Talama, Vol. 26, pp. 641 to 648 0039-9|40/79/0801-0641502.00~ O Pergamon Press Lid 1979. Printed in Great Britain

APPARATUR ZUR S~i, ULENELEKTROPHORESE IN NICHTWASSRIGEN L()SUNGSMITTELN

E. BLASIUS, C. SCHREIER und K. ZIEOLER Fachrichtung Anorganische Analytik und Radiochemie der Universitiit des Saarlandes,

D-6600 Saarbrticken, BRD

(Eingegangen am 1. Dezember 1978. Angenommen am 20. Dezember 1978)

Zusanunenfassung--Es wird eine Apparatur zur S~ulenelektrophorese in nichtw~issrigen LiSsungsmitteln beschrieben, die ein Arbeiten bei Feldstiirken bis zu ~50V/cm and Temperaturen bis -5() ° erlaubt, Zur kontinuierlichen photometrischen Auswertung der Trennungen dient eine Durchflul3ktivette mit zwei doppclten "Suprasil"-fenstern. Sie gestattet die Kfihlung der Probe bis zum Detektorsystem. Getrennt werden Kaliumpolysulfide als l~ispiel for hydrolyseempfindliche Salze, Thiocyanato(phenylen~- diamin)chrom(IIl)-Komplexe als Ikispiel ffir wassersehwerliSsliche Salze und aromatische Sulfonate als Beispiel for mit Kronenverbindungen komplexierte Salze.

Der Obergang von einer offenen Kammer L2 zur geschlossenen S/iule bringt flit die Elektrophorese in nichtw~ssrigen L6sungsmitteln erhebliche Vorteile. Diese sind: Verwendung auch niedrig siedender L/Ssungsmittel, AusschluB yon Luft und FeuchtigkeR, kontinuierliche Probenentnahme und Durchsatz gri~Berer Meitgen.

Im folgenden wird eine Apparatur beschrieben, die nur noch aus Glas besteht und somit die Verwendung aller giingigen organischen LiSsungsmittel sowie die Beobachtung der Vorg~inge in der Trenns/iule, an den Elektroden und Membranen gestattet. Weitere Vor- teile sind der einfache apparative Aufoau, das Heine Totvolumen und eine gute Kiihlleistung, die Feldst~rken bis zu 150 V/cm und Temperaturen his zu - 5 0 ° erlaubt. AuBerdem ist die Kiihlung der Probe his zum Detektor m/Sglich. Je nach Packung der S~iule und Trenntemperatur dauert die Elektro- phorese 30 min bis 5 h. Wegen ihres relativ guten LiSsungs- und IonisierungsvermiSgens dienen als L6sungsmittel haupts/ichlich Ameisens/iure, Eisessig, Methanol, Ethanol, Propanol-2, Acetonitrii, N,N- Dimethyiformamid und Nitrobenzol. Geeignete Leit- salze sind LiCI, NaSCN und KSCN, da sie in den meisten der a~ngegebenen LiSsungsmittel Li~slichkeiten >0,1M besitzen.

E X P E R I M E N T E L L E R T E l L

Verwendete handelsfibliche Ger~te

Hochspannungserzeugung, Power Supply Type 3371 A, LKB (Bromma, Schweden).

Kiihlung. Ultra-KryOmat K-40 DW, Meflger~itewerk Lauda (Lauda).

Photometrische Auswertung. Spektralphotometer PM 2 D, Zeiss (Oberkochen) mit angeschlossenem Kompensa- tionsschreiber Polycomb 2, Hartmann und Braun (Frank- furO.

* Ffir finanzielle Unterstfitzung danken wir der Deutschen Forschungsgemeinschaft, Bonn-Bad Godesberg.

AuJbau der Apparatur • Die Apparatur besteht aus dem unteren Eiektroden

gef'~iB, einem Zwischenstiick, der Probenentnahmevorrich- tung, der eigentlichen Trenns~ule,~dem oberen Elektroden- gef~il~ und einem Vorratsgefeil3 (Abb. 1).

