Aus dem Institut für Bakteriologie und Mykologie der ...¤t_VMF/Institut_Bakteriologie... · DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH EA Eianzahl EG Eigewicht

Aus dem

Institut für Bakteriologie und Mykologie

der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig

Differenzierung aviärer Brachyspiren mit PCR-basierten Methoden und MALDI-TOF-MS

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Grades eines

Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)

durch die Veterinärmedizinische Fakultät

der Universität Leipzig

eingereicht von

Monika Harms

aus Strücklingen

Leipzig, 2018

Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig

Dekan: Prof. Dr. Walter Brehm

Betreuer: Prof. Dr. Christoph G. Baums

Gutachter: Prof. Dr. Vincent Perreten,

Vetsuisse Fakultät

Institut für Veterinär- Bakteriologie

Bern

Prof. Dr. Christoph G. Baums,

Veterinärmedizinische Fakultät Leipzig


Leipzig

Tag der Verteidigung: 27.02.2018

Seite | I

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................................................... I

Tabellenverzeichnis .......................................................................................................................................... III

Abbildungsverzeichnis ...................................................................................................................................... III

Verzeichnis der Abkürzungen ........................................................................................................................... IV

1. Einleitung ....................................................................................................................................................... 1

2. Literaturübersicht .......................................................................................................................................... 3

2.1 Einführung ............................................................................................................................................... 3

2.2 Bedeutung der Brachyspiren bei verschiedenen Spezies ........................................................................ 3

2.3 Brachyspiren beim Geflügel, die AIS ........................................................................................................ 6

2.4 Differenzierung der Brachyspirenarten ................................................................................................. 14

3. Material und Methoden .............................................................................................................................. 25

3.1 Gewinnung von Proben ......................................................................................................................... 25

3.2 Kulturelle Untersuchung auf aviäre Brachyspiren ................................................................................. 29

3.3 Kryokonservierung der Brachyspirenisolate.......................................................................................... 30

3.4 Verwendete Referenzstämme ............................................................................................................... 31

3.5 nox- Sequenzierung ............................................................................................................................... 31

3.6 MALDI-TOF-MS ...................................................................................................................................... 33

3.7 Neue Multiplex-PCRs für aviäre Brachyspiren ....................................................................................... 34

3.8 Statistische Analyse ............................................................................................................................... 35

4. Ergebnisse .................................................................................................................................................... 36

4.1 Optimierung der kulturellen Untersuchung von Kotproben von Legehennen auf Brachyspiren ......... 36

4.2 Befunde aus der pathohistologischen Untersuchung ........................................................................... 37

4.3 Differenzierung der aviären Brachyspirenisolate durch die nox-Sequenzierung .................................. 38

4.4 Differenzierung der aviären Brachyspirenisolate durch MALDI-TOF-MS .............................................. 40

4.5 Neue Multiplex-PCRs für die Differenzierung aviärer Brachyspiren ..................................................... 46

4.6 Subkultivierung und nachfolgende Differenzierung von Einzelkolonien bei Brachyspirenisolaten mit

widersprüchlichen MALDI-TOF-MS und MP-PCR Ergebnissen .................................................................... 47

4.7 Prävalenz der Brachyspiren in Abhängigkeit unterschiedlicher Faktoren ............................................. 48

5. Diskussion .................................................................................................................................................... 51

6. Zusammenfassung ....................................................................................................................................... 63

7. Summary ...................................................................................................................................................... 65

8. Literaturverzeichnis ..................................................................................................................................... 67

9. Anhang ......................................................................................................................................................... 84

9.1 Datenerfassungsbogen .......................................................................................................................... 84

Seite | II

9.2 Auflistung der Ergebnisse durch die durchgeführte BLAST-Analyse ..................................................... 86

9.3 Auszug aus einem Befundbogen des MALDI-TOF-MS zur Beurteilung der erhaltenen Ergebnisse ...... 87

9.5 Statistische Übersicht, Normalverteilung der Logscores, alpha* (α) untere Grenze (uG) und α obere

Grenze (oG) bei den auf Brachyspiren positiven Betrieben ........................................................................ 90

9.6 Bilder der Haltung von Legehennen mit einem mobilen Hühnerstall in ökologischer Haltung ............ 91

9.7 Danksagung ........................................................................................................................................... 92

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Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Vorkommen der unterschiedlichen Brachyspirenarten bei Mensch und Tier (Stand, Oktober 2016)

........................................................................................................................................................................... 4

Tabelle 2: Ergebnisse experimenteller Infektionen mit Brachyspiren beim Geflügel ....................................... 9

Tabelle 3: Ergebnisse experimenteller Infektionen mit Brachyspiren beim Schwein und sonstigen Tierarten

(exemplarisch) ................................................................................................................................................. 12

Tabelle 4: Methoden zur Differenzierung von Brachyspiren in wissenschaftlichen Untersuchungen ........... 17

Tabelle 5: Datenerfassung zu Betriebsparametern ......................................................................................... 26

Tabelle 6: In dieser Arbeit verwendete Referenzstämme der Gattung Brachyspira ...................................... 31

Tabelle 7: Prävalenz von Brachyspira spp. in klinisch unauffälligen Herden in Bezug auf die verschiedenen

Haltungsformen ............................................................................................................................................... 37

Tabelle 8: Identifikation der Isolate mit der nox-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS* .................................. 39

Tabelle 9: Vergleich der Logscores (Mittelwerte mit Standardabweichungen) zur Differenzierung der

Brachyspira spp. unter Verwendung der Original Bruker Datenbank sowie der in dieser Studie erweiterten

Datenbank zur MALDI-TOF-MS Differenzierung ............................................................................................. 43

Tabelle 10: Vergleich der Differenzierung der Feldisolate mit nox-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS* mit

der erweiterten Datenbank ............................................................................................................................. 44

Tabelle 11: Prävalenz von Brachyspira sp. bei klinisch unauffälligen Betrieben in Abhängigkeit vom Alter (in

Lebenswochen LW) der Tiere* ........................................................................................................................ 49

Tabelle 12: Prävalenz von Brachyspira spp. in klinisch unauffälligen Herden in Abhängigkeit zur

Herdengröße.................................................................................................................................................... 50

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Grabentechnik ........................................................................... 30 Abbildung 2: Originaldarstellung der Grabentechnik ..................................................................................... 30

