Andreas Schmitt - Georg-August-Universität Göttingen · Y = Pyrimidin; R = Purin. Das Adenin der Verzweigungsstelle ist rot markiert (nach Burge et al. 1998) Einleitung_____ 8 1.2

Charakterisierung und Kristallisation des

spleißosomalen DEAD-Box Proteins Prp28

Diplomarbeit

vorgelegt von

Andreas Schmitt

aus

Clausthal-Zellerfeld

angefertigt

im Institut für Mikrobiologie und Genetik, Abteilung Molekulare Strukturbiologie

an der biologischen Fakultät der Georg-August-Universität Göttingen

Göttingen, Februar 2009

Referent: Prof. Dr. Ralf Ficner

Korreferent: Prof. Dr. Kai Tittmann

Tag der Abgabe der Diplomarbeit: 25.02.2009

Letzter Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2008

Inhaltsverzeichnis 3

1 EINLEITUNG 6

1.1 INTRONKLASSEN 6

1.2 DER MECHANISMUS DES SPLEIßENS 8

1.3 DAS SPLEIßOSOM 9

1.4 DER SPLEIßZYKLUS 9

1.5 DEXD/H-BOX HELIKASEN 10

1.5.1 FUNKTION DER DEXD/H-BOX HELIKASEN BEIM SPLEIßVORGANG 11

1.5.2 DREIDIMENSIONALE STRUKTUR VON DEXD/H-BOX RNA-HELIKASEN 13

1.5.3 FUNKTION VON DEXD/H-BOX HELIKASEN 14

1.5.4 DIE DEAD-BOX HELIKASE PRP28 15

1.6 AUFGABENSTELLUNG UND ZIELSETZUNG 17

2 MATERIAL UND METHODEN 18

2.1 MATERIAL 18

2.1.1 REAGENZIEN 18

2.1.2 GERÄTE 18

2.1.3 SONSTIGE MATERIALIEN 19

2.1.4 CHROMATOGRAPHIESÄULEN 19

2.1.5 VEKTOREN 20

2.1.6 ENZYME 20

2.1.7 RNA-OLIGONUKLEOTIDE 20

2.1.8 DNA-OLIGONUKLEOTIDE 20

2.1.9 KIT-SYSTEME 20

2.1.10 GRÖßENSTANDARDS 21

2.1.11 ORGANISMEN MIT RESISTENZEN 21

2.1.12 KRISTALLISATIONSSCREENS 21

2.1.13 ANTIBIOTIKA MIT ARBEITSKONZENTRATIONEN 21

2.1.14 COMPUTERPROGRAMME 21

2.2 METHODEN 22

2.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 22

2.2.1.1 Polymerase-Kettenreaktion 22


2.2.1.2 DNA-Sequenzierung 23

2.2.2 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 24

2.2.2.1 Herstellung und Selektionsbedingungen von LB-Agarplatten und LB-

Flüssigmedium 24

2.2.2.2 Herstellung chemisch kompetenter Escherichia coli-Zellen 25

2.2.2.3 Transformation chemisch kompetenter E. coli Zellen 25

2.2.2.4 Expression rekombinanter Proteine in E. coli 26

2.2.2.5 Kontrolle der Expression rekombinanter Proteine 27

2.2.2.6 Zellernte und Aufschluss von Expressionskulturen 27

2.2.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 28

2.2.3.1 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen 28

2.2.3.1.1 Konzentrationsbestimmung nach Bradford 28

2.2.3.1.2 Konzentrationsbestimmung durch UV-Absorptionsmessung 29

2.2.3.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen (SDS-PAGE) 29

2.2.3.3 Anfärben von Proteinen durch Coomassie Brilliant Blue 31

2.2.3.4 Einengen von Proteinlösungen durch Zentrifugation 32

2.2.3.5 Chromatographische Methoden 33

2.2.3.5.1 Affinitätschromatographie 33

2.2.3.5.1.1 Affinitätschromatographische Reinigung von

Hexa-Histidin-Fusionsproteinen 33

2.2.3.5.2 Größenauschlusschromatographie 34

2.2.3.6 Bestimmung von Bindungskonstanten 36

2.2.3.6.1 Fluoreszenztitration 36

2.2.3.6.1.1 Datenaufnahme 37

2.2.3.6.1.2 Korrekturfaktoren 37

2.2.3.6.1.3 Datenauswertung 38

2.2.3.7 Bestimmung der ATPase Aktivität 39

2.2.3.7.1 Datenauswertung 40

2.2.4 KRISTALLOGRAPHISCHE METHODEN 40

2.2.4.1 Kristallisation von Proteinen 40

2.2.4.2 Fein-screening und Additive 42

2.2.4.3 Quervernetzung mit Glutaraldehyd 43

2.2.5 RÖNTGENBEUGUNGSEXPERIMENTE 43


3 ERGEBNISSE 44

3.1 EXPRESSION VON PRP28∆N 44

3.2 REINIGUNG VON PRP28∆N 45

3.2.1 AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHISCHE REINIGUNG ÜBER HIS-TRAP-SÄULEN 45

3.2.2 GRÖßENAUSSCHLUßCHROMATOGRAPHISCHE REINIGUNG ÜBER

GELFILTRATIONSSÄULEN 46

3.3 KRISTALLISATION VON PRP28∆N 48

3.3.1 ENTFERNUNG DER C-TERMINALEN HEXA-HISTIDIN-SEQUENZ 49

3.3.2 FEIN-SCREENING 50

3.4 RÖNTGENBEUGUNGSEXPERIMENTE 51

3.5 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG 52

3.5.1 ATPASE AKTIVITÄT 52

3.5.1.1 Stimulation der ATPase Aktivität durch RNA 55

3.5.2 BINDUNGSSTUDIEN MIT ADP UND ATP 58

3.5.2.1 Bestimmung der Anregungs- und Emissionswellenlänge 58

3.5.2.2 Dissoziationskonstante von Prp28∆N mit mant-ADP und mant-ATP 59

4 DISKUSSION 62

4.1 EXPRESSION UND REINIGUNG VON PRP28∆N 62

4.2 KRISTALLISATION VON PRP28∆N 63

4.3 RÖNTGENBEUGUNGSEXPERIMENTE 64

4.4 ATPASE ASSAY 64

4.4.1 KONTROLLE DES ASSAYS MIT PRP22∆N 64

4.4.2 ATPASE-AKTIVITÄT VON PRP28 66

4.4.3 BINDUNGSSTUDIEN MIT ATP UND ADP 67

5 ZUSAMMENFASSUNG 68

6 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 69

7 LITERATURVERZEICHNIS 71

8 DANKSAGUNG 77

Einleitung___________________________________________________________ 6

1 Einleitung

Bei eukaryotischen Organismen liegt die genetische Information in Form chromosomaler

DNA im Zellkern vor. Die in der Nukleinsäuresequenz der DNA enthaltene Information

muss für die Proteinbiosynthese in prä-messenger RNA (prä-mRNA) umgewandelt

werden, was durch den Vorgang der Transkription geschieht. Anschließend erfolgt die

Prozessierung, in deren Verlauf nicht-kodierende Sequenzen aus der prä-mRNA entfernt

werden und außerdem chemische Modifikationen erfolgen, wie z.B. die Anheftung einer

5’-Guanosin-Kappe (5’-cap). Die nun gereifte mRNA verlässt den Zellkern und wird im

Cytoplasma von den Ribosomen während der Proteinbiosynthese in ein Polypeptid

translatiert, dessen Gestalt und biologische Funktion maßgeblich von der Primärstruktur

der Aminosäuresequenz abhängt.

Im Unterschied zu prokaryotischen Organismen sind bei eukaryotischen Organismen die

einzelnen Gene auf der chromosomalen DNA von nicht-kodierenden Abschnitten

unterbrochen, den sog. Introns (engl. intervening regions) (Berget et al. 1977; Chow et al.

1977). Diese Abschnitte müssen vor der Translation der transkribierten prä-mRNA

entfernt, und die für die Proteinsynthese kodierenden Abschnitte, die Exons (engl.

expressed regions), miteinander Verknüpft werden. Diese Prozesse laufen in einem als

Spleißen bekannten Vorgang ab und werden vom Spleißosom katalysiert.

Durch die Introns in ihrer DNA haben Eukaryoten die Möglichkeit die Exons in

unterschiedlichen Kombinationen zusammenzufügen, indem z.B. einige Exons mit

ausgeschnitten werden. Dies kann z.B. in Abhängigkeit des Zelltyps geschehen, in

welchem das Gen exprimiert wird. Für Eukaryoten ergibt sich durch dieses alternative

Spleißen der Vorteil, dass ein Gen für unterschiedliche Proteine kodieren kann, und somit

die Sequenzen des Genoms vielfältiger genutzt werden können.

1.1 Intronklassen

In Eukaryoten sind verschiedene Klassen von Introns bekannt, welche sich im

Mechanismus des Spleißens unterscheiden. Dazu zählen die Gruppe I und Gruppe II

Klassen der selbstspleißenden Introns, ebenso wie t-RNA Introns sowie die in Eukaryoten

am häufigsten vorkommenden spleißosomalen Introns.

Einleitung___________________________________________________________ 7

Selbstspleißende Introns benötigen keine zusätzlichen Proteine zur Durchführung der

Spleißreaktion. Stattdessen wird das Reaktionszentrum hierbei aus Sekundär- und

Tertiärstrukturen der Intron-RNA selbst gebildet. Von selbstspleißenden Introns sind zwei

Gruppen bekannt, Gruppe I und Gruppe II, die sich in Details ihres Reaktionsmechanismus

unterscheiden, wobei beide Reaktionsmechanismen eine große Ähnlichkeit zu dem

Mechanismus bei spleißosomalen Introns aufweisen (Moore et al. 1993; Nielson 1998;

Peebles et al. 1986; van der Veen et al. 1986; Madhani und Guthrie 1992).

Selbstspleißende Introns treten in Mitochondrien und Chloroplasten von Pilzen und

Pflanzen, in Eubakterien sowie in rRNAs einiger Protozoen auf (Zaug et al. 1983; Cech

1993).

Auch tRNAs z.B. von Hefe enthalten Introns (Lopez und Séraphin 2000). Bei diesen ist

der Spleißvorgang allerdings von einer Endonuklease abhängig, die Intron und Exon

voneinander trennt. Die Exons werden danach in einer ATP-abhängigen Reaktion durch

eine tRNA-Ligase wieder miteinander verbunden (Abelson et al. 1998).

Die in Eukaryonten am häufigsten vorkommenden Introns gehören zur Klasse der

spleißosomalen Introns. Bei diesen wird die Spleißreaktion durch das Spleißosom, einem

dynamischen RNA-Protein-Komplex katalysiert.

Das Spleißosom erkennt dabei hochkonservierte Sequenzen der prä-mRNA, wobei

Untereinheiten des Spleißosoms bestimmte Konsensussequenzen an den Übergängen von

Exon und Intron erkennen und daran binden. Etwa 100 Nukleotide aufwärts der 3´-

Spleißstelle befindet sich die Verzweigungsstelle (branchpoint), welche ein für die erste

Spleißreaktion wichtiges Adenin enthält (Burge et al. 1998).

Abb. 1: Intron Konsensussequenz bei Hefe. Y = Pyrimidin; R = Purin. Das Adenin der Verzweigungsstelle ist rot markiert (nach Burge et al. 1998)

Einleitung___________________________________________________________ 8

1.2 Der Mechanismus des Spleißens

Der eigentliche Spleißvorgang besteht aus zwei aufeinander folgenden

Umesterungsschritten (Abb. 2). Im ersten Schritt erfolgt ein nukleophiler Angriff der 2´-

Hydroxylgruppe des branchpoint Adenins auf das Phosphat der 5´-Spleißstelle. Dadurch

entsteht an dieser ein freies 5´-Exon mit einer freien 3´-Hydroxylgruppe. Das Intron liegt

nach diesem ersten Schritt in einer lassoförmigen Struktur (engl. lariat) vor, die durch die

2´-5´-Phosphodiesterbindung zwischen dem branchpoint Adenin und dem Phosphat der 5´-

Spleißstelle gebildet wird. Im zweiten Reaktionsschritt kommt es nun zu einem

nukleophilen Angriff der freien 3´-Hydroxylgruppe des 5´-Exon auf das Phosphat der 3´-

Spleißstelle. Dabei werden die beiden Exons durch eine 3´-5´-Phosphodiesterbindung

miteinender verknüpft. Das Intron wird als Intron-Lariat freigesetzt (Grabowski et al.

1984; Ruskin et al. 1984).

In beiden Reaktionsschritten muss keine zusätzliche Energie aufgewandt werden, da es

sich lediglich um Umesterungsreaktionen handelt, und nicht um die Hydrolyse und

anschließende Neubildung von Phosphodiesterbindungen.

Abb. 2: Spleißreaktion. Die Spleißreaktion läuft in zwei Umesterungsschritten ab, durch welche die gespleißte mRNA und das Intron-Lariat entstehen (Newman 1998).

Einleitung___________________________________________________________ 9

1.3 Das Spleißosom

Die Erkennung von Anfang und Ende des Introns sowie die Katalyse des Spleißvorgangs

erfolgt durch das Spleißosom. Dieses ist ein großer, dynamischer Komplex aus RNA und

Proteinen mit einer Masse von bis zu 2 MDa, welches Anfang und Ende der Introns mit

hoher Präzision erkennt. Der gesamte Komplex aus 5 Ribonucleoproteinkomplexen (small

nuclear ribonucleoprotein particles, snRNPs) wird sukzessiv um die prä-mRNA herum

aufgebaut.

Das Spleißosom besteht dabei aus den snRNPs U1, U2, U4, U5 und U6, sowie mehreren

assoziierten, nicht-spleißosomalen Proteinen. Jedes der snRNPs besteht aus einer kurzen,

uridinreichen RNA mit ca. 100-200 bp sowie den sieben Sm-Proteinen B, D1, D2, D3, E,

F, G, welche vermutlich zu einem heptameren Ring zusammengelagert sind (Kambach et

al. 1999). Eine Ausnahme stellt hier snRNP U6 dar, welches zu den Sm-Proteinen

homologe Lsm-Proteine enthält. Zusätzlich ist jedes snRNP noch mit mehreren

spezifischen Proteinen assoziiert (Will und Lührmann 2006).

Des Weiteren gibt es noch viele nicht-snRNP-Proteine, die für die Funktion des

Spleißosoms essentiell sind. In Saccharomyces cerevisiae sind über 70 solcher Proteine

bekannt. Diese werden ihrer Funktion entsprechend meist mit Prp bezeichnet, was für pre-

mRNA processing steht.

1.4 Der Spleißzyklus

Der Aufbau des Spleißosoms um die prä-mRNA beginnt mit der Anlagerung des U1

snRNP an die 5´-Spleißstelle, wo die RNA von U1 Basenpaarungen mit der prä-mRNA

eingeht und damit den sog. E-Komplex bildet. Dieser erste Schritt ist im Unterschied zu

allen nachfolgenden nicht mit der Hydrolyse von ATP verbunden. Nachfolgend bindet das

U2 snRNP über Basenpaarungen zwischen der snRNA und der prä-mRNA an die

Verzweigungsstelle des Intron, womit der A-Komplex entsteht (Makarov et al. 2002). Es

folgt die Anlagerung von U4/U5/U6, dem sog. tri-snRNP (Stevens et al. 2002; Malca et al.

2003). Der entstandene B-Komplex durchläuft anschließend einige

Konformationsänderungen um ein aktives Zentrum auszubilden. Hierbei wird zunächst die

Basenpaarung zwischen U1 und der 5´-Spleißstelle ebenso wie die Interaktion der U6

snRNA mit der U4 snRNA aufgelöst, woraufhin U1 sowie U4 den Komplex verlassen

Einleitung___________________________________________________________ 10

(Konarska et al. 1987; Cheng et al. 1987). Die dadurch erreichte aktive Konformation des

Spleißosoms wird C-Komplex genannt. Die U6 snRNA bildet nun Basenpaarungen sowohl

mit der 5´-Spleißstelle als auch mit der U2 snRNA aus. Infolgedessen werden die an der

ersten Umesterungsreaktion beteiligten Nukleotide der 5´-Spleißstelle sowie des

branchpoint in räumliche Nähe zueinender gebracht. Nach den beiden

Umesterungsschritten (1.2) zerfällt der Komplex aus snRNPs und mRNA, wobei das

Intron in Form des Lariat freigesetzt und später abgebaut wird (1.2). Die snRNPs werden

regeneriert und stehen dann für einen weiteren Spleißzyklus zur Verfügung.

Abb. 3: Der Spleißzyklus. Schematische Darstellung der Assemblierung des Spleißosoms an der prä-mRNA mit anschließender Freisetzung von mRNA und Intron-Lariat

Die prozessierte mRNA wird aus dem Zellkern ins Cytoplasma transportiert, wo sie durch

die Ribosomen in eine Aminosäuresequenz translatiert wird.

1.5 DExD/H-Box Helikasen

Wie bereits in 1.2 erwähnt, benötigt die eigentliche Spleißreaktion keine aus der Hydrolyse

von ATP gewonnene Energie. Es ist jedoch Energie in Form von ATP für die

Assemblierung, Umlagerung und den Zerfall des Spleißosoms nötig. DExD/H-Box RNA

Helikasen liefern die Energie für die notwendigen Umlagerungen durch die Hydrolyse von

ATP.