Unteres £1ektroden~fdJ~. Es besitzt ein Volumen yon 200 cm ~ und dient gleichzeitig als Standgef~iB. Die seitfiche Schliflhfiise faBt einen Tetlonkern, in den ~n Platindraht als Elektrode eingepaflt ist. Sie ist h~er einen angel6teten BNC-Stecker mit der Stromquelle v©rbunden. Dutch das angeschmolzene Steigrohr yon 1,0 cm Durchmesser entweichen die Eiektrolysegase. Auf der zweiten Sch- lifIhfilse sitzt das Zwischenstiick.

Zwischenstiick. Es dient zur Kfihlung der Probenentnah- mevorrichtung, hat eine L/inge yon 9 cm, einen Innen- durchmesser yon 0,33 cm und ist mR einem Ktihlmantel (AuBendurchmesser I cm) umgeben, dessen unterer Kern als Hohlschliff ausgelegt ist. Zum Abdichten werden genormte Teflonschuhe (NS 14.5) benutzt. Der obere Teil des Zwischenstficks ist als Planschliff gearbeitet. Auf ihm liegt die ~ntere Membran der Probenentnahmevorrich- tung.

Probenenmahmevorrichtung. Sic besteht aus einem runden, 1 cm hohen, biplan geschliffenen Glasblock, der vertikal und horizontal darchhohrt ist (Abb. 2).

Der lnnendurchmesser der vertikalen Bohrung betr/igt 0,33 cm und entspricht dem des Zwischenstficks und der Trennsiiule. An die horizontale Bohrung (Innendurch- messer 0,33 cm) sind die gegenfiberliegenden Zu- und Ablaufstutzen mit 0,25 cm Innendurchmesser ange- schmolzen. In den biplanen Oberfl~chen des Glasblocks befinden sieh eingeschliffene Vertiefungen, in die die beiden scheibenf'6rmigen Membranen genau hineinpassen, Die obere Membran biidet die Abgrenzung zum Tr~igermateriaL Beide Membranen dienen zur Stri~mungsstabilisierung. Sie werden vor der Elektrophorese12 h in dem jeweihgcn LiSsungsmittel aufbewahrt und bieten dann gegenfiber Glasfritten 3 den Vorteil, dab sich der Widerstand nicht erh~Sht. Auf die obere Seite des Glasblocks setzt man die Trenns~iule. Die gesamte Probenentnahmevorrichtung wird durch einen Flansch (zwei miteinander verschraubte Edel- strahlringe) zusammengehalten.

Trenns~ule. Ihr Innendurchmesser und die Ma~ des Kfihlmanteis entsprechen denen des Zwischenstficks. Zum Packen der Trenns~iule wird die Apparatur bis auf das obere Elektrodengef~iB zusammengesetzt und mit Grund- elektrolytliSsung his I cm fiber die Probenentnahmevorrich- tung geffiUt. An den Membranen diirfen sich dabei keine

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S~iulenelektrophorese in nichtw~srigen L6sungsmittein

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Abb. 2. Ausschnittvergr6Berung der Probenentnahmevorrichtung.

Luftblasen befinden. Der Brei aus Tr~igermaterial und Grundelektrolyt wird anschlielknd langsam in die Siiule eingeschltimmt. Diese mug vertikal stehen und daft wiihrend des Fiillens nicht gekippt werden. Man ItiBt das Trtigermaterial 12 h absetzen, bis eine konstante H0he erreicht ist. Am oberen Ende der Trenns~lule befindet sich ein Hohlschliff zur Aufnahme des oberen Elektroden- gef~ilks.

Oberes Elektrodengef~#$. Es besitzt ein Volumen von 175 cm 3 und wird am unteren Schliff durch einen genormten Tellonschuh (NS 14.5) abgedichtet. Die Platinelektrode wird wie beim unteren EiektrodengefiU3 durch die seitliche Schliffhtllse eingefdhrt. Ober den oberen Schliff wird zun~chst die Apparatur volistttndig mit Grundelektrolytl0- sung gefdllt und dann die Probe mit einer Hamiltonspritze auf die Obert~che des Trttgermaterials aufgegeben. Der Schliff ist mit einem Stopfen abschlieBbar.

