B F E Nr. 9

Sonderdruck aus „ AR CH 1 V FÜR LEBENS M 1 T TEL H Y G 1 E NE", 26. Jahrgang, Heft Nr. 2, Seiten 65-67 (1975)

Verlag M. & H. Schaper, 3 Hannover, Grazer Straße 20 - Druck: Hagemann-Druck, 32 Hildesheim

Antibiotische Eigenschaften des Stammes Bacillus subtilis var. niger Von M. T. B o m a r

Die Hitzesterilisation gehört zu den weitverbreitetsten Me­thoden der Mikroorganismenabtötung. Um ein sicheres Sterilisationsverfahren zu gewährleisten, wurden verschie­dene biologische Testmethoden zur Erforschung der erfor­derlichen Steril isationsbedingungen oder zur Nachprüfung der erfolgten Sterilisation entwickelt. Für diese Untersu­chungen wurden bestimmte Bakterienarten bzw. ihre Spo­ren verwendet. Im allgemeinen wurden hier die Sporen Bacillus subtilis bzw. die Sporen Bacillus. stearothermophi­lus als maßgebend angesehen.

In diesem Beitrag wird über eine einseitige antagonistische Wirkung von Bacillus subtilis gegenüber Bacillus stearo­thermophilus berichtet.

Material und Methoden

Mikroorganismen: Bacillus subtilis var. niger (ATCC 9372), Bacillus stearothermophilus B 6/1972 aus unserer Samm­lung.

Nährböden: Alle Versuche der Antibiose wurden mit der Standard 1-Nährbouillon (Merck, 7882) durchgeführt. Für die quantitative Bestimmung der Keime wurde Standard 1-Nähragar (Merck 7881}, benutzt.

K ·e im z a h 1 bestimm u n g

Zur quantitativen Bestimmung der Keime wurde das Guß­plattenverfahren mit Hilfe von Verdünnungsreihen angewen­det. Die Keimzahlbestimmung der Zellen B. subtilis erfolgte bei 32° C, die des B. stearothermophilus bei 55° C.

Durchführung der Versuche

300 ml Bouillon im Erlenmeyer-Kolben (500 ml) wurde mit einer Impföse aus der Schrägagar-Kultur mit Bacillus sub­tilis-Keimen oder Bacillus stearothermophilus-Keimen be­impft. Die Bebrütung erfolgte auf der Schüttelmaschine (Gyrotory shaker, Med. G. 10, New Brunswick Sei, Co„ lnc.) bei 32° bzw. 55° C. Bei 125 U/Min. wurde dann die Kultur 8, 16 und 24 Std. inkubiert.

Nach dieser Zeit wurde die Suspension in Mengen zu 50 ml in 100 ml Erlenmeyer-Kolben verteilt und sofort mit der 24 Std. Bouillonsuspension des jeweiligen anderen Stam­mes beimpft (pro Kolben 1 ml). Nun wurde die Bebrütungs­temperatur dem zuletzt geimpften Stamm angepaßt. Nach 24 Std. wurde die Vermehrung oder Reduzierung der beiden Bakterienarten durch jeweils doppelte Platten bebrütung er­mittelt. Eine Reihe wurde zwecks Bestimmung der B. sub­tilis-Keime bei 32°, die andere zur Bestimmung der B. stea­rothermophilus-Keime bei 55° C bebrütet.

F i 1 t r a t i o n d e r B. s u b t i 1 i s - S u s p e n s i o n

Die Filtration wurde mit Membranfilter, Porengröße 0,2 µ (Sartorius), durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

Der Hauptunterschied zwischen den hier zu den Versuchen verwendeten Stämmen ist ihre Optimaltemperatur. Wenn man nun diese zwei Spezies als konkurrierende Mikroor­ganismen betrachtet, weist Bacillus stearothermophilus bessere Positionen aus.

Die Keime sind fähig, sich auch bei der Temperatur von 32° C zu vermehren (in 24 Std. fand etwa eine Verdreifachung der Keime statt), obwohl diese Temperatur tief unter dem Optimum liegt. Bacillus subtilis-Keime dagegen wurden durch die Temperatur von 55° C beschädigt und eine Keim­zahlreduktion war signifikant nachweisbar. Die Reaktion beider Bakterienarten auf diese zwei Temperaturen ist in der Tabelle 1 wiedergegeben.

T a b e 1 1 e 1: Die Vermehrung / Reduktion der Keime Bacillus subtilis var. nlger und Bacillus stearothermophilus bei den Tem­

peraturen von 32° C und 55° C nach 24 Stunden

Kontakt­temperatur

in °C

32 55

Keime/ ml Bacillus

Bacillus subtilis stearothermophilus

AKZ* nach 24 Std. AKZ* nach 24 Std.