Abbildung 3: Ausschnitt einer Intensitätskurve: ............................................................................................. 32

Abbildung 4: Auszug aus der Messung einer Spülprobe des unbeimpften Nährmediums als Kontrolle ........ 41

Abbildung 5: Beispielhafte Darstellung der MALDI-TOF-MS-Spektren der angegebenen 5 verschiedenen

Brachyspirenspezies ........................................................................................................................................ 42

Abbildung 6: MALDI-TOF-MS-Dendrogramm basierend auf den Main Spectra Profiles von 64 Brachyspiren

Stämmen ......................................................................................................................................................... 45

Abbildung 7: Ergebnisse der MP-PCR zum Nachweis des nox-, des abgB- und des tnaA-Gens für die

aufgeführten Referenzstämme ....................................................................................................................... 47

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Verzeichnis der Abkürzungen

A Alleinfutter AB Allgemeinbefinden abgB Hippurat-Hydrolase Gen ABK Antibiotika acp Acid phosphatase Gen adh Alkoholdehydrogenase Gen AHVLA Animal Health and Veterinary Laboratories Agency AIS Aviäre Intestinale Spirochätose AIS-TSA Selektivagar zur kulturellen Brachyspirenanzucht alp Alkaline Phosphatase Gen API Analytikal Profile Index APK Antiparasitika

APV Anatomisch- pathologische Veränderungen b Blutbeimengung B Bodenhaltung B. Brachyspira B. hyo Brachyspira hyodysenteriae B. pilo Brachyspira pilosicoli BeF Bekämpfung durch externe Firma in regelmäßigen Intervallen BHI Brain Heart Infusion bhlp16 Gen zu Protein Bhlp16 bhlp17.6 Gen zu Protein Bhlp17.6 bhlp29.7 Gen zu Protein Bhlp29.7 bhmp39f Gen zu Protein Bhmp39f bhmp39h Gen zu Protein Bhmp39h BiK Bekämpfung wird intern mit Köderboxen durchgeführt Bioch. Biochemisch bitC Eisen-Transport Gen blaOXA Carbapeneme-Hydrolyzing β-Lactamase Gen BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Basenpaare C Cellulosegranulat CIS Canine Intestinale Spirochätose clpX Caseinolytic Protease X Gen CO2 Kohlenstoffdioxid cpn60 Chaperon 60 Gen D Durchfall Di Dinkelspelzen DNA Deoxyribonucleic acid DNS Desoxyribonukleinsäure DS Domaine Silver DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH EA Eianzahl EG Eigewicht ELISA Enzyme-linked immunosorbent Assay est Expressed Sequence Tags Gen

EV Eischalenverschmutzung

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exkl. Exklusive F Freilandhaltung FAA Fastidious anaerobe agar ftnA Iron-storage protein ferritin Gen g Erdbeschleunigung GA landwirtschaftlicher Betrieb mit mehreren Tierarten Gä Gänse GDD De Gezondheidsdienst voor Dieren gdh Glutamate dehydrogenase Gen GF Geflügelhaltungsbetrieb mit verschiedenen Arten Gf Geflügel ggf gegebenenfalls ggr geringgradig GIT Gastrointestinaltrakt glpK Glycerol kinase Gen glt Glutamate transporter Gen GS landwirtschaftlicher Betrieb mit Geflügel und Schweinen H2O Wasser H Hobbyhaltung Hb Hobelspäne HCCA α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure Hd Hund HE Hämatoxylin-Eosin Färbung HIS Humane Intestinale Spirochätose HIV Humanes Immundefizienz-Virus hlyA Haemolysin A Gen Hu Huhn IFAT Indirekter Immunfluoreszenz-Antikörpertest IS Intestinale Spirochätose K kombinierte Fütterung KGW Körpergewicht L reiner Legehennenbetrieb l Liter LB Lohmann Brown (Hühnerrasse) Lh Legehennen LSL Lohmann Selected Leghorn (Hühnerrasse) LW Lebenswochen M Maispellets Ma Maus mA Milliampere Makros. Makroskopisch MALDI Matrix-Assistierte Laser-Desorption-Ionisierung mcpB Methyl-accepting chemotaxis protein Gen B Gen mcpC Methyl-accepting chemotaxis protein C Gen MgCl2 Magnesiumchlorid mglB Galactose-binding protein Gen mH Masthähnchen Min. Minuten ml Milliliter

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MLEE Multilokus Enzym Elektrophorese MLST Multilokussequenztypisierung mM Millimol MP-PCR Multiplex-PCR MS Microflex System Ms Mensch MSP Main Spectrum Profile NCBI National Center for Biotechnology Information netB Necrotic enteritis B-like toxin Gen ng Nanogramm nox NADH-Oxidase Gen nox(int) NADH-Oxidase Gen von B. intermedia

O ökologische Haltung oG obere Grenze (Statistische Angabe) oxd Phenylacetaldoxime dehydratase Gen p-Wert Signifikanzwert p.i. post infectionem P Pferde PBS Phosphat gepufferter Salzlösung PCR Polymerasekettenreaktion PFGE Pulsfeldgelelektrophorese pgm Phosphoglucomutase Gen PIS Porzine Intestinale Spirochätose ppm parts per million

R Rind RAPD Random Amplified Polymorphic DNA Analyse RFLP Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus RI Rebhuhnartige Italiener (Hühnerrasse) RO Ross (Hühnerrasse) rRNA ribosomale Ribonukleinsäure S Schwein s Schleimbeimengung Sa Sand Sc Softcell SD Standardabweichung Sek. Sekunden Seq. Sequenzierung SN Super Nick (Hühnerrasse) SP Schadnagerproblematik sp (spp) Spezies (Plural: Spezies) ssp Subspezies St Stroh Std Stunde T2-Toxin Mykotoxin (Gift der Schimmelpilze) thi Thiamine biosynthesis protein Gen tlyA 16S/23S rRNA (cytidine-2'-O)-methyltransferase Gen tnaA Tryptophanase Gen TOF time of flight (Flugzeitanalyse) treP Alpha,alpha-trehalose phosphorylase Gen

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TSA Tryptikase-Soja-Agar U Unit uG untere Grenze (Statistische Angabe) USA United States of Amerika V Volt VSH1 bacteriophage-like agent Region W Wassergeflügel We Weichholzspäne Wo Wochen yqi fimbrial adhesin Gen ZnB Zinkbacitracin °C Grad Celsius % Prozent Ø Durchschnitt, ohne Abweichung µg Mikrogramm µl Mikroliter µM Mikromol α alpha β beta

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1. Einleitung

Die Gattung Brachyspira (B.) aus der Familie der Brachyspiraceae hat in der Veterinärmedizin eine

wichtige Bedeutung. Es handelt sich um gramnegative, anaerobe, spiralig gewundene Bakterien.