Einleitung___________________________________________________________ 11

Helikasen haben im Allgemeinen die Fähigkeit an doppelsträngige Nukleinsäureketten zu

binden, und diese unter ATP-Verbrauch zu entwinden. Es kann sich dabei sowohl um

RNA als auch um DNA handeln. Man teilt die Helikasen nach ihren Sequenzmotiven in

fünf verschiedene Superfamilien ein, wobei die DExD/H-Box-RNA-Helikasen zur

Superfamilie 2 (SF2) gezählt werden. Allen DExD/H-Box Helikasen gemeinsam ist eine

ca. 400 Aminosäuren große Helikasedomäne, welche ihrerseits aus bis zu acht

konservierten Sequenzmotiven besteht (Motiv I, Ia, Ib, II, III, IV, V, VI). Motiv I, auch

Walker A Motiv genannt, ist an der ATP-Bindung und Hydrolyse beteiligt und essentiell

für alle Helikasen. Die Motive Ia und Ib binden an das Riboserückgrat des RNA-

Substrates. Namensgebend für DExD/H-Box Helikasen ist die Aminosäuresequenz von

Motiv II oder Walker B Motiv, wobei sich der Name aus dem Ein-Buchstaben Code der

Aminosäuren ergibt. Die Sequenz beginnt bei allen DExD/H-Box Helikasen mit Aspartat

(D) und Glutamat (E). Die darauf folgende Aminosäure ist variabel (x). Die vierte

Aminosäure kann entweder Aspartat (D) oder Histidin (H) sein. Je nach

Aminosäuresequenz in Motiv II werden die Helikasen weiter unterteilt. Motiv II ist

außerdem an der ATP-Bindung beteiligt, genauso wie die Motive V und VI. Motiv IV

bindet an RNA während die Funktion von Motiv III die Verbindung von RNA-bindenden

Bereichen mit ATPase-Bereichen ist. Die Bindung an RNA erfolgt dabei ausschließlich

über Interaktionen mit dem Ribose-Phosphat Rückgrat, nicht aber mit den Basen. Daraus

ergibt sich zwar eine Spezifität für RNA, die aber unabhängig von der Basensequenz ist.

DEAD-Box Helikasen besitzen drei zusätzliche Motive, Q, GG und QxxR Motiv. Anhand

der Kristallstruktur der DEAD-Box Helikase Vasa aus Drosophila melanogaster mit einem

gebundenem ATP-Analogon konnte gezeigt werden, dass das Q-Motiv mit dem Adeninteil

des ATP interagiert (Sengoku et al. 2006). Das Q-Motiv ist daher wahrscheinlich für die

ATP-Spezifität von DEAD-Box Helikasen verantwortlich. Helikasen ohne das Q-Motiv

zeigen diese Spezifität nicht.

1.5.1 Funktion der DExD/H-Box Helikasen beim Spleißvorgang

Bei Saccharomyces cerevisiae sind insgesamt acht für den Spleißvorgang essentielle

DExD/H-Box Helikasen bekannt. Diese sind im einzelnen Prp5, Sub2, Prp28, Brr2, Prp2,

Prp16, Prp22 und Prp43. In Tab. 1 ist aufgeführt, in welchen Schritten des Spleißvorgangs

welche DExD/H-Box Helikase beteiligt ist.

Einleitung___________________________________________________________ 12

Abb. 4: DExD/H-Box Helikasen im Spleißzyklus mit den ATP-verbrauchenden Schritten (nach Staley und Guthrie 1998)

Tab. 1: Spleißosomale DExD/H-Box Helikasen von S. cerevisiae mit ihren Funktionen während des Spleißprozesses

DExD/H-Box

Helikase

Helikasemotiv Funktion

Prp5 DEAD U2 Anlagerung

Sub2 DECD U2 Anlagerung

Prp28 DEAD Entwindung U1 / 5´-Spleißstelle

Brr2 DEIH Entwindung U4 / U6

Prp2 DEAH erste Umesterungsreaktion

Prp16 DEAH Umlagerung für zweite Umesterung

Prp22 DEAH mRNA Freisetzung

Prp43 DEAH Lariat Freisetzung

Einleitung___________________________________________________________ 13

1.5.2 Dreidimensionale Struktur von DExD/H-Box RNA-Helikasen

Der Sequenzabschnitt, welcher die konservierten Motive der DExD/H-Box Helikasen

enthält, erstreckt sich über eine Länge von etwa 300 – 400 Aminosäuren und bildet die

katalytisch aktive Helikasedomäne. Durch Röntgenstrukturanalyse konnte bereits von

einigen DExD/H-Box Helikasen der Superfamilie 2 die dreidimensionale Struktur

bestimmt werden. Dabei handelt es sich u.a. um den humanen Spleißfaktor UAP56

(Homolog zu Sub2 in Saccharomyces cerevisiae) (Shi et al. 2004), den Translations-

Initiationsfaktor eIF4A aus Saccharomyces cerevisiae (Caruthers et al. 2000), die Helikase

NS3 aus dem Hepatitis C Virus (Yao et al. 1997), MjDEAD aus Methanococcus jannashii

(Story et al. 2001) sowie um das DEAD-Box Protein Vasa aus Drosophila melanogaster

(Sengoku et al. 2006). In allen genannten Arbeiten wurde jeweils nur die Helikasedomäne

kristallisiert, während die N- und C-terminalen Bereiche fehlten.

Die Kristallstrukturen ergaben, dass die eigentliche Helikasedomäne aus zwei einzelnen,

kovalent verbundenen Subdomänen besteht. Beide Subdomänen entsprechen in ihrem

Aufbau aus fünf β-Faltblättern umlagert von fünf α-Helices der Faltung der RecA-Helikase

aus E. coli (Cordin et al. 2006). Hierbei befinden sich die Motive Q, I, Ia, Ib, II und III auf

der N-terminalen Subdomäne, während auf der C-terminalen Subdomäne die Motive IV,

QxxR, V und VI zu finden sind. Fast alle konservierten Sequenzmotive befinden sich dabei

nicht auf den Sekundärstrukturelementen, sondern auf Schleifen zwischen diesen (Cordin

et al. 2006).

Bei Betrachtung der Strukturen kann man außerdem feststellen, dass die Faltung der

Helikase-Subdomänen bei allen Helikasen sehr ähnlich ist, die Orientierung der beiden

Subdomänen zueinander jedoch eine große Variabilität aufweist. Dies deutet darauf hin,

dass die beiden Subdomänen flexibel miteinander verbunden sind, und sich ihre

Orientierung zueinander durch die Bindung von Substraten ändert. Eine solche

substratinduzierte Konformationsänderung konnte für die DEAD-Box-RNA-Helikase

YxiN aus Bacillus subtilis durch FRET-Experimente gezeigt werden (Theissen et al.

2008).

In der aktiven Konformation, welche wahrscheinlich der von mit RNA und ATP

kristallisiertem Vasa entspricht, liegen die Helikase-Subdomänen nahe beieinander. Die

auf beide Subdomänen verteilten konservierten Sequenzmotive der DEAD-Box Helikase

befinden sich damit in räumlicher Nähe zueinander und formen zwischen den Subdomänen

Einleitung___________________________________________________________ 14

eine ATP-Bindetasche, sowie eine sich über beide Subdomänen erstreckende RNA-

Bindestelle. (Sengoku et al. 2006)

1.5.3 Funktion von DExD/H-Box Helikasen

Wie bereits erwähnt, verknüpfen Helikasen die Hydrolyse von ATP mit der Entwindung

von RNA. Es gibt dabei verschiedene Modelle, die den Reaktionsmechanismus und den

Ablauf der Trennung von RNA-RNA-Bindungen zu erklären versuchen (Soultanas und

Wigley 2000, 2001; Tanner und Linder 2001; Rocak und Linder 2004; Tuteja und Tuteja

2004; Cordin et al. 2006)

Anerkannte Modelle sind das Raupenmodell (engl. inchworm) sowie das active rolling

Modell. Bei letzterem muss die Helikase als Dimer vorliegen. Beide Dimere haben dabei

eine unterschiedliche Konformation, wobei eine Konformation eine hohe Affinität zu

doppelsträngiger RNA, die andere zu einzelsträngiger RNA aufweist. Die Bindung und

Hydrolyse von ATP ist jeweils mit einer Konformationsänderung verbunden, was dazu

führt, dass die Helikase an dem RNA-Substrat entlangwandert und es dabei entwindet.

Beim inchworm- Modell geht man davon aus, dass die Helikase wie eine Raupe auf einem

RNA-Strang entlangwandert, und dabei den anderen verdrängt. Hierbei ist es nicht

notwendig, dass die Helikase als Dimer vorliegt. Beide Helikase-Subdomänen binden an

das RNA-Substrat, die Bindung und Hydrolyse von ATP führt dann auch hier zur

Konformationsänderung, wodurch die Helikase auf dem RNA-Strang eine

Kriechbewegung ausführt. Zusätzliche Domänen der Helikase Binden dabei an die RNA

und verhindern so, dass sich die Helikase auf dem Strang in beide Richtungen bewegen

kann (Velankar et al. 1999; Lee und Yang 2006).

Einleitung___________________________________________________________ 15

Abb. 5: Modelle für die Funktion von Helikasen. Das active rolling Modell muss die Helikase als Dimer vorliegen, beim inchworm-Modell ist ein Monomer ausreichend (nach Tanner und Linder 2001)

Prozessive DExD/H-Box Helikasen wie z.B. das vom Hepatitis C Virus kodierte NS3

könnten nach diesem Modell funktionieren (Cheng et al. 2007; Dumont et al. 2006;

Büttner et al. 2007)

Bei Helikasen der DEAD-Box Familie wird davon ausgegangen, dass sie nach einem

anderen Prinzip funktionieren, da man bei ihnen eine RNA-Entwindung in beide

Richtungen festgestellt hat. Außerdem sind DEAD-Box-RNA Helikasen keine prozessiven

Helikasen, sondern sie entwinden nur kurze RNA-Duplexe (Cordin et al. 2006). Anhand

der dreidimensionalen Struktur der DEAD-Box Helikase Vasa wurde ein Modell für die

Funktion der DEAD-Box Helikasen erstellt. Dabei findet eine kooperative Bindung der

Helikasedomäne an ATP sowie den RNA-Strang statt. Die RNA wird dadurch derart

gebogen, dass die Interaktion mit einem anderen RNA-Strang destabilisiert wird. Durch

die anschließende Hydrolyse des gebundenen ATP verringert sich die Affinität zum

gebundenen RNA-Strang und die Helikase löst sich ab.

1.5.4 Die DEAD-Box Helikase Prp28

Prp28 ist ein essentielles DEAD-Box Protein aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae,

welches an der Assemblierung des Spleißosoms beteiligt ist. Es besteht aus

588 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 66,6 kDa. Der isoelektrische Punkt pI

liegt bei 9,36. Die Analyse der Aminosäuresequenz von Prp28 ergab, dass sich die

Einleitung___________________________________________________________ 16

Helikasedomäne am C-terminus befindet. Sie besteht aus zwei Subdomänen, der DEAD-

Box-Domäne sowie der HelicC-Domäne (helicase superfamily c-terminal domain) (Abb.

6). Im Unterschied zum humanen Prp28 Ortholog hPrp28 besitzt Prp28 aus S. cerevisiae

keine RS-Domäne am N-terminus. Diese Domäne verdankt ihren Namen dem hohen

Gehalt an Arginin (R) und Serin (S). In hPrp28 wird diese Domäne von der Protein-Kinase

SRPK2 phosphoryliert, wodurch es eine stabile Interaktion mit dem tri-snRNP eingeht. Da

Prp28 aus Hefe diese Domäne fehlt, wird es nicht phosphoryliert, was ein Grund dafür sein

könnte, dass es im Gegensatz zu seinem humanen Ortholog nicht mit dem tri-snRNP

assoziiert ist (Mathew et al. 2008).

Abb. 6: Domänenübersicht von Prp28. In Orange bzw. Rot: C- bzw. N-terminale Subdomäne der Helikasedomäne. Die Zahlen geben die Position in der Aminosäuresequenz an.

Identifiziert wurde Prp28 durch eine Mutation, bei der ein Glycin gegen Glutamat

ausgetauscht wurde, was zu einem kältesensitiven Phänotyp führte. Sequenzvergleiche mit

bekannten Proteinen zeigten eine große Sequenzübereinstimmung mit Proteinen aus der

Familie der ATP-abhängigen RNA-Helikasen (Strauss und Guthrie 1991). In Folge der

G297E Mutation kam es in vivo zu einer Agglomeration von spleißosomalen Komplexen,

bei denen die Entwindung der U4 und U6 snRNPs nicht stattgefunden hatte. Der

Spleißzyklus musste also durch den Ausfall von Prp28 in einem Schritt vor der U4/U6-

Entwindung unterbrochen worden sein. Eine Mutation der 5´-Spleißstelle, welche zu mehr

Basenpaarungen zwischen der U1 snRNA und der prä-mRNA führte, bewirkte ebenfalls

eine Anhäufung von spleißosomalen Komplexen, bei denen all fünf snRNPs enthalten

sind, und in denen U4 und U6 gepaart vorliegen. Durch Zugabe von Prp28 und ATP war

es in vitro möglich diese Komplexe wieder aufzulösen. Prp28 hat also die Funktion, die U1

snRNA von der 5´-Spleißstelle zu lösen und somit den Austausch gegen das U6 snRNP zu

ermöglichen (Staley und Guthrie 1999; de la Cruz et al. 1999). Bestätigt wird diese

Beobachtung durch die Tatsache, dass bei einer Schwächung der Interaktion zwischen 5´-

Spleißstelle und U1 snRNP durch Mutation der U1 snRNA Prp28 nicht mehr essentiell ist.

In vitro wir die Aktivität von Prp28 möglicherweise von Prp8 reguliert, wobei Prp8 die

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Aktivität von Prp28 solange inhibiert, bis die 5´-Spleißstelle sicher erkannt wurde (Kuhn et

al. 1999 u. 2002)

1.6 Aufgabenstellung und Zielsetzung

Die Aufgabenstellung dieser Diplomarbeit bestand in der Expression und Reinigung der

spleißosomalen DEAD-Box Helikase Prp28 aus Saccharomyces cerevisiae. Das hochreine

Protein sollte anschließend kristallisiert werden, da dies die Voraussetzung für die

Bestimmung der dreidimensionalen Kristallstruktur ist. Des Weiteren sollten mit den

erhaltenen Kristallen Röntgenbeugungsexperimente durchgeführt werden.

Außerdem stand die biochemische Charakterisierung in Vordergrund, bei welcher die in

vitro ATPase-Aktivität von Prp28 bestimmt werden sollte. Zu diesem Zweck war es zuerst

nötig mit einem bereits vorhandenen Protein einen nicht-radioaktiven Assay zu etablieren,

welcher reproduzierbare Ergebnisse liefert. Anschließend sollte die ATPase-Aktivität von

Prp28 untersucht werden, und in diesem Zuge die enzymkinetischen Parameter Vmax und

KM bestimmt werden.

Material und Methoden 18

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Reagenzien

Alle Feinchemikalien und organischen Substanzen wurden von den Firmen AppliChem

(Darmstadt), BioRad (München), Fluka (Buchs), Merck (Darmstadt), Mettler-Toledo

(Steinbach), MWG Biotech (München), Roth (Karlsruhe) oder Sigma-Aldrich (Steinheim)

bezogen und besitzen den Reinheitsgrad pro analysis. Dabei wurde in der Regel der

günstigste Anbieter gewählt.