1,8. 101 >1,8 . 101 1,2 . 107 3,1 . 107

4,0 . 107 1,8 . 10• 4,3 . 10' 2,4. 106

* AKZ = Anfangskeimzahl

Das Verhalten der Keime B. stearothermophiius in einer Suspension von B. subtilis zeigte eine antibiotische Wir­kung (Tabelle 2).

Ta b e 1 1 e 2: Antimikrobielle Wirkung einer Suspension Bacil­lus subtllls var. nlger auf Keime von Bacillus stearothermophilus

Nachweis­temperatur

oc

32 55

B. subtilis-Suspension + 1 ml 8 . stearoth.

B. subtilis/ml 8. stearoth./ml

4,0. 10' 1,2. 102

Kontrolle (reine

Bouillon)

4,2. 104

4,0. 107

Aus den hier vorliegenden Ergebnissen geht hervor, daß Bacillus subtilis eine äußerst starke antimikrobielle Wirkung auf die Zellen von B. stearothermophilus ausübt trotz der optimalen Vermehrungstemperatur für B. stearothermophi­lus. Auf Grund dieser Ergebnisse wurde versucht, folgende Fragen zu beantworten: Ist diese Wachstumshemmung auf den Nährstoffmangel im Medium zurückzuführen, oder beruht sie auf der Produktion von antibiotischen Stoffen?

Zur Beantwortung dieser Frage wurde die B. subtiiis-Sus­pension (24 Std.) mit frischer steriler Bouillon angereichert und mit einer Suspension von B. stearothermophilus (24 Std.) beimpft. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 dar-gestellt. ·

Daraus geht hervor, daß die Anreicherung des Mediums von 90 : 10 bis 50 : 50 der frischen Bouillon keine Vermeh­rung des B. stearothermophilus verursachte. Es war weiter­hin eine antimikrobielle Wirkung zu verzeichnen. Das be­deutet, daß es sich hier um keinen Mangel an Nährstoffen handelte. Bei noch größeren Anreicherungen mit frischer Bouillon in der Größenordnung von 10 : 90 bis 1 : 99 wurde schon der vermutete Hemmstoff so weit verdünnt, daß keine antimikrobiell·e Wirkung mehr stattfinden konnte.

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Ta b e 1 1 e 3 : Keimreduktion des B. stearothermophllus In einer Suspension von B. subtills, die mit neuer Bouillon angereichert wurde

Anreicherung in ml Impfung B. subtilis nach B. stearoth. nach AKZ

Suspension frische B. stearoth. 24 Std. Kontaktzeit 24 Std. Kontaktzeit B. subtilis B. stearoth .

B. subtilis Bouillon {ml) bei 55° C/ ml bei 55° c

90 10 1,6. 10' 3 ,4 . 101 1, 1 . 10• 1,0 . 10'

75 25 1,4 . 10' 3 ,2 . 10' 4 ,8 . 10 ' 1,0 . 10'

50 50 1,0 . 10' 2 ,2 . 10' 2,2 . 10 ' 3,6. 10'

10 90 2,3 . 10' 7,6 . 107 1 ,1 . 107 1,2 . 10'

4 96 8 ,5 . 10' 3,5. 107 4 ,2. 106 1,2 . 10'

2 98 6 ,0 . 10' 8 ,5 . 107 2 ,1 . 10' 1,2 . 10'

1 99 2,2. 102 1,0. 10• 1,0 . 10' 1,2 . 106

Zur Unterstützung dieser Behauptung wurde dann die B. subtilis-Suspension durch die Hitze und durch die Filtration sterilisiert (Tab. 4).

T a b e 1 1 e 4: Einfluß der Sterilisation I Filtration der Bacillus subtllis Suspension auf die Vermehrung I Reduktion der Bacillus

stearothermophllus Keime

H itzeste ri 1 isation

Impfung B. stearoth. nach

AKZ B. subtilis 24 Std. Bebrütung AKZ B. stearoth. bei 55° C

5,5. 10' 1,0 . 10' 2 ,0 . 10 7

Filtrat ion

AKZ B. subtilis Impfung B. stearoth. nach

24 Std . Bebrütung vor Filtration AKZ B. stearoth. bei 55° C

2,4 . 107 4 ,3. 10' 2 ,0 . 10'

Durch die Hitzesterilisation wurde die antim ikrobielle Wir­kung der B. subtilis-Kultur beseitigt, das keimfrei filtrierte Medium behielt eine deutliche antibiotische Wirkung. Der antibiotische Stoff, den die 8 . subtilis-Kultur produzierte, war hitzeempfindlich. . Die bisherigen Versuche wurden immer mit einer 24 Std. alten B. subtilis-Suspension durchgeführt. Um festzustellen, wann sich die Hemmstoffe bilden bzw. wann die Konzen­tration dieser Stoffe schon eine mikrobizide Aktivität er­reicht hat, wurde mit 8, 16 und 24 Std. alter Suspension von B. subtilis experimentiert. Es hat sich herausgestellt, daß die Bildung bzw. Konzentration dieses Stoffes (dieser Stoffe), die zur Antibiose führt, erst zwischen 8 und 16 Std. der Bebrütung in gegebenen Bedingungen stattfindet (Tab. 5).