Die Brachyspiren besiedeln im Wirtstier hauptsächlich den Gastrointestinaltrakt, bevorzugt das

Caecum beziehungsweise die Caeca und das Kolon. Die wirtschaftlichen Verluste bei einem

Krankheitsausbruch sind erheblich und spielen in der Schweine- und Nutzgeflügelhaltung eine

große Rolle.

Zu den pathogenen Arten beim Geflügel zählen B. pilosicoli, B. intermedia und B. alvinipulli.

Brachyspireninfektionen des Geflügels werden als Aviäre Intestinale Spirochätose (AIS) bezeichnet

(STEPHENS & HAMPSON 2001). Beschriebene Symptome sind unter anderem

mukohämorrhagische Durchfälle, verringerte Wachstumsraten, verzögerter Legebeginn,

verminderte Eizahlen und kotverschmutzte Eischalen (DAVELAAR et al. 1986; GRIFFITHS et al.

1987; SMIT et al. 1998). Als typische pathohistologische Veränderungen treten

lymphoplasmatische Typhlitis, submucosale lymphozytische Follikelbildung, Hyperplasie der

Becherzellen und Zerstörung der Mikrovilli auf (SWAYNE et al. 1995; MUNIAPPA et al. 1996;

PRAPASARAKUL et al. 2011). Die AIS ist weltweit verbreitet und die wirtschaftlichen Schäden sind

zum Teil erheblich. Legeeinbußen von bis zu 12 % sind dokumentiert (DAVELAAR et al. 1986;

GRIFFITHS et al. 1987; SWAYNE et al. 1992). In England soll sich der gesamte durch die AIS

hervorgerufene wirtschaftliche Schaden auf jährlich 18 Millionen Pfund belaufen (MAPPLEY et al.

2014).

AIS als klinisch manifeste Erkrankung tritt vor allem beim domestizierten Geflügel auf.

Wildgeflügel zeigt meist keine klinischen Symptome (JANSSEN et al. 2004). Die Brachyspiren

siedeln sich als Kommensalen im Darmtrakt an und die Wildtiere dienen als natürliches Reservoir

(JANSSON et al. 2001; OXBERRY et al. 1998). Im Gegensatz dazu kann es beim Nutzgeflügel zu

einer breiten Spanne an Krankheitszeichen kommen. Es sind sehr unterschiedliche Verläufe

möglich. Subklinische (MC LAREN et al. 1996) und milde Verläufe mit Diarrhoe und

Leistungseinbußen sind häufig (DAVELAAR et al. 1986; GRIFFITHS et al. 1987; TROTT et al. 1995).

Allerdings wurden auch schon tödlich verlaufende Infektionen beschrieben (SAGARTZ et al. 1992).

Entscheidend für die Pathogenese sind einerseits die Eigenschaften des Erregers und andererseits

vorherrschende prädisponierende Faktoren, die die Kolonisation und Proliferation beeinflussen

(infektiöse Faktorenerkrankung).

Aktuell gelten die bei Vögeln isolierten Arten B. innocens, B. murdochii und „B. pulli“

weitestgehend als apathogen, wobei ein pathogenes Potential bei „B. pulli“ nicht ausgeschlossen

werden kann und für B. innocens eine Reduktion der Legeleistung in Freilandhaltung beschrieben

wurde (BURCH et al. 2009). Auch B. hyodysenteriae, der Erreger der Dysenterie des Schweines

(WHITING et al. 1921; TAYLOR & ALEXANDER 1971; POHLENZ. 1991), wurde schon beim Geflügel

nachgewiesen. Aber außer beim Nandu und bei Enten, bei denen nekrotisierende Typhlitiden

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festgestellt wurden, spielt B. hyodysenteriae als Krankheitserreger beim Geflügel nach derzeitigem

Wissenstand keine Rolle (GLAVITS et al. 2011; SAGARTZ et al. 1992).

B. pilosicoli und B. intermedia kommen nicht nur bei unterschiedlichen Vogelarten, sondern auch

bei zahlreichen Säugetieren vor. Als Erreger der Spirochätendiarrhoe (TAYLOR et al. 1980;

DUHAMEL. 2001) spielt B. pilosicoli beim Schwein eine größere veterinärmedizinische Rolle.

Weiterhin sind Infektionen beim Hund beschrieben (PRAPASARAKUL et al. 2011). Nagetiere

können wichtige Trägertiere pathogener Brachyspiren in Schweine- und Geflügelbeständen sein

(BANO et al. 2008).

Im Laufe der Zeit sind viele Differenzierungsmethoden für Brachyspiren entwickelt worden. Es gibt

einerseits phänotypische Methoden, wie zum Beispiel die Beurteilung des Hämolyseverhaltens

oder die biochemische Differenzierung (FELLSTRÖM et al. 1997; FELTRUP et al. 1999; STANTON et

al. 1997). Eine schnelle, günstige und exakte Alternative bietet die Massenspektrometrie, um

Brachyspirenarten zu differenzieren. (CALDERARO et al. 2013; WARNEKE et al. 2014; PROHASKA et

al. 2014). Heute spielen zudem genotypische Methoden eine wichtige Rolle. Dazu gehören einige

als speziesspezifisch beschriebene Polymerasekettenreaktionsverfahren (PCRs), wie die für B.

hyodysenteriae spezifische PCR nach FELLSTRÖM et al. (2001), welche das 16S/23S rRNA (cytidine-

2‘-0)-methyltransferase- (tlyA) Gen dieser Art detektiert. Weitere PCR gestützte Verfahren, wie

beispielhaft der Restriktionsfragment- Längenpolymorphismus (RFLP) nach ROHDE und

HABIGHORST-BLOME (2012), ermöglichen eine Differenzierung mehrerer Brachyspirenarten. Die

Mehrheit dieser Techniken ist allerdings für die Differenzierung der beim Schwein vorkommenden

Brachyspirenarten entwickelt worden. Für Isolate vom Geflügel wurden viele Methoden nicht

evaluiert.

