299E. Urban

• durch Polarimetrie

• durch NMR-Spektroskopie - NMR-Spektroskopie mit chiralen shift-Reagenzien

- NMR-Spektroskopie diastereomerer Derivate • durch Gaschromatographie (GC) - GC an chiralen Phasen

- GC diastereomerer Derivate • durch Hochdruckflüssigchromatographie - HPLC an chiralen Phasen - HPLC diastereomerer Derivate

• durch Kapillarelektrophorese (CE)

Analytische Methoden zum Nachweis der Reinheitvon Enantiomeren und Diastereomeren :

300E. Urban

Die Reinheit chiraler Verbindungen und die Selektivität asymmetrischerSynthesen wird durch die Angabe des Enantiomerneüberschuß (% ee)charakterisiert.

[E1 - E2]

[E1 + E2]x 100% ee =

% ee = Enantiomerenüberschuß in %E1 > E2E1 = Enantiomer 1E2 = Enantiomer 2

% ee = 0% Racemat% ee = 100% reines Enantiomer E1

Enantiomerenüberschuß:

301E. Urban

Nachweis der Enantiomerenreinheit durch Polarimetrie

Definition:Polarimetrie nennt man die Messung der Drehung der Polarisationsebene deslinear polarisierten Lichts durch optisch aktive Substanzen.Unter optischer Aktivität versteht man die Eigenschaft verschiedener Stoffe,bei Durchstrahlung mit linear polarisiertes Licht, dessen Ebene um einengewissen Winkel α zu drehen.

circular polarisiertes Licht linear polarisiertes Licht

302E. Urban

Herstellung von polarisiertem Licht:

Zur Herstellung von polarisiertem Licht wird ein Nicol‘sche Prisma verwendet.Das Nicol‘sche Prisma kann aber ebenso als Analysator zur Untersuchung vonpolarisiertem Licht verwendet werden, da es nur Licht einer bestimmten Polarisations-richtung durchläßt.

68°

Canada-Balsam

circular polarisiertes

Licht

linear polarisiertes

Licht

Nicol'sches Prisma

Calciumcarbonat (= Kalkspat)

303E. Urban

Aufbau eines Polarimeters:

304E. Urban

Meßergebnis:Auf diese Weise kann man nicht nur ermitteln, daß eine Substanz optisch aktivist und in welche Richtung die Drehung erfolgt, sondern man kann auch denDrehwinkel messen. Diese entspricht einfach der Gradzahl um den man denAnalysator drehen muß, damit er wieder mit der Schwingungsebene korreliert.

[α] =20D

α

l d.Drehwert von Flüssigkeiten

(d = Dichte in g/ml)

[α] =20D

α

l c.Drehwert von Lösungen(c Konzentration in g/ml)

305E. Urban

Anwendung der Polarimetrie:• zur Gehaltsbestimmung von Verbindungen mit bekannter spezifischer Drehung

• zur Identitäts und Reinheitsprüfung

• zur Bestimmung der optischen Reinheit eines Enantiomerengemisches

• zur Bestimmung der Absolutkonfiguration (Vorzeichen des Drehwertes)

Nachteile der Methode:

• hoher Probenbedarf

• spezifische Drehung (= Drehwert) mancher chiraler Stoffe sehr gering

• Meßgenauigkeit hängt von vielen Faktoren an (Temperatur, Lösungsmittel,

pH, Verunreinigungen,... )

306E. Urban

Bei enantiomer angereicherten Proben wird der Drehwinkelvom Enantiomerenüberschuß bestimmt und zum Drehwinkeleiner enenatiomerenreinen Probe in Beziehung gesetzt .

[α]

[α]maxx 100% ee =

% ee = Enantiomerenüberschuß in %

Beispiel: 99% ee bedeutet 99.0% (R) + 1.0% (R+S)

= 99,5% (R) + 0,5% (S)

Enantiomerenüberschußbestimmung durch Polarimetrie:

307E. Urban

Präzision von polarimetrischen Messungen:Die Einfachheit der Messung täuscht eine hohe Präzision vor(" man kann da doch nichts falsch machen")

Beispiel: 1-Phenyl-ethan-1,2-diol[α] = -52,2 (c=0,77 in MeOH)20

D

• Ablesung am Polarimeter: α = 0.407 (∆α = 0.005)• Zelllänge: l = 1 dm (∆l = 0.001 dm)• Einwaage: m = 0,0770 g (∆m = 0.0001 g)• Volumen des Lösungsmittels: V = 10.00 ml (∆V = 0.10 ml)

Fehler: 1.6% ! daher ee-Angaben aufgrund der Drehwertmesungin diesem Beispiel nur bis Maximal 97% ee sinnvoll !

Fehler: [α] = -52,2 ± 0,84 (c= 0.77 in MeOH)20D

308E. Urban

Einfluß desWassergehalt des Lösungsmittels:

309E. Urban

O OH

HO H

HDD

α-D-Glucopyranose

[α] = + 11220D

HOOH

OHO OH

H H

HODL

β-D-Glucopyranose

[α] = + 1920D

HOOH

OH

Mutarotationsgleichgewichtsmischung: 36% α + 64% β

Kristalle aus Wasser Kristalle aus MeOH

[α] = + 52,520D

Offenkettige Form: 0,0026% = 26 ppm !

