This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

8 0 6 W. SCHARLEMANN

Acridin-Alkaloide aus Kalluskulturen von Ruta graveolens L. Acridine-Alkaloids from Callus Cultures of Ruta graveolens L.

WOLFGANG SCHARLEMANN

Institut für Pharmakognosie der Universität Würzburg

(Z. Naturforsch. 27 b, 8 0 6 - 809 [1972] ; eingegangen am 13. April 1972)

Acridin-Alkaloide, Kalluskulturen, Ruta graveolens, Rutaceen

Rutacridone, 1-hydroxy-A-methylacridone, and l-hydroxy-3-methoxy-A-methylacridone have been isolated for the first time from callus cultures, which had been obtained from meristematic stem cells of Ruta graveolens L. The alkaloids were identified by co-chromatography with authentic compounds, by IR spectra, and by electronic spectra before and after addition of A1C13 . The use of the bathochromic shift by the AlCl3-complex in the analysis of acridine-alkaloids has been demonstrated for the first time.

Bei Untersuchungen der Chlorophylle und Caro-tinoide aus Kalluskulturen von Ruta graveolens (SCHARLEMANN U. CZYGAN \ SCHARLEMANN 2 ) i so -lierten wir ein gelbes Stoffgemisch, das keine Caro-tinoideigenschaften, sondern in seinen chemischen Reaktionen mit Flavonoiden Ähnlichkeiten zeigte. Wie die genaue Identifizierung ergab, handelte es sich aber um ausschließlich in einigen Rutaceen vor-kommende Acridin-Alkaloide3. Aus der intakten Rautenpflanze sind Vertreter dieser Stoffgruppe be-reits isoliert worden 4~6. Dagegen wurden Acridin-Alkaloide in Gewebekulturen von Ruta bisher nicht nachgewiesen.

Material und Methoden

Die Kalluskulturen von Ruta graveolens L., die ur-sprünglich von REINHARD et al.7 aus Stengelstücken einer Rautenpflanze angelegt worden sind, wurden auf einem modifizierten Nähragar nach ERIKSSON 8 heran-gezogen. Der Nähragar enthielt anstelle von EDTA, FeS04 und Zn — Na^EDTA folgende Bestandteile: Fe (III) EDTA (42,8 mg/1), ZnS04 • 7 H20 (10,26 mg/1) und zusätzlich m-Inosit (100mg/l).

Die Gewebe wurden nach 8-wöchiger Kultur9 im Dauerlicht (ca. 1800 Lux) geerntet, bei 40 °C getrock-net und in einer Soxhlet-Apparatur mit Aceton bis zur Farblosigkeit extrahiert. Nach Verseifen 10 des Extrak-tes wurden die Acridin-Alkaloide dünnschichtchromato-graphisch (de) im verteilungschromatographischen Sy-stem von H A G E R U. MEYER-BERTENRATH 11 von den Carotinoiden und Chlorophyllderivaten abgetrennt.

Für die Auftrennung des Alkaloidgemisches in drei Komponenten (Xga, X2b» X3) verwendeten wir die de

Sonderdrudeanforderungen an Dr. W. SCHARLEMANN, Institut für Pharmakognosie der Universität Würzburg, D-8700 Wiirzburg, Mittlerer Dallenbergweg 64.

Systeme I und II. Die Co-Chromatographie mit authen-tischen Vergleichssubstanzen erfolgte in den Systemen I bis VI.

System 1: Schicht11: CaC03 + MgO + Ca (OH), (29,5 + 6 + 5 Gew.-Tle.) ; Fließmittel12: Petrolben" zin (Sdp. 1 0 0 - 140 °C) + Benzol + Methanol + Me-thyläthylketon (70 + 20 + 2 + 8 Vol.-Tle.). System II12: Schicht: Polyamid 11 Fo54-Fertigplatten Merck; Fließmittel: Petrolbenzin (Sdp" 100-140 °C) + Ben-zol + Methanol + Methyläthylketon (50 + 40 + 5 + 5 Vol.-Tle.). Systeme III-VI: Schicht: Kieselgel G Merck (Schichtdicke 0,25 mm; bei 105 °C aktiviert); System III13: Fließmittel: Benzol + Essigsäureäthyl-ester (60 + 40 Vol.-Tle.). System IV4: Fließmittel: Toluol + Essigsäureäthylester + Ameisensäure (50 + 40 + 10 Vol.-Tle.). System V14: Fließmittel: Benzol + Pyridin (96 + 4 Vol.-Tle.). System VI14: Fließ-mittel: Benzol + Ameisensäureäthylester + Ameisen-säure (65 + 30 + 5 Vol.-Tle.).

Die Elektronenanregungsspektren im ultravioletten und sichtbaren Spektralbereich wurden mit dem Spek-tralphotometer Zeiss DMR 21 in Methanol automatisch registriert (Registriergeschw.: 15 min/Trommelumdr.; Registrierdispersion: 1 mm ^ 1 nm; Küvetten: 1 cm Quarz Halbmikro MT 4). Die Aufnahme der IR-Spek-tren erfolgte in KBr-Preßlingen mit dem Gerät IR-10 Beckman 15.