Ziele der Arbeit

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Optimierung der kulturellen Differenzierung aviärer

Brachyspiren. Es erfolgte eine Evaluierung unterschiedlicher Methoden zur Differenzierung der

aviären Brachyspirenarten. Des Weiteren sollten erste Daten zum Vorkommen der verschiedenen

Brachyspirenarten bei Legehennen in unterschiedlichen Haltungssystemen in Deutschland

gesammelt werden.

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2. Literaturübersicht

2.1 Einführung

Spiralförmige Bakterien sind bereits seit dem 17. Jahrhundert bekannt (DOBELL. 1932) und nach

EHRENBERG (1835) dem Genus Spirochaeta zugeordnet. Neben der Familie der Brachyspiraceae

(PASTER et al. 2010) gehören noch die Brevinemataceae (PASTER et al. 2010), die Leptospiraceae

(HOVIND-HOUGEN et al. 1979) und die Spirochaetaceae (SWELLENGREBEL. 1907) diesem Genus

an. Charakteristisch für alle Mitglieder dieser Gruppe ist der langgestreckte, spiralförmig-

gewundene Körper. Die Endoflagellen sind im Periplasma lokalisiert und dienen der aktiven,

schraubenzieherartigen Fortbewegung. Brachyspiren betreiben einen strikt anaeroben bis

mikroaerophilen Stoffwechsel.

Zu den Spirochaeta gehören wichtige pathogene Mikroorganismen wie zum Beispiel der Erreger

der Syphilis, Treponema pallidum Subspezies (ssp.) pallidum oder der Lyme-Borreliose-Erreger

Borrelia burgdorferi. Weiterhin gehören viele apathogene Kommensalen zu den Spirochaeta.

Die Familie der Brachyspiraceae umfasst lediglich die Gattung Brachyspira (OCHIAI et al. 1997).

Auf Grund der 16S rRNA-Sequenzen sind aktuell sieben Brachyspirenarten offiziell anerkannt: B.

aalborgi (HOVIND-HOUGEN et al. 1982), B. alvinipulli (SWAYNE et al. 1995), B. hyodysenteriae

(TAYLOR & ALEXANDER 1971), B. innocens (STANTON. 1992), B. intermedia (STANTON et al. 1997),

B. murdochii (STANTON et al. 1997), B. pilosicoli (TAYLOR et al. 1980). Vorgeschlagene Arten sind

„B. canis“ (DUHAMEL et al. 1998), „B. suanatina“ (RÅSBÄCK et al. 2007) und „B. pulli“. Alle

Brachyspiren sind ca. 0,25-0,4 μm x 6-9 μm groß (TAYLOR & ALEXANDER 1971) und wachsen unter

anaeroben bis teilweise aerotoleranten Bedingungen aufgrund ihrer NADH-Oxidase (HARRIS et al.

1972; STANTON & LEBO 1988).

Brachyspiren siedeln sich im Gastrointestinaltrakt (GIT) ihres Wirtes an. Pathogene Arten können

ebenda die sogenannten Intestinalen Spirochätosen (IS) verursachen. Einige Arten, insbesondere

B. aalborgi und „B. canis“, sind sehr wirtsspezifisch. B. pilosicoli zeichnet sich durch ein breites

Wirtsspektrum aus. Tabelle 1 (Vorkommen der unterschiedlichen Brachyspirenarten bei Mensch

und Tier (Stand, Oktober 2016)) zeigt einen Überblick zum Vorkommen der verschiedenen

Brachyspirenarten bei den unterschiedlichen Spezies auf Grundlage der Anzahl an Publikationen in

der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI-PubMed)

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed; 04. Oktober 2016).

2.2 Bedeutung der Brachyspiren bei verschiedenen Spezies

B. aalborgi wurde bis heute nur beim Menschen nachgewiesen. Diese Art konnte in Dänemark,

genauer in Aalborg (HOVIND-HOUGEN et al. 1982), und in Schweden (KRAAZ et al. 2000) aus

Biopsien des Darmes und Rektums kultiviert werden. Sowohl B. aalborgi als auch B. pilosicoli

können die Humane Intestinale Spirochätose (HIS) hervorrufen (TRIVETT-MOORE et al. 1998;

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MIKOSZA et al. 1999). Dabei lagern sich die Bakterien im Dickdarm an die Epithelzellen an und

bilden einen sogenannten „false brush border“ (HARLAND et al. 1967). Die Patienten leiden unter

gastrointestinalen Beschwerden wie chronischem Durchfall und Blutungen im Rektalbereich

(DOUGLAS et al. 1981). Die Prävalenz der HIS ist in Entwicklungsländern, sowie bei

immungeschwächten Personen, insbesondere bei mit dem Humanen Immundefizienz-Virus (HIV)

infizierten Menschen, stark erhöht (HAMPSON et al. 2006). In einer Studie zu HIS auf Bali wurde

beispielsweise gezeigt, dass Menschen, die Brunnenwasser statt Leitungswasser tranken,

vermehrt mit B. pilosicoli besiedelt waren und dass die Nachweisrate bei an Durchfall erkrankten

Menschen höher war, als bei Gesunden (MARGAWANI et al. 2004).

Tabelle 1: Vorkommen der unterschiedlichen Brachyspirenarten bei Mensch und Tier (Stand,

Oktober 2016)

Gattung/ Art Nachweis bei

Mensch Schwein Hund Geflügel Wildvögel B. aalborgi ++

B. alvinipulli (+) ++ (+)

„B. canis“ ++

B. hampsonii +++ +

B. hyodysenteriae +++ (+) ++ +

B. innocens +++ ++

B. intermedia +++ + +++

B. murdochii ++ ++ (+)

B. pilosicoli +++ +++ ++ +++ (+)

„B. pulli“ (+) ++

„B. suanatina“ ++ (+) +

+++ >10 bei PubMed gelistete Veröffentlichungen mit Nachweis ++ 4 – 10 bei PubMed gelistete Veröffentlichungen mit Nachweis + 2 – 3 bei PubMed gelistete Veröffentlichungen mit Nachweis (+) 1 bei PubMed gelistete Veröffentlichungen mit Nachweis

„B. canis“ wird als wirtsspezifisch für den Hund beschrieben. Diese Art konnte sowohl bei

gesunden als auch bei an Durchfall erkrankten Hunden nachgewiesen werden (DUHAMEL et al.