Vorratsgefd~. An einem Stativ auf der Grundplatte ist ein 250 cm s Scheidetrichter befestigt. Zwischen diesem Vor- ratsgefiiB und dem Zulauf der Probenentnahmevorrichtung befindet sich eine Kiihlschlange. Die Verbindungen erfolgen fiber Siliconschliiuche (Abb. 3). Nach dem Zusam- mensetzen der Apparatur und Filllen wird das Vorrats- gefiiB auf Niveaugleichheit eingesteUt.

Detektionssysteme Die Detektion der aufgetrennten Substanzen kann

visuell, diskontinuierlich nach Auffangen im Fraktions- sammler bzw. kontinuierlich tiber eine DurchfluBktivette erfolgen.

Hauptteile einer eigem entwickelten bis - 50 ° ktihlbaren DurchfluBkUvette sind die MeBzelle mit den Zu- und Ablaufstutzen for die zu messende Probe, der Messingkiildblock mit den beiden Zuftihrungen for die

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= ~ Abtauf der KLihtf~.sigkeit i l~ Siticonschlnuch ( 2 ram}

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ZutQuf tier Ki~tft~ssigkeit

Grundplatte

Abb. 3. VorratsgefaB mit KUhlvorrichtung.

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Zutoufsfutzen f o r die Probe

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aus Edelsfahl

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Abb. 4. Querschnitt durch die kiihlbare DurchfluBkiivette senkrecht zum Lichtstrahl.

Kiihlfliissigkeit aus dem Kryomaten sowie die Teflonum- mantelung (Abb. 4).

Die MeBzelle sitzt im unteren Teil eines gut kiihlbaren Messingblocks. Dieser ist am oberen Ende ausgedreht und mit Stutzen fdr den Kiihlkreislauf versehen. Der gesamte

Kiihlblock mit Mei3zelle ist in ein zylindrisches Teflon- gefdB eingepal3t, dessen Mafle so gewiihlt sind, dab die kiihlbare Durchflu~kiivette gegen die normale kiiufliche Kiivette des Spektralphotometers PM 2 D ausgewechselt werden kann.

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zum Empfdnger m . . . . . . . . . .

AnschluO zur Pmbenentnahmevorrichtung

Edeistolgrohr

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Ki/vet fenroum • monochrom atischer LicMsfrahl

Suprasiifenster

Messmg~rschroubung

Edelsluhl~hr

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Abb. 5. Halbseitiger Schnitt durch die kfihlbare Meflzelle parallel zum Lichtstrahl.

Stiulenelektrophorese in niChtwiissrigen L~sungsmitteln 645

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Abb. 6. Trennung von K2K2, K2K3, K2K4 und K2Ke in N,N-Dimethylformamid bei -50°C.

Mel3zelle. Sic besteht aus einem Edelstahirohr mit innen eingedrehtem Gewinde (Abb. 5) und ist durch einen 1 cm langen Siliconschlauch mit dem Ablaufstutzen der Pro- benentnahmevorricbtung verbunden.

Durchmesser und L/inge der MeBzelle betragen jeweils 15 ram. In der mittleren massiven Edelstahlscheib¢ befinden sich eine zentrische Bohrung von 2 mm Durch- messer und vertikal dazu die Zu- und Ablaufbohrungen, Der eigentliche Kfivettenraum (Zylinder yon 2 mm Durch- messer und 2 mm HiShe) wird durch das beidseitige Auf- iegen der beiden inneren "Suprasir'-Fenster erhalten. Da- zwischen befinden sich ringfdrmige Teflondichtungen. Zwei weitere "Suprasil'-Fenster bilden die iiulkre Begrenzung. Die gesamte Anordnung wird durch die Messingverschrau- bung und die "Viton"-Ringe zusammengepreBt. Die Strah- lungsleistung bleibt aufgrund der doppelten "Suprasil"- Fenster bis -20 ° Kryomatentemperatur ungeschwiicht. Die Verringerung der Durchliissigkeit durch Kondensatbil- dung und Vereisung betriigt bei -50 ° etwa 10%.