Einfluß von Gleichgewichtsreaktionen:

310E. Urban

Nachweis der Enantiomerenreinheit durch NMR

Enantiomere unterscheiden sich prinzipiell NMR-spektroskopisch nicht !Lediglich Diastereomere können unterscheidbare NMR-Signale liefern !Daher ist der Zusatz von enantiomerenreine Hilfsstoffen erforderlich.

Methoden:- Lösungsmittel oder Lösungsmitteladditiv ist chiral und enantiomerenrein; es bilden sich diastereomere Komplexe- vor der Messung erfolgt die Synthese von diastereomeren Derivaten mit einem enatiomerenreinen Hilfsstoff

Voraussetzungen für die Anwendbarkeit der Methode:- das NMR-Spektrum des Analyten sollte möglichst viele differenzierte NMR-Signale liefern- die getrennt detektierten Signale sollten keine Kopplungen aufweisen- das signal/noise-Verhältnis erlaubt eine quantitative Auswertung

311E. Urban

Als Lösungsmitteladditive werden Komplexe von Lanthaniden (Eu, Pr, Yb,) mit chiralen Komplexbildnern (meist Campher-Derivate) verwendet

- Europium(II), MG = 152, Z = 63- Praseodym(III), MG = 141, Z = 59- Ytterbium(III), MG = 173, Z = 70

Diese Schwermetalle liefern große shift-Effekte ohne große LinienverbreiterungDer Effekt der kommt über die Bindungen und durch Dipolwirkung zustande und ist abhängig vom Abstand zum Schwermetall- Eu, Yb: liefert Tieffeldverschiebung- Pr: ergibt HochfeldverschiebungAls chirale Komplexbildner werden fluorierte Diketone verwendet, die auschiral-pool-Bausteinen (z.B.Campher) hergestellt werden können

ee-Bestimmung mit chiralen shift-Reagenzien

312E. Urban

Chirale shift-Reagentien (1)

313E. Urban

Chirale shift-Reagentien (2)

314E. Urban

O

Eu/3

O

C3F7

Europium(III) tris[3-(heptafluorobutanoyl)-(1R)-camphorat = Eu(hfc)3

O

O

Cl

H

(S)-Methyl-2-Chlor-propanoat

Beispiel:

315E. Urban

Anwendungsbereich:Diese Methode ist für Arzneistoffe geeignet, die einen Komplex mit dem chiralen shift-Reagens bilden könnenAmine, Aminosäureester, Alkohole, Hydroxysäureester,Thiole, Oxirane,Aziridine, Aldehyde, Ketone, Ester, Sulfoxide, ...

Präzission der Methode:stark abhängig von Signalform, Signaltrennung und somit der Feldstärke

für das Beispiel (S)-Methyl-2-Chlor-propanoat / Eu(hfc)3 gilt laut Literaturangaben: 99.8 ± 1% ee bei 400 MHz

316E. Urban

ee-Bestimmung nach Derivatisierung zu Diastereomeren

Die Derivatisierung von Enantiomerenmischungen mit chiralen Reagentien führt zu diastereomeren Produkten; diese haben unterschiedliche NMR-Spektren Detektierbare Kerne: 1H, 13C, 19F, 31P,..

Kern natürlicheHäufigkeit

in %

Spin Larmor-Frequenz(MHz)

Verschiebungsbereichδ(ppm)

1H 99,989 1/2 500,0000 12 bis -1

13C 1,070 1/2 125,7520 240 bis -10

15N 0,358 1/2 50,6990 1200 bis -500

19F 100 1/2 470,2850 100 bis -300

31P 100 1/2 202,5890 230 bis -200

317E. Urban

Voraussetzungen für die Anwendbarkeit der Methode:a) chirales Reagens muß verfügbar sein (möglichst beide Antipoden)b) chirales Reagens muß klar getrennte, scharfe Signale liefert (z.B. CH3, OCH3, CF3, tBu,...)c) Derivatisierungsreaktion muß quantitativ verlaufen (keine kinetische Racematspaltung !)d) während der Derivatisierung darf keine Racemisierung des Analyten, des Reagenzes oder der Produkte auftretene) es darf kein Reinigungsschritt vor der NMR-Messung stattfinden, da die Gefahr der Anreicherung eines Diastereomers bestehtf) das NMR-Spektrum des Analyten sollte möglichst viele differenzierte NMR-Signale lieferng) Die optische Reinheit des Reagenzes ist limitierend für die Bestimmung geringer Antipodenkonzentrationenh) 13C-NMR-Signale werden durch unterschiedliche NOE-Effekte unterschiedlich groß - aber gleichartige Kohlenstoffsignale können verglichen werden

318E. Urban

Beispiel:

319E. Urban

Nachweis der Enantiomerenreinheit durch GC

Voraussetzungen für die Anwendbarkeit der Methode:- ausreichende Löslichkeit - ausreichende Flüchtigkeit (eventuell erst nach Derivatisierung)- ausreichende thermische Stabilität (Racemisierungsgefahr !)Vorteile der Methode:- hohe Geschwindigkeit- hohe Empfindlichkeit- hohe Auflösung- hohe Präzision - gute ReproduzierbarkeitNachteile der Methode:- Enantiomere lassen sich durch GC nur an chiralen stationären Phasen trennen !- An achiralen GC-Phasen kann der Nachweis der Enantiomerenreinheit erst nach einer Synthese von diastereomeren Derivaten erfolgen !