1995; FELLSTRÖM et al. 2001; MANABE et al. 2004; TROTT et al. 1997). Es ist deshalb noch fraglich,

ob ein pathogenes Potential besteht (OXBERRY & HAMPSON 2003). Bei den Untersuchungen in

Skandinavien, den USA, Australien, Deutschland und Spanien wurde neben „B. canis“ vor allem B.

pilosicoli von Hunden isoliert. Diese Art wurde vorwiegend für die Canine Intestinale Spirochätose

(CIS) verantwortlich gemacht.

Das Schwein dient mehreren Arten als Wirt. Neben B. intermedia, B. innocens und B. murdochii,

die als apathogene Kommensalen gelten (HAMPSON. 2000), wurden B. hampsonii, „B. suanatina“,

B. hyodysenteriae und B. pilosicoli nachgewiesen. B. hampsonii und „B. suanatina“ wurden erst vor

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wenigen Jahren als neue Arten beschrieben, dennoch ist jetzt schon klar, dass sie als

Krankheitserreger beim Schwein eine wichtige Rolle spielen. Im Jahr 2007 wurde erstmals „B.

suanatina“ (RÅSBÄCK et al. 2007) in Schweden und Dänemark isoliert. Eine Infektion beim Schwein

ruft Durchfälle und Kolititiden, ähnlich wie bei der Schweinedysenterie, hervor (RÅSBÄCK et al.

2007). 2012 entdeckte man in den USA und Kanada die Art B. hampsonii (CHANDER et al. 2012;

HARDING et al. 2012), welche eine mukohaemorrhagische Diarrhoe und Kolitis auslöst

(BURROUGH et al. 2012; CHANDER et al 2012; RUBIN et al. 2013).

Schon seit Längerem sind beim Schwein B. pilosicoli und B. hyodysenteriae als wirtschaftlich

wichtige Krankheitserreger bekannt. Die Porzine Intestinale Spirochätose (PIS), auch

Spirochätendiarrhoe genannt, wird durch B. pilosicoli verursacht. Bei der PIS tritt grundsätzlich

eine milde Kolitis begleitet von Durchfällen auf, in seltenen Fällen konnte Fieber festgestellt

werden (TAYLOR et al. 1980; DUHAMEL. 2001). Der PIS wird aufgrund des eher milden Verlaufs

und der geringen Mortalität häufig wenig Aufmerksamkeit geschenkt. Nach überstandener

Erkrankung sind die Schweine aber latent infiziert. Die Folge sind eine schlechte Futterverwertung

und damit einhergehende geringere Wachstumsraten (TAYLOR. 1992; GIRARD et al. 1995; DÜNSER

et al. 1997; TROTT et al. 1996; TAYLOR & TROTT 1997; THOMPSON et al. 1998; VERSPOHL et al.

2001).

B. hyodysenteriae nimmt beim Schwein als Krankheitserreger eine herausragende Rolle unter den

Brachyspirenarten ein. Die Schweinedysenterie wurde erstmals 1921 in den USA beschrieben

(WHITING et al. 1921), allerdings wurde der Erreger ätiologisch erst rund 50 Jahre später mit der

Erkrankung in Verbindung gebracht (TAYLOR & ALEXANDER 1971). Die Schweinedysenterie ist

weltweit verbreitet, tritt vor allem bei heranwachsenden Mastschweinen auf und zeichnet sich

durch eine Morbidität bis 90 % sowie einer Mortalität bis zu 30 % aus (TER HUURNE et al. 1993).

Das Krankheitsbild äußert sich in mukofibrinösen, hämorrhagischen bis diphteroid-

nekrotisierenden Entzündungen der Caecum- und Kolonschleimhaut (POHLENZ. 1991). Klinisch ist

zementfarbener Durchfall, oft mit Blut- und Schleimbeimengungen, typisch. Die Flanken der

erkrankten Tiere sind durch Flüssigkeits- und Gewichtsverlust oft stark eingefallen. Die Analregion

ist kotverschmutzt und es kommt in Folge der überstandenen Erkrankung nicht selten zum

Kümmern (MEIER. 1983; EICH. 1985; GEILER. 1986). Todesfälle treten in Folge von Dehydratation,

Azidose oder Hyperkaliämie auf (SEEGER et al. 1984), doch auch perakute Verluste ohne vorherige

Krankheitsanzeichen können vorkommen (HARRIS & LYSONS 1992). Die Ausbreitung erfolgt nicht

selten explosionsartig (ALEXANDER & TAYLOR 1969), so dass der komplette Bestand in kürzester

Zeit betroffen ist.

Für den betroffenen Betrieb entstehen hohe wirtschaftliche Verluste; einerseits durch die

tatsächlichen Tierverluste, andererseits durch verminderte Gewichtszunahmen, längere

Mastdauer und hohe Behandlungskosten (PRIEKSAT. 2000).

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2.3 Brachyspiren beim Geflügel, die AIS

Bereits 1910 wurden Spirochäten im GIT von Moorschneehühnern (Lagopus lagopus) auf den

Britischen Inseln beobachtet und beschrieben (FANTHAM. 1910). In den darauf folgenden

Jahrzehnten wurden die Beobachtungen vertieft und Spirochäten bei Hennen (Gallus gallus

domesticus) isoliert, deren Caecuminhalt in Konsistenz und Geruch verändert war (HARRIS. 1930).

Erst 1955 wurden Spirochäten mit anatomisch-pathologischen Veränderungen, wie käsigen

Knötchen in der Caecumwand, bei verschiedenen Geflügelspezies in Verbindung gebracht

(MATHEY & ZANDER 1955). In den Niederlanden konnte 1986 eine Assoziation der

Durchfallerkrankung mit den Spirochäten beim Nutzgeflügel aufgezeigt werden (DAVELAAR et al.

1986). Bestätigt wurde die AIS als Erkrankung dann in zahlreichen Ländern, insbesondere im

Vereinigten Königreich (GRIFFITHS et al. 1987) sowie weiteren Ländern Europas (BANO et al.