2.1.2 Geräte

AbiPrism 3100 DNA Sequencer Applied Biosystems, Darmstadt

Agarosegelelektrophorese-Kammer BioRad, München

Äkta Prime GE Healthcare, Freiburg

Autoklav HST 4-5-8 Zirbus, Bad Grund

Auftragungsschleifen 5 ml GE Healthcare, Freiburg

Binokulare Carl Zeiss, Jena

Feinwaagen Sartorius, Göttingen

Fluorimeter Fluoromax III Horiba Jobin Yvon, USA

Gelschüttler Promax 1020 Heidolph, Schwabach

Innova 4230 Schüttelinkubator New Brunswick Scientific,

Nürtingen

Inkubator Mytron Schütt, Göttingen

Magnetrührer IKAMAG REO IKA, Staufen

Microfluidizer 110 S Microfluidics, USA

PCR-Whatman Biometra T personal Biometra, Göttingen

pH-Meter Beckman Coulter, Krefeld

Photometer Eppendorf, Hamburg

Pipettierhilfe Accu-Jet Brand, Wertheim

Rotor JA-20 / JA-30.50 Ti Beckman Coulter, Krefeld

Rotor JLA 8.1000 Beckman Coulter, Krefeld


Superloops GE Healthcare, Freiburg

Elektrophoresekammer Hoefer miniVE GE Healthcare, Freiburg

Sonifier 250 Branson, USA

Spektralphotometer Amersham Pharmacia Biotech,

Freiburg

Thermomixer comfort Eppendorf, Hamburg

Tischzentrifuge 5417 R Eppendorf, Hamburg

Vortexer Schütt, Göttingen

Zentrifuge Allegra 21R Beckman Coulter, Krefeld

Zentrifuge Avanti J-20 XPIJA-20 Beckman Coulter, Krefeld

Zentrifuge Avanti J-30 I Beckman Coulter, Krefeld

Zentrifuge Avanti JA-20 Beckman Coulter, Krefeld

2.1.3 Sonstige Materialien

Sterilfilter Millipore, USA

Glasgeräte Merck, Darmstadt

Crystal Clear Tape Henkel, Aachen

Reaktionsgefäße (0.5 ml, 1.5 ml, 2.0 ml) Eppendorf, Hamburg

Reaktionsgefäße (15 ml, 50 ml) Sarstedt, Deutschland

24Well Kristallisationsschalen sitting drop Hampton Research, USA

Pipetten (verstellbar) Eppendorf, Hamburg

Vivaspin Konzentratoren Vivascience, Hannover

JA30-Zentrifugenröhrchen Beckman Coulter, Krefeld

Zentrifugenbecher ( 1 l, 500 ml) Beckman Coulter, Krefeld

2.1.4 Chromatographiesäulen

HisTrap FF 5ml Amersham Pharmacia Biotech,

Freiburg


Superdex 75 HiLoad (26/60) Amersham Pharmacia Biotech,

Freiburg

2.1.5 Vektoren

pET-21a (C-terminaler His-tag,) Novagen Merck, Darmstadt

2.1.6 Enzyme

Carboxypeptidase B Boehringer, Ingelheim

2.1.7 RNA-Oligonukleotide

Die RNA-Oligonukleotide für die Aktivitätsmessungen wurden von IBA, Göttingen

bezogen und waren HPLC-gereinigt

Oligo-Name Sequenz

PolyA20 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

2.1.8 DNA-Oligonukleotide

Alle Primer wurden von MWG Biotech, München bezogen

T7

5’- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG – 3’

T7 term

5’ - CTA GTT ATT GCT CAG CGG T – 3’

2.1.9 Kit-Systeme

EnzChek Phosphate Assay Kit Invitrogen, USA


2.1.10 Größenstandards

Protein Molekular Weight Marker #SM0431 Fermentas, St. Leon-Rot

2.1.11 Organismen mit Resistenzen

Stammsammlung der AG Ficner, Molekulare Strukturbiologie, Universität Göttingen

E. coli Rosetta 2 (DE3) (Chloramphenicol)

2.1.12 Kristallisationsscreens

Crystal Screen 1 Hampton Research, USA

Crystal Screen 2 Hampton Research, USA

Crystal Screen Lite Hampton Research, USA

Crystal Screen Cryo Hampton Research, USA

Crystal Screen PEG/Ion Hampton Research, USA

Additiv Screen 1-2 Hampton Research, USA

Footprint Screens 1-2 Stura et al., 1999

JB Screen 1-9 Jena Bioscience, Jena

Magic Screen 1 – 3 Biogenova, USA

The Opti Salts Qiagen, Hilden

2.1.13 Antibiotika mit Arbeitskonzentrationen

Ampicillin (100 µg/ml) Roche, Mannheim

Chloramphenicol (20 µg/ml) Roth, Karlsruhe

2.1.14 Computerprogramme

Sigmaplot 11.0 Systat Software, Erkrath

GENtle 1.9.4 Magnus Manske, Köln


2.2 Methoden

2.2.1 Molekularbiologische Methoden

2.2.1.1 Polymerase-Kettenreaktion Die Polymerase-Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) dient zur

spezifischen Amplifikation von Desoxyribonukleinsäuren (DNA). Da das Enzym DNA-

Polymerase die Nukleinsäurekette jedoch nicht de novo synthetisieren kann, werden kurze

DNA-Oligonukleotide benötigt (20-30 Basen), die das 3´- und das 5´-Ende der zu

amplifizierenden DNA-Sequenz flankieren und zu ihr komplementär sind. Darüber hinaus

werden alle Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs), die zu amplifizierende Sequenz

(Matrize) und eine hitzestabile DNA-Polymerase (z.B. aus Thermus aquaticus) benötigt.

Ein Reaktionszyklus besteht aus drei Schritten:

1. Die DNA-Doppelhelix muss zunächst durch die Erhöhung der Temperatur auf 95 °C in

ihre beiden komplementären Stränge zerlegt werden (Denaturierung).

2. Durch die Senkung der Temperatur 5 °C unter den Schmelzpunkt der DNA-

Oligonukleotide können sich diese hochspezifisch an die zu amplifizierende DNA-

Sequenz anlagern (Hybridisierung).

3. Die DNA-Synthese erfolgt durch Änderung der Temperatur auf das Optimum der

jeweilig verwendeten DNA-Polymerase (Elongation).

Diese drei Schritte laufen mehrmals hintereinander ab, so dass die im vorherigen Zyklus

generierten DNA-Fragmente im Folgezyklus wieder als Matrizen dienen können. Durch

diese periodische Anordnung der Schritte nimmt die Zahl der DNA-Moleküle nahezu

exponentiell zu.

Ein typisches PCR-Programm ist im Folgenden beschrieben: 1. Denaturierung 95 °C 5 Minuten

2. Denaturierung 95 °C 30 Sekunden

3. Primer Hybridisierung x °C 20 Sekunden

4. Elongation y °C z Minuten

5. Abschlußelongation 72 °C 10 Minuten


Die Temperatur „x“ bei der die Hybridisierung der DNA-Oligonukleotide stattfindet, hängt

von der Schmelztemperatur derselben ab. Dabei wird die Hybridisierungstemperatur in der

Regel 5 °C unter der Schmelztemperatur der Oligonukleotide gewählt. Die optimale

Elongationstemperatur „y“ variiert zwischen den Polymerasen. So liegt sie für die Taq-

Polymerase bei 72 °C, wogegen sie für die Pfu-Polymerase 68 °C beträgt. Die

Elongationsdauer „z“ ist sowohl von der Länge des zu replizierenden Fragments als auch

von der Replikationsgeschwindigkeit der eingesetzten Polymerase abhängig.

2.2.1.2 DNA-Sequenzierung

Die Sequenzierung von DNA wird in Anlehnung an die „didesoxy-Methode“ nach Sanger

(1977) durchgeführt. Dabei werden bei der Amplifikation der zu sequenzierenden DNA in

einer Reaktion Kettenabbrüche der Polymerase-Reaktion durch den zufälligen Einbau

eines fluoreszenzmarkierten ddNTPs (didesoxy-Ribonukleosidtriphosphat) erzeugt. Da

hier die 3´-OH-Gruppe fehlt, kommt es zum Kettenabbruch. Der Statistik folgend ist damit

jedes mögliche, auf ddNTP-endende Fragment im Ansatz enthalten. Die entsprechenden

Fragmente unterschiedlicher Länge mit den jeweils fluoreszenzmarkierten ddNTP-Enden,

werden durch lange Kapillaren getrennt und detektiert. Mit dem Seq-Mix BigDye

Terminator v1.1 von Applied Biosystems kann die komplette Reaktion in einem einzigen

Ansatz durchgeführt werden. Für einen typischen Sequenzierungsansatz werden pipettiert:

200 - 400 ng zu sequenzierendes Fragment (Template)

8 pmol DNA-Oligonukleotid (Primer)

1,5 μl Seq-Mix

1,5 μl Seq-Puffer

add 10 μl H2O

Das Programm für Sequenzierungsreaktionen ist dem unter 2.2.2.1 genannten Programm

analog, wobei die optimale Temperatur für die Polymerisation bei 60 °C liegt. Die

Hybridisierungstemperatur ist abhängig von den verwendeten DNA-Oligonukleotiden.

Nach der Reaktion werden die Produkte für den Sequenzierungsautomaten gereinigt, um


störende Faktoren wie DNA-Oligonukleotide, Polymerase und restliche ddNTPs zu

entfernen. Hierzu wird dem Ansatz hinzupipettiert:

1 μl 0,125 M EDTA

1 μl 3 M Natriumacetat

50 μl Ethanol (96 %)

Der Ansatz wird vorsichtig durchmischt, für 5 Minuten inkubiert und anschließend bei

16000 x g für 15 Minuten und bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen,

das Pellet in 70 μl Ethanol (70 %) gewaschen und erneut für 5 Minuten zentrifugiert. Das

Pellet wird 2 Minuten an der Luft getrocknet und schließlich in 10 μl HiDye

aufgenommen.

Die gereinigten DNA-Fragmente werden in einem Kapillarsequenzierer von Applied

Biosystems (2.1.2) analysiert.

2.2.2 Mikrobiologische Methoden

2.2.2.1 Herstellung und Selektionsbedingungen von LB-Agarplatten und LB-Flüssigmedium

LB-Agarplatten werden benutzt, um einzelne Bakterienkolonien wachsen zu lassen. Die

Herstellung der Platten muss unter sterilen Bedingungen ablaufen. Dazu werden die unten

aufgeführten Substanzen gemischt und autoklaviert. Falls Antibiotika verwendet werden,

werden diese nach dem Abkühlen des LB-Agars auf ca. 45°C in der erforderlichen Menge

zugegeben.

LB-Flüssigmedium wird verwendet, um die in den Zellen enthaltene DNA in größerem

Maßstab zu vermehren. Je nach Zellstamm und Plasmidsystem werden auch hier

Antibiotika eingesetzt.

LB-Medium LB-Agarplatten

1 % (w/v) Trypton 500 ml LB-Medium

0,5 % (w/v) Hefeextrakt 1,5 % (w/v) Agar-Agar

0,5 % (w/v) NaCl


Sterilisation durch Autoklavieren Sterilisation durch Autoklavieren

2.2.2.2 Herstellung chemisch kompetenter Escherichia coli-Zellen

Das Einführen von Plasmiden in E. coli Zellen nennt man Transformation (2.2.2.3). Damit

Zellen Plasmide aufnehmen können, müssen sie kompetent gemacht werden, das heißt die

Zellmembran muss in einen porösen Zustand versetzt werden. Durch die entstandenen

Poren können Plasmide oder andere DNA-Fragmente in die Zelle gelangen. Aus einer

Dauerkultur werden mit einem sterilen Zahnstocher einige Zellen herausgekratzt. Diese

werden auf einer LB-Agarplatte bei 37°C über Nacht im Brutschrank angezogen. Hat der

Zellstamm eine eigene Antibiotikaresistenz, wird die LB-Agarplatte mit dem

entsprechenden Antibiotikum hergestellt. Von einem Klon auf der LB-Agarplatte wird

dann eine 5 ml Übernachtkultur in flüssigem LB-Medium angesetzt und über Nacht bei

37°C inkubiert. Diese Vorkultur wird dann durch Überführen in 500 ml LB-Medium und

Mischen auf 1:100 verdünnt und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,6 angezogen. Die

Zellernte erfolgt durch Zentrifugation mit 3000 x g für 10 Minuten bei 4°C. Das

entstandene Zellpellet wird mit 150 ml eiskaltem TFB1-Puffer resuspendiert und für 5

Minuten auf Eis inkubiert. Danach werden die Zellen durch Zentrifugation bei 3500 x g für

und 4°C für 10 Minuten pelletiert. Dieses Zellpellet wird in 5 ml eiskaltem TFB2-Puffer

vorsichtig resuspendiert und unter Kühlung in 50 µl Aliquots aufgeteilt. Die Zellen werden

durch flüssigen Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert.

TFB1-Puffer TFB2-Puffer

0,03 M Kaliumacetat pH 7,0 0,01 M NaMOPS pH 7,2

0,05 M MnCl2 0,075 M CaCl2

0,01 M CaCl2 0,01 M RbCl2

0,1 M RbCl2 15 % (v/v) Glyzerin

15 % (v/v) Glyzerin

pH 5,8 mit 0,2 M Essigsäure einstellen pH 6,5 mit 1 M NaOH einstellen

Sterilfiltrieren Sterilfiltrieren

2.2.2.3 Transformation chemisch kompetenter E. coli Zellen


Das Einbringen von DNA in kompetent E. coli Zellen erfolgt nach folgender Methode: 50

µl kompetente Zellen (2.2.2.2) werden für 10 Minuten auf Eis aufgetaut. 100 – 200 ng

eines gereinigten Plasmids werden zu den Zellen gegeben, vermischt, für 30 Minuten auf

Eis inkubiert und für 1 Minute einem Hitzeschock von 42°C ausgesetzt. Nach einer

Abkühlungsphase von 5 Minuten auf Eis wird 1 ml LB-Medium (2.2.2.1) ohne

Antibiotikum zu den Zellen gegeben. Der Ansatz wird unter Schütteln (400 Upm) bei 37°C

für 45 Minuten inkubiert und die Zellen danach bei 5000 x g und 4°C für 1 Minute

abzentrifugiert. Das Pellet wird in 100 µl LB-Medium resuspendiert und auf einer LB-

Agarplatte ausgestrichen. Die Platte enthält ein Antibiotikum, gegen welches das

transformierte Plasmid eine Resistenz vermittelt, um Zellen ohne Plasmid

auszuselektieren. Diese Platte wird bei 37°C über Nacht inkubiert.

2.2.2.4 Expression rekombinanter Proteine in E. coli

Rekombinante Proteine sind Proteine die auf DNA-Ebene über molekularbiologische

Methoden in Plasmide (2.1.5) mit bestimmten Eigenschaften eingebaut werden. Dabei

erhält das Gen des Proteins einen Replikationsursprung und einen induzierbaren Promotor,

in der Regel einen durch IPTG induzierbaren Lac-Promotor. Ferner wird das Gen so in das

Plasmid eingebaut, dass es korrekt im offenen Leserahmen liegt. Das Plasmid enthält eine

Antibiotikaresistenz, die es ermöglicht, im Expressionsmedium auf Zellen mit Plasmid zu

selektieren. Es gibt Expressionsstämme, die schon Plasmide mit bestimmten Eigenschaften

tragen und deshalb mehrere Resistenzen besitzen. Rekombinante Proteine werden in

Labororganismen produziert, in welchen sie in der Natur in der Regel nicht vorkommen.

Durch induktive Expression durch IPTG, welches auf den Lac-Promoter wirkt, erreicht

man oft eine stark gesteigerte Expression des rekombinanten Proteins, im Vergleich zur

Expression des nativen Proteins in den Zellen des Ursprungsorganismus. Deshalb spricht

man in diesem Fall auch von der Überexpression eines rekombinanten Proteins. Oft ist

diese Überexpression über eine Polyacrylamidgelelektrophorese (2.2.3.2) der Proteine

einer Zelle erkennbar. Dabei vergleicht man das gesamte Proteom vor und nach der

Induktion der Expression. Die Expression rekombinanter Proteine in E. coli kann in 2YT-

Medium mit entsprechenden Antibiotika durchgeführt werden. Vom transformierten

Expressionsstamm (2.2.2.3) wird eine 10 ml Vorkultur angesetzt, die bei 37°C über Nacht

im Schüttler (200 Upm) anwächst. Danach werden für die Hauptultur 500 ml 2YT Medium


mit Antibiotikum gemischt und im Verhältnis 1:100 mit der Vorkultur angeimpft. Die

Zellen wachsen bei 37°C im Schüttler (200 Upm) bis zu einer OD600 von 0,5 – 0,8. Bei

einer OD600 zwischen 0,5 und 0,8 wird die Expression durch Zugabe von 0,1 mM IPTG

induziert und für 18-24 Stunden bei 16 °C im Schüttler (200 Upm) durchgeführt. Die

OD600 wird am Ende der Expression bestimmt. Danach erfolgt die Zellernte (2.2.2.6).

2YT-Medium

2 % (w/v) Trypton

2 % (w/v) Hefeextrakt

1 % (w/v) NaCl

Sterilisation durch Autoklavieren

2.2.2.5 Kontrolle der Expression rekombinanter Proteine

Die Kontrolle der Expression erfolgt über Polyacrylamidelektrophorese (2.2.3.2). Dazu

wird von der Kultur direkt vor der Induktion 1 ml abgenommen. Die Zellen werden für 1

Minute bei 11.000 x g pelletiert und das Pellet mit Laemmli-Probenpuffer (2.2.3.2)

resuspendiert., für 5 Minuten bei 95°C gekocht und durch SDS-PAGE analysiert.

2.2.2.6 Zellernte und Aufschluss von Expressionskulturen

Um die exprimierten rekombinanten Proteine (2.2.2.4) aus den Zellen zu isolieren, müssen

die Zellen geerntet und aufgeschlossen werden. Die Ernte erfolgt durch Zentrifugation mit

4.800 x g für 20 Minuten bei 4°C. Nach dem Entfernen des Überstands wird das Pellet

entweder sofort aufgeschlossen oder in flüssigem Stickstoff schockgefroren und für bis zu

6 Monaten bei -20°C gelagert.

Für den Aufschluss der Zellen wird das Pellet in kaltem Lysispuffer resuspendiert. Die

Zusammensetzung des Lysispuffers richtet sich nach den Eigenschaften des zu

isolierenden Proteins und ist am Ende dieses Abschnitts für Prp28∆N angegeben. Der pH-

Wert des Puffers richtet sich nach dem isoelektrischen Punkt des Proteins. Salze und

Glycerin beeinflussen die Löslichkeit beim Aufschluss und Proteaseinhibitoren verhindern

den Abbau des rekombinanten Proteins durch beim Aufschluss freigesetzte Proteasen. Der

Aufschluss von Zellen wird im pneumatischen Zelldesintegrator (2.1.2) durchgeführt. Das


Prinzip besteht darin, die Zellen in einer Kapillaren unter großem Druck

aufeinanderprallen zu lassen. Mechanische Kräfte lassen die Zellen aufbrechen. Für einen

effizienten Aufschluss wird das Zellpellet gewogen und pro Gramm Pellet mit 3-5 ml

Lysispuffer resuspendiert.

Im mit Lysispuffer äquilibrierten und eisgekühlten Fluidizer werden die Zellen 3-mal mit

einem Druck von 80-90 psi aufgeschlossen. Anschließend wird das Lysat in JA30-

Zentrifugenröhrchen gegeben und bei 30.000 x g für 60 Minuten und 4°C

ultrazentrifugiert. Gelöstes Protein befindet sich im Überstand, Zelltrümmer und unlösliche

Proteine sind im Pellet. Die Effizienz des Aufschlusses und die Löslichkeit des

rekombinanten Proteins wird nach jedem Aufschluss in einem Polyacrylamidgel (2.2.3.2)

überprüft. Es werden je 20 µl von Lysat, Überstand und resuspendiertem Pellet mit 20 µl

Laemmli-Probenpuffer gemischt. Danach werden die Proben 5 Minuten bei 95°C gekocht

und zusammen mit der Expressionskontrolle (2.2.2.5) auf einem Polyacrylamidgel

analysiert.