Ergebnisse und Diskussion

Drei Acridin-Alkaloide fanden wir in den Kallus-kulturen von Ruta graveolens: Rutacridon (X^a)? 1-Hydroxy-A^-methylacridon (X2b) und 1-Hydroxy-3-methoxy-7V-methylacridon (X3) 16.

Zur Identifizierung der Alkaloide dienten folgende Kriterien: a) Spektren im UV und im sichtbaren Bereich und die Verschiebung ihrer Maxima nach AlCl3-Zusatz, b) Co-Chromatographie mit authenti-schen Substanzen und c) IR-Spektren.

ACRIDIN-ALKALOIDE AUS KALLUSKULTUREN VON RUTA GRAVEOLENS L. 8 0 7

Rutacridon (X2a)

R=H: 1-Hydroxy-N-methylacridon (X2b)

R=OCH3:1-Hydroxy-3-methoxy-N-methylacridon (X3)

nm —

Abb. 3. Spektren von l-Hydroxy-3-methoxy-iV-methylacridon (X3) in Methanol. Vergleiche Abb. 1.

findlichen Keto- und Hydroxygruppen eine Kom-plexbildung ein 17. Eine den Flavonoiden ähnliche Grundstruktur liegt auch bei den Acridin-Alkaloiden vor: Neben der hier in C-9-Position vorhandenen Ketogruppe befindet sich in o-Stellung am C-l eine freie oder methylierte Hydroxygruppe. Diese Kom-plexbildung wurde damit erstmals von uns für die Analytik von Acridin-Alkaloiden benutzt.

Audi weitere „typische" Flavonoidreaktionen zei-gen die aus dem Ruta-Kallus isolierten Acridone. So verfärben sie sich z. B. mit konz. H2S04 , mit 1-proz. Vanillinlösung in 25-proz. HCl oder mit dem „Na-turstoff"-Reagenz18 orange (weitere Hinweise vgl. I .e . 2 ) .

ad b) Die chromatographischen Vergleiche der isolierten Alkaloide mit bekannten Acridin-Alka-loiden in 6 verschiedenen dc-Systemen zeigt Tab. 1. Auch im chromatographischen Verhalten stimmen X2a mit Rutacridon, X2b mit l-Hydroxy-ZV-methyl-acridon und X3 mit l-Hydroxy-3-methoxy-methyl-acridon überein.

ad c) Das IR-Spektrum von X2a ist mit dem von authentischem Rutacridon identisch: Hauptbanden bei 1625, 1593 und 1540 cm"1 (1. c. 5 ) .

Die entsprechenden Werte für X2b liegen bei 1625, 1595 und 1555 cm - 1 , genau wie bei authenti-schem l-Hydroxy-A^-methylacridon. Von X3 konnte kein IR-Spektrum aufgenommen werden, da zu we-nig Substanz zur Verfügung stand.

Erstmals wurden in Gewebekulturen von Ruta graveolens Acridin-Alkaloide gefunden. Es ist von besonderem Interesse, daß Rutacridon und 1-Hy-droxy-A-methylacridon bisher nur aus Wurzeln 5' 6, nicht dagegen aus den oberirdischen Organen der i?iito-Pflanze isoliert werden konnten. Im Stengel, aus dem die untersuchte Kalluskultur ursprünglich

ad a) Acridone zeigen charakteristische Spektren (Abbn. 1 bis 3) . Nach Zusatz von A1C13 (3%) zur methanolischen Lösung der Alkaloide tritt eine bathochrome Verschiebung der Maxima ein, z. B. wird das Maximum bei ca. 400 nm um etwa 40 nm verschoben (Abbn. 1 bis 3) . Lage und Höhe der Maxima vor und nach der Verschiebung durch AlCl3-Zusatz stimmen mit authentischem Material überein.

nm —

Abb. 2. Spektren von 1 -Hydroxy-A-methylacridon (X2b) m Methanol. Vergleiche Abb. 1.

Bekannt ist diese Reaktion bei Flavonoiden. Sie wird dort zur Analytik herangezogen. Das Alumi-niumchlorid geht dabei mit den o-Dihydroxygrup-pen, aber auch mit den zueinander in o-Stellung be-

Abb. 1. Spektren von Rutacridon (X2a) in Methanol vor ( — — ) und nach (• • •) AlCl3-Zusatz.

