDA-TNB um die Bindungsstellen der TNT-Antikörper (mab 11B3; Immunogen: TNB-Ovalbumin), die auf der Glasfaser immobilisiert sind. Das maximale Signal wird erreicht, wenn kein TNT in der Probe ist, da hier die maximale Menge an Cy5-EDA-TNB an den Antikörpern auf der Faser bindet. Ist TNT in der Probe vorhanden, dann verringert sich das Fluoreszenzsignal. Die Faser kann wieder regeneriert werden (ca. 20 mal; 50% Ethanol in PBS, 1 min), so daß eine reversible Arbeitsweise möglich ist. Der linearen Konzentrationsbereich für den TNT- Antikörper AK 11B3, der in Wasser gemessen werden kann, erstreckt sich von 20-3500 µg/L. Kommerzielle Test-Kits für Nitroaromaten Auf dem deutschen Markt sind Test-Kits für TNT kommerziell verfügbar. Diese wurden entweder in Deutschland oder in den USA entwickelt. Die Nachteile aller Test-Kits bestehen darin, dass die Durchführung - und vor allem auch die Interpretation - von geschultem Personal durchgeführt werden muss, dass sie relativ viel Zeit beanspruchen (z.T. mehr als 1 Stunde) und dass sie relativ viel Abfall (vor allem in Form von Plastik) verursachen. Solche Test-Kits sind z.T. nur für die Anwendung vor Ort entwickelt worden oder sind noch nicht optimal hierfür geeignet. Das einzige, für Vor-Ort-Untersuchungen konzipierte Test-Kit ist das sogenannte DTech Kit, dessen Produktion aber Anfang 1999 aus unbekannten Gründen eingestellt wurde.

Abschlußbericht


Arbeiten der Projektpartner vor Projektbeginn Immunoassay- Methoden für die Umweltanalytik (GSF bzw. TUM) Bisherige Arbeiten des Projektpartners am Institut für Ökologische Chemie beinhalteten die Herstellung von polyklonalen Antikörpern (Antiseren) gegen 1.) 1-Naphthol, ein Metabolit des Insektizids Carbaryl, und 2.) gegen Isoproturon, ein häufig verwendetes Herbizid. Beim letzteren handelt es sich um jüngste Arbeiten, die noch in Bearbeitung sind und bisher nur in Form eines Posters veröffentlicht wurden. Weitere Arbeiten, die vom Partner im Bereich Immunoanalytik bereits durchgeführt wurden, umfassen die Integration von LC (Liquid Chromatography) mit Immunoassay als selektivem Detektor für verschiedene 4-Nitrophenole und die Validierung von Immunoassay Test-Kits für TNT und PAH für den Altlastenbereich. Auf der Basis immunochemischer Prinzipien wurde in den zurückliegenden Jahren die Methode der Fließinjektionsimmunoaffinitätsanalyse (FIIAA) entwickelt und kontinuierlich verbessert. Auf Grund ihrer hohen Sensitivität ist diese Methode zur Direktbestimmung von Pestiziden in Wässern geeignet und erlaubt es, Konzentrationen von 0,02 µg/l noch sicher zu bestimmen. Die Methode beruht auf einem kompetitiven Immunoassay. Dabei werden über Protein A an ein Säulenmaterial gebundene Antikörper mit der Probe inkubiert und anschließend ein Enzym-Tracer dazugegeben, der an die freien Antikörperbindungsstellen bindet. Die Enzymreaktion unter Bildung eines (Fluoreszenz-) Farbstoffs wird letztendlich zur Detektion ausgenutzt. Das Fluoreszenz- oder Absorptionssignal ist proportional der Enzym-Tracer Konzentration und darum, infolge des Kompetitionsprinzips, umgekehrt proportional zur Analytkonzentration. In Zusammenarbeit mit der Meta Messtechnische Systeme GmbH, Altenberge, wurde bereits ein Prototyp-FIIAA-System aufgebaut, das zwei Pumpen, zwei Injektions- und zwei Selektionsventile, sowie die temperierte Immunoaffinitätssäule und einen kommerziellen Fluoreszenzdetektor enthält. Das Gerät ist im 19"-Rack-Format aufgebaut (L x B x H: ca. 48 cm x 40 cm x 30 cm) und wurde innerhalb eines EU- Projektes (Programm Life) zur on-line Kontrolle und als Laborautomat verwendet. Die Analysezeit beträgt etwa eine Stunde und es kann nur jeweils ein Analyt, z.B. Atrazin oder Diuron, gemessen werden. Mikrotechnik für den Einsatz in Analysegeräten (IMM) Am Institut für Mikrotechnik in Mainz wurden und werden eine Reihe von Mikrostrukturierungsverfahren für verschiedene Materialien entwickelt und angewendet. Neben der Entwicklung von Verfahren wurden am Institut auch Anlagen zur Herstellung von Mikrostrukturen, wie z.B. ein Röntgenscanner für die Tiefenlithographie (zusammen mit der Fa. Jenoptik), eine Galvanikanlage zur Mikrogalvanoformung metallischer Strukturen (zusammen mit der Fa. Kissler) und Anlagen zur Mikrofunkenerosion (zusammen mit der Fa. Agie) entwickelt, die kommerziell erhältlich sind. Diese Entwicklung dient vor allem der Erweiterung der Palette an Materialien, die mikrostrukturiert werden können. Ein wesentlicher Aspekt der Entwicklung von Herstellungsverfahren ist auch, Mikrostrukturen kostengünstig in größeren Stückzahlen herstellen zu können. Der LIGA-Prozeß erlaubt es beispielsweise, eine Vielzahl von Polymerstrukturen durch Mikrospritzguß abzuformen. Die Zykluszeiten liegen dabei im Bereich weniger Minuten. Analog der Entwicklung von Batch-Fertigungstechnologien in der Mikroelektronik wurde am IMM die Plastics Wafer Technologie entwickelt. Dabei werden viele Mikrostrukturen auf einer Fläche einer konventionellen Compact Disk in einem Arbeitsgang hergestellt. Die Handhabung dieser "Plastics Wafer" erlaubt dann die standardisierte Magazinierung und Mikromontage unter Verwendung des Wafers als Montageplattform. Damit werden Voraussetzungen zur automatisierten Fertigung komplexer Mikrostrukturen geschaffen. Für viele Anwendungen im Bereich Chemie, Biochemie und Analytik werden hohe Anforderungen an die verwendeten Materialien hinsichtlich Säure-, Base- und Lösungsmittelstabilität gestellt. Neben Quarz und Glas finden auch eine Reihe von Polymermaterialien, wie PTFE, PVDF, POM und PEEK Anwendung. Die Eignung von Polymermaterialien für die Mikroabformung ist jedoch sehr unterschiedlich.

Abschlußbericht


Neben massenproduktionstauglichen Fertigungsverfahren werden am IMM auch Verfahren zum Rapid Prototyping zur Herstellung von Mikrostrukturen angewendet. Beispielsweise lassen sich dreidimensionale Mikrostrukturen ausgehend von CAD-Daten einfach durch Laserablation in Polymeren erzeugen. Bekannte Konstruktionen, Verfahren und Schutzrechte wurden im Projekt nicht eingesetzt. Eine Aktualisierung der Fachliteratur befindet sich in Kap. 3.9 und Anhang 3.3.

Eingehende Darstellung der Projektarbeiten

Im Folgenden sind die erzielten Ergebnisse der einzelnen Teilprojekte detailliert dargestellt (Kap.1 bis Kap.2). Der Bericht der WASAG DECON wurde hier nicht aufgenommen, da er bereits vor Abgabe des vorliegenden Berichtes ohne Abstimmung mit dem Projektkoordinator (IMM) an den Projektträger übermittelt wurde. Die Darstellung der Wirtschaftlichkeitsbetrachtung und Designverbesserungsvorschläge sind dem Bericht der WASAG DECON zu entnehmen. Die Darstellung des Fortschrittes auf dem Gebiet des Vorhabens bei anderen Stellen ist ebenfalls dem Bericht der WASAG DECON sowie Kap. 3 zu entnehmen. Die erfolgte Patentanmeldung ist Kap.4 zu entnehmen Eine Liste der Veröffentlichungen ist in Kap.5 zusammengefasst. Darüber hinaus wurde der Feldgerät-Demonstrator durch das Marketing des IMM im Sinne des Verwertungsplans auf mehreren Messen vorgestellt und Informationen über das Gerät der Presse zugänglich gemacht. Die Messeaktivitäten des IMM und die Presseresonanz sind in Kap.6 kurz zusammengefasst. Die Versuche, einen Geldgeber für die Weiterentwicklung des Gerätes zur Serienreife zu finden, waren bis dato nicht von Erfolg gekrönt.

Abschlußbericht


Teilprojekt:: 1 AUFBAU UND „“PROOF OF PRINCIPLE“ EINES

MIKRO-FIAA-DEMONSTRATORS

Verfasser: Dr. Gunther Kolb (IMM)

Zuwendungsempfänger: Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH

Förderkennzeichen: 02 WU 0101

Abschlußbericht


1.1 Auswahl der Detektionsmethode

Die Auswahl einer geeigneten Detektionsmethode wurde von der Zielsetzung bestimmt, ein Feldsystem für schnelle, umweltverträgliche und kostengünstige Analysen chemischer Stoffgruppen bzw. Einzelsubstanzen zu entwickeln. Die Detektionsmethode sollte daher:

• Eine Realisierung aus weitestgehend kommerziell erhältlichen Komponenten ermöglichen.

• Einen sicheren Nachweis der chemischen Substanzen im Konzentrationsbereich um 0.1 µg/l gewährleisten.

• Eine kostengünstige Produktion auch in größeren Stückzahlen erlauben.

Zu Projektbeginn und in ersten Projektbesprechungen wurden die Detektion mittels Fluoreszenz im sichtbaren Bereich und mittels Chemilumineszenz als Alternativen diskutiert. Eine Literaturrecherche ergab, dass beim Einsatz von Chemilumineszenz in der Literatur direkte und indirekte Detektionsverfahren beschrieben sind, mit denen Nachweisgrenzen von 0,1 µg/l prinzipiell realisierbar sind.

Zur Bestimmung von Nitroaromaten bzw. deren Metaboliten auf der Basis eines Immunoassays bietet sich ein Peroxidasesystem (POD) an. Als Substrat der Enzymreaktion findet hierbei Luminol Verwendung, das von POD in Gegenwart des Kosubstrates Wasserstoffperoxid über zwei Intermediate zu 3-Aminophtalat umgesetzt wird. Beim letzten Schritt dieser Reaktionsfolge wird Licht im sichtbaren Bereich des Spektrums als Chemilumineszenz mit einem Maximum bei etwa 425 nm abgestrahlt. Gegenüber einer reinen Fluoreszenzmarkierung des Analyten im kompetitiven Immunoassay stellt diese enzymkatalysierte Reaktion eine Amplifikation dar, wodurch sehr viel niedrigere Detektionsgrenzen erreicht werden können. Gegenüber enzym-katalysierten, fluorogenen Reaktionen ist vorteilhaft, dass hier auf eine Anregungslichtquelle verzichtet werden kann und die emittierte Strahlung im sichtbaren Bereich des Lichtes liegt. Daher wurde die Chemilumineszenz als Detektionsmethode ausgewählt. Das Messprinzip der Chemilumineszenz, das letztendlich bei dem Analysengerät realisiert wurde, ist in Abb.1.1 zusammenfassend dargestellt. Daraus resultiert eine spezifische Vorgehensweise beim Durchführen einer Analyse. Abb. 1.2 – 1.6 zeigt die Arbeitsschritte, die von dem Analysengerät abgearbeitet werden müssen. Die schematische Darstellung ist weitgehend maßstabsgerecht und lehnt sich bereits stark an das nachfolgend entwickelte Design des Gerätes an: 1. Spülen der Fluidkanäle mit Pufferlösung (Abb. 1.2) 2. Spülen der Probenzuführung mit frischer Probe (Abb. 1.3) 3. Aufbringen der Probe auf die Messzelle (Abb. 1.4) 4. Aufbringen des Enzymtracers auf die Messzelle (Abb. 1.5) 5. Spülen der Messzelle mit Substrat für die Enzymreaktion (Abb. 1.6) 6. Messung Bereits im Projektantrag war vorgesehen gewesen, das Gerät in einen fest installierten Teil (sog. „Basisplatte“) und einen auswechselbaren Teil, den „Einwegchip“ zu unterteilen. Dieses Konzept wurde bei der Realisierung beibehalten. Im Folgenden wird die Entwicklung der einzelnen Systemkomponenten wie Messzelle und Einwegchip beschrieben und schließlich die Realisierung der beiden Analysengeräte (Laborprototyp und Feldmessgerät-Demonstrator) dokumentiert.

Abschlußbericht


Struktur mit Protein A, A/G oder Ziege anti-MausAntikörpern belegen

- Zugabe von Enzym-Tracer und Inkubation

- Spülschritt

- Zugabe von Analyt (Standard oder Probe) und Vorinkubation

- Spülschritt

- Zugabe von Anti-Analyt-Antikörpern und Inkubation

1.

2.

3.

4.