2008; BURCH et al. 2006), den USA (SWAYNE et al. 1992; TRAMPEL et al. 1994) und Australien

(MCLAREN et al. 1996; PHILLIPS et al. 2005). Prinzipiell können alle Arten von Vögeln Brachyspiren

tragen. Bisher wurden sie bei Wildvögeln wie dem Moorschneehuhn (Lagopus lagopus)

(FANTHAM. 1910), beim Nandu (Rhea americana) (SAGARTZ et al. 1992), bei Raben (Corvus)

(JANSSON et al. 2008), Schwänen (Cygnini) und Flamingos (Phoenicopteridae) (TROTT et al. 1996),

bei der Schneegans (Chen caerulescens) (RUBIN et al. 2013), bei Stockenten (Anas platyrhynchos)

(RÅSBÄCK et al. 2007), bei Straußenvögeln (Struthio camelus) (STOUTENBURG & SWAYNE 1992),

Fasanen (Phasianus colchicus) (WEBB et al. 1997), beim Weißgesicht-Scheidenschnabel (Chionis

albus) (JANSSON et al. 2009) und bei diversen Wasservögeln (OXBERRY et al. 1998) isoliert. Beim

Nutzgeflügel wurden Brachyspiren in Broilern (Gallus gallus domesticus) (DWARS et al. 1990),

Broilerelterntieren (Gallus gallus domesticus) (STEPHENS & HAMPSON 2002), Legehennen (Gallus

gallus domesticus) (DAVELAAR et al. 1986; GRIFFITHS et al. 1987), Gänsen (Anserinae) (NEMES et

al. 2006) und Puten (Meleagris gallopavo) (MATHEY & ZANDER 1955) nachgewiesen.

Der Erreger wird vom Wirt oral aufgenommen, insbesondere über kotkontaminierte Einstreu,

Futter, Wasser oder auch über den Kontakt mit belasteten Gegenständen und Aerosolen (BANO et

al. 2008). Brachyspiren können im Wasser bis zu 66 Tage bei 6 °C überleben (OXBERRY et al. 1998).

Geschützt durch Schleimsubstanzen passieren die Brachyspiren den Magen (HAMPSON et al.

1997). Nach der Magen- und Darmpassage siedeln sie sich im unteren GIT der Tiere an. Hier

vermehren sie sich und es kann bereits 5 Tage nach der Infektion zu ersten Symptomen kommen

(SWAYNE et al. 1995). Mit dem Kot wieder ausgeschieden, überleben sie einige Zeit außerhalb des

Tierkörpers und können so auf andere Tiere, auch Schadnager, übertragen werden (PHILLIPS et al.

2003). Unter natürlichen Bedingungen sind vor allem Tiere ab der 15. Lebenswoche betroffen

(BANO et al. 2008; PHILLIPS et al. 2005). In experimentellen Belastungsversuchen gelangen die

Infektionen verschiedener Altersklassen (STEPHENS & HAMPSON 2002; IVANICS et al. 2007;

JANSSEN et al. 2009; PRAPASARAKUL et al. 2011). Gehäuft tritt die AIS zu Legebeginn und während

der Mauser auf. Einige Studien konnten zeigen, dass die Kolonisation mit Brachyspiren von

verschiedenen Einflüssen, wie etwa vom Gehalt an Nicht-Stärke-Polysacchariden im Futter,

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abhängig ist (PHILLIPS et al. 2004). Die AIS wird demnach als infektiöse Faktorenerkrankung

eingestuft.

Aktuell sind 9 verschiedene Brachyspirenarten beim Geflügel beschrieben worden. Als nicht

pathogen für das Geflügel gilt B. hampsonii, welcher beim Wassergeflügel, vor allem Zugvögeln,

nachgewiesen wurde. Wassergeflügel stellt somit ein natürliches Reservoir für diesen Erreger dar

und ist eine wichtige Infektionsquelle für Schweine, die schwer an B. hampsonii Infektionen

erkranken können (MARTÍNEZ-LOBO et al. 2013). Weiterhin werden B. innocens und B. murdochii

zur physiologischen Mikrobiota gezählt, da in Infektionsversuchen keine klinischen Symptome

oder pathohistologische Veränderungen ausgelöst werden konnten (SWAYNE. 2003). BURCH et al.

(2009) berichten aber von einer Reduktion der Legeleistung in der Freilandhaltung durch B.

innocens. Weiterhin gilt „B. pulli“ nach dem derzeitigen Kenntnisstand als apathogener Vertreter.

B. hyodysenteriae wurde beim Nandu und bei Enten isoliert, bei denen nekrotisierende Typhlitis

festgestellt wurde. Das pathogene Potential von B. hyodysenteriae beim Vogel ist im Vergleich

zum Schwein aber wohl deutlich geringer (GLAVITS et al. 2011; SAGARTZ et al. 1992). „B.

suanatina“ wurde bei Stockenten nachgewiesen (RÅSBÄCK et al. 2007). In Infektionsversuchen

konnten keine klinischen Symptome beobachtet werden. Pathohistologisch konnten aber

Läsionen festgestellt werden (JANSSEN et al. 2009).

Die folgenden drei Arten werden als pathogene Erreger beim Geflügel eingestuft: B. alvinipulli, B.

intermedia und B. pilosicoli (MCLAREN et al. 1997). Eine Spanne von milden bis hin zu schweren

Symptomen ist beschrieben worden. Geringere Futteraufnahme und -verwertung sowie reduzierte

Wachstumsraten konnten bei Broilern dokumentiert werden (DWARS et al. 1993; SMIT et al.

1998). Bei Legehennen stellen sich ein verzögerter Legebeginn und eine verminderte Legeleistung

ein. Zudem treten, als Folge von Durchfällen, verschmutzte Eischalen und nasse Einstreu auf

(GRIFFITHS et al. 1987; DWARS et al. 1989, 1992; SWAYNE et al. 1992; TRAMPEL et al. 1994). Eine

erhöhte Mortalität ist bei Gänsen beobachtet worden. In 2006 wurde sie mit 18 % und 28 % in

zwei Gänsezuchtbeständen beziffert (NEMES et al. 2006). In pathohistologischen Untersuchungen

wiederholten sich Befunde wie lymphoplasmatische Typhlitis, submukosale lymphozytische

Follikelbildung, Hyperplasie der Becherzellen und Zerstörung der Mikrovilli (SWAYNE et al. 1995;

MUNIAPPA et al. 1996; PRAPASARAKUL et al. 2011).

