4. Konstruktion einer chromosomalen B. subtilis-Knockout Mutante

Erlernen einer Methode zur Inaktivierung eines Gens bei Bacillus subtilis

Versuchsziel:

Experimentelle Möglichkeiten, eine Knockout-Mutante zu konstruieren:

1. Gen mit den flankierende Regionen in ein Vektor-Plasmid einbauen; Markergen in die singuläre Schnittstelle am Beginn des zu inaktivierenden Gens

2. Gen mit flankierender Region in ein Vektor- Plasmid klonieren; Markergen in singuläre Schnittstelle innerhalb des Gen einbauen

A B B C

B Marker B

A

B

B

C

3. Etwa 300 bp vom Beginn des Gens mittels PCR amplifizieren und in einen Integrationsvektor einbauen

Integration des recombinanten pMUTIN in das Zielgen

Charakteristika der pMUTIN- Vektoren

1. Erlauben die Konstruktion von Knockouts2. Fusionieren das Promotor-lose lacZ-Gen an

den Promotor des inaktivierten Gens3. Fusionieren den regulierbaren Pspac

Promotor an Gene des Operons, die downstream von dem inaktivierten liegen

Gewinnung und

Einbau eines ca. 300-

bp Fragments in den

pMUTIN4-Vektor

Integration des

Plasmids in das

B. subtilis-

Chromosom in

einem Single-

Crossing Over

Ereignis

Experimentelle Durchführung: Teil 1

1. Präparation des rekombinanten Plasmids pMUTIN-yrdB aus E. coli-Zellen

2. Kontrollverdau des Plasmids; Kontrolle leerer Vektor

3. Transformation B. subtilis; Selektion auf LB + 1 µg/ml Erythromycin (Em)

4. Screening von ca. 100 Transformanten auf LB + 100 µg/ml Em

Unterscheidung

zwischen Pseudo-

resistenten und

resistenten

Kolonien

1 µg/ml Em

100 µg/ml Em 1 µg/ml Em

resistente pseudo-resistente Kolonien

Amplifikation von chromosomalen DNA-Sequenzen

X X

Em

Em

Em Em

+

unequal crossing-over

Experimentelle Durchführung: Teil 2

5. Präparation chromosomaler DNA aus zwei Kandidaten

6. Hydrolyse der chromosomalen DNA mit EcoRV

7. Auftrennung der DNA-Fragmente in einem 0,8% Agarosegel

8. Southern-Blot (Vakuum-Blot)9. Detektion der gesuchten DNA-Fragmente mit

einer DIG-markierten RNA-Sonde

Experimentelle Durchführung: Teil 3

• Hydrolyse der chromosomalen DNA mit EcoRV

• Auftrennung der DNA-Fragmente in einem 0,8% Agarosegel

• Southern-Blot (Vakuum-Blot)• Detektion der gesuchten DNA-Fragmente mit

einer DIG-markierten RNA-Sonde

ECL (Enhanced ChemoLuminescence):

Zweitantikörper mit konjugierter Meerrettich Peroxidase

1. Meerretich-Peroxidase reduziert H2 O2 zu Wasser und Sauerstoffradikalen

2. Sauerstoffradikale reagieren mit Luminol zu 3- Aminophtalat und Lichtquanten

Zwei konsekutive Reaktionen:

kb

8.07.16.04.83.42.7

Verifizierung mittels Southern-Blot

Die Sonde (in blau) hybridisiert mit den angegebenen drei Fragmenten