5.- Messung der Chemilumineszenz

- Spülschritt

- Zugabe von Substrat für die Enzymreaktion

Abb.1.1 Messprinzip der Chemilumineszenz

Abschlußbericht


Abb. 1.2 Spülen mit Puffer Abb. 1.3 Spülen mit Probe

Abb. 1.4 Aufbringen der Probe Abb1.5 Aufbringen Enzymtracer

Abschlußbericht


Abb. 1.6 Spülen mit Substrat

1.2 Entwicklung der optischen Messzelle

Die optische Messzelle beinhaltet eine mikrostrukturierte und mit Gold beschichtete Oberfläche, welche die Abstrahlung der Chemilumineszenz auf den Detektorbereich fokussiert (siehe Abb. 1.7). Das Messprinzip ist eine Verdrängungsmessung, bei der umso weniger Licht durch die Chemiluminszenzreaktion erzeugt wird, je mehr Analyt die Antikörper belegt hat. Dadurch stehen dem nachfolgend aufgebrachten Enzym weniger freie Antikörper zum Anlagern zur Verfügung und es verbleibt weniger Enzym in der Messzelle.

Dieser prinzipielle Aufbau wurde durch optische Simulationen mit dem Programm OptiCAD weiter optimiert. Die Ergebnisse zeigen, dass eine pyramidal strukturierte und verspiegelte Oberfläche in der Lage ist, statistisch ausgerichtete Strahlen in die Detektorrichtung umzulenken (siehe Abb. 1.8). Zur Überprüfung dieser Simulationen wurden auf PMMA-Wafern mittels einer Ultra-Präzisionsfräse vier Vergleichsstrukturen / -oberflächen hergestellt: • Polierte Oberflächen • Pyramidenstrukturen mit den Aspektverhältnissen (d.h. Höhe zur Seitenlänge der

Basisfläche) 0,5, 1 und 2. Aus diesen strukturierten Wafer wurden anschließend Pellets von 6,2 mm Durchmesser vereinzelt und diese dann teilweise vergoldet (s. Abb. 1.9-1.13). Insbesondere die Pyramidenstruktur mit dem Aspektverhältnis 2 (höchste Pyramiden) stellte die größte Herausforderung an die Frästechnik dar. Während es gelang, bis zu einem Aspektverhältnis von 1 gratfrei zu fräsen (s. Abb. 1.14), konnte beim Aspektverhältnis von 2 deutlicher Gratwurf an den Pyramidenkanten beobachtet werden (Abb. 1.15). Zur Stabilisierung der Goldbeschichtung wurden Chrom und Titan als Haftvermittler zwischen PMMA und Goldschicht getestet, wobei sich Chrom als optimaler Haftgrund erwies. Durch den Einsatz des Chroms können nunmehr alle Strukturen blasenfrei beschichtet werden.

Abschlußbericht


Detektorkopf

Polymer Substrat

Goldschicht Receptor

Fließrichtung der Probe

Polymersubstrat

Gold-schicht

Rezeptor

(hν)max(hν)red

Detektorkopf

Polymer Substrat

Goldschicht Receptor

Fließrichtung der Probe

Polymersubstrat

Gold-schicht

Rezeptor

Polymersubstrat

Gold-schicht

Rezeptor

(hν)max(hν)max(hν)red

Abb.1.7: Schematischer Aufbau der optischen Detektionszelle.

1) 2)

Abb. 1.8: Simulation der optischen Detektionszelle. Die Graphiken zeigen den Einfluß der geometrischen Ausgestaltung der Mikrostrukturierung, d.h. Variation von Strukturhöhe und Neigungswinkel, auf die zu beobachtende Strahlfokussierung.

Enzym Polymer

Analyt

Ohne Analyt (Blindmessung)

Mit Analyt

Abschlußbericht


Abb. 1.9: Vereinzelte Strukturen, Oberfläche

poliert und unvergoldet. Abb. 1.10: Vereinzelte Strukturen, Aspekt-

verhältnis 0,5 und unvergoldet.

Abb. 1.11: Vereinzelte Strukturen, Aspekt-

verhältnis 2 und unvergoldet. Abb. 1.12: Vereinzelte Strukturen,

Oberfläche poliert und vergoldet.

Abb. 1.13: Vereinzelte Strukturen, Aspektverhältnis 1 und vergoldet.

Abschlußbericht


Abb. 1.14: REM-Aufnahme von Pyramiden-

strukturen mit gekappter Spitze – Aspektverhältnis 1.

Abb. 1.15: REM-Aufnahme von Pyramiden mit Aspektverhältnis 2 und gekappter Spitze.

Insgesamt wurden – um auch Wiederholungsmessungen zu ermöglichen - 128 Pellets in Non-binding-Titerplatten eingeklebt und der TUM für Messungen an dem dortigen Lumineszenz- bzw. Absorptions-ELISA-Reader übergeben. Die dortigen Messungen ergaben unter anderem, dass das Aspektverhhältnis 1 die besten Ergebnisse erzielte. Daher wurden später nur noch entsprechende Messzellen gefertigt. In Hinblick auf eine spätere Massenproduktion durch thermische Verfahren wie Spritzgießen oder Prägen wurden einige Vorversuche durchgeführt. Diese sollten zunächst die Machbarkeit derartig kleiner Strukturen mittels einer dieser Fertigungstechniken aufzeigen. Dazu wurde ein Formteil mit einzelnen Pyramidenstrukturen von 300 µm Kantenlänge im Heißprägeverfahren auf eine PMMA-Platte abgebildet. Dadurch entstanden pyramidenförmige Kavitäten im Kunststoff. Wie man in Abb. 1.16 sehen kann, sind die hierbei erzielten Ergebnisse recht vielversprechend.

Abb. 1.16: Im Heißprägeverfahren hergestellte pyramidenförmige Kavitäten.

Abschlußbericht


1.3 Entwicklung des Einwegchips Der entwickelte Einwegchip enthält die empfindlichsten und verderblichen Komponenten – nämlich die biologisch aktiven Substanzen – bereits in definierten Mengen für jeweils eine Messung dicht verschlossen und damit lagerfähig. Während der Herstellung der Einwegchips und der Kleinserienfertigung für die Experimente an der TUM – es wurden mehr als 60 Chips unterschiedlicher Konzeption gefertigt – zeigte sich, dass die Fertigungskosten auch bei späterem Einsatz von Spritzgussverfahren nicht ausreichend gesenkt werden können, um eine einmalige Nutzung wirtschaftlich zu machen. Daher wurde an der TUM die Regenerierung der Chips getestet, die sich als begrenzt machbar erwies (siehe Kap.2 – Bericht TUM).

Abb. 1.17: Der Einwegchip (Explosionszeichnung); montiert befindet sich die gezeigte Seite unten

Der Einwegchip, dessen Aufbau in Abb.1.17 dargestellt ist, enthält folgende Komponenten: - ein Probenvorratsvolumen, das von oben befüllt wird (es befindet sich in Abb.1.17 auf der

Rückseite), - eine Mäanderstruktur, in der der Enzymtracer gelagert wird, - die Meßzelle, die ihrerseits aus den Pyramidenstrukturen, beladen mit den Antikörpern, der

Abdeckfolie und den fluidischen Zu- und Abführsystem besteht. Die Probenvorratskammer, der Mäander für den Enzymtracer und die Meßzelle wurden Abdeckplatten verschlossen. Zunächst wurden die transparenten Folien auf den Chip mittels Laser aufgeschweißt.

nicht sichtbar: Probenvorrat

Mäander mit Enzymtracer

Dichtungsscheiben der Anschlüsse

Pyramidenstruktur in der Messzelle

Obere Abdeckplatte

Untere Abdeckplatte

Abschlußbericht


1.3.1 Optimierung der Zellengeometrie Es wurden zunächst sowohl runde als auch quadratische Grundflächen der Pyramidenstrukturen hergestellt, um die optimale Geometrie experimentell zu ermitteln. Der Durchmesser der runden Zellen entsprach dabei genau dem optischen Eingang des Messgerätes, eines hochempfindlichen Photomultipliers. Um eine möglichst gleichmäßige Durchströmung der Messzelle zu gewährleisten und das Auftreten von Totvolumina zu vermeiden, wurden die Pyramidenreihen diagonal eingebracht. Außerdem wurden in der Fluidzuführung der quadratischen Ausführung drei Strömungsbrecher angeordnet (siehe Abb.1.18). Diese relativ einfachen Maßnahmen basieren auf Simulationsergebnissen des IMM, die bei ähnlichen Problemstellungen gewonnen worden waren.

Abb. 1.18: Einbindung der Pyramidenstruktur in die Meßzelle Abb.1.19 zeigt Chips in runder und quadratischer Ausführung, die in der frühen Phase des Projektes noch laserverschweißt wurden. Abb.1.20 und 1.22 visualisieren die Geschwindigkeitsverteilung in quadratischen bzw. runden Messzellen. Gleiche Farben entsprechen gleichen Geschwindigkeiten, was auf eine höchst gleichmäßige Strömung in den Zellen hinweist. Hauptziel der Simulationen war es, den Zeitbedarf für ein vollständiges Leerspülen der Messzelle bei gegebenem Volumenstrom der Pufferlösung zu ermitteln. Es zeigte sich, wie Abb. 1.21 und 1.23 belegen, dass nach 40 s Spülen bei einem Spülstrom von 400 µl/min die quadratische und nach 20 s die runde Messzelle vollständig entleert sind. Dies ist eine wichtige Zeitkonstante für die späteren Messungen. Bei der praktischen Durchführung von Messungen durch die TUM zeigte sich, dass beim Aufsetzen der Chips eingeschlossene Luftblasen aus den runden Messzellen leichter ausgespült werden konnten, so dass später nur noch runde Messzellen gefertigt werden.

Dichtungsscheibe Strömungsbrecher

Durchflußrichtung

Richtung der optischen Signale

Abschlußbericht


Abb.1.19: Einwegchips mit runder und quadratischer Meßzelle

Abb.1.20 Geschwindigkeitsverteilung in der quadratischen Messzelle; Aspektverhältnis

der Pyramiden: 1

Abschlußbericht


10 100

0,01

0,1

1

Flow rate=400µl/min Flow rate=200µl/min y=2.72622-3.04911x y=3.49548-2.9285x

Res

idua

l por

tion

(log1

0)

Time (s -log10)

Abb.1.21: Restanteil der ursprünglich vorliegenden Flüssigkeit; quadratische Meßzelle

Abb.1.22 Geschwindigkeitsverteilung in der runden Messzelle; Aspektverhältnis der

Pyramiden: 1

400 µl/min: 40 Sek. 200 µl/min: 100 Sek.

Abschlußbericht


Abb.1.23 Restanteil der ursprünglich vorliegenden Flüssigkeit; runde Meßzelle

1.3.1.1 Vergrößerung des Volumens der Messzelle Im Standardverfahren erfolgt der Einbau der Pyramidenstrukturen so, dass die Spitzen der Pyramiden mit der darüber befindlichen Deckelfolie bündig abschließen. Mit dem Ziel, das Volumen der Messzelle zu vergrößern und damit das Messsignals zu erhöhen, wurden auf Anregung der TUM Chips mit einem definierten Abstand zwischen Pyramidenspitzen und Deckelfolie gefertigt. Um den Anteil der Flüssigkeit zu ermitteln, der bei diesen Chips die Messzelle passiert ohne dabei mit der Oberfläche der Pyramidenstruktur in Kontakt zu treten wurden zunächst numerische Simulationen eines Strömungskanals durchgeführt (s. Abb.1.25). Dieser Strömungskanal ist stellvertretend für die Gesamtoberfläche der Pyramidenstruktur. Anhand dieses Strömungskanals kann, bei konstantem Durchfluss, ein Geschwindigkeitsprofil über die Vertikale erstellt werden. Dies lässt Rückschlüsse auf die Verteilung bei unterschiedlichen Abständen von Deckelfolie und Pyramidenstruktur zu. Erwartungsgemäß zeigte sich, dass bei größeren Abständen der Hauptteil der Flüssigkeit ungenutzt über die Pyramidenstruktur hinwegströmt, wie aus Abb.1.26 ersichtlich wird. Praktische Versuche, die mit einem transparenten Chip und gefärbten Flüssigkeiten durchgeführt wurden, bestätigten die Simulationsergebnisse. Bei den vorherrschenden laminaren Strömungsbedingungen ist die Tendenz zur Durchmischung der Flüssigkeiten klein. Dagegen überwiegt eine Überschichtung der Flüssigkeiten im relevanten Bereich der Pyramidenstruktur. Da auf der Pyramidenstruktur sämtliche relevanten Reaktionen ablaufen und die zur Verfügung stehenden Substanzmengen begrenzt sind, können derartige „Bypass-strömungen“ nicht

10

0,01

0,1

1

Flow Rate=400µl/min Flow Rate=200µl/min y=2.05072-3.22003x y=2.77153-2.97049x

Res

idua

l por

tion

(log1

0)

Time (s- log10)

400 µl/min: 30 Sek. 200 µl/min: 60 Sek.

Abschlußbericht


toleriert werden. Es war auch nicht praktikabel, die Halte- bzw. Inkubationszeiten entsprechend zu verlängern, da diese im Gesamtprozess minimiert werden sollten. Daher wurden keine weiteren Chips mit einem vergrößerten Volumen der Messzelle hergestellt.