Seit den 1980er Jahren konnten die drei genannten Brachyspirenarten immer wieder bei Tieren

mit Symptomen einer AIS nachgewiesen werden. In den Niederlanden wurden in 27,6 % der

Proben von erkrankten Legehennen Brachyspiren gefunden (DWARS et al. 1989), wobei die

Wissenschaftler mit einem indirekten Immunfluoreszenz-Antikörpertest (IFAT) arbeiteten und eine

Artdiagnose mit diesem Verfahren nicht möglich ist. In Australien betrug der Prozentsatz in

auffälligen Betrieben 53,3 % bei Broilern und 35,1 % bei Legehennen (MCLAREN et al. 1996).

BURCH et al. (2007) führten eine Studie zur Prävalenz von Brachyspiren in England durch und

ermittelten in 70 % der Proben pathogene Brachyspirenarten in Betrieben, die über eine schlechte

Herdenleistung berichteten. Eine Publikation aus Norditalien bezifferte das Vorkommen von

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Brachyspiren sogar auf 72,4 %, davon war B. intermedia mit 27,5 % und B. pilosicoli mit 13,8 %

vertreten (BANO et al. 2008).

Zahlreiche Infektionsversuche beim Geflügel bestätigen die Pathogenität von B. pilosicoli und B.

intermedia sowie in Einzelfällen auch von B. alvinipulli. Eine Übersicht über alle bis heute

publizierten experimentellen Infektionen beim Geflügel wird in Tabelle 2 (Ergebnisse

experimenteller Infektionen mit Brachyspiren beim Geflügel) dargestellt. Zum Vergleich werden

exemplarisch die Ergebnisse experimenteller Infektionen für andere Tierarten in Tabelle 3

(Ergebnisse experimenteller Infektionen mit Brachyspiren beim Schwein und sonstigen Tierarten)

gezeigt.

Aus Legehennen, Gänsen und Stockenten ist B. alvinipulli bisher isoliert worden (FEBERWEE et al.

2008; SWAYNE et al. 1992; NEMES et al. 2006; JANSSON et al. 2011). Klinisch verursachte B.

alvinipulli in natürlich infizierten Tieren Durchfall, verklebte Kloakenöffnungen und somit auch

verschmutzte Eischalen (SWAYNE et al. 1992). Histologisch waren Typhlitiden mit fokalen

Nekrosen prominent (FEBERWEE et al. 2008). Bei experimentellen B. alvinipulli-Infektionen sind

verminderte Gewichtszunahmen und Durchfälle sowie dilatierte, entzündete Caeca mit

Epithelhyperplasie und submukosalen, lymphozytischen Follikeln aufgetreten (SWAYNE et al.

1995).

Aus den Ergebnissen der experimentellen Infektionen mit B. intermedia ging hervor, dass klinisch

sowohl Broiler als auch Legehennen Durchfälle und verminderte Wachstumsraten zeigten.

Zusätzlich zu Legeeinbußen kamen noch verminderte Eigewichte und veränderte Eidotter hinzu.

Blutuntersuchungen ergaben erhöhte Werte von Proteinen, Lipiden, Karotinoiden und Bilirubin im

Serum (DWARS et al. 1990, 1992, 1993; HAMPSON & MCLAREN 1999; PHILLIPS et al. 2004).

Histologisch konnten Ansammlungen von B. intermedia in der Mukosa der Caeca nachgewiesen

werden, die mit Erosionen assoziiert waren.

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Tabelle 2: Ergebnisse experimenteller Infektionen mit Brachyspiren beim Geflügel

Experimentelles Design Ergebnis der experimentellen Infektion

Referenz Art Alter Read out Parameter Klinik Pathologisch- anatomische Veränderungen

ADACHI. 1985 B. hyodysenteriae 1 Tag APV (Caeca) Keine Mukosa rauh und erodiert, Ödeme

SUEYOSHI et al. 1987 B. hyodysenteriae 1 Tag APV (Caeca) keine Epithelzerstörung, Kryptendilatation

SUEYOSHI & ADACHI 1990

B. hyodysenteriae 1 Tag APV (Caeca) Keine Atrophien, weiß-wässriger Inhalt, erodierte Zellen, Ödeme, heterophile Infiltration

DWARS et al. 1990 B. intermedia AB, Kot, APV Gastrointestinale Dysfunktion B.sp. in caecaler Mukosa, „gap line lesions“

DWARS et al. 1992 B. intermedia 1 Tag AB, KGW, Kot, APV, Blutuntersuchung

Depression, Ds, blasse Gliedmaßen, Wachstumsverzögerung

Ödeme Intestinum Blut: alkalische Phosphataseaktivität +

DWARS et al. 1992 B. intermedia 20 Wo Kot D keine

DWARS et al. 1992 B. intermedia 1 Tag AB, KGW, Kot, APV, Blutuntersuchung

keine Invasion caecaler Mukosa mit B.sp., fokal Läsionen

DWARS et al. 1993 B. intermedia 14 Wo AB, KGW, Kot, EG, EA, Eigelb, Blut, Nachkommen

Schaumig-helle D, EG/EA-, Karotin in Eiern - ; Nachkommen: KGW-, D

alkalische Phosphataseaktivität Serum +, Karotin im Serum -

SWAYNE et al. 1995 B. alvinipulli 1 Tag, 2. Legeperiode

KGW, Kot gelb-goldener D Caecumdilatation, flüssiger Inhalt, Typhlitis u. Proktitis, Zellhyperplasien, Ödeme Lamina propria, Kryptendilatation

TROTT. 1995 B. hyodysenteriae

B. innocens

1 Tag KGW, Kot, APV KGW-, Ds B. hyo.: Ceaca kleiner, Wände verdickt

MUNIAPPA et al. 1996 B. pilosicoli

1 Tag APV keine Caecuminhalt: gelbbraun, übelriechend; Caecum: „Cell brush border“, Nekrosen

MUNIAPPA et al. 1997 B. hyodysenteriae

B. innocens

1 Tag APV Keine Caecuminhalt: gelbbraun, übelriechend und wässrig

TROTT & HAMPSON 1998

B. pilo, B. hyo

B. intermedia

B. aalborgii

B. murdochii

1 Tag KGW, Kot, APV B. pilo./B. hyo.: D B. hyo.: KGW-

B. pilo./B. hyo.: Caecumatrophie, Zellhyperplasien

HAMPSON & MCLAREN 1999

B. intermedia 14 Wo KGW, Kot, EG, EA, APV D, KGW-, EG/EA - keine

HAMPSON et al. 2002*1 B. intermedia 18 Wo KGW, Kot, EG, APV D keine

HAMPSON et al. 2002*2 B. intermedia 18 Wo KGW, Kot, EG, EA, EG/EA-, B.sp.- durch ZnB u. Tiamulin

keine

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Referenz Art Alter Read out Parameter Klinik Pathologisch- anatomische Veränderungen