Lysispuffer von His-Fusionsproteinen:

50 mM HEPES/NaOH pH 7,5

600 mM NaCl

2 mM β-Mercaptoethanol

2.2.3 Proteinbiochemische Methoden

2.2.3.1 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen

Alle in diese Diplomarbeit angegebenen Proteinkonzentrationen wurden mittels zweier

Methoden bestimmt, nach der Methode von Bradford, sowie unter zu Hilfenahme des

molaren Extinktionskoeffizienten

2.2.3.1.1 Konzentrationsbestimmung nach Bradford

Das Prinzip der Methode liegt in der Anfärbung von Proteinen mit dem Farbstoff

Coomassie Blue G-250, welcher spezifisch an Arginin-, Tryptophan-, Tyrosin, Histidin-

und Phenylalaninreste bindet. Arginin wird dabei achtmal stärker als die anderen


Aminosäuren gebunden. Die Bindung des Farbstoffs an Aminosäuren führt zu einer

Veränderung des Absorptionsmaximums. Freies Coomassie Brilliant Blue G-250 hat ein

Maximum bei 470 nm, gebundenes bei 595 nm. Die Änderung der Absorption bei 595 nm

wird photometrisch bestimmt. Sie verhält sich im Bereich OD595 0,1-0,9 annähernd

proportional zur Proteinkonzentration. Dabei entspricht eine OD595 von 0,1 ungefähr 0,1

mg/ml Protein.

2.2.3.1.2 Konzentrationsbestimmung durch UV-Absorptionsmessung

Diese Methode beruht auf der Absorption von Proteinen bei 280 nm aufgrund ihres

Gehalts an Tryptophan und Tyrosin. Enthält ein Protein x Tryptophanreste und y

Tyrosinreste, errechnet sich der theoretische molare Extinktionskoeffizient nach folgender

Formel:

ε280(denat) = x (Tyr)*1280 M-1cm-1 + y (Trp) * 5690 M-1cm-1

Dieser Wert gilt jedoch nur für ein entfaltetes Protein. Der molare Extinktionskoeffizient

eines nativen Proteins wird nach der Methode von Gill und Hippel (1989) bestimmt.

Puffer A: Puffer B: 6 M Guanidiniumchlorid 150 mM KCl 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5 10 mM HEPES/NaOH, pH 7,5

Es werden identische Proteinmengen in Puffer A und Puffer B überführt

(Endkonzentration etwa 0,5 mg/ml). Die Ansätze werden für 2 h bei 37°C inkubiert. Puffer

A führt dabei zu einer Denaturierung des Proteins, während Puffer B das native Protein

enthält. Nach Äquilibrierung der Proben auf 20°C wird die UV-Absorption bei 280 nm

gemessen. Für den nativen Extinktionskoeffizienten gilt:

ε280(nativ) = ε280(denat) * OD280(Puffer B) / OD280(Puffer A)

2.2.3.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen (SDS-PAGE)

Die Auftrennung von Proteinen anhand ihrer Größe erfolgt mittels der SDS-

Polyacrylamidgelelektrophorese nach Laemmli (LAEMMLI, 1970). Das Detergenz

Natriumdodecylsulfat (engl. sodium dodecyl sulfat, SDS) denaturiert Proteine und bildet

mit ihnen Komplexe. Damit verleiht es dem Protein eine stark negative Ladung, die eine


gerichtete Wanderung im elektrischen Feld zur Anode ermöglicht. Die Eigenladung des

Proteins wird weitgehend maskiert und ermöglicht somit eine Trennung der Proteinen

ausschließlich nach ihrer Größe. Polyacrylamid dient als Trägermaterial und ist ein

molekulares Sieb mit gleichmäßigen Vernetzungsgrad. Das Prinzip der diskontinuierlichen

Gelelektrophorese beruht auf der Fokussierung von Proteinen vor der eigentlichen

Trennung durch einen Sprung des pH-Wertes von zwei übereinander geschichteten

Polyacrylamidgelen. Das untere Trenngel enthält einen Puffer mit einem pH-Wert von 8,8

und einem Leition hoher Ionenbeweglichkeit. Der pH-Wert des darüber geschichteten

Sammelgels liegt deutlich tiefer bei 6,8. Das Leition des Sammelgels besitzt eine geringere

Ionenbeweglichkeit. Der Elektrodenpuffer enthält ein Folgeion geringer

Ionenbeweglichkeit, dessen Ladung allerdings abhängig vom pH-Wert ist.

Durch das Einschalten des Stromes bewegen sich die Leitionen des Laufpuffers mit hoher

Geschwindigkeit durch das elektrische Feld und überholen dabei die aufgetragenen

Proteine. Daraus resultiert hinter den Proteinen eine Zone geringerer Ionendichte und

erhöhter Feldstärke, aufgrund dessen die Proteine und Folgeionen beschleunigt werden.

Die Geschwindigkeit der Proteine ist dabei größer als die der Folgeionen, aber langsamer

als die der Leitionen. Es resultiert die Fokussierung der Proteine als scharfe Front an dem

Feldstärkesprung.

Beim Auftreffen auf das Trenngel ändern die Folgeionen aufgrund des erhöhten pH-

Wertes ihre Ladung und damit ihre Ionenbeweglichkeit. Sie überholen die Proteine, die

sich dann wieder in einem Gebiet konstanter Feldstärke bewegen. Die Folge ist eine

Auftrennung der am Trenngel komprimierten Proteinfront. Das Trenngel wirkt dabei als

Molekularsieb, da die Proteine durch die weit engeren Poren des Trenngels in

Abhängigkeit ihrer Masse verlangsamt und so ihrer Größe nach getrennt werden. Das

Herstellen der SDS-Gele erfolgt mit dem Protein-Elektrophoresesystem Hoefer miniVE

von GE Healthcare, Freiburg (2.1.2). Dabei wird pro Gel eine Keramikplatte und eine

Glasplatte mit Ethanol gewaschen und staubfrei trocken gerieben. Diese Platten werden

mit Abstandshaltern auf 1 mm Abstand gehalten und in einer Gießvorrichtung für vier

Gele eingespannt. Das Trenngel wird als erstes gegossen, indem der Raum zwischen dem

Platten bis auf 2 cm unterhalb des oberen Randes mit polymerisierender Trenngellösung

aufgefüllt wird. Das Trenngel wird mit Isopropanol überschichtet. Dies wird danach

entfernt, das Gel mit Wasser gewaschen und der restliche Raum mit Sammelgellösung

gefüllt. In diese wird ein Kamm mit der benötigten Taschengröße gesteckt.


Nicht sofort benötigte Gele werden bis zu einer Woche bei 4°C in nasse Tücher

eingewickelt gelagert. Die Gele werden mit den Platten in die Gelhalterung eingespannt

und in die Laufkammer eingehängt. Diese wird mit der benötigten Menge Laufpuffer

gefüllt, der auch in das obere Reservoir gefüllt wird. Danach wird vorsichtig der Kamm

gezogen und die Geltaschen mit Hilfe einer Spritze und Laufpuffer gespült. Die

aufzutragenden Proteinproben werden 1:1 mit 2x Laemmli-Probenpuffer gemischt und für

5 Minuten bei 95°C gekocht.

1-20 µl dieser Proben werden mit einer 100 µl Hamilton-Pipette in die Geltaschen geladen.

Zusätzlich wird ein Proteinmarker mit bekannten Molekülgrößen aufgetragen. Die

Elektrophorese wird für 1-2 Stunden mit einer Stromstärke von 25 mA durchgeführt bis

die Lauffront des Laemmli-Probenpuffers unten aus dem Gel läuft. Danach wird das Gel

aus den Platten genommen, das Sammelgel entfernt und das Trenngel gefärbt (2.2.3.3).

Trenngel (10, 12,5 oder 15 %) Sammelgel (5 %)

10/12,5/15 % (w/v) Acrylamid 5 % (w/v) Acrylamid

0,375 M Tris/HCl pH 8,8 0,125 M Tris/HCl pH 6,8

0,1 % (w/v) SDS 0,1 % (w/v) SDS

0,1 % (v/v) TEMED 0,1 % (v/v) TEMED

0,05 % (w/v) Ammoniumpersulfat 0,05 % (w/v) Ammoniumpersulfat

Laufpuffer Laemmli-Probenpuffer (2x)

0,025 M Tris-HCl 0,0625 M Tris-HCl pH 6,8

0,192 M Glycin 0,07 M SDS

0,1 % (w/v) SDS 50 % (v/v) Glyzerin

0,1 % (w/v) Bromphenolblau

5 % (v/v) 2-Mercaptoethanol

2.2.3.3 Anfärben von Proteinen durch Coomassie Brilliant Blue

Zum Anfärben der Proteine im Gel wird Coomassie Brilliant Blue G-250 Lösung benutzt.

Proteinmengen bis zu 0,1 µg pro 0,5 cm Bande können mit Coomassie noch sichtbar

gemacht werden. Das Gel wird nach der SDS-PAGE (2.2.3.2)aus den Platten genommen

und in eine Lösung aus 100 ml Entfärbelösung und 300 µl Coomassie Brilliant Blue G-250


gegeben. Dann wird das Gel für eine Minute in der Mikrowelle auf höchster Stufe erhitzt

und auf einer Wippe für 5 Minuten gefärbt. Die Entfärbung erfolgt für eine Stunde in

Entfärbelösung.

Coomassie Brilliant Blue G-250 Lösung

1 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue G-250 in Ethanol

Entfärbelösung

10 % (v/v) Ethanol

5 % (v/v) Essigsäure

Nach dem Entfärben werden die Gele mit einem Scanner (Snapscan 50, AGFA)

digitalisiert und in den Dateiformaten TIFF und JPG gespeichert.

2.2.3.4 Einengen von Proteinlösungen durch Zentrifugation

Eine einfache und schnelle Methode, um Proteinlösungen zu konzentrieren, ist die

Zentrifugation der Lösung in Gefäßen, welche am Boden eine Membran mit definierter

Porengröße besitzen (Konzentratoren). Unter dieser Membran ist ein weiteres Gefäß

aufgesetzt, welches den Durchfluss auffängt. Bei einem ideal globulären Proteinmolekül

korreliert die Anzahl der Aminosäuren mit dem Durchmesser in einem definierten

Verhältnis, genannte Stokes-Radius. Dadurch können sich Teilchen, welche kleiner sind

als der Durchmesser der Pore, also kleine Proteine, Wasser und gelöste Ionen durch diese

Membran in das Auffanggefäß bewegen. Das zu konzentrierende Protein wird hierbei

zurückgehalten, wodurch sich seine Konzentration stetig erhöht.

Die Zentrifugationen erfolgen bei 3000-4000 x g bei 4°C so lange, bis die gewünscht

Proteinkonzentration erreicht ist. Es wird sowohl die Konzentration der Proteinlösung nach

der Zentrifugation bestimmt (Bradford, 2.2.3.1.1) als auch die Menge an Protein im

Durchfluss. Die Proteine werden auf einem Polyacrylamidgel (2.2.3.2) analysiert. Beim

Einengen von Proteinlösungen werden Vivaspin-Konzentratoren der Firma Vivascience

verwendet.


2.2.3.5 Chromatographische Methoden

Chromatographische Methoden werden verwendet, um große Mengen von Proteinen

aufzureinigen oder Eigenschaften einzelner Proteine zu untersuchen. Es gibt zahlreiche

chromatographische Trennmethoden, wie z.B. Affinitäts-, Größenausschluss-,

Ionenaustausch-, Dünnschicht- oder Gaschromatographie.

Bei der nativen Trennung von Proteinen wird meist auf Affinitäts-, Ionenaustausch- und

Ausschlusschromatographie zurückgegriffen. Alle Trennmethoden erfolgen an Säulen

(2.1.4) die mit Hilfe eines Chromatographiesystems (2.1.2) kontrolliert werden, welches

die jeweiligen Verlaufsdiagramme im Computer dokumentiert. Es werden Fraktionen

gesammelt, die je nach erforderlicher Trenngenauigkeit zwischen 0,5-10 ml groß sind. Die

Verlaufsdiagramme jeder Proteinchromatographie sind im Ergebnisteil (3) aufgeführt. In

den folgenden Abschnitten werden die in dieser Arbeit benutzten chromatographischen

Methoden beschrieben.

2.2.3.5.1 Affinitätschromatographie

Die Affinitätschromatographie beruht auf spezifischen und reversiblen Interaktionen von

Säulenmaterial und Protein. Abhängig von der Beschaffenheit des Säulenmaterials und der

Probe binden die Moleküle an die Matrix. Das Adsorbens kann von der Säule durch

kompetitive Verdrängung, Konformationswechsel durch Änderung des pH-Wertes oder

durch Änderung der Ionenstärke eluiert werden. Die Affinitätschromatographie stellt eine

sehr spezifische und selektive Trennmethode für Biomoleküle dar.

2.2.3.5.1.1 Affinitätschromatographische Reinigung von Hexa-Histidin-Fusionsproteinen

Proteine, die mit N- oder C-terminaler His-Sequenz exprimiert werden, lassen sich selektiv

über eine Affinitätschromatographie mittels immobilisierter Metallchelatkomplexe

reinigen (engl. immobilized metal chelating affinity chromatography, IMAC). Hierbei

bilden zwei Histidine über die freien Elektronenpaare ihrer Stickstoffatome koordinative

Bindungen zu einem immobilisierten Metallion aus. Dabei bildet sich ein Chelatkomplex,

der kompetetiv durch Imidazol aufgelöst werden kann. Die Metallionen (z. B. Nickelionen)


müssen dabei zweiwertig sein und sind meist an Nitrilotriessigsäure-Sepharose (NTA)

gebunden.

In dieser Arbeit werden für die Reinigung von Proteinen mit Hexa-Histidin-Sequenz die

HiTrapChelating Ni-NTA-Sepharose-Säulen (5 ml, GE Healthcare) benutzt. Als Metallion

wird Nickel eingesetzt, das über vier koordinative Bindungen an NTA gebunden ist. NTA

ist seinerseits kovalent an die Sepharose-Trägermatrix gebunden. Zur Entfernung von an

das Zielprotein gebundener RNA wird nach dem Probenauftrag mit 2-3 Säulenvolumen

Waschpuffer gewaschen. Durch die darin enthaltenen 2 M LiCl wird evtl. an das

Zielprotein gebundene RNA gefällt und somit vom Protein entfernt. Um unspezifisch an

das Säulenmaterial gebundene Proteine zu eluieren, wird zunächst ein Stufengradient auf

8% Elutionspuffer angelegt. Die reversible Wechselwirkung von Metallion und Histidin-

Sequenz am Zielprotein wird durch einen linearen Gradienten von 9-100 % Elutionspuffer

gelöst. Alle Chromatographien dieser Art werden ebenfalls bei 4 °C und einer Flussrate

von 2 ml/Minute durchgeführt.

Bindepuffer Elutionspuffer

50 mM HEPES/NaOH pH 7,5 50 mM HEPES/NaOH pH 7,5

600 mM NaCl 600 mM NaCl

2 mM β-Mercaptoethanol 2 mM β-Mercaptoethanol

20 mM Imidazol 200 mM Imidazol

Waschpuffer


600 mM NaCl

2 M LiCl


20 mM Imidazol

2.2.3.5.2 Größenauschlusschromatographie

Die Größenausschlusschromatographie trennt Moleküle nach ihrer Größe. Die hierbei

verwendeten Chromatographiesäulen bestehen aus einem porösen Gelmaterial (Sepharose)

mit definierter Porengröße. Das Trennverhalten basiert auf den unterschiedlichen


hydrodynamischen Volumina der Probenmoleküle. Je nach Molekülgröße, Molekülgestalt

und gewählten Säuleneigenschaften dringen die Moleküle unterschiedlich tief in die

Gelmatrix ein. Kleineren und globulären Molekülen steht dabei mehr Raum zur Verfügung

als größeren und langgestreckten. Daher erfahren kleinere Moleküle durch das tiefere

Eindringen in die Gelmatrix eine Verzögerung und eluieren später von der Säule als

größere. Die Größenausschlusschromatographie ist daher eine Methode, um Proteine nach

den ersten Reinigungsschritten von weiteren Verunreinigungen zu trennen. Die Auflösung

der Trennung ist abhängig von der Fließgeschwindigkeit und dem aufgetragenen

Probenvolumen. Eine niedrige Fließgeschwindigkeit und kleine Probenvolumina erzielen

bessere Auflösungen. Diese Trennmethode wird im Rahmen diese Arbeit ausschließlich

für präparative Reinigungen von Proteinen verwendet. Die HiPrep 26/60 Superdex75 Säule

(2.1.4) eignet sich zur Trennung von Proteinen mit einer Molekülmasse von weniger als 75

kDa. Ihre Gelmatrix besteht aus Allyldextran, das kovalent zu N,N’-Methylenbisacrylamid

verknüpft ist. Nach Äquilibrierung der Säule mit 1,5-fachem Säulenvolumen Laufpuffer

wird die Probe auf die Säule gegeben. Das maximale aufgetragene Probenvolumen beträgt

2 % des Säulenvolumens, das entspricht 6,4 ml bei der XK 26/60 Säule. Alle

aufgetragenen Proteinkonzentrationen sind nicht höher als 8 mg/ml. Die Proteinprobe wird

von der Säule mit Puffer eluiert und das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die

Ausschlusschromatographie erfolgt für alle Proteine bei 4 °C und einer

Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/Minute. Die Analyse der Fraktionen erfolgt anschließend

durch SDS-PAGE (2.2.3.2)

Laufpuffer für Prp28∆N-His


150 mM KCl



2.2.3.6 Bestimmung von Bindungskonstanten

Die Stärke der Bindung zwischen einem Protein und seinem Liganden kann mit der

Dissoziationskonstanten KD beschrieben werden. Es gilt:

][][*][

PLLPK D =

[P]: Konzentration des freien Proteins [L]: Konzentration des freien Liganden [PL]: Konzentration des Protein-Ligand-Komplexes

Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten für die Interaktion von Prp28 mit ATP und

ADP wurde die Methode der Fluoreszenztitration (2.2.3.6.1) angewandt. Es wurde der KD-

Wert bei 25°C in Bindungspuffer ermittelt.