Abb.1.25: Strömungskanal durch die Pyramidenstruktur

Abb.1.26: Geschwindigkeitsprofile bei zunehmender Höhe des freien Kanals oberhalb der Pyramiden der Messzelle

Abschlußbericht


1.3.2 Fluidik Die Probenvorratskammer der Chips (hier nicht gezeigt) ist konisch geformt, um eine vollständige Entleerung zu ermöglichen. Da sich bei den Chips der ersten und zweiten Generation keine vollständige Entleerung des Probenreservoirs innerhalb des normalen Betriebsumfeldes realisieren lies, musste eine praktikable Lösung gefunden werden. Dabei standen zwei Varianten zur Wahl: 1. Mikrostrukturierung der Oberfläche, die ein Abperlen der Probenflüssigkeit von den Rändern begünstigt. 2. Anti-adhäsive Beschichtung. Die erste Variante ließe sich relativ einfach realisieren, sobald der komplette Chip in einem Spritzgussverfahren hergestellt wird. Sie ist jedoch bei der hier angewandten Einzelanfertigung zu aufwendig. Eine Strukturierung durch eine spanende Methode oder durch eine Abtragung mittels Laserablation bzw. eine Abformung mittels Heißprägen hätte den Zeit- und Kostenrahmen des Projektes gesprengt. Aus diesem Grund wurden die Flächen der Probenreservoirs zunächst poliert und anschließend mit PTFE beschichtet, was das Entleerungsverhalten stark verbesserte. Alle Fluideingänge und -ausgänge wurden durch spezielle Silikondichtungsscheiben verschlossen, die eine einfache und luftfreie Befüllung des Enzymtracers und der Messzelle mittels Spritzen erlauben. Die Chips wurden dann mittels Schrauben und Flügelmuttern an die Basisplatte montiert. Die fluidischen Verbindungen wurden zunächst über Injektionsnadeln hergestellt, die in der Basisplatte eingeklebt waren. Später wurden HPLC-Schlaucholiven eingesetzt, die in der Basisplatte verschraubt und eingeklebt waren (s. Abb.1.27). Diese Verbindungstechnik ließ sich einfacher handhaben als die ursprünglich vorgesehenen Nadeln und verhinderte den Eintrag von Silikonpartikeln beim Eindringen der Nadeln in die Septen. Die Septen wurden für den Einsatz mit Schlaucholiven perforiert und mit Folie abgedichtet, um die Flüssigkeiten im Chip zu halten.

Abb.1.27 Fluidische Verbindung Einwegchip – Basisplatte mit Schlaucholiven

(1)

Abschlußbericht


Für das Laborgerät wie für das tragbare Messgerät wurde dasselbe Chipdesign gewählt.

1.3.3 Weitere Optimierung der Einwegechips Bei der Herstellung weiterer Einwegechips wurden zunächst die Fertigungstoleranzen der spanenden Bearbeitung enger gesetzt. Außerdem konnten dank zunehmender Routine im manuellen Zusammenbau der Chips, wie dem Ausrichten und Einkleben der Pyramidenstruktur, deutliche Verbesserungen bzgl. der Fertigungsgenauigkeit erreicht werden. Es wurde zunächst mit Silikon, dann mit Acetylaceton eingeklebt.

1.4 Entwicklung des Laborgerätes Es wurde zunächst ein Laborgerät entwickelt, das nur die wesentlichen Bestandteile des Analysengerätes enthält. Für dieses Gerät wurde auf die autarke Stromversorgung, die kompakte Bauweise und zunächst auch auf die Klimatisierung verzichtet. Abb.1.27 zeigt das "Herz" des Laborgerätes, die Basisplatte, die zunächst wie hier gezeigt, aus zwei PMMA Platten gefertigt wurde. Eine der Hälften der Basisplatte wurde aus transparentem PMMA gefertigt, die andere aus schwarzem, da zunächst auch hier Laserschweißen als Verbindungstechnik und zum Abdichten der Fluidkanäle zum Einsatz kommen sollte. Später wurde jedoch, wie bei dem Chip (s. Kap. 1.3), wegen auftretender Undichtigkeiten die transparente Hälften der Basisplatte durch eine Folie ersetzt. Schließlich wurde auch hier auf Lösungsmittelkleben übergegangen. In der Basisplatte wurden Aussparungen für den Einwegchip und den Detektor vorgesehen. Die Fluidkanäle wurden ausgefräst. Weiterhin trägt die Basisplatte die Bohrungen für die Montage der Mikroventile. Das Substrat, welches im Gerät zum Einsatz kommt, besteht aus zwei Flüssigkeiten (Luminol und einer wäßrigen Wasserstoffperoxidlösung). Diese müssen unmittelbar vor den Tests gemischt werden, da die Haltbarkeit der Mischung sehr begrenzt ist. Um dies zu ermöglichen und eine optimale Vermischung der beiden Komponenten zu gewährleisten, wurde zunächst ein am IMM im Rahmen anderer Projekte entwickelter Mikromischer in das Gerät integriert. Dessen Funktionsweise wird in Abb.1.28 veranschaulicht. Die beiden Fluidströme werden in ca. 40 µm breite Fluidlamellen unterteilt, welche sich aufgrund von Diffusionseffekten anschließend vermischen (interdigitales Mischprinzip). Nur das Kernstück des IMM-Mischers, wurde in das Laborgerät eingebaut (s. Abb.1.29). Es handelte sich dabei zunächst um eine Ausführung aus Metall. Wegen des Platzbedarfs wurden die Mischerstrukturen später direkt in der Abdeckfolie der Basisplatte durch Laserablation integriert. Der im Projektantrag für die Förderung der Flüssigkeiten vorgesehene Einsatz von Mikromembranpumpen erwies sich als nicht realisierbar, da diese nicht mit exakter Reproduzierbarkeit arbeiten und zudem Hochfrequenzstrahlung emittieren. Gerade die exakte, reproduzierbare Flüssigkeitsdosierung ist jedoch entscheidend für die Qualität der Messergebnisse. Einige der Arbeitsschritte des Messgerätes (wie z.B. das Aufbringen der Probe oder des Enzymtracers in die Messzelle) werden durch eine exakte Dosierung die Ergebnisse erheblich verbessert. Daher scheiden auch alternative Fördermodule wie peristaltische Pumpen aus. Als Alternative für die Dosierung der Flüssigkeiten wurde eine Kolbenspritze gewählt, die mittels einer Schrittmotorsteuerung angetrieben wird. Das Konzept der Zwangsförderung erlaubt eine dosiergenaue Einstellung der geförderten Flüssigkeitsmengen. Abb.1.30 zeigt die Ventilsteuerung des Laborgerätes zusammen mit der Schrittmotorsteuerung und der Spritzenpumpe. Die Wege, welche die verschiedenen Flüssigkeiten (Substrat, Puffer und Probe) durch das Messgerät nehmen, wurden durch Mikromagnetventile festgelegt. Es kamen kommerziell erhältliche Ventile der Firma Lee zum Einsatz. Abb.1.31 zeigt das Laborgerät schematisch mit allen wesentlichen Bauteilen. Bei dem Detektor, handelt es sich um einen miniaturisierten Photomultiplier der Fa. Hamamatsu. Messungen an der TUM, die in Zusammenarbeit mit dem IMM vorgenommen wurden, hatten ergeben, dass handelsübliche einfache Detektoren, wie sie für Chemilumineszenzmessungen angeboten werden, für die vorliegende Messaufgabe nicht empfindlich genug sind. Der hochempfindliche Photomultiplier musste jedoch lichtdicht gekapselt werden, da er bereits durch Tageslichteinfluss geschädigt wird. Das Gerät wurde mit einem Laptop angesteuert.

Abschlußbericht


Abb.1.27 Schema der Basisplatte des Laborgerätes

Öffnung für

Photomultiplier

Hohlraum für

Mikromischer

Abb.1.28 Basisplatte des Laborgerätes

Aussparung für den Einwegchip

Mikrostrukturierte Kanäle Aussparung für den Detektor

Abschlußbericht


Abb.1.29 Funktionsprinzip des IMM-Mikromischers

Abb.1.30 Dosierspritze, Schrittmotorsteuerung und Ventilsteuerung des Laborgerätes

Abschlußbericht


Abb. 1.31 Basisplatte mit Einwegchip und Ventilen (Explosionszeichnung) Abb.1.32 zeigt alle Bestandteile des Laborgerätes zusammen mit dem Laptop, welcher die Teilschritte der Analyse kontrolliert, die Ventile entsprechend den Erfordernissen der einzelnen Teilschritte der Analyse schaltet und der auch zur Datenerfassung eingesetzt wird. Es wurde eine benutzerfreundliche Software entwickelt, welche die Programmierung der zeitlichen Abfolge und der Dauer der einzelnen Analysenschritte ermöglicht. Dadurch konnte eine hohe Flexibilität für unterschiedlichste Analysenprobleme erreicht werden. Abb.1.33 zeigt die Bildschirmmaske des Programms. Welche Ventile aktuell geöffnet bzw. geschlossen sind, wird in einem on-line Fließbild visualisiert. Ebenso werden die Meßdaten des Detektors nicht nur in einer Datei abgelegt, sondern auch graphisch am Bildschirm dargestellt. Substrat und Pufferlösung werden aus Vorratsbehältern vorgelegt. Das Gerät wurde am 26.07.2002 an TUM übergeben.

1.4.1 Entwicklung einer Thermostatisierung für das Laborgerät Die Messungen, die seitens der TUM an dem Laborgerät durchgeführt wurden, zeigten bald eine deutliche Beeinflussung der Analysenergebnisse durch die vorherrschende Umgebungstemperatur bereits im Labor. Um diese Störgröße eliminieren zu können, wurde eine zusätzliche Thermostatisierung für das Laborgerät realisiert.

Abschlußbericht


Abb. 1.32 Das Laborgerät mit Laptop und der Lichtabschirmung für den Detektor (X)

Abb.1.33 Bildschirmmaske des Laborgerätes

X

Abschlußbericht


Die Anforderungen an die Thermostatisierung waren folgende:

• Netzbetrieb. • Einstellbare Sollwerttemperatur. • Hohe Kühl- bzw. Heizleistung. • Einfache Bedienung. • Lichtdichtes Gehäuse. • Ein vergrößerter Innenraum für die fluidischen Komponenten.

Verwendung fand ein Peltier-Element. Durch den ausschließlichen Netzbetrieb war es möglich, die Kühl- bzw. Heizleistung im Vergleich zum transportablen Feldgerät zu verdoppeln. Als zusätzliche Maßnahme wurde die Wärmeisolation verstärkt. Das Gerät kann, im Gegensatz zum Feldgerät, völlig unabhängig von den übrigen Hard- und Softwarekomponenten betrieben werden. Abb.1.34 zeigt links die Einheit mit dem Peltier-Element, dem Netzteil und dem Controller, sowie einen Behälter für die Kühlflüssigkeit nebst Verbindungsschläuchen. Rechts ist die lichtdichte, wärmeisolierte Box zur Aufnahme der fluidischen Komponenten zu sehen.

Abb.1.34: Thermostatisierung für das Laborgerät

Abschlußbericht


1.5 Entwicklung des Feldgerätes (Demonstrator) Abb.1.35 zeigt das tragbare Analysengerät, das für die Feldversuche entwickelt wurde. Die Ausführung ist stoß- und spritzwassergeschützt und kann durch zwei Akkumulatoren bis zu 12 Stunden unabhängig vom Netz betrieben werden. Das Gerät kann bei Temperaturen von -10 bis + 50°C eingesetzt werden. Das eigentliche Analysengerät befindet sich zusammen mit dem Detektor und den Vorratsbehältern für das Substrat und die Pufferspüllösung in einem thermisch isolierten Behälter (s. Abb.1.36), der mittels Peltierelementen je nach Außentemperatur gekühlt oder beheizt werden kann, um die Betriebstemperatur von 18°C für die Messungen zu gewährleisten. Die Schrittmotorsteuerung wurde in den abgedeckten Raum integriert, in dem sich auch der PC befindet (s. Abb.1.37 und 1.38). Die Steuerung des Gerätes erfolgt mittels eines miniaturisierten Industrie-PC mit stoßfester Festplatte, Bildschirm und Touch-Screen Tastatur (siehe Abb.1.37). Es wurde eine benutzerfreundliche Software entwickelt, welche über die Software des Laborgerätes hinaus die wesentlichen Betriebsparameter wie Außen- und Innentemperatur und Akkuspannung anzeigt und das Aus- und Einschalten der Thermostatisierung ermöglicht. Alle anderen Funktionen wurden von dem Vorgängermodell in teilweise verbesserten Versionen übernommen. Abb.1.39 zeigt die Bildschirmmaske des Programms. Die aufgezeichneten Daten können auf den beiliegenden USB-Stick übertragen werden. Hierzu steht eine Schnittstelle unter der Geräteabdeckung in der thermostatisierten Box ( (4) in Abb.1.36) zur Verfügung. Nach dem Einsetzen des Einwegchips und dem Aufgeben der Probe in den Vorratsbehälter wird der thermostatisierte Behälter geschlossen und die Software gestartet. Die Arbeitsschritte der Analyse werden dann automatisch abgearbeitet, was zur Zeit etwa 15 min Zeit in Anspruch nimmt. In dieser Zeit kann sich der Operator bereits um weitere Probenahmen und die Vorbereitung der nächsten Proben kümmern. Die Funktionstüchtigkeit des Gerätes wurde durch Lecktests und Tests mit gefärbten Flüssigkeiten überprüft.