K~hluno. VorratsgeffiB, Trenns~iule, ZwischenstBck und DurcbfluBkiivette kfihlt man parallel fiber einen Kryo- maten. Die Kiihlschliiuche sind durch Moosgummi weitge- hend w~irmeisoliert. Die Kfihlung muB eine Stunde vor Beginn der Trennung eingeschaltet werden.

TRENNBEISPIELE

Die Anwendungsbreite der neuen Apparatur wird an drei Trennproblemen aufgezeigt. Diese stellen aus- gew~ihlte Beispiele fiir die Notwendigkeit des Ein- satzes nichtw~issriger L~sungsmittel dar. Folgende Trennungen werden durchgeRihrt:

(a) Kaliumpolysulfide als Beispiel f'tir hydrolyse- empfindliche Salze;

~b) Thiocyanato(phenylendiamin)chrom(III)-Kom- plexe als Beispiel fiir wasserschwerl6sliche Salze;

(c) Aromatische Sulfonate als" Beispiel for mit Kronenverbindungen komplexierte Salze.

Kaliumpolysulfide Die Trennung eines Gemisches aus K2S2, K2S3,

K2S,, und KzS~ in N,N-Dimethylformamid bei - 50 ° ist in Abb. 6 wiedergegeben. In Tab. 1 sind die ents- prechenden Trennbedingungen zusammengestellt.

Eine Trennung des Gemisches ist bei 0 ° nicht m~glich. Bei dieser Temperatur stellen sich Gleich-

Tabeile 1. Trennbedingungen for die Trennung der Kaliumpolysuifide

Probegemisch:

Probevolumen: Spannung: Feldstiirke Stromsfiirke: Trenntemperatur: Trennzeit: Grundelektrolytsystem: Triiger: Auswertung:

Kaliumpolysulfidgemiseh jeweils 10-2M an KaSz, K2S3, KzS,, K2S~ (in N,N-Dimethyiformamid)

1000 V 100 V/cm 8 mA -50°C 2h 0,1M LiCI in N,N-Dimethylformamid Sephadex LH-20 Extinktionsmessung in der DurchfluBkfivette bei 400 nm

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Tabelle 2. Trennbedingungen Ffir die Trennung der Thiocyanato(phenylendiamin)chrom(llI)-Komplexe

Probegemisch:

Probevolumen: Spannung: Feidst~irke: Trenntempcratur: Trennzeit:

Grundelektrolytsystem : Tr~iger: Auswertung:

0,125M Komplexgemisch bezogen auf Cr in Acetonitril 50/zl I000 V I00 V/cm 0oc I h bei anodischen Komplexen 3 h bei kathodischen Komplexen 0,1M KSCN in Acetonitril A1203 Extinktionsmessung in der DurchfluBkiivette bei 540 nm

gewichte zwischen den einzelnen Polysulfidanionen und einem Si-Radikalionein.'*

Thiocyanato(phenylendiamin)chrom(lll)-Komplexe

Ein Gemisch aus Thiocyanato(phenylendiamin)- chrom(III)-Komplexen, hergestellt dutch Umsetzung yon Ks[Cr(SCN)6] mit o-Phenylendiamin in Acetoni- tril wird in Acetonitril in die vier m6glichen Einzel- kompon©nten getrennt (Trennbedingungen in Tab. 2).

Ist die untere Elektrode als Anode geschaltet,

erfolgt die Auftrennung in eine violette und eine rosa Zone, die nach ihren Wanderungsgeschwindigkeiten dem [Cr(SCN)~] 3- und dem [Cr(SCN)4(phen)]- zugeordnet werden (Abb. 7 links). Im anderen Fall wandern zwei auf der S~iule visuell nicht mehr er- kennbare Zonen, die nach ihren Wanderungsges- chwindigkeiten dem [Cr(phen)3]3 + und dem [Cr(SCN)2(phen)2] + zugeordnet werden, zur Kathode (Abb. 7 rechts).