Bindungspuffer:

10 mM Hepes/NaOH, pH 7,5

150 mM KaCl

10 mM MgCl2

2.2.3.6.1 Fluoreszenztitration

Die Bestimmung des KD-Wertes erfolgt über die Messung der Abnahme der Tryptophan-

Fluoreszenz des Proteins mit zunehmender Ligandenkonzentration. Als Ligand werden

mant- ADP und mant-ATP (Jena Bioscience, Jena) verwendet (Abb. 7). Die mant-Gruppe

ist ein Fluorophor, das bei 355 nm maximal angeregt wird und bei 448 nm maximal

fluoresziert. Da sich die Anregungswellenlänge mit der Tryptophan-Fluoreszenz von

Proteinen überschneidet, kommt es bei Bindung des mant-Nukleotids zu einem

Energietransfer zwischen der Tryptophan- Fluoreszenz des Proteins und der mant-Gruppe

(FRET-Effekt). Dadurch nimmt die Tryptophan-Fluoreszenz ab.


Abb. 7: mant-ADP

2.2.3.6.1.1 Datenaufnahme

Für mant-ATP und mant-ADP werden jeweils Ausgangslösungen hergestellt, deren

Konzentrationen über UV-Absorption bei 255 nm genau bestimmt werden. Gemäß den

Herstellerangaben wird als Extinktionskoeffizient ε255 nm = 23300 M-1cm-1 verwendet.

Es werden jeweils 120 μl Proben in Bindungspuffer (2.2.3.6) vorbereitet. Sie enthalten 1

μM Protein und unterschiedliche Konzentrationen des Liganden. Jede Probe wird dreimal

unabhängig voneinander angesetzt. Nach dem Mischen werden die Ansätze 45 min bei 25

°C inkubiert, damit sich das Bindungsgleichgewicht einstellt.

Die Fluoreszenzmessungen werden mit einem Spektrofluorimeter Fluoromax III (2.1.2) bei

25 °C durchgeführt. Es werden 0,2 x 1 cm Küvetten verwendet. Gemessen wird das

Fluoreszenzsignal (S/R, in der Einheit cps – counts per second) bei 330 nm nach Anregung

bei 295 nm. Der Öffnungsschlitz für die Anregung ist 2 nm breit, derjenige für die

Detektion 5 nm. Die Detektion erfolgt während 1 Minute mit einer Integrationszeit von 0,5

Sekunden. Für jede Probe wird der Mittelwert berechnet und um den Beitrag des Puffers

korrigiert.

2.2.3.6.1.2 Korrekturfaktoren

Die mant-Gruppe absorbiert einen kleinen Anteil der Anregungs- und

Fluoreszenzstrahlung. Dieser Anteil wird mit zunehmender Ligandenkonzentration größer

und verringert das beobachtete Fluoreszenzsignal (S/R). Durch Multiplikation mit

Korrekturfaktoren wird dieser inner filter effect ausgeglichen (Birdsall et al. 1983).

Die Korrekturfaktoren basieren auf dem Lambert-Beer-Gesetz. Es wird dabei vereinfacht

angenommen, dass das gemessene Fluoreszenzsignal im Küvettenmittelpunkt entsteht.


Dann muss bezogen auf 0,2 x 1 cm2 Küvetten die Anregungsstrahlung eine Weglänge von

0,5 cm und die Fluoreszenzstrahlung eine Strecke von 0,1 cm zurücklegen. Mit den

molaren Extinktionskoffizienten ε295nm(mant) und ε330nm(mant) ergibt sich:

(S / R)korr = (S / R)gemessen * 10 ε295nm(mant)*[L]*0,5cm * 10 ε330nm(mant)*[L]*0,1cm

[L]: mant-ATP- oder -ADP-Konzentration

Der erste Exponentialterm korrigiert die Absorption der Anregungsstrahlung, der zweite

Term die Absorption der Fluoreszenzstrahlung.

2.2.3.6.1.3 Datenauswertung

Die Gesamtkonzentration [P]0 des Proteins setzt sich aus der Konzentration des freien

Proteins [P] und des Protein-Ligand-Komplexes [PL] zusammen: [P]0 = [P] + [PL]. Damit

lässt sich die Gleichung für den KD-Wert (2.2.3.6) umformen zu:

DKLLP

PL+

=][

][][][ 0

[L]: Konzentration des freien Liganden

Diese Gleichung hat dieselbe Form wie die Michaelis-Menten Gleichung. Bei der Messung

ist [PL] proportional zu der Abnahme der Tryptophan-Fluoreszenz ΔF. Maximal kann [PL]

den Wert von [P]0 erreichen. Darum gilt:

DKLLF

F+

Δ=Δ

][][max

Setzt man vereinfachend [L] gleich der zugegebenen Gesamtkonzentration des Liganden,

so lässt sich mit dieser Formel KD aus den Typtophan-Fluoreszenzmessungen berechnen.

Es wird das korrigierte Fluoreszenzsignal (S/R) gegen [L] aufgetragen und an folgende

Gleichung angepasst:


Dkorr KL

LFFRS

+Δ

−=][

][)/( max

max

Fmax = maximales korrigiertes Fluoreszenzsignal (S / R)korr ∆Fmax = maximaler Betrag der Steigung von (S / R)korr

Der Kurvenangleich wird mit dem Programm SigmaPlot durchgeführt. Da die oben

angegebene Gleichung dieselbe Form wie die Michaelis-Menten Gleichung hat, gilt in

analoger Weise außerdem der Eadie-Hofstee-Plot:

][max LFKFF D

Δ−Δ=Δ

Trägt man also ΔF gegen ΔF/[L] auf, so ergibt sich eine Gerade, aus deren Steigung KD

abgelesen werden kann. Dies ist eine alternative Möglichkeit, den KD-Wert aus den

Meßergebnissen zu bestimmen.

2.2.3.7 Bestimmung der ATPase Aktivität

Die Kinetik eines Enzyms lässt sich mit den beiden Parametern KM und Vmax beschreiben.

Dabei beschreibt der Wert Vmax einen Zustand der Sättigung, in welchem die

Umsatzgeschwindigkeit v nicht mehr durch Erhöhung der Substratkonzentration gesteigert

werden kann. Die Michaelis-Menten Konstante KM gibt die Substratkonzentration an, bei

der Vmax/2 erreicht ist.

][][*max

SKSV

vM +

=

[S] = Konzentration des Substrats

Zur Bestimmung von KM und Vmax wird in einer Messreihe die Anfangsgeschwindigkeit

der Reaktion v bei verschiedenen Substratkonzentrationen [S] gemessen. In dieser Arbeit

wurde dazu das EnzChek® Phosphate Assay Kit der Firma Invitrogen (2.1.9) verwendet.

In diesem ist das Enzym Purin Nukleosid Phosphorylase enthalten, welches in

Anwesenheit von Phosphat das ebenfalls im Kit enthaltene Substrat 2-amino-6-mercapto-

7-methylpurine-Ribosid (MESG) zu Ribose-1-Phosphate und 2-amino-6-mercapto-7-

Methylpurine umwandelt. Dies ist mit einer Verschiebung des Absorptionsmaximums von

330 nm zu 360 nm verbunden, wodurch sich ein direkter proportionaler Zusammenhang


zwischen Absorptionszunahme und Freisetzung von Phosphat durch ATPase-Aktivität von

Prp28 ergibt. Die Absorptionszunahme bei 360 nm wird Photometrisch gemessen.

Für die einzelnen Messungen werden jeweils 100 µl Proben angesetzt. Diese enthalten das

Protein in einer Konzentration von 1 µM sowie ATP in Konzentrationen von 0 – 500 µM.

Die Ansätze werden vor der Zugabe von ATP 10 min bei 25 °C im Photometer inkubiert.

Unmittelbar nach der ATP-Zugabe wird die Messung gestartet.

Die Anfanggeschwidigkeit v0 in ∆E/min wird anhand der Anfangssteigung der gemessenen

Absorptionsänderung bestimmt.

Von allen Messungen wurden Negativkontrollen ohne ATP bzw. ohne Protein

durchgeführt, um sicherzustellen, dass die gemessene Absorptionsänderung wirklich von

der ATPase-Aktivität des zu testenden Proteins stammt.

2.2.3.7.1 Datenauswertung

Die Datenauswertung erfolgt nach Lineweaver-Burk. Bei diesem Linearisierungsverfahren

wird 1/v auf der Y-Achse gegen 1/[S] auf der X-Achse aufgetragen. Die dabei entstehende

Gerade hat die Steigung KM/Vmax, und schneidet die Y-Achse bei 1/Vmax sowie die X-

Achse bei -1/KM. Zusätzlich erfolgt die Auswertung durch Kurvenanpassung mit

SigmaPlot an die Michaelis-Menten Gleichung

][][*max

SKSV

vM +

=

[S] = Konzentration des Substrats

Anschließend wurde mit dem Quotionten aus Vmax und der eingesetzten

Enzymkonzentration von 1µM die Wechselzahl kcat bestimmt.

2.2.4 Kristallographische Methoden

2.2.4.1 Kristallisation von Proteinen

Die Kristallisation von Proteinen ist die Voraussetzung für eine hochaufgelöste,

dreidimensionale Strukturanalyse mit Hilfe von Röntgenbeugungsexperimenten. Generell

bilden sich Kristalle durch regelmäßiges Aneinanderlagern von Proteinmolekülen in einer


genau definierten, sich immer wiederholenden räumlichen Ausrichtung. Bei diesem

Vorgang spielen die thermodynamische und die kinetische Komponente entscheidende

Rollen. Die thermodynamische Komponente setzt voraus, dass sich das Protein in

übersättigtem Zustand in Lösung befindet. Durch das Aggregieren von Protein sinkt die

Konzentration und durch die H2O Freisetzung aus der Hydrathülle der Proteine erreicht die

Lösung einen Zustand höherer Entropie, ein thermodynamisch bevorzugter Zustand.

Geschieht dies zu schnell (in sehr stark übersättigten Proteinlösungen), bilden sich keine

geordneten Kristalle und das Protein präzipitiert ungeordnet. Geschieht es dagegen zu

langsam (in nicht oder nur leicht übersättigten Proteinlösungen) bilden sich gar keine

Kristalle oder sie entstehen erst nach Monaten oder Jahren. Aus diesem Grund muss auch

die kinetische Komponente der Kristallisation berücksichtigt werden, um in akzeptabler

Zeit geordnete Kristalle zu erhalten.

Wegen einer Fülle von beeinflussenden Parametern ist das Kristallwachstum von Proteinen

nicht planbar. Zu diesen Parametern gehören chemische Substanzen,

Proteinkonzentrationen und Temperaturen. Deshalb greift man zu Anfang auf initiale

Kristallisationstests zurück (2.1.12), um erste Kristallisationsbedingungen für ein Protein

zu finden. Bei diesen initialen Kristallisationsansätzen handelt es sich um eine Sammlung

von empirisch ermittelten Anfangsbedingungen, die relativ häufig zur Kristallisation

verschiedener Proteine geführt haben. Eine solche Bedingung besteht meistes aus einem so

genannten Präzipitans, welches die Löslichkeit des Proteins herabsetzt und verschiedenen

anderen Zusätzen. Man beginnt in der Regel mit einer Proteinkonzentration von 10 mg/ml,

überprüft, ob das Protein sofort ausfällt und passt die Konzentration entsprechend an.

Die langsame Übersättigung der Proteinlösung erreicht man über die Methode der

Dampfdruckdiffusion. Dabei wird eine bestimmte Menge an gereinigtem Protein zu einer

Lösung mit genau definierten Bedingungen gegeben. Über eine Gasphase steht diese

Mischung in Kontakt mit einem Reservoir, in dem sich nur die Lösung ohne Protein

befindet. Der Dampfdruck des Wassers lässt es entlang des Konzentrationsgradienten in

das Reservoir diffundieren, der Kristallisationstropfen verkleinert sich und wird

konzentriert. Die Kristallisation wird in dieser Arbeit im so genannten sitzenden (engl.

sitting drop) Tropfen durchgeführt. Dabei werden Kristallisationsplatten (2.1.3) mit 24

Ansätzen verwendet, deren einzelne Kammern einen zentralen Stempel enthalten, der in

der Mitte eine Vertiefung für die Proteinlösung besitzt. Der Stempel ist umgeben von

einem Reservoir in das die Bedingung vorgelegt wird, in der das Protein kristallisieren soll.


Das Volumen der vorgelegten Bedingung beträgt in den hier durchgeführten

Kristallisationsversuchen immer 500 µl, die Temperatur wenn nicht anders angegeben 4°C.

Für die initialen Kristallisationstests wird 1 µl aus dem Reservoir in die Vertiefung des

Stempels gegeben und 1 µl der Proteinlösung zugesetzt. Die Kristallisationsplatte wird

nach dem Pipettieren von 12 Bedingungen immer sofort mit Klarsichtklebeband

verschlossen, um ein Austrocknen zu vermeiden und ein Mikroklima herzustellen.

In regelmäßigen Abständen wird der Topfen mit dem Binokular nach möglichen Kristallen

oder aussichtsreichen Bedingungen überprüft und Entwicklungen notiert. Mit einer

Digitalkamera auf einem Binokular werden Erfolg versprechende Bedingungen im

Computer dokumentiert.

2.2.4.2 Fein-screening und Additive

In den seltensten Fällen findet man gut streuende Kristalle in initialen

Kristallisationsbedingungen. Mit Erfolg versprechenden Bedingungen führt man deshalb

ein so genanntes Fein-screening durch, um die Kristallisationsbedingungen zu verbessern.

Dabei werden folgende Veränderungen an den Ursprungsbedingungen getestet:

- pH-Wert erhöhen / erniedrigen in kleinen Schritten

- Proteinkonzentration erhöhen / erniedrigen

- Proteinlösung / Reservoir-Tropfenverhältnis ändern

- Kation oder Anion der Salze variieren

- Temperatur verändern (20°C, 10°C, 4°C)

- Additive testen

- Mikro-Seeding

Hat man verbesserte Bedingungen gefunden, werden die Kristalle im

Röntgenbeugungsexperiment getestet. Reichen die Verbesserungen nicht aus, um die

Kristallordnung zu erhöhen, wird auch auf diese neue Bedingung ein Fein-screening

durchgeführt.


2.2.4.3 Quervernetzung mit Glutaraldehyd Um während der Röntegbeugungsexperimente am Kristall auftretende Strahlenschäden

möglichts gering zu halten, wird der Kristall vor der Datensammlung in flüssigem

Stickstoff eingefroren, und während des gesamten Experimentes in einem Stickstoffstrom

mit einer Temperatur von ca. 100 K gehalten. Dabei treten am Kristall Belastungen auf,

welche die Kristallordnung zerstören und damit negativen Einfluss auf die

Beugungseigenschaften des Kristalls haben können. Um des Kristall zu stabilisieren, kann

die Methode der Quervernetzung angewandt werden.

Die Kristalle wurden dazu für zwei Stunden in einer 2 % (w/v) Glutaraldehyd-Lösung bei

4 °C inkubiert. Das Glutaraldehyd diffundiert dabei in den Kristall und bildet

Querverbindungen zwischen Lysinresten der Aminosäurekette aus, die Den Kristall

stabilisieren.

2.2.5 Röntgenbeugungsexperimente Mittels Röntgenkristallographie ist es möglich, die molekulare Struktur großer

Makromoleküle wie Proteine aufzuklären. Notwendig dafür sind geeignete Kristalle des

entsprechenden Proteins. Der Kristall wird dann mit einem Röntgenstrahl definierter

Wellenlänge bestrahlt. Trifft dieser auf den Proteinkristall, so wird er gestreut und das

Streuungsmuster wird detektiert. Da das Streuverhalten von der Orientierung des Kristalls

abhängt, wird er während der Messung gedreht, um möglichst alle Streu-Reflexe zu

erfassen.

Vor der Datensammlung wird der Kristall in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann auf

einem Goniometerkopf im Schnittpunkt des Röntgenstrahls mit der Rotationsachse

montiert. In dieser Position wird der Kristall durch einen mit flüssigem Stickstoff

gekühlten Cryostrom auf einer Temperatur von 100 K gehalten. Die Datensammlung bei

tiefen Temperaturen verringert die Schädigung des Kristalls durch die Strahlung und

ermöglicht dadurch häufig die Aufnahme mehrerer Datensätze von einem einzigen

Kristall.

Röntenbeugungsexperimente von Prp28∆N-Kristallen wurden am ID 23-2 Strahl der

European Syncrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble) sowie durch Dr. Jana

Schmitzova an dem 14.1-Strahl des Berliner Elektronensynchrotrons (BESSY, Freie

Universität Berlin) durchgeführt.