Abb.1.35 Der Feldgerät-Demonstrator

Vorrats-behälter

Peltierelemente

Analysengerät

Abschlußbericht


Abb.1.36 Die thermostatisierte Box mit Basisplatte (1), Vorratsbehältern (2) und Peltierelementen (3) sowie dem USB-Stick (4)

Abb.1.37 Das Innere des Demonstrators mit PC (1) und Schrittmotorsteuerung für die Spritze (2)

(3)

(1)

(1)

(2)

(4) (2)

Abschlußbericht


Abb.1.38 Die in den abgedeckten PC-Raum integrierte Schrittmotorsteuerung

Abb.1.39 Ansicht der Bildschirmmaske der Benutzersoftware des Demonstrators

Abschlußbericht


1.6 Handhabung des Laborgerätes und des Feldgerätes Sowohl mit dem Labor- als auch mit dem Feldgerät wurden unter Laborbedingen im Labor der TU München zufrieden stellende Ergebnisse erzielt. (siehe Bericht der TUM Kap.2). Im Bericht der WASAG DECON werden folgende Aussagen getroffen: „Auch beim Projektpartner TU München wurden quantitativ aussagekräftige Daten nur in wenigen Fällen erhalten. Andererseits wurde vom Projektpartner berichtet, dass die Reproduzierbarkeit mit isolierten Goldstrukturen auf Mikrotiterplatten erheblich besser war und auch Nachweisgrenzen erzielt werden konnten, die an die ehemals kommerziell erhältlichen Test heranreicht oder diese übertrifft. Offensichtlich gibt es noch erhebliche Probleme bei der Integration der prinzipiell leistungsfähigen Immunchemie mit dem gewählten Ausführungsprinzip.“ Dem wird hiermit widersprochen. An der TU München wurden sehr wohl zahlreiche aussagekräftige Daten erhalten, wie deren Bericht zu entnehmen ist. Die Ergebnisse der Erprobung des Feldgerätes bei der WASAG DECON werden in deren Bericht als nicht vollständig zufrieden stellend bezeichnet. Es wurden stark schwankende Messwerte bereits für Leerproben erhalten. Dies wird auch in der unzureichenden Einarbeitung seitens dieses Projektpartners begründet gewesen sein, wie sie für einen Prototypen naturgemäß erforderlich gewesen wäre. Ohne diese Einarbeitung hatten alle durchgeführten Messungen wenig Aussicht auf Erfolg. Im Bericht der WASAG DECON werden folgende Aussagen getroffen: Trotz der Bezeichnung als Fließinjektionssystem arbeitet der vorliegende Prototyp diskontinuierlich; eine Spritzenpumpe fördert die Lösungen durch das Gerät und muss nach jeder Messung entleert werden. Zur Herstellung eines kontinuierlichen Flüssigkeitsstromes durch das Gerät können peristaltische Pumpen eingesetzt werden, die auch für sehr geringe Förderraten erhältlich sind. Da diese Pumpen in Mehrkanalausführungen erhältlich sind, bietet sich ihr Einsatz zur Konstruktion eines Mehrkanalgerätes an. Bei einem kontinuierlichen Strom von Systempuffer durch das Grundgerät und einer Integration aller Fließwege außer der eigentlichen Messzelle erübrigt sich auch die zeitaufwändige und fehleranfällige Montage (und Demontage) eines Waschchips zwischen mehreren Messungen. Dem wird hiermit widersprochen. Peristaltische Pumpen sind für ein derartiges System denkbar ungeeignet, da sie nicht die gewünschte Dosiergenauigkeit erbringen. Außerdem werden Spritzenpumpen und eine quasi-diskontinuierliche Betriebsweise heute selbst von den führenden Fachleuten im Bereich der FIA propagiert. Man würde es wohl eher 'Sequential Injection Analysis' (SIA) nennen, so nennt es jedenfalls Prof. Ruzicka, der Erfinder der FIA [J. Ruzicka, Analyst 115 (2000) 1053]

Abschlußbericht


Anhang 1.1 Immunofia – Datenblatt und Betriebsanleitung Feldgerät-Demonstrator

Gerätedaten Gerätetyp portables Immunochemisches-Fließinjektionssystem Zweck Quantitativer Nachweis von Trinitrotoluol in Wasser Messprinzip Chemolumineszenz Nachweisgrenze 0,1µg / l (TNT) Fördervolumenstrom 300µl / min Dosiergenauigkeit +/- 125nl Volumen der Dosiereinheit 10ml Betriebstemperatur intern +18°C (einstellbar) Einsatztemperatur -10°C bis +50°C Gehäuse Stoß- und Spritzwassergeschützt Energieversorgung zwei Akkumulatoren zu 12 Ah

externes Ladegerät Betriebszeit mindestens 6 Stunden im Volllastbetrieb,

ca. 12 Stunden bei Zeitweiser Deaktivierung der Temperaturregelung

Aufstellung • Die Aufstellung sollte auf einem festen und ebenen Untergrund erfolgen. • Das Gerät ist gegen Spritzwasser geschützt. Es darf jedoch beispielsweise nicht in

geöffnetem Zustand im Regen betrieben werden. • Im Bereich der Ansaugöffnungen sollten sich keine größeren Mengen an Staub

befinden, anderenfalls können hier Filter eingesetzt werden. • Bei der Überführung des Gerätes von einem warmen zu einem kalten Ort muss mit dem

Anfallen von Kondenswasser im Innern gerechnet werden. Es ist daher ratsam vor der Inbetriebnahme einige Minuten für den Temperaturausgleich abzuwarten.

Inbetriebnahme Nach dem Betätigen des Hauptschalters fährt der Rechner automatisch hoch und startet das Immunofia-Betriebssystem (siehe Abb.1) mit dem zuletzt verwendeten Programm. Im linken, oberen Teil ist das Schaltbild mit der Prozess-Isttemperatur dargestellt. Darunter befinden sich, von links nach rechts: der Schalter für die Temperaturregelung, die Anzeige der Außentemperatur und die Spannungsanzeige der Akkumulatoren. Ab einem Spannungsabfall auf 10 Volt sollten die Akkumulatoren mit dem beiliegenden Netzgerät wieder aufgeladen werden. Anderenfalls ist mit einer Tiefenentladung zu rechnen durch die sich die Ladungskapazität nach einer Wiederaufladung der Akkumulatoren vermindert. Mit Betätigung des Hauptschalters wird die Temperaturregelung aktiviert. Wenn auf eine Temperierung zeitweilig verzichtet werden kann, empfiehlt es sich diese auszuschalten um Energie zu sparen. Im rechten Teil des Bildschirms ist zu oberst der aktuelle Pfad des Steuerprogramms (Arbeitsfile) angegeben. Dieser Pfad darf nicht geändert werden. Es ist lediglich zulässig das Arbeitsfile direkt zu ändern (siehe Unterpunkt: Programmierung). Darunter befindet sich die Anzeige mit dem aktuellen Arbeitsschritt, incl. einer Angabe zur bereits verstrichenen Zeit und eine Vorschau auf den nächsten folgenden Arbeitsschritt. Es schließen sich die Tasten zum Starten und Unterbrechen des aktuellen Programms an. Im rechten, unteren Teil ist die Anzeige des Fotomultipliers untergebracht. Die Skalierung und Abtastrate kann frei gewählt werden. Standardmäßig ist die Abtastrate auf 1/s eingestellt. Der Aufzeichnungspfad und Dateiname ist frei wählbar.

Abschlußbericht


Abb.1 Programmierung Um direkten Zugriff auf den Programmablauf zu erhalten, kann aus dem Startmodus heraus die Stopptaste betätigt werden. Es öffnet sich ein dreigeteiltes Fenster und ein virtuelles Keyboard. Unter Schritt 1 ist in Tabellenform der aktuelle Ablaufplan ersichtlich. Die erste Spalte („Job“) dient der fortlaufenden Nummerierung der einzelnen Arbeitsschritte. In dieser Spalte dürfen nur ganze und von oben nach unten fortlaufende Zahlen eingetragen werden. Zulässige Eintragungen können beispielsweise in der Zahlenfolge: 1, 2, 3, 4 … oder auch 5, 10, 15, 16, 18, 20 ….erfolgen. In der zweiten Spalte („Zweck“) kann die Art des jeweiligen Arbeitsschrittes beschrieben werden, wie z.B. „Spülen“. Die dritte Spalte zeigt binär den jeweiligen Status der Ventile und der Pumpe im aktuellen Arbeitsschritt an. Bei der Förderung von Flüssigkeit ist darauf zu achten das alle erforderlichen Ventile zwischen Zu- und Ablauf geöffnet sind. Die Pumpe P1 und das Ventil V7 müssen dabei eingeschaltet sein. Beim Entleeren der Spritze muss P1 eingeschaltet und das Ventil V7 ausgeschaltet sein. Alle anderen Ventile sollten dabei sicherheitshalber geschlossen werden. Das Entleeren der Spritze wird nach ca. 30 Betriebsminuten unbedingt erforderlich und kann in den Programmablauf integriert werden. Die vierte und fünfte Spalte („Zeit“ und „Menge“) dienen zur Dosierung der Flüssigkeitsmenge. Es kann wahlweise unter „Zeit“ eine Laufzeitangabe für die Pumpe in Sekunden gemacht werden oder unter „Menge“ eine Vorgabe der zu dosierenden Menge in µl. Achtung: Bei einer Eintragung in einer der beiden Spalten muss in der jeweils Anderen die Eingabe Null gemacht werden!

Abschlußbericht


Für die Eintragungen unter „Zeit“ ist zu beachten, dass hier zwei Steuerbefehle vorgesehen sind. Der Zahlenwert 1000 aktiviert die Entleerung der Spritze. Der Zahlenwert 1001 beendet das laufende Programm. Alle Eintragungen in der Tabelle können durch direktes Anklicken und über das Keyboard vorgenommen werden. Unter Schritt 2 ist zu oberst der aktuelle Arbeitsschritt zum Zeitpunkt des Programmabbruchs angegeben („Alter Job Nr. _“). Nach Abschluss der Änderungen unter Schritt 1 kann unter „Neuer Job Nr._“ das Programm von einer beliebigen Position aus wieder gestartet werden. Unter Schritt 3 wird mit dem Betätigen der Taste „Editor beenden“ das neue Programm gespeichert und ausgeführt. Messen Vor dem Messvorgang ist sicherzustellen, dass das System frei von Luftblasen ist. Hierzu empfiehlt es sich das Programm für die Analyse mit einem nicht befüllten Chip solange ablaufen zu lassen, bis in der Abflussleitung keine Luftblasen mehr zu sehen sind. Dieser Vorgang kann einige Minuten in Anspruch nehmen. Die Vorgehensweise für den Messvorgang gliedert sich nach den nachfolgenden Punkten:

• Deckel öffnen • Sicherheitsblende schließen • Chip einsetzen bzw. auswechseln und die vier Flügelmuttern fest anziehen • Sicherheitsblende öffnen • Deckel schließen • Bei Bedarf die Temperaturregelung einschalten • Den Startschalter betätigen • oder mit dem Stoppschalter anschließend den Programmablauf ändern (siehe

Unterpunkt: Programmierung) • Die Datenaufzeichnung mit dem Aufnahmeschalter aktivieren Achtung: Der USB-Stick muss vor der Messung aus dem Gehäuse entfernt werden, da es anderenfalls zu einer Störung des Fotomultipliers kommt.

Datenaufzeichnung Bei Betätigung des Aufnahmeschalters öffnet sich zunächst ein Explorer-Fenster. Es kann wahlweise eine bereits vorhandene Datei weitergeführt oder eine neue Datei unter gleichem oder anderem Pfad begonnen werden. Die aufgezeichneten Daten können auf den beiliegenden USB-Stick übertragen werden. Hierzu steht eine Schnittstelle unter der Geräteabdeckung zur Verfügung.

Abschlußbericht

TU München, Freising-Weihenstephan Die Verwendung dieses Berichts unterliegt den vertraglichen Vereinbarungen der Vertragspartner. Als vertraulich gekennzeichnete Berichte sind grundsätzlich Verschlußsache. Dateiname: Immunofiaabschlußbericht.doc Version-Nr.: 1 Seite 35 von 61

Teilprojekt:: 2. : ENTWICKLUNG DER IMMUNOREAGENZIEN

Verfasser: PD Dr.P. Krämer (IÖC)

Zuwendungsempfänger: TU München, Freising-Weihenstephan

Förderkennzeichen: 02 WU 0102

Abschlußbericht


2.1 Einleitung und Ziel

Die Hauptaufgaben des Teilprojektes 2 (TUM) waren

1.) Die Herstellung von neuen Immunoreagenzien für dieses System und

2.) die Bearbeitung der Integration der Immunoreagenzien mit der neuen automatisierten µ-FIA (Fließinjektionsanalyse).

Zu 1.) Die Herstellung von Immunoreagenzien sind für ein auf immunochemischer Detektion basierendes System von entscheidender Bedeutung. Daher wurden diese im Projekt entwickelt. Haptene (Strukturanaloge des Analyten von Interesse), monoklonale Antikörper (mAk) und Enzym-Tracer wurden für die Analyse von Nitroaromaten hergestellt.