320E. Urban

Nachweis der Enantiomerenreinheit durch GC

321E. Urban

Präzision von gaschromatographischen Analysen:

sehr hoch, da meist geringes Grundrauschen !0.1- 1% des "minor" Antipoden noch detektierbar

Fehlerquellen:• Zersetzung der Probe auf der Säule; bei großen Trennfaktoren bleibt ein Enantiomer länger auf der Säule (Minusfehler !)• co-Ellution von Verunreinigungen (Plusfehler !)• "minor" Antipode verschwindet bei der Derivatisierung• Racemisierung von konfigurativ labilen Verbindungen im Einspritz-Port oder auf der Säule

• Detektorlinearität nich gegeben 0.1% ee bedeutet Linearität über 3 Zehnerpotenzen !

322E. Urban

323E. Urban

324E. Urban

325E. Urban

326E. Urban

Nachweis der Enantiomerenreinheit durch HPLC

• HPLC-Trennung der Oxacepam-Enantiomere an einer chiralen stationärer Phase• HPLC-Trennung von α-Aminosäuren nach Derivatisierung

327E. Urban

HPLC-Trennung der Oxacepam-Enantiomere an einer chiralen stationärer Phase:

328E. Urban

Trennung von Trennung von α-Aminosäuren nach Derivatisierung:

329E. Urban

330E. Urban

Chromatogramm des Racemates:

331E. Urban

Standard (Racemat) Area (L) in % Area (D) in %

49,18 50,8249,25 50,7549,00 51,0049,18 50,8249,50 50,5049,50 50,50

Mittelwert 49,27 50,73

Korrekturfaktor 1,015 0,986

Analyse des Racemates:

N

S

NOH

COOHH

COOHH

N

S

NOH

COOHH

COOHH

(L) (L)

(D)(L)

332E. Urban

Chromatogramme der Proben:

333E. Urban

Analyse der Probe:

N

S

NOH

COOHH

COOHH

N

S

NOH

COOHH

COOHH

(L) (L)

(D)(L)

Korrekturfaktor für L-Valin = 1,015 Korrekturfaktor für D-Valin = 0,986

[E1 - E2]

[E1 + E2]x 100% ee =

Area (L) Area (L) MW (L) Area korr.(L) Area (D) Area (D) MW (D) Area korr.(D) ee(gef.) main enantiomer

334598 335771 335185 340162 81209 81461 81335 80162 61,86 L94646 96270 95458 96876 295974 296176 296075 291805 50,15 D

334E. Urban

Nachweis der Enantiomerenreinheit durch Kapillarelektrophorese

• Monosaccharid-Anakytik nach Derivatisierung mit (S)-Phenylethylamin• Anakytik von chiralen Aminen nach Derivatisierung mit (D)-Glucuronsäure

UV

30kV

Kapillare

Kappilarelektrophorese(Blockschema)

335E. Urban

D-GlucoseNaBH3CN

HOOH OH

OHOHHN

Ph

HOOH OH

OHOHPh

NH2

HOOH OH

OHOHN

PhH

O

Monosaccharid-Anakytik nach Derivatisierung mit (S)-Phenylethylamin:

B. Lachmann 2000

336E. Urban

-1

0

1

2

3

4

5

10 15 20 25 30 35 40 45

time [min]

mA

U

D,L

-gly

ceri

nald

ehyd

e

D-,L

-ery

D-,L

-thre

oD

-,L-ly

x

L-,D

-gul

L-,D

-xyl

L-,D

-rib D

-,L-a

ra

D-,L

-tal

L-,D

-glc

D-,L

-man

L-,D

-all

L-,D

-gal

D-,L

-alt

Elektropherogramm der (S)-Phenylethylamin-Derivate:

337E. Urban

(S)-O-Methyltyrosinol nach Derivatisierung mit (D)-Glucuronsäure:

B. Lachmann 2002

N

MeO OH

OHH

OH

OH

OH

OH

O

(L)-O-Methyl-tyrosinol

NaBH3CN

N

MeO OH

OH

OH

OH

OH

OH

ONH2

MeO OH

O

OH

OH

OH

OH

OH

O

H

338E. Urban

Elektropherogramme der (D)-Glucuronsäure-Derivate:

0

10

20

30

40

50

60

10 10,5 11 11,5 12 12,5 13 13,

time (min)

mA

U

(S)-

Der

ivat

(R)-D

eriv

at

3,5

3,7

3,9

4,1

4,3

4,5

4,7

4,9

10,5 11 11,5 12 12,5 13 13,5

time (min)

mA

U

(S)-

Der

ivat

(R)-D

eric

atDiastereomerenmischung 1,1% (R)- neben 98,9% (S)-