Ergebnisse 44

3 Ergebnisse

3.1 Expression von Prp28∆N

Zu Beginn dieser Arbeit wurde von Dr. Jana Schmitzova (Universität Göttingen) das

Konstrukt pET-21a-Prp28∆N zur Verfügung gestellt. Dieses enthält den Vektor pET-21a

und die kodierende Sequenz für die Aminosäuren 131 - 588 von Prp28. Diese N-terminale

verkürzte Variante von Prp28 wird im weiteren Verlauf dieser Arbeit als Prp28∆N

bezeichnet. Die DNA von Prp28∆N wurde über die Restriktionsschnittstellen NdeI und

XhoI in den entsprechend geschnittenen Vektor inseriert. Dieser enthält zusätzlich eine

kodierende Sequenz, welche eine Hexa-Histidin-Affinitätssequenz C-terminal an das zu

exprimierende Protein anfügt.

Vor der Expression wurde das Plasmid mittels Sequenzanalyse (2.2.1.2) auf Fehlerfreiheit

überprüft.

Das Plasmid wurde in chemisch kompetenten Zellen des E. coli Stammes Rosetta 2 (DE3)

transformiert, die Expression erfolgte wie in (2.2.2.4) beschrieben.

Die Zellernte erfolgte bei 4 °C und 5750 x g, anschließend wurden die Zellen

aufgeschlossen (2.2.2.6)

Aufschluss, Überstand und Pellet wurden mittels SDS-PAGE analysiert. Die vor der

Induktion aus der Kultur genommene Probe ging vor dem Auftrag auf das Gel verloren.

Die SDS-PAGE (Abb. 8) zeigt im Aufschluss eine deutliche Überexpression von Prp28∆N

mit einem apparenten Molekulargewicht von etwa 51 kDa. Nach der Zentrifugation waren

sowohl im Überstand wie auch im Pellet größere Mengen von Prp28∆N vorhanden, wobei

das Verhältnis etwa 1:1 beträgt. Da die Menge im Überstand ausreichend groß für die

weiteren Experimente war, wurde darauf verzichtet, die Löslichkeit des Proteins weiter zu

verbessern.

Ergebnisse 45

3.2 Reinigung von Prp28∆N

3.2.1 Affinitätschromatographische Reinigung über His-Trap-Säulen

Der Überstand nach der Zentrifugation wurde über eine HiTrapChelating Ni-NTA-

Sepharose-Säule gereinigt (2.2.3.5.1.1).

Abb. X: Chromatogramm von Beladung und Elution der HiTrapChelating Ni-NTA-Sepharose-Säule. Die Schulter im vorderen Bereich des Maximums bei 150 ml deutet auf eine Verunreinigung des eluierten Proteins hin. (blau: UV-Absorption bei 280 nm; rot: Leitfähigkeit; grün: Anteil Elutionspuffer; rot gekennzeichnet: eluiertes Protein)

Die Elution mit einem Gradienten von 0 – 100 % Elutionspuffer führte zu einem

Elutionsmaximum von etwa 350 mAu bei 160 ml mit einer leichten Schulter im vorderen

Bereich. Danach flacht die Kurve wieder ab, und es zeigt sich kein weiteres Maximum

mehr. Das Maximum in der Kurve der Leitfähigkeit wurde durch das Waschen der Säule

mit 2 M LiCl hervorgerufen.

Einzelne Fraktionen des Säulenlaufs wurden auf einem SDS-Gel analysiert. Dabei zeigte

sich, dass neben dem Protein mit Histidin-Affinitätssequenz weitere Proteine an die Säule

gebunden haben, welche im Elutionsmaximum von der Säule eluieren. Eines mit etwa 80

kDa und eines mit etwa 28 kDa. Hauptsächlich jedoch Protein mit ca. 50 kDa, was relativ

Ergebnisse 46

genau dem überexprimierten Prp28∆N mit einem theoretischen Molekulargewicht von

51,1 kDa entspricht.

Prp28∆N

Abb. 8: SDS-PAGE des Prp28∆N-Aufschlusses und der Histidin-Affinitätschromatographie. M = Marker; A = Aufschluss; Ü = Überstand; P = Pellet; F8 – F47 = Fraktionen der Histidin-Affinitätschromatographie. Im Aufschluss ist die Überexpression eines ca. 51 kDa großen Proteins zu erkennen (roter Pfeil). Sowohl im Überstand als auch im Pellet befinden sich größere Mengen dieses Proteins. Das exprimierte Protein Prp28∆N ist in den Fraktionen 30 bis 47 deutlich zu sehen (schwarzer Pfeil). Ebenso ist ein verunreinigendes Protein mit einer Größe von etwa 28 kDa zu sehen, welches wahrscheinlich die Schulter im Elutionsmaximum in Abb. X verursacht.

3.2.2 Größenausschlußchromatographische Reinigung über Gelfiltrationssäulen

Als letzter Reinigungsschritt wurde eine Größenausschlusschromatographie mittels einer

Gelfiltrationssäule Superdex 75 26/60 (2.2.3.5.2) durchgeführt. Ziel war es, alle

Fremdproteine vom überexprimierten Fusionsprotein Prp28∆N zu trennen.

Dazu wurde die Probe auf die Säule appliziert und der Lauf mit einer Geschwindigkeit von

1 ml/min bei 4 °C durchgeführt.

Im Chromatogramm entspricht das erste Maximum bei etwa 100 ml dem

Ausschlussvolumen der Säule. Alle Proteine sowie Proteinkomplexe die größer als ca. 130

kDa sind, werden hier eluiert. Das zweite Maximum bei etwa 115 ml Elutionsvolumen

entspricht dem Fremdprotein, welches als deutliche Bande in Abb. 10 zu sehen ist. Das

dritte Maximum bei ca. 160 ml Elutionsvolumen stellt das überexprimierte Protein

Prp28∆N dar.

Ergebnisse 47

Abb. 9: Chromatogramm der Größenauschlusschromatographie über eine Superdex 75 26/60 Gelfiltrationssäule. Prp28∆N Maximum bei 170 ml. Die Asymmetrie des Maximums weist auf eine Verunreinigung des Proteins hin. (blau: UV-Absorption bei 280 nm)

Die einzelnen Fraktionen wurden per SDS-PAGE analysiert.

Abb. 10: SDS-PAGE der Größenausschlusschromatographie. M: Größenstandard; 13 -24: Fraktionen der Größenausschlusschromatographie aus Abb. 9

Ergebnisse 48

Auf dem SDS-Gel (Abb. 10) entspricht Spur 1 dem erstem Maximum, und somit dem

Ausschlussvolumen. Die hier laufenden Proteine sind meist mißgefaltet und lagern sich

über hydrophobe Bereiche zu Komplexen zusammen. Die Banden in Spur 1 sind nur sehr

schwach, was wahrscheinlich auf die geringe Proteinkonzentration zurückzuführen ist. Die

zweite Spur entspricht Fraktion 15 in Abb. 9. Hier ist eine deutliche Bande bei ca. 66 kDa

zu sehen, welche das zweite Maximum im Chromatogramm hervorruft. Die Spuren 3 – 6

repräsentieren die Fraktionen 20 – 21 und 23 – 24, welche dem dritten Maximum

entsprechen. Es sind sehr starke Banden bei etwa 50 kDa zu beobachten, welche dem

überexprimierten Protein Prp28∆N entsprechen. Die Proben wurden auf 5 mg/ml

konzentriert. Eine anschließende erneute Analyse mittels SDS-PAGE zeigte, dass die in

Abb. 10 in Spur 4 zu sehende Bande bei etwa 20 kDa durch den Prozess des

Ankonzentrierens (2.2.3.4) entfernt werden konnte. Die Probe besaß somit eine

ausreichende Reinheit um damit biochemische Charakterisierungen sowie

Kristallisationsversuche durchführen zu können.

Es ergab sich eine Ausbeute von ca. 8,5 mg reinem Protein pro Liter Expressionskultur.

3.3 Kristallisation von Prp28∆N

Ein zentraler Punkt dieser Diplomarbeit bestand in der Kristallisation von Prp28∆N. Für

die Kristallisationsversuche wurde das Protein in einer Konzentration von 4 mg/ml

eingesetzt. In das Reservoir wurden jeweils 500 µl der Bedingung vorgelegt, anschließend

1 µl der Bedingung in die zentral liegende Vertiefung (engl.: well) pipettiert und mit 1 µl

der Proteinlösung gemischt. Die Platten wurden unmittelbar danach verschlossen und bei 4

°C gelagert. Es wurden folgende Screens pipettiert:

Crystal Screen I

Crystal Screen II

Crystal Screen lite

Crystal Screen Cryo

JB 1 – 9

Magic Screen 1 – 3

Footprint Screen I

The Opti Salts

Ergebnisse 49

Crystal Screen PEG/Ion

Additive Screen 1 – 2

In etwa 50 % der Fälle präzipitierte das Protein nach einigen Tagen in der

Kristallisationsbedingung. Es konnten keine Anzeichen von Kristallisation oder

Kristallisationsvorstufen wie z.B. granulöse Strukturen oder Sphärolithe gefunden werden.

Um die DEAD-Box Domäne in der Lösung zu stabilisieren, wurde in den

Kristallisationstropfen 2mM Adenosin-5'-(β,γ,-imido)triphosphat (AMP-PNP) (Abb. 11)

hinzugegeben.

O

N

N

N

N

NH2

O

O

OH

OHP

O- P

O-

O

OO

-

O-

NH

O

P

Abb. 11: AMP-PNP

Dieses Molekül ist ein Analog von ATP, welches aufgrund der Imidogruppe jedoch nicht

von Prp28∆N hydrolysiert werden kann. Ziel war es das Protein durch die Interaktion mit

AMP-PNP zu stabilisieren. Es konnte jedoch kein positiver Einfluss von AMP-PNP auf die

Kristallisation von Prp28∆N festgestellt werden.

3.3.1 Entfernung der C-terminalen Hexa-Histidin-Sequenz

Da sämtliche Kristallisationsversuche nicht erfolgreich waren, wurde versucht, die für die

Reinigung des Proteins benötigte Hexa-Histidin-Sequenz am C-terminus des Proteins zu

entfernen, da diese sich evtl. störend auf die Kristallisation auswirken könnte. Da das

rekombinante Protein über keine Proteaseschnittstelle zwischen der Sequenz von Prp28∆N

und der Hexa-Histidin-Sequenz verfügte, konnte diese nicht durch Verdau mit einer

Ergebnisse 50

spezifisch schneidenden Protease entfernt werden. Stattdessen wurde ein Verdau mit

Carboxypeptidase B durchgeführt. Carboxypeptidasen sind Metalloproteine, die Proteine

vom Carboxyterminus aus angreifen (sog. Exopeptidasen). Carboxypeptidase B spaltet

dabei nach basischen Aminosäuren.

Zum Verdau wurde Carboxypeptidase B in einem molaren Verhältnis von 1:1000 mit

Prp28∆N für 20 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend in die vorgelegte

Kristallisationsbedingung pipettiert.

Das so verdaute Protein bildete in einer Bedingung des JB 5 Screen sehr viele jedoch sehr

kleine plattenförmige Kristalle.

Abb. 12: Prp28∆N-Kristalle in Bedingung 13 von JB 5 Zusammensetzung: 0,2 M NH4SO4; 22 % (w/v)

PEG 8000; 0,1 M MES pH 6,5

3.3.2 Fein-screening

Da die beobachteten Kristalle mit ca. 30 µm x 20 µm x 5 µm zu klein für

Röntgenbeugungsexperimente am zur Verfügung stehenden Röntgendiffraktometer waren,

wurde ein Fein-screening (2.2.4.2) durchgeführt, um die Größe und Qualität der Kristalle

zu verbessern.

Dabei wurde die NH4SO4-Konzentration in den Bedingungen in 0,02 M Schritten, der pH-

Wert in 0,1 Schritten und die PEG 8000 Konzentration in 0,5 % Schritten geändert.

Außerdem wurde je eines der folgenden Salze in Konzentrationen von 0,05 – 0,3 M in die

einzelnen Bedingungen gegeben:

Ergebnisse 51

NaCl

HCOO- / Na+

CH3COO- / Na+

NaSCN

Durch dieses Fein-screening konnte die Größe der Kristalle deutlich auf etwa

150 µm x 90 µm x 20 µm gesteigert werden (Abb. 13). Die Kristalle wiesen fast alle eine

dreieckige Form auf, wenige waren quaderförmig. Allen Kristallen gemein war das starke

Wachstum in zwei Dimensionen, während das Wachstum in die dritte Dimension deutlich

geringer war.

A B C

Abb. 13: Prp28∆N-Kristall in optimierten Bedingungen. Durch das Fein-screening konnte die Größe der Kristalle deutlich gesteigert werden. (A) Bedingung im Tropfen: 0,06 M NaSCN, 0,22 M NH4SO4, 20% (w/v) PEG8000, 0,1 M MES pH 6,8; (B) 0,12 M CH3COO- / Na+, 0,24 M NH4SO4, 20,5 % (w/v) PEG8000, 0,1 M MES pH 6,6; (C) In einer Bedingung mit 0,24 M NaSCN, 0,28 M NH4SO4, 21,5 % (w/v) PEG8000, 0,1 M MES pH 6,7 bildeten sich lange, stäbchenförmige Kristalle.

3.4 Röntgenbeugungsexperimente

Mit den Kristallen aus Abb. 13 (A) und (B) wurden sowohl am Röntgendiffraktometer der

Molekularen Strukturbiologie, Göttingen als auch durch Dr. Jana Schmitzova mit

Synchrotronstrahlung am BESSY, Berlin Röntgenbeugungsexperimente durchgeführt. In

beiden Fällen ergab sich eine Auflösung von lediglich 8 Å. Daraufhin wurde versucht,

durch Behandlung der Kristalle mit Glutaraldehyd (2.2.4.3) die Stabilität des Kristalls zu

erhöhen um höher auflösende Beugungsdaten zu erhalten. Diese Versuche erwiesen sich

jedoch als nicht erfolgreich, da sich die Auflösung nicht verbessern ließ.

Ergebnisse 52

Mit den langen, stäbchenförmigen Kristallen aus Abb. 13 wurden

Röntgenbeugungsexperimente mit Synchrotronstrahlung an der Microfocus Beamline

ID23-2 des ESRF Grenoble, Frankreich durchgeführt, da es hier möglich war, den

Röntgenstrahl auf einen geringeren Durchmesser als den Kristalldurchmesser zu

fokussieren. Dies ermöglicht eine hohe Strahlintensität im Kristall bei gleichzeitig

geringerem Hintergrund, als dies bei einem schwächer fokussierten Strahl der Fall ist,

dessen Durchmesser größer als der Durchmesser des zu messenden Kristalls ist.

Abb. 14: Beugungsbild eines Prp28∆N Kristalls aus Abb. 13 (C) Aufgenommen an der Beamline ID23-2 ESRF, Grenoble. Wellenlänge: 0,873 Å, Detektorentfernung 372.31 mm, Belichtungszeit: 1 sek., Auflösungsgrenze: ca. 7 Å

Die maximal erreichte Auflösung betrug auch in diesem Fall nur etwa 7 Å, was zur

Bestimmung der dreidimensionalen Kristallstruktur von Prp28∆N nicht ausreichend ist.

3.5 Biochemische Charakterisierung 3.5.1 ATPase Aktivität Die RNA-Helikase-Aktivität von DEAD-Box Proteinen setzt die Hydrolyse von ATP

voraus. Dementsprechend weisen viele dieser Proteine eine in vitro ATPase Aktivität auf.

In dieser Arbeit sollte ein Test zur quantitativen Bestimmung der ATPase-Aktivität von

Proteinen etabliert werden. Hierbei kam der kommerziell erhältliche EnzCheck Phosphate

Ergebnisse 53

Assay der Firma Invitrogen zum Einsatz, bei welchem in einer Phosphatabhängigen

Reaktion das Substrat MESG enzymatisch umgesetzt wird (2.2.3.7). Zur Kontrolle des

Assays wurde eine vom N-terminus um 464 Aminosäuren verkürzte Variante des

spleißosomalen DEAH-Box Proteins Prp22 aus Saccharomyces cerevisiae eingesetzt, deren

KM-Wert für die ATPase Aktivität aus der Literatur bekannt ist (Tanaka und Schwer 2005).

Vor Beginn der Messungen wurde der molare Extinktionskoeffizient ε von 2-amino-6-

mercapto-7-Methylpurin bei 360 nm bestimmt. Dazu wurden in einer Messreihe

Reaktionsansätze bestehend aus MESG, Purin Nukleosid Phosphorylase und Puffer mit

Phosphat in Konzentrationen von 0 – 100 µM inkubiert und die Absorption bei 360 nm

gemessen.

y = 0,01x

00,20,40,60,8

11,21,41,6

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Phosphat [µM]

Extin

ktio

n 36

0nm

Abb. 15 Phosphatstandard zur Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten. Die gemessenen Punkte liegen auf einer Geraden mit der Steigung 0,01

Die gemessene Extinktion wurde gegen die Phosphatkonzentration aufgetragen. Aus der

Steigung der Geraden ergab sich ein molarer Extinktionskoeffizient ε von 0,01/µM*cm.

Zur Bestimmung der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit Vmax und der

Substratkonzentration, bei der Vmax/2 erreicht ist (KM-Wert) wurden Proben mit je 1µM

Prp22∆N angesetzt und 10 min in der Küvette im Photometer bei 25 °C inkubiert. Danach

wurde ATP in Konzentrationen von 0 – 500 µM zum Reaktionsansatz hinzugegeben und

die Absorption bei 360 nm über eine Zeitspanne von 5 min gemessen. Jede Probe wurde

dreimal unabhängig voneinander angesetzt und gemessen. Die Datenauswertung erfolgte

gemäß Lineweaver-Burk.