Da die Nitrogruppen des TNTs während der Metabolisierung sukzessive zu Aminogruppen abgebaut werden, und die gebildeten Metabolite wasserlöslicher als TNT sind, war es ein Ziel auch diese Metabolite mit erfassen zu können. Daher sollten während des Projektes auch mAk für die beiden ersten Metabolite des TNT-Abbaus, nämlich

2-Amino-4,6-Dinitrotoluol (2-ADNT) und 4-Amino-2,6-Dinitrotoluol (4-ADNT) hergestellt werden.

CH3

NO2

NO2O2N

2,4,6-Trinitrotoluol (TNT)MW 227.13

CH3

NH2

NO2

O2N

2-Amino-4,6-dinitrotoluolMW 212.13

CH3

NH2

NO2O2N

4-Amino-2,6-dinitrotoluolMW 212.13

Metabolismus

Abb. 2.1 Metabolite des TNTs: 2-ADNT und 4-ADNT

Zu 2.) Das vom IMM entwickelte µ-FIA-System besteht aus einer Grundplatte und einem Einwegchip. Die Grundplatte enthält die Kanäle und Ventile für die Fluidik. Der Einwegchip besteht aus PMMA und enthält Strukturen, welche mit Antikörpern beschichtet sind. Außerdem sind im Einwegchip je ein Reservoir für den Enzym-Tracer und die Probe integriert. Über den Strukturen, auf denen die immunochemische Reaktion stattfindet, befindet sich ein sehr empfindlicher Photomultiplier, der die Photonen, die aus der Enzymreaktion entstehen, misst.

Abschlußbericht


Die zweite wichtige Aufgabenstellung in unserem Teilprojekt war die Verbindung zwischen den Immunoreagenzien und dem Analysengerät. Hierzu mussten wichtige Parameter zur Demonstration des ‘Proof of principle’ getested werden, nämlich,

1. die Möglichkeiten der Immobilisierung und Stabilisierung, 2. die Optimierung der Verdünnungen und 3. das Einbringen in das kompetitive Assayformat. Der Einwegchip war hierbei für unsere Aufgabenstellung von zentraler Bedeutung. Hier sollte die Produktion in größeren Stückzahlen möglich sein. Der Einwegchip sollte daher lagerstabil und reproduzierbar sein.

2.2 Die wichtigsten wissenschaftlich-technischen Ergebnisse und andere wichtige Ergebnisse

2.2.1. Entwicklung von mAk für TNT, 2-ADNT und 4-ADNT und Aufbau konven-tioneller ELISAs

Für die Entwicklung von mAk müssen zunächst Derivate der zu analysierenden Zielsubstanz hergestellt werden, damit diese an höhermolekulare Verbindungen (i.d.R. Proteine) konjugiert werden und im Anschluss als ‚Immunogene’ zur Immunisierung der Tiere genutzt werden können.

Nachdem die ersten Synthesen, die wir von der Firma Synthon Dr. Krawielitzki, Augsburg, erhielten, nicht den Substanzen entsprochen hatten, die wir in Auftrag gegeben hatten, vergaben wir eine zweite Auftragssynthese an die Firma Solvias, Basel, Schweiz.

Hier konnten wir nur zwei der ursprünglich vier geplanten Derivate synthetisieren lassen, da die Synthesen wesentlich teurer waren (Abb. 2.2).

Abb. 2.2: Strukturen der in Auftrag gegebenen Haptene (Firma Solvias, Basel)

Die Strukturdaten und die Substanzen, die von der Firma Solvias geliefert wurden, wurden nochmals von Dr. Hertkorn (IÖC, GSF) überprüft und als richtig bestätigt.

Im Anschluss wurden diese Substanzen jeweils an die Proteine KLH (keyhole limpet hemocyanin) und BSA (bovine serum albumin) konjugiert. Die Kopplung wurde mit UV-Spektroskopie überprüft (Tabelle 2.1). Mit den Hapten-Protein-Konjugaten wurden von Frau Dr. E. Kremmer (IMI, GSF) Ratten immunisiert. Frau Kremmer immunisierte mit DNT4-KLH und DNT2-KLH. DNT4-BSA und DNT2-BSA wurden für

NH2

NO2

O2N

COOH

NH2

NO2

COOH

O2N

2-Amino-4,6-DNT-Derivat 4-Amino-2,6-DNT-Derivat

Abk.: DNT2 3-(2-Amino-4,6-dinitrophenyl) propionsäure

Mw 269.22 C10H11N3O6

Abk.: DNT4 3-(4-Amino-2,6-dinitrophenyl) propionsäure

Mw 269.22 C10H11N3O6

Abschlußbericht


das Screening nach positiven Klonen im sogenannten ‚Coating Antigen’-Format’ genutzt. Weiterhin wurden Ratten auch mit TNP-Glycylglycin-KLH immunisiert. Hiervon erwarteten wir uns anti-TNT mAk.

Für die Entwicklung, Optimierung und auch den späteren Vergleich mit der neu zu entwickelnden Methode der µ-FIA war es weiterhin wichtig, auch einen konventionellen ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) zu entwickeln. Dieser wird im nach dem ersten Schritt zum Screening der Zellkulturüberstände (s.o.) später dann in das ‚Enzym-Tracer Format’ überführt.

Tabelle 2.1: Haupt-Peaks aus den UV-Spektren der Derivate, der Proteine alleine und der Konjugate Protein / Derivat / Konjugat Peak 1 [nm] Peak 2 [nm] Peak 3 [nm]

KLH 277,0 ca. 345

BSA 277,6

DNT4 256,8 450,8

DNT4-KLH ca. 452

DNT4-BSA 447,5

DNT2 252,5 391,8

DNT2-KLH ca. 392

DNT2-BSA 389,2

TNP-Glycylglycin 339,7

TNP-Glycylglycin-BSA 340,8

Nach dem primären Screening von insgesamt etwa 50 Überständen für 2-ADNT bzw. 4-ADNT und TNT konnten mehrere Klone gegen die Zielanalyte 2-ADNT und 4-ADNT gefunden werden. Überraschenderweise wurden hierbei auch Klone gefunden, die in fast allen Fällen die Hauptsubstanz TNT am besten erkannten. Diese stammten ausschließlich aus Zelllinien, die ursprünglich aus Immunisierungen mit dem DNT4-Hapten (3-(4-Amino-2,6-dinitrophenyl) propionsäure) immunisiert worden waren. Im Anschluss wurden die ausgewählten Klone in das Enzym-Tracer-Format überführt, das auch die Grundlage der Durchführung in der µ-FIA ist. Hierbei war von enormem Vorteil, dass neben den von Solvias synthetisierten Substanzen (Abb. 2.2) auch andere strukturell ähnliche Substanzen kommerziell verfügbar waren, mit denen man zusätzlich weitere Enzym-Tracer herstellen konnte (Konjugation dieser Substanzen an das Enzym HRP (horseradish peroxidase; deutsch: POD), (Tabelle 2.2).

Abschlußbericht


Tabelle 2.2: Strukturen der Substanzen, die kommerziell erhältlich waren, an Proteine und oder das Enzym HRP (deutsch: POD) gekoppelt wurden und für die Immunisierung bzw. den Einsatz im Enzym-Tracer genutzt wurden

Substanz Struktur

TNP-Glycylglycin

N

N

NO2

NO2

COOH

NO2

O

TNP-Glycin

N

NO2

NO2

COOH

NO2

TNP-α-Aminobuttersäure

NO2

NO2 NO2

COOHNH2

DNP-γ-Aminobuttersäure

N

NO2

NO2

COOH

DNP-ε-Aminocapronsäure

N

NO2

NO2

COOH

DNP-Glycin

N

NO2

NO2

COOH

Kommerziell verfügbar: Research Organics, Cleveland, OH, USA (Vertrieb in Deutschland durch AppliChem, Darmstadt).

Abschlußbericht


2.2.2. Charakterisierung der in-Haus entwickelten mAk für TNT und Amino DNTs Mindestens 6 mAk wurden gefunden, die unterschiedliche Sensitivität und Spezifität für TNT, 2-ADNT und 4-ADNT haben (Tabelle 2.3).

Tabelle 2.3: Übersicht zu den Testmittelpunkten der ausgewählten Analyte TNT, 2-ADNT und 4-ADNT der optimierten Immunoassays mit den verschiedenen in-Haus entwickelten mAk.

Antikörper Enzym-Tracer Testmittelpunkte der Analyte

[µg/L]

Hauptanalyt Kreuz-reaktivität

[%]*

DNT4 3F6 [50 ng/mL]

2,4-DNP-ε-Amino-capronsäure-HRP

1:16000

TNT 2-ADNT 4-ADNT

0,28 ± 0,09 3,5 1,4

TNT 100 6,0 15

DNT4 4G4 [50 ng/mL]


1:2000

TNT 2-ADNT 4-ADNT

0,35 ± 0,07 6,3 2,5

TNT 100 5 13

DNT4 1A3 [39 ng/mL]


1:4000

TNT 2-ADNT 4-ADNT

0,74 ± 0,15 6,1

10,8

TNT 100 11 6

DNT4 1A7 [40 ng/mL]

2,4-DNT-γ-Amino-buttersäure-HRP

1:4000

TNT 2-ADNT 4-ADNT

2,69 ± 0,83 11,2 5,6

TNT 100 21 42

PK 5E3 [45 ng/mL]


1:4000

TNT 2-ADNT 4-ADNT

21,0 ± 5,05 35,1 2095

TNT 100 62 1

DNT2 4B4 [42 ng/mL]

DNT2-HRP 1:2000

2-ADNT 4-ADNT

TNT

8,6 ± 1,7 1788 7190

2-ADNT 100 0,4 0,1

DNT4 1A7 [40 ng/mL]


1:4000

2,6-Dinitroanilin 2,4-Dinitroanilin 3,5-Dinitroanilin

0,98 ± 0,33 4,7 8,2

2,6-Dinitroanilin

100 26 9

PK 5H6 [15 ng/mL]


1:16000

2,4-Dinitroanilin 2,4-Dinitrotoluol

2-ADNT

0,22 ± 0,06 0,7 1,9

2,4-Dinitroanilin

100 42 13

Im Vergleich hierzu der kommerzielle mAk A1.1.1

A1.1.1 (1:35000)

[300 ng/mL]

TNP-Glycylglycin-HRP

1:2000

TNT 2-ADNT 4-ADNT

0,7 ± 0,3 9,8 539

TNT 100 7

0,1 *Die angegebene Kreuzreaktivität (CR) kann von den Werten, die man mit den hier angegebenen Testmittel-punkten berechnen würde, leicht abweichen, da die CR immer auf die Testmittelpunkte des Hauptanalyten auf derselben Mikrotiterplatte bezogen wurde und nicht auf den hier angegebenen Mittelwert des Testmittelpunktes des Hauptanalyten über alle Platten. Alle CR-Werte wurden gerundet.

In vielen Immunoassays zeigten sich die Haptene 2,4-DNT-e-Aminocapronsäure und 2,4-DNT-γ-Aminobuttersäure als sehr geeignet für den Enzym-Tracer. MAk DNT4 3F6 ist der Antikörper, mit dem TNT am sensitivsten detektiert werden kann. Mit einem

Abschlußbericht


Testmittelpunkt von ca. 0,3 µg/L ist dieser mAk vergleichbar, wenn nicht besser als der kommerziell verfügbare mAk A1 (SBS, USA; siehe Tabelle 2.3). Außerdem hat DNT4 3F6 eine höhere CR für 4-ADNT als mAk A1. Die Kreuzreaktivitäten mit anderen nitroaromatischen Verbindungen wurden mit diesem mAk bestimmt und sind in Tabelle 2.4 gelistet.

Tabelle 2.4: Kreuzreaktionen (CR) von mAk DNT4 3F6 (50 ng/mL) mit Enzym-Tracer 2,4-DNP-ε-Aminocapronsäure-HRP 1:16000

Substanz Testmittelpunkt [µg/L]

Kreuzreaktivität [%]*

TNT 0,28 ± 0,09 (n=16) 100

1,3,5-Trinitrobenol 0,27 120

2,6-Dinitroanilin 0,35 71



4-ADNT 1,6 15

2,4-Dinitrotoluol 2,5 10

1,3-Dinitrobenzol 4,2 8

2-ADNT 3,1 6

2,6-Dinitrotoluol 4,6 6

Tetryl 21 1,5

2,6-Diamino-4-nitrotoluol 397 0,1

Hexogen, RDX 1370 0,04

2-Nitrotoluol 1827 0,02


2,4-Diamino-6-nitrotoluol 4169 <0,01

4-Nitrotoluol >10000 <0,01

Nitrobenzol >10000 <0,01

Octogen, HMX >10000 <0,01

DNT4 0,18 170 Immunogen

2,4,6-TNP-Glycin 0,12 88

2,4-DNP-Glycin 0,44 76

2,4,6-TNP-Glycylglycin 0,16 58

2,4-DNP-γ-aminobuttersäure 0,3 55

2,4-DNP-ε-aminocapronsäure 1,1 30

2,4,6-TNP-α-aminobuttersäure 0,72 23

DNT2 1694 0,02

*Die angegebene Kreuzreaktivität (CR) kann von den Werten, die man mit den hier angegebenen Testmittel-punkten berechnen würde, leicht abweichen, da die CR immer auf den Testmittelpunkt von TNT auf derselben Mikrotiterplatte bezogen wurde und nicht auf den hier angegebenen Mittelwert des Testmittelpunktes von TNT über alle Platten. CR-Werte wurden gerundet.