Auf diese art gelingt die Reindarstellung der einzel- nen Komplexe.

[Cr|SCN} 6 ]3-

phenl]- [Cr~SCN)2lphen}2 ]" [Cr I ~

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Abb. 7. Trennung yon Thiocyanato(phenylendiamin)chrom(Ill)-Komplexen in Acetonitril. Links: untere Elektrode als Anode. Rechts: untere Elektrode als Kathode.

Tabelle 3. Trennbedingungen for die Trennungen der aromatischen Sulfonate

Probegemisch:

Probcvolumen: Spannung: Feldsfiirke: Stromstiirke: Trenntemperatur: Trennzeit: Grundeicktrolytsystem: T~ger: Auswertung:

Gemisch 0,1M 2-Naphthoi-6,S-disulfonat 0,1M 2-Naphthylamin=6,8.disuifonat bzw. 0,1M an DB-18-C-6 in Ameisens~lure 50/zl 750 V 75 V/cm 40 mA 0°C 4 bzw. 2 h 0,2M LiCI bzw. zu~tzlich 0,1M an DB-18-C-6 in Ameisensiiure Ccllulosepulver Extinktionsmessung in dcr DurchfluBkiivette bei 335 nm

S/iulen¢lektrophorcse in nichtw~issrigcn LSsungsmitteln 647

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Aromatische Sulfonate

Die Trennung chemisch sehr ~ihnlicher aroma- tischer Sulfonate stellt allgemein ein analytisches Problem dar. Die elektrophoretische Trennung in wiissrigen Systemen wird durch die starke Hydra- tation der Ionen erschwert. Der Einsatz nichtw~iss- riger L~sungsmittel bewirkt eine Verkleinerung der Solvathiille. Dadurch wird ein gr~Berer relativer Un- terschied in Radius und Masse der Ionen und damit der Ionenbeweglichkeiten erzielt. Jedoch bewirkt das organische L~sungsmittel Herabsetzung der L6slich- keit und Dissoziation der Salze. Diese Nachteile werden durch den Einsatz von Kronenverbindungen aufgehoben.

Mit Dibenzo-18-krone-6 wird die Trennung aroma- tischer Sulfonate, wie 2-Naphthol-6,8-disulfonat und

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2-Naphthylamin-6,8-disulfonat, in Ameisens~iure erheblich verbcssert (Abb. 8). In Tab. 3 sind die Trennbedingungen zusammengestellt. Durch den Ein- satz yon Dibenzo-18-krone-6 erh6ht sich der Rs-Wert s yon 1,4 auf 2,6. Dies entspricht einer Ver- besserung der Trenngiite yon 85,7%.

LITERATUR

1. E. Blasius, H. Augustin und G. Klemm, J. Chromatoq.. 1975, 108, 53.

2. E. Biasius und G. Klemm, ibid., 1977, 135, 323. 3. H. G. Kunkel, in D. Glick, Methods of Biochemical

Analysis, Vol, I, Interscience, New York, 1954. 4. F. Scel und H. J. Grittier, Z. Naturforsch., 1975, 30b.

88. 5. F. Geiss, Die Parameter der Di~nnschichtchromatogra-

phie, Vieweg, Braunschweig, 1972.

Summary--An apparatus for electrophoresis in non-aqueous solvents is described, which makes it possible to work in field strengths up to 150 V/cm and at temperatures down to -50 °. A flow-through cell with two double "Suprasil" windows facilitates the photometric evaluation of the separations, and keeps the sample cool until it reaches the detection system. Potassium polysulphides have been separated as an example of salts sensitive to hydrolysis, thiocyanato(phenylenediamine)chromium(IlI) complexes as an example of salts only slightly soluble in water, and aromatil: sulphonates as an example of salts complex~ by crown compounds.