Ergebnisse 54

y = 0,389x + 0,011

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

1/ATP [µM]

1/v

[µm

ol/(l

*min

)]

Abb. 16: Lineweaver-Burk Diagramm der gemittelten ATPase Aktivität von Prp22∆N. Es ist 1/Anfangsgeschwindigkeit v auf der Y-Achse gegen 1/ATP Konzentration in µM auf der X-Achse aufgetragen. Es ergibt sich folgende Gleichung für die Gerade: y = 0,389 + 0,011 , was einem KM-Wert von 35,22 µM und einem Wert von 90,53 µmol/(l*min) für Vmax entspricht Wie erwartet liegen die einzelnen Messwerte mit nur geringer Abweichung auf einer

Geraden. Aus der Steigung dieser Geraden ergab sich für Prp22∆N ein KM-Wert von 35,22

± 7,36 µM µM sowie ein Wert von 90,53 ± 8,23 µmol/(l*min) für Vmax.

Weiterhin wurde der KM-Wert sowie Vmax durch Kurvenanpassung an die Michaelis-

Menten-Gleichung mit dem Programm SigmaPlot bestimmt.

ATP [µM]

0 100 200 300 400 500

v [µ

mol

/(l*m

in)]

0

20

40

60

80

100

120

Abb. 17: Kurvenanpassung mit SigmaPlot. Dabei ergibt sich ein KM-Wert von 30,51 ± 9,78 µM sowie ein Wert von 101,93 ± 16,27 µmol/(l*min) für Vmax

Ergebnisse 55

Hierbei ergab sich für den KM-Wert 30,51 ± 9,78 µM und für Vmax 101,93 ± 16,27

µmol/(l*min).

Die Messungen zur Bestimmung der ATPase Aktivität von Prp28∆N wurden auf die

gleiche Weise durchgeführt. Es konnte dabei nach Abzug der Referenzmessungen ohne

Prp28∆N jedoch keine signifikante Absorptionsänderung beobachtet werden. Der durch

Kurvenanpassung ermittelte KM-Wert liegt bei 1,24 ± 3,41 µM, Vmax hat einen Wert von

0,057 ± 0,012 µmol/(l*min). Daraus ergibt sich zusammen mit der Proteinkonzentration

von 1µM eine Wechselzahl von 0,00095 s-1, was einem Umsatz von 1 Molekül ATP pro

1000 Sekunden entspricht.

ATP [µM]

0 200 400 600 800 1000 1200

v [µ

mol

/(l*m

in)]

-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

Abb. 18: ATPase-Aktivität von Prp28∆N. Es ist die Reaktionsgeschwindigkeit v bei verschiedenen ATP Konzentrationen aufgetragen. Eine Signifikante ATPase-Aktivität kann nicht beobachtet werden.

3.5.1.1 Stimulation der ATPase Aktivität durch RNA

Da Helikasen wie Prp28 und Prp22 in vivo während des Spleißvorgangs an RNA binden

und diese entwinden, sollte die Auswirkung von an das Protein gebundener RNA auf die

ATPase-Aktivität untersucht werden. Für die Messungen wurde Poly-Adenin RNA mit

einer Kettenlänge von 20 Nukleotiden verwendet, da für diesen RNA-Typ bereits

Messwerte bezüglich der ATPase-Aktivität von Prp22 in der Literatur vorliegen, die zum

Ergebnisse 56

Vergleich herangezogen werden können. Die Messungen erfolgten wie in (2.2.3.7)

beschrieben. Zusätzlich wurde RNA in Konzentrationen von 0 – 10 µM zu den einzelnen

Messansätzen hinzugefügt.

ATP [µM]

0 100 200 300 400 500

v [µ

mol

/(l*m

in)]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 100 200 300 400 500

Abb. 19: ATPase-Aktivität von Prp22∆N in Anwesenheit von Poly-Adenin RNA. Aufgetragen ist die Reaktionsgeschwindigkeit v auf der Y-Achse gegen die ATP Konzentration auf der X-Achse. Für 0 und 10 µM RNA sind außerdem die Graphen aus der Kurvenanpassung aufgetragen (●: ohne RNA; ○: 1 µM RNA; ▼: 2 µM RNA; ∆: 4 µM RNA; ■: 10 µM RNA

Wie man in Abb. X sieht, ergibt sich bei steigender RNA-Konzentration ein deutlicher

Anstieg von Vmax. Die durch Kurvenanpassung mit SigmaPlot erhaltenen Werte lauten wie

folgt:

RNA-Konzentration KM [µM] Vmax [µmol/(l*min)]

0 µM (zum Vergleich) 30,51 ± 9,78 101,93 ± 7,85 1 µM 45,19 ± 4,55 114,82 ± 6,59 2 µM 58,72 ± 7,72 128,16 ± 9,97 4 µM 72,32 ± 7,12 153,73 ± 9,34 10 µM 81,28 ± 5,93 185,80 ± 8,48 Zusätzlich erfolgte die Auftragung der Messwerte nach Lineweaver-Burk. Durch die Art

der Auftragung werden hierbei die Messwerte bei niedrigen ATP-Konzentrationen stärker

gewichtet.

Ergebnisse 57

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

1/ATP [µM]

1/v

[µm

ol/(l

*min

)]

1 µM RNA 2 µM RNA 4 µM RNA 10 µM RNA ohne RNA

Abb. 20: Lineweaver-Burk-Diagramm der ATPase-Aktivität von Prp22∆N bei unterschiedlichen PolyA-RNA Konzentrationen. Es ist 1/Anfangsgeschwindigkeit v auf der Y-Achse gegen 1/ATP Konzentration in µM auf der X-Achse für RNA-Konzentrationen von 0µM (schwarz), 1 µM (rot), 2 µM (gelb), 4 µM (blau) und 10 µM (grün) aufgetragen. Aus den Steigungen der Geraden ergeben sich folgende KM-Werte: 0 µM RNA: 35,22 µM; 1 µM RNA: 34,89 µM; 2 µM RNA: 28,28 µM; 4 µM RNA: 52,18 µM; 10 µM RNA: 54,29 µM Die aus der Steigung der Geraden durch die Messpunkte erhaltenen Werte lauten wie folgt:

RNA-Konzentration KM [µM] Vmax [µmol/(l*min)]

0 µM (zum Vergleich) 35,22 ± 7,36 90,53 ± 8,23

1 µM 34,89 ± 6,78 94,36 ± 5,68 2 µM 28,28 ± 7,83 76,76 ± 8,43

4 µM 52,18 ± 5,24 117,25 ± 6,97 10 µM 54,29 ± 8,66 137,12 ± 9,74 Bei Prp28∆N zeigte sich in Anwesenheit von RNA auch bei Zugabe von hohen

Konzentrationen ATP (bis 5 mM) keine messbare ATPase-Aktivität.

Ergebnisse 58

3.5.2 Bindungsstudien mit ADP und ATP Eine Ursache für die fehlende in vitro ATPase Aktivität von Prp28∆N könnte sein, dass die

Konformation von isoliertem Prp28∆N derart verändert ist, dass keine ATP Bindung mehr

möglich ist. Um dies zu überprüfen, wurden Bindungsstudien durchgeführt, in deren

Verlauf die Dissoziationskonstante KD für die Interaktion von Prp28∆N mit ATP und ADP

bestimmt wurde.

Es kam hierbei ein fluorimetrisches Verfahren zum Einsatz, bei dem die durch Bindung

eines Liganden hervorgerufene Abnahme der Tryptophan-Fluoreszenz gemessen wurde

(2.2.3.6.1). Bei diesen Liganden handelte es sich um mant-modifizierte Nukleotide. Die

mant-Gruppe ist ein Fluorophor, dessen Anregungswellenlänge sich mit der

Emissionswellenlänge von Tryptophan überschneidet. Bei Bindung eines mant-

modifizierten Nukleotid kommt es zu einem Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen

Tryptophan und der mant-Gruppe, was in der Abnahme der Tryptophan-Fluoreszenz

resultiert.

3.5.2.1 Bestimmung der Anregungs- und Emissionswellenlänge

Zur Ermittlung geeigneter Wellenlängen für Anregung sowie die Emissionsmessungen

wurden zunächst ein UV-Absorptionsspektrum von mant-ADP und ein

Fluoreszenzspektrum von Prp28∆N aufgenommen.

A B

Wellenlänge [nm]

250 300 350 400 450

Abs

orpt

ion

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Wellenlänge [nm]

300 320 340 360 380 400 420 440 460

Fluo

resz

enz

[cps

]

0

1e+6

2e+6

3e+6

4e+6

5e+6

6e+6

Abb. 21: (A) UV-Absorptionsspektrum von mant-ADP. Die Kurve zeigt zwei Maxima bei 260 nm sowie bei 350 nm. (B) Fluoreszenzspektrum von Prp28∆N bei einer Anregungswellenlänge von 295 nm. Das Fluoreszenzmaximum befindet sich bei 350 nm.

Ergebnisse 59

Da Prp28∆N neben 5 Tryptophanen auch 14 Tyrosine enthält, in diesem Experiment aber

selektiv nur die Fluoreszenz der Tryptophane gemessen werden sollte, sollte eine

Anregungswellenlänge ≥ 295 nm gewählt werden, da unterhalb dieser Wellenlänge auch

die Tyrosine angeregt werden. Gleichzeitig sollte die Anregungswellenlänge aber auch so

gewählt werden, dass möglichst wenig Strahlung von mant-ADP bzw. mant-ATP

absorbiert wird, um den inner filter effect (2.2.3.6.1.2) möglichst gering zu halten.

Im UV-Absorbtionsspektrum zeigte sich für mant-ADP ein Minimum bei 292 nm. Für

mant-ATP trifft das gleiche zu. Zur Anregung der Tryptophane wurde daher eine

Wellenlänge von 295 nm gewählt.

Zur Messung der Tryptophan-Fluoreszenz sollte eine Wellenlänge gewählt werden, bei der

die Fluoreszenz der Tryptophane stark ist, die Absorption durch den Liganden mant-ADP

bzw. mant-ATP aber wiederum gering. Das Fluoreszenzspektrum von Prp28∆N zeigt ein

Maximum bei einer Wellenlänge von 345 nm. Allerdings tritt bei dieser Wellenlänge auch

eine starke Absorption durch die mant-Gruppe auf, die im UV-Absorptionsspektrum ein

Maximum bei 350 nm zeigt. Zur Messung der Fluoreszenz wurde daher eine Wellenlänge

von 330 nm verwendet. Bei dieser Wellenlänge absorbiert die mant-Gruppe deutlich

weniger stark, während die Fluoreszenz der Tryptophane nur geringfügig schwächer ist.

3.5.2.2 Dissoziationskonstante von Prp28∆N mit mant-ADP und mant-ATP

Zur Bestimmung des KD-Wertes wurden Proben mit 1 µM Prp28∆N und variierenden

Konzentrationen von mant-ADP (0 – 100 µM) bzw. mant-ATP (0 – 200 µM) angesetzt.

Die Proben wurden für 45 min bei 25 °C im Fluorimeter inkubiert, damit sich ein

Bindungsgleichgewicht einstellen konnte. Danach wurde jede Probe bei 295 nm angeregt

und das Fluoreszenzsignal bei 330 nm gemessen. Aufgrund der teilweise hohen

Ligandenkonzentrationen in den einzelnen Proben konnte ein inner filter effect trotz

Optimierung der Wellenlängen (2.2.3.6.1.1) nicht immer vermieden werden. Aus diesem

Grund wurden die gemessenen Fluoreszenzsignale entsprechend korrigiert (2.2.3.6.1.2).

Die dazu nötigen molaren Extinktionskoeffizienten für mant-ADP und mant-ATP wurden

aus dem UV-Absorptionsspektrum abgelesen. Es ergaben sich folgende Werte:

ε295nm = 463 M-1 cm -1 und ε330nm = 3550 M-1 cm-1.

Die Auswertung erfolgte gemäß dem Eadie-Hofstee Plot nach folgender Formel:

Ergebnisse 60

][max LFKFF D

Δ−Δ=Δ


[L] = Konzentration von mant-ADP bzw. –ATP [KD] = Dissoziationskonstante

Wie zu erwarten war, liegen die Werte für mant-ADP relativ gut auf einer Geraden mit

einer Steigung von -14,56 cps/(cps/µM). Daraus ergibt sich für mant-ADP ein KD-Wert

von 14,6 µM. Die Werte für mant-ATP liegen hingegen weit gestreut vor, was ein Hinweis

auf einen sehr hohen KD-Wert ist.

mant-ADP

y = -14,563x - 992146

-920000-820000-720000-620000-520000-420000-320000-220000-120000-20000

-55000 -45000 -35000 -25000 -15000 -5000

∆F/[L] [cps/µM]

∆F [c

ps]

mant-ATP

-600000

-500000

-400000

-300000

-200000

-100000

0-200000 -150000 -100000 -50000 0

∆F/[L] [cps/µM]

∆F [c

ps]

Abb. 22: Eadie-Hofstee Plot. Aufgetragen ist die Änderung des Fluoreszenzsignals ∆F auf der Y-Achse gegen die Änderung des Fluoreszenzsignals geteilt durch die Konzentration des Liganden mant-ADP bzw. mant-ATP auf der X-Achse. Für mant-ADP beträgt die Steigung der Geraden durch die Messwerte -14,56, was einem KD-Wert von 14,56 µM entspricht. In die Auftragung der Messwerte von mant-ATP konnte keine Gerade eingepasst werden.

Zusätzlich zur Auftragung gemäß Eadie-Hofstee wurden die KD-Werte durch

Kurvenanpassung bestimmt. Dabei wurden die Messwerte mit dem Programm SigmaPlot

an folgende Formel angepasst:

Dkorr KL

LFFRS

+Δ

−=][

][)/( max

max


Ergebnisse 61

mant-ADP [µM]

0 20 40 60 80 100 120

Fluo

resz

enz

(S /

R)k

orr [

cps]

1,2e+6

1,4e+6

1,6e+6

1,8e+6

2,0e+6

2,2e+6

2,4e+6

2,6e+6

Abb. 23: Kurvenanpassung mit SigmaPlot. Es ist sind die korrigierten Fluoreszenzwerte auf der X-Achse gegen die mant-ADP Konzentration in µM auf der auf der Y-Achse aufgetragen. Für mant-ADP ergibt sich ein KD-Wert von 14,2 ± 1,7 µM

Für mant-ADP ergibt sich ein KD-Wert von 14,2 ± 1,7 µM, was relativ gut mit dem Wert

aus dem Eadie-Hofstee-Plot übereinstimmt. In die Auftragung der Messwerte für mant-

ATP konnte keine Kurve eingepasst werden.

Diskussion 62

4 Diskussion Ziel dieser Diplomarbeit war die Etablierung eines nicht-radioaktiven ATPase-Assays zur

Charakterisierung von ATP-hydrolysierenden Proteinen wie z.B. Helikasen. Des Weiteren

sollte die spleißosomale DEAD-Box Helikase Prp28 aus Saccharomyces cerevisiae

gereinigt und anschließend kristallisiert werden, was die Grundlage für eine spätere

röntgenkristallographische Strukturaufklärung darstellen sollte.

Das Protein Prp28 konnte in einer N-terminal verkürzten Form mit einer C-terminalen

Hexa-Histidin-Affinitätssequenz durch mehrere Aufreinigungsschritte in reiner Form

gewonnen werden (3.2). Kristallisationsversuche mit diesem Protein blieben zunächst

erfolglos, auch die Zugabe eines Interaktionspartners führte zu keiner Verbesserung (3.3).

Erst durch Behandlung des Proteins mit der Protease Carboxypeptidase B konnten erste

kleine Kristalle beobachtet werden (3.3.1). Durch Variation der

Kristallisationsbedingungen konnte die Größe der Kristalle soweit gesteigert werden, dass

sie zu Röntgenbeugungsexperimenten genutzt werden konnten. Hierbei wurde jedoch nur

eine sehr niedrige Auflösung erzielt, die im Verlauf dieser Arbeit nicht gesteigert werden

konnte (3.4).

Zur Messung der ATPase Aktivität wurde ein Assay etabliert. Als Positivkontrolle kam das

spleißosomale Protein Prp22 zum Einsatz, welches N-terminal verkürzt war, und von dem

eine in vitro Aktivität bereits in vorhergehenden Arbeiten gezeigt wurde.

Die ATPase-Aktivität von Prp22 konnte mit dem neu zu etablierenden Assay

reproduzierbar quantifiziert werden (3.5.1). Prp28 zeigte hingegen keine messbare

ATPase-Aktivität, welche auch nicht durch die Zugabe von RNA stimuliert werden konnte

(3.5.1.1) Daraufhin durchgeführte Bindungsstudien gaben Hinweise darauf, dass Prp28 in

vitro zwar ADP jedoch kein ATP bindet (3.5.2.2).

4.1 Expression und Reinigung von Prp28∆N

Prp28∆N wurde mit einer Hexa-Histidin-Sequenz in E. coli exprimiert und anschließend

über zwei Chromatographiesäulen gereinigt. Die Reinigung verlief erfolgreich, es wurden

insgesamt ca. 70 mg reines Protein erhalten, welches sowohl für die

Kristallisationsexperimente als auch für Aktivitätstests sowie Bindungsstudien verwendet

wurde. Die Ausbeute hätte noch gesteigert werden können, da ein größerer Teil des

Diskussion 63

Zielproteins nach dem Zellaufschluss unlöslich im Pellet verblieb. Eine Optimierung des

Aufschlusspuffers oder die Zugabe von 2 % Ethanol zur Expressionskultur zur Stimulation

der Synthese von Faltungshelfern (Chaperonen) hätte zu einer höheren Löslichkeit und

damit zu einer höheren Ausbeute führen können. Da die Menge an löslichem Protein mit

70 mg für die durchzuführenden Experimente jedoch ausreichend hoch war, wurden diese

Optimierungsansätze nicht weiter verfolgt.