Abschlußbericht


Eine repräsentative Standardkurve unter optimierten ELISA-Bedingungen zeigt Abb. 2.3 für TNT, und für die Kreuzreaktanten 2-ADNT und 4-ADNT. Die Bedingungen für diese Standardkurve sind: mAk DNT4 3F6 50 ng/mL, 2,4-DNT-e-Aminocapronsäure 1:16000.

Analyte [µg/L]

1e-4 0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 1000000

0,2

0,4

0,6

0,8

MAb DNT4 3F6

y = ( (A - D)/(1 + (x/C)^B ) ) + D: A B C D R^21 (2-Amino DNT: Concentration vs MeanVal... 0,729 1,04 3,45 0,001 0,9982 (TNT: Concentration vs MeanValue) 0,759 1,019 0,211 -3,25e-4 13 (4-Amino DNT: Concentration vs MeanVal... 0,793 0,928 1,41 -7,88e-4 0,998

Abb. 2.3: MAk DNT4 3F6 – Standardkurven für TNT, 4-ADNT und 2-ADNT

Als Beispiel eines sehr selektiven Antikörpers konnte der mAk DNT2 4B4 etabliert werden. Mit diesem mAk wurden ebenfalls die relevanten Substanzen als Kreuzreaktanten getestet (Tabelle 2.4). Als Enzym-Tracer dient hier DNT2-HRP. Obwohl der mAk DNT2 4B4 sehr selektiv für 2-ADNT ist, ist er mit einem Testmittelpunkt von 8,6 µg/L nicht sehr sensitiv (s. Tabellen 2.3 und 2.5 und Abb. 2.4).

Der Mangel an Sensitivität rührt daher, dass dieser mAk das Hapten im Immunogen, DNT2, das auch als Hapten im Enzym-Tracer eingesetzt wurde, extrem gut erkennt (CR ca. 1800%). Eine Kompetition mit dem Analyten 2-ADNT verlangt daher höhere Konzentrationen.

DNT2 kommt allerdings nicht in der Umwelt vor, die CR ist daher nicht relevant. Umweltrelevante Substanzen, mit denen dieser mAk nennenswerte CR zeigt, sind 3,5-Dinitroanilin (26%), 2,4-Dinitroanilin (18%), 2,6-Diamino-4-nitrotoluol (2.8%) und 2,4-Diamino-6-nitrotoluol (1.3%). Dieser mAk war damit der selektivste aus unserer Reihe von entwickelten mAk. Ein Beispiel einer Standardkurve, zusammen mit den Kreuzreaktanten 4-ADNT und TNT ist in Abb.2.3 für diesen Assay dargestellt. Die optimierten Bedingungen sind hier: DNT2 4B4 42 ng/mL und DNT2-HRP 1:8000.

Abschlußbericht


Tabelle 2.5: Kreuzreaktionen (CR) von mAk DNT2 4B4 (42 ng/mL) mit Enzym-Tracer DNT2-HRP 1:8000

Substanz Testmittelpunkt [µg/L]

Kreuzreaktivität [%]*

2-ADNT 8,6 ± 1,7 (n=18) 100

3,5-Dinitroanilin 32 26

2,4-Dinitroanilin 64 18



2,4-Dinitrotoluol 1201 0,6

4-ADNT 1788 0,4

1,3-Dinitrobenzol 2311 0,3



TNT 7477 0,1

2,6-Dinitroanilin 7231 0,1

Nitrobenzol 19904 0,04

2-Nitrotoluol >10000 <0,01

1,3,5-Trinitrobenol >10000 <0,01

2,6-Dinitrotoluol >10000 <0,01

Hexogen, RDX >10000 <0,01

Octogen, HMX >10000 <0,01

Tetryl >10000 <0,01

DNT2 0,3 ca. 1800 Immunogen

2,4-DNP-ε-aminocapronsäure 87,1 10,8

2,4-DNP-γ-aminobuttersäure 119 7,4

2,4,6-TNP-Glycylglycin 374 2,3

2,4,6-TNP-Glycin 554 1,6

2,4-DNP-Glycin 582 1,6

2,4,6-TNP-α-aminobuttersäure 2098 0,4

DNT4 10137 0,1 *Die angegebene Kreuzreaktivität (CR) kann von den Werten, die man mit den hier angegebenen Testmittel-punkten berechnen würde, leicht abweichen, da die CR immer auf den Testmittelpunkt von 2-ADNT auf derselben Mikrotiterplatte bezogen wurde und nicht auf den hier angegebenen Mittelwert des Testmittelpunktes von 2-ADNT über alle Platten. CR-Werte wurden gerundet.

Abschlußbericht


Analyte [µg L-1]

0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 1000000

20

40

60

80

100

MAb DNT2 4B4

y = ( (A - D)/(1 + (x/C)^B ) ) + D: A B C D R^21 (2-Amino DNT: Concentration vs Mean%C... 98,243 1,193 7,362 2,4 0,9942 (4-Amino DNT: Concentration vs Mean%C... 95,073 0,842 1375,986 0,059 0,9973 (TNT: Concentration vs Mean%Control) 97,718 0,957 7191,651 2,517 0,996

Abb. 2.4: MAk DNT2 4B4 – Standardkurven für 2-ADNT, 4-ADNT und TNT

Für die anderen mAb wurden ebenfalls die CR aller Substanzen bestimmt (18 umweltrelevante Substanzen und 8 Substanzen, die als Haptene für die Immunogene bzw. Enzym-Tracer eingesetzt wurden). Alle Werte wurden in einer Publikation dargestellt (Krämer et al., Anal. Bioanal. Chem., eingereicht). In den folgenden Abb. 5-8 sind Beispiele von Standardkurven gezeigt. Diese Kurven wurden mit den jeweils optimierten Assays (aufgereinigte Antikörper) durchgeführt. Bei einigen mAk wurde der Enzym-Tracer noch einmal neu optimiert. So wird in einigen Assays jetzt anstatt der 2,4-DNT-γ-Aminobuttersäure die 2,4-DNT-e-Aminocapronsäure als Hapten im Enzym-Tracer verwandt.

Abschlußbericht


Analyte [µg/L]

0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 1000000

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8PK 5E3-1 [45ng/ml]; DNP-y-Am.BA-HRP 1:4000

y = ( (A - D)/(1 + (x/C)^B ) ) + D: A B C D R^21 (TNT: Concentration vs MeanValue) 0,719 0,868 19,655 0,003 0,9972 (2-Amino DNT: Concentration vs MeanVal... 0,707 1,009 33,675 0,012 0,9973 (4-Amino DNT: Concentration vs MeanVal... 0,661 1,052 1816,29 0,017 0,976

Abb. 2.5: MAk PK 5E3 – Standardkurven für TNT, 2-ADNT und 4-ADNT Die Bedingungen für diese Standardkurve sind: PK 5E3 45 ng/mL, 2,4-DNT-γ-Aminobuttersäure 1:4000.

Analyte [µg/L]

1e-5 1e-4 0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 1000000

0,5

1

PK 5H6-1-1 1:240000 (15,4ng/mL);DNP-e-AmCA-HRP 1:16000

y = ( (A - D)/(1 + (x/C)^B ) ) + D: A B C D R^21 (2,6-Dinitroaniline: Concentration vs Mean... 1,158 0,847 3,347 -9,04e-4 0,9972 (2,4-Dinitroaniline: Concentration vs Mean... 1,127 1,018 0,219 0,001 0,9953 (TNT: Concentration vs MeanValue) 1,179 0,697 12,781 -0,012 0,995

Abb. 2.6: MAk PK 5H6 – Standardkurven für 2,4-Dinitroanilin, 2,6-Dintroanilin und TNT

Abschlußbericht


Die Bedingungen für diese Standardkurve sind: PK 5H6 15 ng/mL, 2,4-DNT-ε-Aminocapronsäure 1:16000.

Analyte [µg/L]

1e-5 1e-4 0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 1000000

0,2

0,4

0,6

0,8

1

PK 5H6-1-1 1:240000 (15,4ng/mL);DNP-e-AmCA-HRP 1:16000

y = ( (A - D)/(1 + (x/C)^B ) ) + D: A B C D R^21 (2-Amino DNT: Concentration vs MeanVal... 1,05 0,577 1,75 -0,016 0,9962 (2,4-Dinitroaniline: Concentration vs Mean... 0,941 0,929 0,243 -2,75e-4 0,9943 (4-Amino DNT: Concentration vs MeanVal... 1,033 0,813 96,525 -0,01 0,997

Abb. 2.7: MAk PK 5H6 – Standardkurven für 2,4-Dinitroanilin, 2-ADNT und 4-ADNT Bedingungen, siehe Abb. 2.6.

Abschlußbericht


2.3. Arbeiten mit dem Feldgerät - Optimierungen Das neue miniaturisierte, immunochemische Fließinjektionssystem (µ-FIA-System) besteht aus einem Hauptgerät (Grundplatte) und dem Einweg-Chip (s. Zwischenbericht IMM). Im vergangenen Projektzeitraum war es unsere Aufgabe Messungen mit den beiden Demonstratoren durchzuführen, d.h. mit dem Laborgerät und mit dem Feldgerät. Hierzu mussten die Verdünnungen der Immunoreagenzien, die Inkubationszeiten, die Abfolge, u.a.m., optimiert werden. Im Wesentlichen wurden diese Arbeiten mit dem kommerziell verfügbarem mAk A1.1.1 durchgeführt. Zunächst wurden auf der Mikrotiterplatte Inkubationszeiten und auch die Reihenfolge der Inkubationen Analyt und Enzym-Tracer getestet. Dies war wesentlich für die Übertragung auf den Einweg-Chip, da in diesem die Zeiten wesentlich kürzer und auch die Reihenfolge der Inkubation anders als im konventionellen ELISA sind. Eine Inkubation von 3-10 min (Kompetition) und 10 min Substrat (H2O2/TMB) waren ausreichend, um gute Absorptionswerte und auch gute Testmittelpunkte zu erzielen (Abb. 2.8, hier 10 min Kompetition, blaue Kurve). Eine Trennung der Inkubation von Analyt und Enzym-Tracer zeigte einen negativen Effekt. Hier wurde zunächst der Analyt TNT inkubiert, dann gewaschen und im Anschluß der Enzym-Tracer inkubiert (Abb. 2.8, grüne Kurve) bzw. umgekehrt (zuerst Enzym-Tracer, waschen, dann Analyt; Abb. 2.8, rote Kurve). Das Reaktionsmuster ist allerdings abhängig von der Affinität der Antikörper (zu Analyt und Enzym-Tracer) und daher nicht für alle Immunoreagenzien gleich.

TNT [µg/L]

0,001 0,01 0,1 1 10 100 10000

20

40

60

80

100

120%Control Standard Curves

y = ( (A - D)/(1 + (x/C)^B ) ) + D: A B C D R^2Plot#1 (Standards: Concentration vs %Cont... 99,351 1,027 0,637 1,358 1Plot#2 (TNT / w ash / Tr: Concentration vs ... 103,743 0,53 0,795 50,044 0,953Plot#3 (Tr / w ash / TNT: Concentration vs ... 97,391 0,98 1,23 23,72 0,993

Abb. 2.8: Test der Inkubationszeiten und Reihenfolge der Inkubation von Analyt und Enzym-Tracer (mAk A1.1.1 und Enzym-Tracer Gly-Gly-HRP) Weiterhin wurden Optimierungen auf den Strukturen alleine (Batch-ELISA) vorgenommen. Verschiedene Pestizide wurden getestet (Atrazin, Diuron, Isoproturon) und auch TNT. In Abb. 2.9 ist als Beispiel die Standardkurve für Isoproturon dargestellt. Hier war es wesentlich, dass Milchpulver (1%, v/v) verwendet wurde, um unspezifische Bindungen auf der Goldoberfläche zu verhindern.

Abschlußbericht


Isoproturon-ELISA on IMM structures. TIB 172; Milk Powder. Anti-Ip Mab 1: 20 000; Tracer: 1: 200

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0 0.001 0.01 0.1 1 100

Analyte (µg/L)A

bso

rban

ce (

450-

650

nm

)

Abb. 2.9: Standardkurve für Isoproturon auf Goldstrukturen – Batch-ELISA (Aspekt 1) Dies spielte auch eine wesentliche Rolle bei der Hintergrund-Chemilumineszenz. Auch hier stellte sich Milchpulver (1%, v/v) als am besten geeignet heraus, diese zu reduzieren (s. Vergleich gelb/weiß zu hellblau/dunkelblau, Abb. 2.10).

Abb. 2.10: Effekt von Milchpulver (1%) als Absättigung – Hintergrundsignal (Chemilumineszenz) von Antikörpern (Protein A/G + Anti-TNT-mAk) Als eine weitere entscheidende Beeinflussung des Assays im Laborgerät stellte sich die Temperatur heraus. Die Hintergrund-Chemilumineszenz war hierbei der wesentliche Faktor. Diese ist höher bei

10

100

1000

10000

100000

1000000

1 11 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 1 101 111 121

Number of M easurement (every 3 s)

Lo

g [

RL

U]

Pr A/G - Mab (1)Pr A/G - Mab (2)Pr A/G - Mab - MP (1)Pr A/G - Mab - MP (2)

1

2

3

1. End of substrate pumping

2. End of substrate incubation

3. 20-30 seconds of washing

Abschlußbericht


niedrigeren Temperaturen (Abb. 2.11).