Ta b e 1 1 e 5: Bildung der erforderlichen Konzentration des mikrobiziden Stoffes bei der Kultur Bacillus subtills nach ver­

schiedener Bebrütungsdauer

Suspens ion B. subti lis Std. AKZ

8 16 24

2,1 . 10 7

6 ,9 . 107

3,3. 10'

B. stearoth. AKZ Probe

9,0. 10' 2,7. 10' 8,2. 105

4 ,0 . 107

4 ,5 . 10' 4,0 . 10'

Die antibiotischen Eigenschaften von B. subtilis var. niger sind der schon lange bekannten Tatsache zuzuschreiben, daß viele Sporenbildner Polypeptide ausscheiden, die starke Antibiotika darstellen (Du b o s . 1940). Verschiedene Spezies von Bacillus subtil is bilden Antibiotika, wie Baci­tracin (Moore and Wo o ldridg e , 1950) ; Bacitracin ist eine Bezeichnung, die von Bacillus subtilis Tracy abge­leitet wurde. Dieser Stamm liegt dem Bacillus subtilis Cohn sehr nahe, der Unterschied beruht auf der Fähigkeit, in Gegenwart von Nitrat anaerob zu wachsen (Th i m a n n , 1964). An­dere Spezies von Baci llus subtilis produzieren Subti lin

•

(Jans e n und Hirschmann. 1944; 0 s t er , 1957), Bacill in (F o s t er und Wo o d ruf f , 1946) und Myco­baci llin (M a j u m dar and B o s e , 1958). Alle diese Sub­stanzen sind hauptsächlich gegen Gram-positive Bakterien und gegen Pilze aktiv (Reh m , 1967 ; 0 s t er , 1957; An -dersen and Mich e n e r , 1950; Landy et. al., 1948) . Die hier dargestellte Wirkung von Bacillus subtilis auf Ba­cillus stearothermophilus hat eine für die Sterilitätskontrolle wichtige Regel angedeutet. Es ist nicht zu empfehlen, mit einer Mischung dieser Bakterien oder sogar mit einer unbekannten Bakterienmischung zu arbeiten ; es könnte dann nämlich passieren, daß die überlebenden Keime die ander·en hitzeresistenten Keime in der Auskeimung hem­men könnten.

Zusammenfassung

In diesem Beitrag wird über eine antagonistische Wirkung von Bacillus subtilis var. niger gegenüber Bacillus stearo­thermophilus referiert. Die Bildung antagonistischer Stoffe (in ausreichender Konzentration), die zur mikrobiziden Wir­kung gegen Bacillus stearothermophilus bei der Temperatur von 55° C führten, wurde erst in einer B. subtilis-Bouillon­Suspension (Bebrütungstemperatur 32° C), die mehr als 8 Stunden alt war, erreicht. Durch die Hitzesterilisation der Bouillon wurde diese antimikrobielle Wirkung beseitigt. Das keimfrei gefilterte Medium behielt eine deutliche antibio­tische Aktivität. Aus diesen Gründen ist es nicht zu emp­fehlen, mit einer Mischung dieser Bakterien oder sogar mit einer unbekannten Bakterienmischung zu arbeiten, wei l evtl. die Möglichkeit besteht, daß die überlebenden Keime die anderen hitzeresistenten im Wachstum negativ beein­flussen.

Summary

lt is reported about the antagonistic effect of B. subtilis var. niger against B. stearothermophilus. Antagonistic substances (in sufficient concentration) leading to the microbicidal effect against B. stearothermophilus at a temperature of 55° C could be found only if the B. subtilis cu lture had been cultivatet at 32° C for at last 8 hours. This antimic robial effect cou ld be eliminated by heat sterilization. The filtrate without organisms showed furtheron a distinct antibiotic activity. Therefore it cannot be recommended to make investigations with a mixture of these microorganisms or even with unknown bacteria, because there is a possibility for the surviving organisms to have a negative influence on the growth of other heat- resistant organisms.

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März/ April 1975 ARCHIV FÜR LEBENSMITTELHYGIENE 67

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Für die gewissenhafte Mitarbeit bei der Durchführung der Unter­suchungen danke ich Frau Margit Se r s. Anschrift des Verfassers: M. T. B o m a r , Bundesforschungsanstalt für Ernährung , 75 Karlsruhe 1, Engesserstraße 20

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