4.2 Kristallisation von Prp28∆N

Zur Kristallisation wurde das Protein in einer Konzentration von 4,5 mg/ml eingesetzt. Die

Kristallisation verlief zunächst nicht erfolgreich, es konnten in keiner der verwendeten

Bedingungen Kristalle oder Kristallvorstufen wie z.B. Sphärolithe gefunden werden. Auch

der Zusatz des Interaktionspartners AMP-PNP in den Kristallisationstropfen führte zu

keiner Verbesserung. Allerdings präzipitierte das Protein in ca. der Hälfte der Bedingungen

des Screens Footprint I, was auf eine zur Kristallisation geeignete Proteinkonzentration

hinwies.

Ein möglicher Grund für die bisher nicht erfolgreiche Kristallisation von Prp28 könnte die

zur Reinigung des Proteins benötigte Hexa-Histidin-Affinitätssequenz am C-terminus des

Proteins sein. Da diese frei beweglich und somit ungeordnet ist, könnte sie die zur

Kristallbildung nötige periodische Zusammenlagerung stören.

Um dies zu verhindern und damit die Kristallisation von Prp28 zu ermöglichen, wurde

versucht, die Hexa-Histidin-Affinitätssequenz mittels der Protease Carboxypeptidase B zu

entfernen (3.3.1).

Erneute Kristallisationsversuche ergaben kleine Kristalle in einer Bedingung welche

NH4SO4, PEG 8000 sowie MES mit einem pH-Wert von 6,5 enthielt. Im anschließenden

Fein-Screening zeigte sich, dass die Bildung von Kristallen durch einen pH-Werte unter

6,7 sowie durch den Zusatz von Natrium-Salzen positiv beeinflusst wird.

Durch das Fein-Screening konnten die Kristalle bis auf eine Größe von ca.

150 µm x 90 µm x 20 µm gebracht werden. Diese wurden für die nachfolgenden

Röntgenbeugungsexperimente verwendet.

Diskussion 64

4.3 Röntgenbeugungsexperimente

In den durchgeführten Röntgenbeugungsexperimenten streuten alle getesteten

Kristallformen nur bis zu einer Auflösung von maximal 7Å. Ein möglicher Grund für diese

niedrige Auflösung kann in der C-terminalen Helikasesubdomäne begründet liegen. Bei

der Strukturaufklärung des DEAD-Box Proteins eIF4A zeigte sich eine hohe Flexibilität in

der RNA-bindenden Helikasesubdomäne (Caruthers et al. 2000) ebenso wie bei der

Lösung der Struktur eines DEAD-Box Proteins aus Methanococcus jannashii (Story et al.

2001). Durch diese Flexibilität können sich Fehler in der Packung des Kristalls ergeben,

welche dann zu schlecht streuenden Kristallen führen. Zur Verbesserung der Streuung zu

höheren Auflösungen wurden verschiedene Versuche unternommen. Die Kristallisation

mit gebundenem AMP-PNP sollte die Helikase-Subdomänen in einer definierten Position

stabilisieren, und damit die Ordnung im Kristall verbessern. Diese Maßnahme zeigte

jedoch keine Wirkung auf die im Röntgenbeugungsexperiment erzielte Auflösung. Die

später durchgeführten Messungen zur Bindung von ATP an Prp28∆N (3.5.2.2) zeigten

jedoch, dass Prp28∆N nicht oder nur sehr schwach an ATP bindet. Da AMP-PNP ein ATP-

Analogon ist, liegt die Vermutung nahe, dass auch dieses von Prp28∆N nicht gebunden

wurde, und die Orientierung der Helikase-Subdomänen zueinander nicht in einer

definierten Konformation stabilisiert wurde. Eine weitere Möglichkeit die Flexibilität der

Domänen einzuschränken, welche in Rahmen dieser Arbeit nicht mehr zum Einsatz kam,

wäre das Protein mit RNA als einem Interaktionspartner der Helikasedomäne zu

kristallisieren. Auch hierdurch kann das Protein in einer definierten Konformation

stabilisiert werden, was zu einer verbesserten Ordnung im Kristall führt. Somit erhöht sich

die Periodizität im Kristall, und es stehen mehr Atome für konstruktive Interferenz zur

Verfügung, was im Röntgenbeugungsexperiment zu höheren Auflösungen führen könnte.

4.4 ATPase Assay

4.4.1 Kontrolle des Assays mit Prp22∆N

Neben der Kristallisation sollte Prp28∆N in Bezug auf seine ATPase-Aktivität

biochemisch charakterisiert werden, und zu diesem Zwecke ein ATPase Aktivitätstest

etabliert werden.

Diskussion 65

Die zur Validierung der Ergebnisse durchgeführte Positivkontrolle wurde mit der N-

terminal verkürzten Helikase Prp22 durchgeführt, von der eine in vitro Aktivität bereits aus

vorhergehenden Arbeiten bekannt ist.

Die Auswertung der Messungen durch Kurvenanpassung mit SigmaPlot ergab für Prp22

ohne RNA einen KM-Wert von 30,51 µM mit einer mittleren Abweichung von ± 9,78 µM.

Die Auftragung nach Lineweaver-Burk ergab einen KM-Wert von 35,22 µM, die mittlere

Abweichung betrug hier ± 7,36 µM. Die Abweichung der Werte voneinander ergibt sich

aus den unterschiedlichen Methoden der Auftragung. Bei der reziproken Auftragung nach

Lineweaver-Burk werden die bei niedrigen ATP-Konzentrationen gemessenen Werte

durch die Art der Auftragung gegenüber den bei hohen ATP-Konzentrationen gemessenen

Werten stärker gewichtet als bei der Kurvenanpassung durch SigmaPlot.

Die veröffentlichten KM-Werte für Prp22 weichen mit 700 µM erheblich davon ab (Tanaka

und Schwer 2005). Allerdings wurde in der genannten Veröffentlichung Prp22 in voller

Länge eingesetzt, während in dieser Arbeit aus Gründen der Verfügbarkeit eine N-terminal

verkürzte Variante zum Einsatz kam (Abb. 24). Der entfernte N-terminale Bereich

beinhaltet beim wildtyp Prp22 ein sog. S1 Motiv, welches wahrscheinlich an der RNA-

Bindung beteiligt ist (Schneider et al. 2001). Kinetische Untersuchungen mit Prp22-

Mutanten ohne S1-Motiv haben allerdings gezeigt, dass das Fehlen des S1-Motivs keine

Auswirkungen auf die Aktivität des Enzyms hat (Schneider et al. 2001).

S1 HelicC DEAH HA2 DUF

Prp22

Prp22∆N

Abb. 24: Domänenstruktur von Prp22. blau: S1; orange: DEAH; rot: HelicC; grau: HA2; grün: Domäne unbekannter Funktion (Domain of unknown function: DUF)

Vergleichbares ergaben auch die durchgeführten Aktivitätstests mit RNA. Es zeigte sich

ein deutlicher Einfluss von RNA auf die ATPase-Aktivität. Der Wert von Vmax konnte

durch Zugabe von RNA von 101,93 µmol/(min*l) auf bis zu 185,8 µmol/(min*l) bei einer

RNA Konzentration von 10 µM gesteigert werden, was einer Steigerung der Aktivität von

82 % entspricht. Daraus kann geschlossen werden, dass das S1-Motiv für die Bindung von

RNA nicht zwingen notwendig ist, oder Prp22∆N ein weiteres Motiv zur Bindung von

Diskussion 66

RNA besitzt. Warum die Zugabe von RNA bei gleichzeitig steigender Vmax zu einem

steigenden KM-Wert führte, konnte nicht abschließend geklärt werden. Möglicherweise

stabilisiert die RNA die Helikasedomäne in einer Weise, die zu einer schlechteren

Zugänglichkeit der ATP-Bindungstasche führt, und somit die Affinität von Prp22∆N zu

ATP herabsetzt. Auch wäre es möglich, dass die negativ geladene RNA die Interaktion von

ATP, welches ebenfalls negative Ladungen trägt, mit der ATP-Bindetasche direkt

behindert.

4.4.2 ATPase-Aktivität von Prp28

Bei den durchgeführten Messungen konnte für Prp28 keine signifikante in vitro ATPase-

Aktivität ermittelt werden. Der ermittelte KM-Wert liegt bei 1,24 ± 3,41 µM. Die

Abweichung vom Mittelwert ist in diesem Fall größer als der ermittelte KM-Wert, was auf

die extrem niedrigen und zusätzlich stark schwankenden Werte aus den einzelnen

Absorptionsmessungen zurückzuführen ist. Ein niedriger KM-Wert weist im Allgemeinen

auf eine hohe Affinität zwischen Substrat und Enzym hin. Die in diesem Fall ermittelte

Aktivität Vmax fällt mit 0,057 ± 0,012 µmol/(l*min) und einer Wechselzahl von 0,00095 s-1

jedoch so gering aus, dass man kaum von einer eindeutigen physiologisch signifikanten

ATPase-Aktivität sprechen kann.

Die fehlende in vitro ATPase-Aktivität ist insofern ungewöhnlich, als dass Prp28∆N alle

konservierten Sequenzmotive einer DEAD-Box Helikase enthält, was darauf hinweist, dass

es in vivo eine ATPase-Aktivität besitzt.

Häufig lässt sich die Aktivität von DEAD-Box Helikasen durch RNA erhöhen, dieses war

auch in dieser Arbeit bei der DEAH-Box Helikase Prp22∆N der Fall (3.5.1.1). Bei

Prp28∆N ergab sich durch den Zusatz von RNA keine Änderung in der Aktivität. Hier sind

offenbar noch weitere Komponenten zur Aktivierung nötig, welche in vivo wahrscheinlich

vorhanden sind. In vorhergehenden Arbeiten wurde gezeigt, dass das humane Ortholog

hPrp28 in vitro ebenfalls keine ATPase-Aktivität zeigt. Ebenso wurde bei hPrp28, welches

aus HeLa-Zellen isoliert wurde, eine in vitro nicht vorhandene Helikaseaktivität beobachtet

(Laggerbauer et al. 1998), welche ebenso auf das fehlen der ATPase-Aktivität

zurückzuführen sein könnte. Auch die DEAD-Box Helikase RhlB aus E. coli zeigte nur in

Verbindung mit RNase E als Interaktionspartner in vitro ATPase- und Helikaseaktivität.

(Carpousis et al. 2008)

Diskussion 67

Um die Ursache für die nicht vorhandene ATPase-Aktivität besser erklären zu können,

wurde im weiteren Verlauf dieser Arbeit die Bindung von ATP und ADP an Prp28∆N

untersucht.

4.4.3 Bindungsstudien mit ATP und ADP

Damit ein Protein ATP hydrolysieren und damit eine ATPase-Aktivität aufweisen kann, ist

es zunächst einmal nötig, dass das betreffende Protein ATP bindet. Bei den mittels

Fluoreszenztitration durchgeführten Untersuchungen konnte jedoch keine Interaktion

zwischen ATP und Prp28∆N nachgewiesen werden (3.5.2.2). Allerdings kann mit der

verwendeten Messmethode eine Dissoziationskonstante nur bis etwa 100 µM relativ genau

bestimmt werden. Bei höheren Liganden-Konzentrationen wird der inner filter effect trotz

Anpassung der Anregungs- und Emissionswellenlänge sowie der Berechnung von

Korrekturfaktoren zu groß, womit die Auswertung sehr fehleranfällig wird.

Für ADP war mit den durchgeführten Fluoreszenztitrationsmessungen eine Interaktion mit

Prp28∆N nachweisbar. Der durch Kurvenanpassung ermittelte KD-Wert liegt bei 14,2 µM

mit einer Abweichung vom Mittelwert von 1,7 µM. Der Wert aus dem Eadie-Hofstee-Plot

stimmt damit sehr gut überein (3.5.2).

Die veröffentlichten Dissoziationskonstanten für die Interaktion von DEAD-Box Helikasen

mit ATP liegen im Allgemeinen zwischen 50 µM und 1000 µM (Cordin et al. 2006).

Daher wäre es evtl. möglich, mit anderen Methoden wie z.B. der Isothermen Titrations-

Kalorimetrie (engl. ITC) auch für Prp28∆N eine Interaktion mit Prp28∆N nachzuweisen.

Zusammenfassung 68

5 Zusammenfassung

Die DNA eukaryotischer Organismen sowie die einiger Archäen enthält sowohl

kodierende als auch nicht-kodierende Bereiche, Introns und Exons. Nach der Transkription

müssen die Introns aus der prä-mRNA entfernt werden. Dieser Vorgang, das sog. Spleißen,

wird von einem großen Protein-RNA-Komplex, dem Spleißosom katalysiert. Das

Spleißosom besteht aus 5 Untereinheiten, den sog. snRNPs (small nuclear

ribonucleoprotein particles). Der Aufbau des Spleißosoms erfolgt sukzessiv an der prä-

mRNA, wobei die snRNPs untereinander und mit der mRNA interagieren. Die Bildung des

aktiven Spleißosoms erfordert einige Umlagerungen der snRNPs, wobei RNA-RNA-

Interaktionen aufgebrochen werden müssen. Eine entscheidende Rolle bei diesen

Umlagerungen spielen DExD/H-Box-RNA-Helikasen, welche unter ATP-Verbrauch

RNA-Duplexe entwinden. Eine dieser Helikasen ist Prp28, welche für die Entfernung des

U1-snRNP von der 5´-Spleißstelle verantwortlich ist.

In dieser Arbeit wurde ein C-terminales Fragment von Prp28 rekombinant in Escherichia

coli exprimiert und anschließend gereinigt. Daraufhin wurde versucht, das Protein zu

kristallisieren. Die Kristallisationsversuche waren erfolgreich, allerdings war die mit den

Kristallen im Röntgenbeugungsexperiment erhaltene Auflösung zu gering zur Bestimmung

der dreidimensionalen Kristallstruktur.

Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die biochemische Charakterisierung der

ATPase-Aktivität von Prp28. Dazu wurde zunächst ein Test zur Messung dieser Aktivität

etabliert, der mit dem spleißosomalen DEAH-Box-Protein Prp22 reproduzierbare

Ergebnisse lieferte. Für Prp28 konnte jedoch keine in vitro ATPase Aktivität gezeigt

werden. Daraufhin wurde in Bindungsstudien die Interaktion von Prp28 mit ATP

untersucht, wobei keine signifikante Interaktion festgestellt werden konnte.

Abkürzungsverzeichnis 69

6 Abkürzungsverzeichnis

α alpha

Å Angström [1 Å = 0.1 nm]

Abb. Abbildung

AS Aminosäuren

ADP Adenosindiphosphat

ATP Adenosintriphosphat

Β beta

bp Basenpaare

c Konzentration [M]

° C Grad Celsius

cm Zentimeter

d.h. das heißt

Da Dalton [g/mol]

ddH2O bidestilliertes Wasser

dNTP Desoxynukleotidtriphosphat

ddNTP Didesoxynukleotidtriphosphat

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dsDNA doppelsträngige DNA

E. coli Escherichia coli

et al. et altera

EtOH Ethanol

γ gamma

IPTG Isopropyl-β-D-isothiogalactosid

k kilo (als präfix)

λ Wellenlänge [nm]

l Liter

LB Luria Bertani

μ mikro (als Präfix)

m milli (als präfix)

M Molarität

Abkürzungsverzeichnis 70

mAU Milliabsorptionseinheiten

mRNA Messenger RNA

MW Molekulargewicht [g/mol]

n nano (als Präfix)

OD Optische Dichte

PAGE Polyacryamidgel-elektrophorese

PCR Polymerasekettenreaktion

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

prä-mRNA mRNA-Vorläufer

RNA Ribonukleinsäure

RT Raumtemperatur

S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

SDS Natriumdodecylsulfat

SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Sm Steven Miller

snRNA small nuclear RNA

snRNP small nuclear Ribonucleoprotei particels

Tab. Tabelle

TEMED N, N, N´, N´ Tetramethylethylendiamin

Tm Schmelztemperatur

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

U Unit (Einheit der Enzymaktivität)

Upm Umdrehungen pro Minute

U snRNP Uridinrich small nuclear ribonucleoprotein

UV Ultraviolett

V Volumen

vgl. vergleiche

v/v Volumenprozent (volume per volume)

w/v Gewichtsprozent (weight per volume)

x g Vielfaches der Erdbeschleunigung (g = 9,81 m/s2)

z.B. zum Beispiel

ε Molarer Extinktionskoeffizient [M-1 cm-1]

Literaturverzeichnis 71

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Danksagung 77

8 Danksagung

Herrn Prof. Dr. Ralf Ficner möchte ich für die Möglichkeit, meine Diplomarbeit in der

Molekularen Strukturbiologie anzufertigen sowie für die interessante Aufgabenstallung

danken.

Herrn Prof. Dr. Kai Tittmann danke ich für die Übernahme des Korreferates.

Bei Dr. Jana Schmitzove bedanke ich mich sehr herzlich für die Bereitstellung der

klonierten Vektoren mit Prp28∆N bedanken.

Thomas Moneke und Stephanie Schell danke ich für die vielen nützlichen Anregungen,

Diskussionen und Hilfestellungen sowie für die kritische Durchsicht der Arbeit. Weiterhin

möchte ich Eike Schulz für die großartige Arbeitsatmosphäre danken.

Meinen Eltern, die mir das Studium ermöglicht haben, bin ich für die ständige

Unterstützung sehr dankbar.

Ganz besonders bedanken möchte ich mich bei Sarah Seifert, für die seelische

Unterstützung in weniger erfolgreichen Momenten sowie die unzähligen schönen Tage.

Documents

Andreas Schmitt - Georg-August-Universität Göttingen · Y = Pyrimidin; R = Purin. Das Adenin der Verzweigungsstelle ist rot markiert (nach Burge et al. 1998) Einleitung_____ 8 1.2