Abb. 2.11: Effekt von Temperatur auf die das Hintergrundsignal der Chemilumineszenz Die Abb. 2.12 und 2.13 zeigen einen Ausschnitt der Original-Signalaufnahme während unterschiedlicher Messungen, nämlich Einwegchips ohne TNT (0 µg/L) und mit TNT (0,1 oder 0,01 µg/L). In Abb. 2.12 ist das Chemilumineszenzsignal (RLU) in logarithmischer Skalierung dargestellt, um das Ende der Substratzufuhr, die Substratinkubation und den Waschvorgang nach der Inkubation klater darstellen zu können. Hier sieht man nicht deutlich den Unterschied zwischen den Einwegchips und auch nicht zwischen Chips mit und ohne TNT. Dieselbe Graphik ist daher in Abb. 2.13 noch einmal in linearer Skalierung dargestellt. Hier sieht man deutlich den Unterschied zwischen den unterschiedlichen Signalen. Weiterhin ist in der Graphik der Abb. 2.13 eindeutig der Unterschied zwischen den Chips zu sehen, hier als ‚low binding Chip’ und ‚normal binding Chip’ bezeichnet. An diesem Ergebnis sieht man, dass es essentiell ist, dass die Chargen der Chips einheitlich sind. Dies muss immer vor Beginn der Nutzung der Chips überprüft werden, denn sonst könnte ein niedrigeres Signal bedingt durch einen ‚low binding chip’ das Vorhandensein des Analyten vortäuschen (falsch-positive Ergebnisse).

Influence of temperature on luminescence background signal (each chip measured five times in a row)

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

1 21 41 61 81 101 121 141 161 181 201 221 241

Signal recording time (once every 3 s)

Log

[R

LU]

21°C (1)21°C (2)19°C (1)19°C (2)

Abschlußbericht


Abb. 2.12: Entwicklung des Chemilumineszenzsignals – Logarithmische Skalierung Darstellung der Unterschiede zwischen Chips mit und ohne TNT; Darstellung der Unterschiede zwischen den Chips. Abb. 2.13: Entwicklung des Chemilumineszenzsignals – Lineare Skalierung Darstellung der Unterschiede zwischen Chips mit und ohne TNT; Darstellung der Unterschiede zwischen den Chips. Nachdem alle Parameter optimiert waren, konnten mit dem Feldgerät Standardkurven für TNT gemessen werden (Abb. 2.14). Das Detektionslimit war hierbei bei unterschiedlichen Messungen ca. 0.01-0.1 µg/L. Die Inkubation des Analyten und Enzym-Tracers von 10 min war besser für das Erreichen eines niedrigeren Detektionslimits (im Vergleich zu 5 min). Entscheidend war weiterhin, dass im TNT-Sensor Analyt und Enzym-Tracer gemeinsam inkubiert werden müssen. Daher wurden Analyt und Enzym-Tracer im Wechsel zu der Oberfläche mit Antikörpern gepumpt und dann zusammen auf der Pyramidenoberfläche inkubiert.

10

100

1000

10000

100000

1000000

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101

Number of M easurement (every 3 s)Lo

g [R

LU)

Normal Chip TNT 0 µg/L

Normal Chip TNT 0.1 µg/L

Low-binding Chip TNT 0 µg/L

Low-binding Chip TNT 0.01 µg/L

12

3

1. End of substrate pumping

2. End of substrate incubation

3. 20-30 seconds of washing

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101

Number of M easurement (every 3 s)

[RLU

]

Normal Chip TNT 0 µg/L

Normal Chip TNT 0.1 µg/L

Low-binding Chip TNT 0 µg/L

Low-binding Chip TNT 0.01 µg/L

Abschlußbericht


Abb. 2.14: Standardkurve für TNT mit dem Feldinstrument Neben Standardkurven für TNT wurden auch Messungen für Atrazin (Abb. 2.15) und Diuron (Abb. 2.16) durchgeführt. Auch hier war die Bestimmung im unteren µg/l-Bereich möglich. Die Immunoreagenzien stammten hierbei von Kollegen aus den USA (Dr. A. Karu, ehemals UC Berkeley, CA, Dr. Marvin Goodrow, ehemals UC Davis, CA). Die Werte, die mit dem Einwegchip erzielt wurden, sind mit denen im konventionellen ELISA auf der Mikrotiterplatte vergleichbar. Abb. 2.15: Standardkurve für Atrazin mit dem Feldinstrument

Standard curve with 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) performed with the IMM portable flow injection immunosensor

0

20

40

60

80

100

0 0.01 0.1 1 10

TNT [µg/L]

%C

on

trol

Standard curve with Atrazine, performed with the IMM portable flow injection immunosensor

0

20

40

60

80

100

0 0.01 0.1 1 10 100 1000

Atrazine [µg/L]

% C

on

trol

Abschlußbericht


Standard curve with Diuron, performed with the IMM portable flow injection immunosensor

0

20

40

60

80

100

0 0.01 0.1 1 10 100

Diuron [µg/L]

%C

on

trol

Abb. 2.16: Standardkurve für Diuron mit dem Feldinstrument

Abschlußbericht


2.3 Zielerreichung

Mit den neu synthetisierten Haptenen (DNT2 und DNT4) und dem kommerziell erhältlichen TNP-Glycylglycin konnten mehrere mAk für TNT, 2-ADNT und 4-ADNT entwickelt werden. In der Regel zeigen alle mAk relevante Kreuzreaktionen für alle 3 Analyte, lediglich mAk DNT2 4B4 ist sehr selektiv, wenn auch nicht sehr sensitiv für 2-ADNT. MAk DNT4 3F6 war der Antikörper, mit dem die geringsten Konzentrationen von TNT bestimmt werden können. Daneben waren mindestens zwei der mAk auch sehr sensitiv für 2,6-Dinitroanilin (mAk DNT4 1A7) und 2,4-Dinitroanilin (mAk PK 5H6). Die Übertragung der in-Haus entwickelten Immunoreagenzien erfolgte nicht mehr auf den Einwegchip, da unsere Reagenzien erst ab August 2003 entwickelt werden konnten. Es ist allerdings davon auszugehen, dass der Einsatz unserer Reagenzien zu ähnlich guten Ergebnissen führen wird wie die mit dem kommerziellen mAk A1, da die in-Haus entwickelten mAk sehr gut sind. Die Optimierungen der Assays für den Einwegchip waren sehr aufwendig. Die Übertragung von der Mikrotiterplatte über den ‚Batch-ELISA’ auf den vereinzelten Strukturen bis hin zum Einwegchip benötigten viele Anpassungen. Wie unterschiedlich sich die einzelnen Formate verhalten, ist in Tabelle 2.6 zusammenfassend dargestellt. Der wesentliche Teil ist der, dass sich das Verhältnis Oberfläche zu Volumen um den Faktor 10 zwischen Mikrotiterplatte und Einwegchip verändert. Hinzu kommen die unterschiedlichen Bedingungen innerhalb eines Fließsystems. Auch das Auftreten von Luftblasen war hierbei teilweise ein Problem. Die Überprüfung über die Form des aufgezeichneten Signals (Bsp. Abb. 2.12 und 2.13) war ein guter Indikator für die Gültigkeit der Messung. Letztlich wurden aber doch die Messungen von unterschiedlichen Standards möglich. Ein ‚Proof of principle’ konnte für mehrere Analyte erfolgreich gezeigt werden. Sehr aufwendig ist weiterhin die Regenerierung der Einwegchips, die bisher immer noch vorge-nommen werden muss. Die Chips sind in der Produktion noch zu teuer (ca. 50 €), um für nur einen einmaligen Gebrauch eingesetzt zu werden. Die Regenerierung konnte bisher mindestens 50x durchgeführt werden. Weiterhin wichtig ist, dass die Chips untereinander noch nicht einheitlich genug sind, um mit Einzelmessungen zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Sie können von Charge zu Charge variieren. Dies wäre eine wichtige Aufgabe für zukünftige Weiterentwicklungen. Auch die Herstellung der Chips im Spritzgussverfahren, ein Verfahren, das sich erst ab mehreren Tausend Stück finanziell tragbar ist, wäre hierbei von Vorteil, um die Vereinheitlichung zu gewährleisten.

Abschlußbericht


Zusammenfassender Vergleich des Stands des Vorhabens mit der ursprünglichen (bzw. mit Zustimmung des Zuwendungsgebers geänderten Arbeits-, Zeit und Ausgabenplanung - Teilprojekt 2

1.a Neusynthese von 2 Derivaten

(Haptene für die Immunisierung), Solvias, Basel

Die Neusynthese erfolgte im Juli 2003 und lieferte richtige Strukturen. Von den ursprünglich vier geplanten Derivaten wurden zwei in Auftrag gegeben und hergestellt (Abk.: DNT2 und DNT4).

Weiterhin wurde noch die kommerziell erhältliche Substanz TNP-Glycylglycin als Hapten für die Immunisierung eingesetzt.

2.a Konjugation der Haptene an Trägerproteine und Enzym

Die Haptene wurden an KLH und BSA kovalent gekoppelt. Außerdem wurden neben diesen Haptenen noch weitere 5 verschiedene Substanzen an Peroxidase konjugiert, sodass insgesamt 8 Enzym-Tracer für die Optimierungen der ELISAs zur Verfügung standen.

3.a Immunisierung der neuen Konjugate; Fusionen; Screening nach Zelllinien

Im August 2003 wurde mit den neuen Immunisierungen begonnen: DNT2-KLH und DNT4-KLH.

Daneben wurde auch mit TNP-Glycylglycin-KLH immunisiert; dieses Immunogen sollte der Gewinnung von Anti-TNT Antikörpern dienen.

Von der Immunisierung mit DNT2-KLH wurden 25 Zellkulturüberstände getestet. Dieselbe Anzahl wurde auch aus der Immunisierung mit DNT4-KLH getestet.

Im ersten Screening nach Inhibition mit 2-ADNT und 4-ADNT konnten insgesamt 12 Klone ausgewählt werden, die sich mit 2-ADNT (3) oder 4-ADNT (9) inhibieren ließen.

Aus der Immunisierung mit TNP-Glycylglycin-KLH wurden 11 Überstände getestet. Hier ließen sich 2 Klone mit TNT inhibieren.

4.a Kompetitiver ELISA für Amino-DNT und TNT

Die ausgewählten Klone wurden subkloniert und etabliert. Danach gereinigt über Protein G und in kompetitive ELISAs formattiert.

5.a Charakterisierung der mAk für Amino-DNT und TNT

Die Kreuzreaktivitäten aller mAk wurden bestimmt. Außerdem wurden einige der Assays mit Wasserproben getestet. Dazu wurden unterschiedliche Wasserproben (Bach, Fluß, Teich) mit TNT, 2-ADNT und 4-ADNT dotiert und in den unterschiedlichen Assays gemessen.

Die Ergebnisse wurden in einem Manuskript zur Publikation eingereicht.

6. Testcharakterisierungen und -optimierungen der bereits vorhandenen Immunoassays; Triazine, TNT, u.a.

MAk und Enzym-Tracer für Atrazin, Diuron, Isoproturon und TNT kamen zum Einsatz. Diese Immunoreagenzien wurden z.T. auch im Immunosensor eingesetzt.

7. Entwicklung einer schnellen und einfachen Extraktion für TNT, Amino-DNT aus Boden

Dieser Teilschritt wurde nicht behandelt, da die Firma Wasag Decon im Verlauf des Projektes mitteilte, dass die Analyse von Wasserproben wichtiger sei.

Abschlußbericht


8. Anpassung der Extraktion auf den Immunoassay bzw. Sensorchip

s. Punkt 8

9. Mitarbeit an der Probennahme Eine Probenahme im Feld wurde nicht durchgeführt.

9.a Mitarbeit bei Messungen Herr Ciumasu war mehrere Tage bei der Firma Wasag Decon, um das Know-how zum optimierten Ablauf der Messung mit dem Feldgerät zu transferieren.

10. Tests und Optimierungen der Immobilisierung (verschiedene Materialien des Sensorchips)

Hier wurde dreistufig vorgegangen:

1.) Tests in Mikrotiterplatten, in denen die Einzelstrukturen (mit Plastik- und mit Goldoberfläche) eingeklebt waren.

2.) Test im Batch-ELISA. Hier wurden die Einzelstrukturen (nur mit Goldoberfläche) in Glasgefäßen getestet, u.a. auch auf unspezifische Bindungen (s. Punkt 11).

3.) Tests mit dem Sensor-Chip im Labor- und im Feldgerät.

Es wurden zum größten Teil nur die Adsorption von Proteinen an Gold genutzt. Erste Versuche Protein A/G (ein Proteingemisch, das den Fc-Teil von Antikörpern bindet) kovalent an Gold zu immobilisieren, wurden unternommen, aber nicht weiterverfolgt. Eine kovalente Bindung an Gold wäre auf Dauer nur dann möglich, wenn man die Immobilisierung schon außerhalb des Sensor-Chips durchführen könnte (Grund: Einsatz von Lösungsmitteln ist notwendig, die mit dem Plastikmaterial des Chips unverträglich sind).

11. Stabilisierung der Immunoreagenzien; unspezifische Bindungen (Sensorchip)

Verschiedene Versuche zur Stabilisierung der Reagenzien wurden durchgeführt. Es wurden jedoch keine Langzeitversuche gemacht.