8 0 8 ACRIDIN-ALKALOIDE AUS KALLUSKULTUREN VON RUTA GRAVEOLENS L. 808

dc-System I II III IV V VI

Arborinin * (0,13)+ 0,32 0,23 0,45 0,06 0,33

l-Methoxy-3- ** hydroxy-A-methylacridon

0,00 0,02 0,01 0,09 0,01 0,00

1.3-Dihydroxy- ** A-methyl- 0,00 acridon

0,05 0,29 0,52 0,07 0,39

x 3 (0,31)+ 0,42 0,49 0,61 0,22 0,61

l-Hydroxy-3- *** methoxy-A- (0,31)+

methylacridon 0,42 0,49 0,61 0,22 0,61

Rutacri-don- * caprylat

(0,18) + 0,67 0,45 0,66 0,09 0,57

X 2 a 0,55 0,57 0,57 0,66 0,24 0,66

Rutacridon * 0,55 0,57 0,57 0,66 0,24 0,66

X2b 0,55 0,47 0,57 0,66 0,29 0,66

1-Hydroxy-A- * methyl- 0,55 0,47 0,57 0,66 0,29 0,66 acridon

Tab. 1. Rf-Werte der Acridin-Alkaloide (X2a, X2b > X3) aus /?uta-Kallus und authentischer Vergleichssubstanzen in 6 dc-Systemen. + Schwanzbildung. * wurde uns von Dr. SZENDREI, * * v o n P r o f . RITCHIE u n d * * * v o n D r . FISH z u r

Verfügung gestellt.

angelegt wurde, kommt nur Arborinin (1-Hydroxy-2.3-dimethoxy-7V-methylacridon) vor4 . Dieses Acri-

don konnte allerdings mit der von uns verwendeten Methode weder in den Ausgangspflanzen noch in den Kalluskulturen nachgewiesen werden. Das unter-schiedliche Alkaloidmuster der Stengelzellen intakter Pflanzen und der daraus gewonnenen Gewebekultu-ren wirft eine Reihe interessanter Fragen auf. So ist denkbar, daß in der intakten Pflanze zwar Rutacri-don und 1-Hydroxy-A^-methylacridon im Stengel bio-synthetisiert, dann aber in die Wurzel transportiert werden. Wahrscheinlicher ist allerdings, daß im Ver-band der intakten Pflanze die Fähigkeit der Stengel-zellen zur Biosynthese der Wurzel-Acridone durch endogene oder exogene unbekannte Faktoren unter-drückt ist. Erst in der Kalluskultur gewinnen dann diese Zellen ihre Omnipotenz wieder zurück. In wei-teren Versuchen soll geprüft werden, wie in intakten Pflanzen, die durch Differenzierung aus Stengelkalli hervorgegangen sind, die Alkaloide verteilt sind.

Herrn Dr. F . FISH, Glasgow, Herrn Prof. Dr. E . RITCHIE, Sydney, Herrn Dr. K . SZENDREI, Szeged, und Herrn Dr. E . WOLLENWEBER, Darmstadt, danken wir für die zur Verfügung gestellten Vergleichssubstanzen und für methodische Hinweise. Der Deutschen For-schungsgemeinschaft sind wir für Sachbeihilfen zu Dank verpflichtet.

Diese Untersuchungen sind Teile einer Dissertation. Herrn Prof. Dr. F . - C . C Z Y G A N danke ich für die Auf-gabenstellung und die stets hilfsbereite Leitung.

1 W . SCHARLEMANN U. F.-C. CZYGAN, Herba hungarica, im Drude.

2 W. SCHARLEMANN, Dissertation Würzburg 1972. 3 D . GRÖGER, i n : K . MOTHES U. H . R . SCHÜTTE ( H e r a u s g . ) ,

Biosynthese der Alkaloide, 562. VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlin 1969.

4 I . N O V A K , G . BUZAS, E . MINKER, M . KOLTAI U. K . SZENDREI, Planta med. [Stuttgart] 15, 132 [1967].

5 J . REISCH, K . SZENDREI, E . MINKER, a n d I . N O V A K , A c t a pharm. Suecica 4, 265 [1967].

0 J . REISCH, K . SZENDREI, I . NOVAK, E . MINKER U. ZS. ROZSA, Experientia [Basel] 27,1005 [1971].

7 E . REINHARD, G . CORDUAN U. 0 . H . VOLK, P l a n t a m e d . [Stuttgart] 16, 8 [1968].

8 T. ERIKSSON, Physiol. Plant. 18, 976 [1965]. 9 An den verwendeten Kulturen waren mikroskopisch keine

Sproß- oder Wurzelanlagen zu erkennen.

10 F.-C. CZYGAN, Arch. Mikrobiol. 61, 81 [1968]. 1 1 A . HAGER U. T . MEYER-BERTENRATH, P l a n t a 6 9 , 1 9 8

[1966]. 12 E. WOLLENWEBER, persönliche Mitteilung. 13 K. SZENDREI, persönliche Mitteilung. 1 4 H . H . S . F O N G , N . R . FARNSWORTH, a n d G . H . SVOBODA.

Lloydia 32 ,110 [1969]. 15 Die IR-Spektren wurden im Inst. f. Pharm, u. Lebensmit-

telchemie Würzburg (Prof. Dr. C. H. BRIESKORN) dan-kenswerter Weise aufgenommen.

16 Bisher nur in Fagara leprieurii Engl, gefunden: F . FISH and P. G. WATERMAN, Phytochemistry 10, 3322 [1971].

1 7 T . J . M A B R Y , K . R . M A R K H A M , a n d M . B . THOMAS, T h e Systematic Identification of Flavonoids. Springer-Verlag. Berlin-Heidelberg-New York 1970.

18 Firma Roth, Karlsruhe.