Da das Verhältnis Oberfläche zu Volumen sehr hoch ist, mussten viele Optimierungen zur Verhinderung unspezifischer Bindungen an der Goldoberfläche durchgeführt werden.

12. Projekttreffen Es fanden insgesamt 5 Projekttreffen und 3 Arbeitstreffen zwischen IMM und TUM statt.

13. Vorträge, Poster auf Workshops, Tagungen, Kongressen

s. Punkt 7 des Berichts

14. Interne Koordination und wissenschaftliche Leitung des Projekts, Koordination mit IMM und WASAG DECON

Die Partner stimmten die Arbeiten aufeinander ab. Intern (TUM und GSF) wurde sehr eng mit Frau Dr. E. Kremmer (IMI-GSF) zusammen gearbeitet. Hier wurden die Tiere immunisiert, die Fusionen, das Primär-Screening und auch die Ak-Reinigungen durchgeführt.

15. Verfassen von Zwischen- und Endbericht (en)

Jedes Jahr wurde ein Jahresbericht geschrieben. Am Ende der Projektes ein Endbericht.

Abschlußbericht


Anhang 2.1: Arbeitsanweisung für den Prototypen des Feldgerätes Immunosensor – Operating Procedures

Version 1

Preparation of Tracer-solution

Tracer is already diluted 3x. Final dilution is 6000. Dilute 4.5 µl to 9 ml with PBS. Keep refrigerated. Do not allow solution to come to room temperature. 0.3 ml in syringe to room temperature 5 min before measurement.

Preparation of substrate

Allow to come to room temperature. Mix solutions 1:1, no dilution. Substrate comes through valve 1. 30 sec of substrate pumping is programmed -> ca. 150 µl per chip. The instrument is primed with ca. 600 µl (2 min pumping)

Washing the System

1. Start Program: washing with PBST 2. Start Program: washing with substrate

Measurement

Time Step 00:00 Take chip from the freezer to the refrigerator (+4°C) 00:20 Take chip from the refrigerator, allow to take room temperature 00:40 Fill cell with 1 ml PBST (washing buffer), fill the reservoir with tracer. 00:45 Remove air from connections by filling with PBST, connect chip to groundplate

make measurement: refill sample reservoir when sample is drawn, open security lid and close case, start data acquisition before the substrate is drawn.

ATTENTION!

Keep the same sample handling times for all chips!

Same incubation temperature for all chips! If 18 °C cannot be reached, take a higher temperature e.g. 22°C.

Washing of the system after measurement

Fix rinsing chip

Put all tubings into water, fill sample reservoir with water

Run washing program 3 times.

ATTENTION!

Watch the battery voltage – it must be more than 10 V!

Protect substrate from light. Prepare freshly every day.

Make sure the pump is empty – instrument will not empty the pump if the door is open.

Abschlußbericht


Preparation of needed solutions

Preparation of buffers

Coating buffer = 50mM carbonate buffer. Dilute 1.59 g Na2CO3 and 2.94 g NaHCO3 to 1 l final volume with dist. water. PBS: Dilute 0.69 g NaH2PO4, 6.23 g Na2HPO4 and 5.84 g NaCl to 1 l final volume with dist. water. PBST (washing buffer): Mix 0.1 l PBS, 0.9 l Wasser, 0.5 ml 0.05 % (v/v) Tween 20 Regeneration buffer: 14.7 g Na-citrate and 2.9 g NaCl, fill to 1 l with dist. water. Adjust pH to 2.5 with HCl (conz.)

Reconstitution of Protein A/G

Stock solution: 5 mg (all) in 2.5 ml PBST/glycerol (1:1 v/v) Aliquot to 25 x 100 µl, store in Eppendorf-vials in the freezer (-24 °C)

Working solution of Protein A/G

12 µl in 6 ml carbonate buffer (1:500). 0.5 ml are needed for each chip

Antibody solution

6 µl diluted in 6 ml in PBS

Milkpowder solution

1% (w/v) in PBS. About 300 mg milk powder diluted to 30 ml with dist. water.

Regeneration of the surface

Wash with 5 ml Regeneration Buffer. Washing 4 times with 5 ml water (1 time backflush) Wash the tracer reservoir with 5 ml water. Wash the sample reservoir 5-10 times with water. Dry with nitrogen

Preparation of the chips with antibody

Each chip is washed with 0.5 ml Protein A/G-solution. Incubate 2 hours at RT Each chip is washed with 1 ml PBST (washing)-buffer. Each chip is washed with 0.5 ml Antibody (MAB) solution. Incubate 1 hour at RT Each chip is washed with 1 ml milkpowder solution. Incubate 30 min at RT Wash with 1 ml PBST and empty the chips, dry with nitrogen-gas, then freeze (-24°C)

Abschlußbericht


Tabelle 2.6 Vergleich von Konventionellem ELISA (Mikrotiterplatte), Batch-ELISA auf vereinzelten Strukturen und dem Einwegchip

Conventional ELISA Batch-ELISA Single-use chip

Set-up and adsorption surface

Polystyrene

Gold

Gold

Surface area 139 mm2 (for 150 µl) 87 mm2 87 mm2

Maximum volume 150 µl 1000 µl 9,5 µl

Volume per surface area 1,08 µl mm-2 11,5 µl mm-2 0,11 µl mm-2

Antibody dilution 1:35000 1:10000 1:1000

Antibody volume 150 µl 1000 µl 9,5 µl

Enzyme-tracer dilution 1:2000 1:2000 1:6000

Enzyme-tracer volume 50 µl 300 µl 1/3 of 9,5 µl

Analyte volume 100 µl 600 µl 2/3 of 9,5 µl

Substrate TMB/H2O2 TMB/H2O2 Super Signal

(Luminol-Enhancer/H2O2)

Substrate volume 150 µl 1000 µl 9,5 µl

Signal Absorbance Absorbance Chemiluminescence

aus: I.M. Ciumasu et al. Biosens. Bioelectron., akzeptiert

Abschlußbericht


3. Bekannt gewordene F&E-Ergebnisse Dritter s. Bericht der (WASAG DECON) und eine neue Publikation:

Charles, P.T., Shriver-Lake, L.C., Francesconi, S.C., Churilla, A.M., Rangasammy, J.G., Patterson Jr., C.H., Deschamps, J.R., Kusterbeck, A.W., Characterization and performance evaluation of in vivo and in vitro produced monoclonal anti-TNT antibodies for the detection of TNT. J. Immunol. Methods. 284 (2004) 15-26. Weitere neue F&E-Ergebnisse sind nicht bekannt geworden.

5. Angemeldete Schutzrechte Gemeinsame Patentanmeldung von IMM und TUM: Patentanmeldung DE 102 45 845.6 „Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer Probe und Meßchip hierfür“ beim Deutschen Patent- und Markenamt am 30.09. 2002 eingereicht. G. Kolb, P. Krämer, I. Frese

5. Gesamtliste der Veröffentlichungen, Poster und Vorträge

Anm.: Es werden in den nächsten Monaten noch weitere Publikationen geschrieben, die leider noch nicht in diesen Bericht gelistet werden können.

5.1 Veröffentlichungen

Petra M. Krämer, Elisabeth Kremmer, Cristina M. Weber, Ioan M. Ciumasu, Antonius A. Kettrup Development of a panel of new rat monoclonal antibodies with different selectivities and sensitivities for 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) and other nitroaromatic compounds. Analytical Bioanalytical Chemistry (eingereicht) Ioan M. Ciumasu, Petra M. Krämer, Cristina M. Weber, Gunther Kolb, David Tiemann, Stefan Windisch, Ines Frese, Antonius A. Kettrup A new, versatile field immunosensor for environmental pollutants. Development and proof of principle with TNT, diuron, and atrazine. Biosensors and Bioelectronics (akzeptiert)

5.2 Poster

The Eighth World Congress on Biosensors, Granada, Spanien, 24.-26. Mai 2004

I.M. Ciumasu, P.M. Krämer, C.M. Weber, G. Kolb, D. Tiemann, S. Windisch, I. Frese, A.A. Kettrup Single-use field immunosensor for environmental pollutants. Proof of principle for nitroaromatics and pesticides. (Abstract book P.2.4.8)

P.M. Krämer, C.-M. Weber, I.M. Ciumasu, E. Kremmer, A.A. Kettrup Development of monoclonal antibodies for 2,4,6-trinitrotoluene and its metabolites 2-amino-4,6-dinitrotoluene and 4-amino-2,6-dinitrotoluene for their use in immunosensors (Abstract book P.2.4.60)

Abschlußbericht


ANAKON 2003, Konstanz, 2.-5. April 2003 P.M. Krämer, C.-M. Weber, A.A. Kettrup, Optimierungen zur Entwicklung eines miniaturisierten, automatisierten, immunochemischen Test-Systems für verschiedene Pestizide. Abstract im Tagungsband: Topic, ‚Sensoren, Bioassays, Prozessanalytik, Chemometrie, Standardi-sierung’, Poster C-022, Seite 188 IUPAC 2002, Basel, Schweiz, 4.-9. August 2002 P.M. Krämer, M. Ciumasu, C. Weber, G. Kolb, I. Frese, B. Werner, A.A. Kettrup, Development of an automated miniaturized immunochemical device for on-site screening of pesticides in water. Abstract im Tagungsband: Main Topic 6, Residues and Consumer Safety, Subtopic 6a ‘Trends in Analytical Methods and Instrumentation’, Poster 6a.01, Seite 201

5.3 Vorträge Petra M. Krämer Immunoassay developments and applications for the analyses of pesticides and nitroaromatic compounds. First SWIFT-WFD Workshop on Validation of Robustness of Sensors and Bioassays for Screening Pollutants. Mao, Menorca, Spain, December 2-3, 2004 P.M. Krämer, I.M. Ciumasu, C.M. Weber, G. Kolb, D. Tiemann, I Frese, H.Löwe, A.A. Kettrup A new, automated, portable immunochemical system for field screening. The 6th Workshop on Biosensors and BioAnalytical µ-Techniques in Environmental and Clinical Analysis. ENEA – University of Rome ‘La Sapienza’, Italien, 8.-12. Oktober 2004 Petra M. Krämer, Ioan M. Ciumasu, Cristina-Mihaela Weber, Antonius A. Kettrup, David Tiemann, Ines Frese, Gunther Kolb Entwicklung eines neuen, tragbaren, automatisierten Einweg-Immunosensors für eine Vor-Ort-Auswahl von mit Umweltschadstoffen belasteten Proben. Graduiertenkolleg ‚Analytische Chemie’, 2.-4. Februar 2004, Blaubeuren, FRG Gunther Kolb, David Tiemann, Fangming Jiang, Petra Krämer, Ioan Ciumasu, Volker Hessel, Holger Löwe A Mobile Immunochemical Analytical System for Fast On-site Analysis of Environmentally Relevant Chemicals 2nd Defence Nanotechnology Conference, November 6-7 2003, London, UK Ines Frese, Petra M. Krämer, Ioan M. Ciumasu, Cristina M. Weber, Gunther Kolb, David Tiemann Development of an optical detection cell for an automated miniaturized immunochemical device for on-site screening of pesticide residues in water. Internationale Messe mit Kongress „Sensor 2003“, 13.-15. Mai 2003, Nürnberg, F.R.G. Gunther Kolb, Volker Hessel, Petra Krämer, Holger Löwe, David Tiemann, Bernd Werner. Ein mobiles immunochemisches Analysensystem für die schnelle Vor-Ort-Analytik von umweltrelevanten Chemikalien. 11. Heiligenstädter Kolloquium, Heilbad Heiligenstadt, F.R.G., Sept. 2002 (Abstract im Tagungsband)

Abschlußbericht


6. Vorstellung des Feldgerät-Demonstrators auf Messen und Pressearbeit (IMM) Das Gerät wurde auf folgenden Messen vorgestellt: HMI 2003 07.-12. April 2003 ACHEMA 2003 19.-23. Mai 2003 BIOTECHNICA 2003 07.-09. Oktober 2003 In Folgenden ist Resonanz der Presse auf ein Informationsrundschreiben des IMM-Marketing zusammengefasst: November 2002, EUWID Europäischer Wirtschaftsdienst, "Forschungsprojekte: Vor-Ort-Analytik von TNT“ November 2002, IDW-Online.de, "Miniaturisiertes Einweglabor soll Umweltanalysen vor Ort erlauben“ Dezember 2002, Transkript, "Antikörper-Sprengstoff-Chip spürt TNT auf“ Januar 2003, Umweltmedizin, "Mini-Analysesystem entwickelt“ Januar 2003, Embedded Engineering, "Wegwerfchip für schnelle TNT-Analyse“ Januar 2003, EUWID Europäischer Wirtschaftsdienst, Vor-Ort-Analytik von TNT und Pestiziden Januar/Februar 2003, umwelt praxis, "Miniaturisiertes Einweglabor spürt TNT in Böden auf“ Februar 2003, F&M, "Wegwerfchip für schnelle TNT-Analyse“ März 2003, Dialog, "TNT-Analysis with Microchips"

Documents

Abschlußbericht - cleaner-production.de · Insektizids Carbaryl, und 2.) gegen Isoproturon, ein häufig verwendetes Herbizid. Beim letzteren Beim letzteren handelt es sich um jüngste