JAMSHIDI & HAMPSON 2002*3

B. pilosicoli 18 Wo KGW, Kot, EG, EA, APV keine Zusatz von ZnB erhöhte Kolonisation

STEPHENS & HAMPSON 2002

B. pilosicoli

B. innocens

17 Wo KGW, Kot, EG, EA, APV B. pilo: D (schaumig-braun), EA-, verzögerter Legebeginn, Depression

Caecum aufgebläht, Inhalt schaumig u. flüssig

STEPHENS & HAMPSON 2002*4

B. pilosicoli 20 Wo KGW, Kot, EG, EA, EV, APV KGW-, D, EV-, Behandlung drängt Infektion zurück

keine

JAMSHIDI & HAMPSON 2003

B. pilosicoli 18 Wo KGW, Kot, EG, EA, APV D keine

PHILLIPS et al. 2004*5 B. intermedia 18 Wo KGW, Kot, EG, EA, APV Weizenfütterung: EA-, B.sp.+ keine

PHILLIPS et al. 2004*6 B. intermedia 18 Wo KGW, Kot, EG, EA, APV B.sp.+/D bei höherem Weizengehalt

keine

IVANICS et al. 2007 B. hyodysenteriae

B. alvinipulli

10 Tage AB, KGW, Kot, APV keine Caecumdilatation, wässrig-gelber Inhalt Intestinale Mukosa: Entzündungszeichen, Zellhyperplasie, Ödeme in Lamina propria

JANSSEN et al. 2009 „B. suanatina“

B. hyodysenteriae

1 Wo AB, KGW, Kot, APV, Leukozytenzahl

keine Leukozytose, Caecum: wässrig-gelber Inhalt, leukozytäre Infiltration Lamina propria, Mukosahyperplasie, epitheliale Läsionen

AMIN et al. 2009*7 B. intermedia 20 Wo KGW, Kot, Eg, EA, APV, Serum keine Caecum aufgebläht, schaumig-schleimiger Inhalt, Epithelablösung, Ödeme Lamina propria

PRAPASARAKUL et al. 2011

B. pilo, B.hyo

„B. canis“

“B. pulli”

B. innocens

1 Tag AB, KGW, Kot, APV KGW- (exkl. B. innocens) Caecuminhalt grün-wässrig, Mikrovilli verkürzt, Zellinfiltration Lamina propria

THUMA et al. 2011*8 B. pilosicoli

B. alvinipulli

1 Tag Ab, KGW, Kot, APV T2-Toxin: KGW- T2-Toxin: Krusten am Schnabel, Nekrosen in Mundhöhle und an Füßen, Thymus- und Bursa fabricii Atrophie

VERLINDEN et al. 2013*9 B. intermedia 1 Tag KGW, Kot keine Weniger Kolonisation bei Zusatz von Ölen

MAPPLEY et al. 2013*5 B. pilosicoli 18 Wo KGW, Kot, EG, EV, APV Gruppe 1: KGW+, B.sp.-, D-, EG/EV- Gruppe 1: ggr lymphoide Hyperplasie, Kryptabszesse u. subepitheliale Haemorrhagien

MAPPLEY et al. 2013 B. pilosicoli 17 Wo KGW, Kot, EG, EA, EV, APV KGW-, D, EG/EA-, EV+, verzögerter Legebeginn

B. sp. in Leber und Milz, Kryptabszesse, lymphoide Hyperplasie, Ceacalgewicht-, lymphoplasmatische Zellen in Caecum/ Kolon

WOODWARD et al. 2015 B. pilosicoli 17 Wo AB, KGW, Kot, EG, EA, EV, APV AB-, KGW-, EG/EA-, EV+ B.sp. in Leber und Milz

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B. = Brachyspira, AB = Allgemeinbefinden, KGW = Körpergewicht, EG = Eigewicht, EA = Eianzahl, EV = Eischalenverschmutzung, APV = Anatomisch-

pathologische Veränderungen (inklusive Histologie), - = verringert, + = erhöht, Kot: Farbe, Konsistenz, Menge, Durchfall (= D) mit gegebenenfalls

(ggf.) Beimengungen wie Schleim (= s) oder Blut (= b), Nachweis von Brachyspiren (= B.sp.), *Prädisposition, ZnB = Zinkbacitracin, ggr = geringgradig,

exkl. = exklusive, B. hyo = Brachyspira hyodysenteriae, B. pilo = Brachyspira pilosicoli, p.i. = post infectionem, Wo = Wochen

*1 Zinkbacitracin in unterschiedlichen Konzentrationen (Gruppe 1 und 2), diätätisches Enzym Anzyme®

*2 Zinkbacitracin vor der Infektion und ab 5. Woche p.i. (Gruppe 1), Behandlung mit Tiamulin (Gruppe 2)

*3 Zusatz von Zinkbacitracin

*4 Behandlung der Infektion mit Tiamulin und Lincomycin

*5 Diätfutter (verschiedene Gehalte Nicht-Stärke-Polysaccharide: Weizen, Gerste, Gerste u. Hirse)

*6 Diätfutter ( unterschiedlich hohe Weizengehalte)

*7 Vakzination mit autogenem Bakterin, gewonnen von B. intermedia

*8 Zusatz von Mykotoxin (T2- Toxin) je in einer Gruppe mit B. pilosicoli und B. alvinipulli infiziert und in einer Kontrollgruppe

*9 Zusatz von essentiellen Ölen (trans-cinnamaldehyd)

*10 Lactobacillus reuteri als Probiotika (Gruppe 1)

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Tabelle 3: Ergebnisse experimenteller Infektionen mit Brachyspiren beim Schwein und sonstigen Tierarten (exemplarisch)

Experimentelle Infektionen Ergebnis der Infektion

Referenz Art Alter Read out Parameter Klinik Pathologisch- anatomische

Veränderungen TROTT et al. 1996*1 B. pilosicoli Schwein 5 Wo KGW, Kot, APV Ds Mukosale Kolitis, dilatierte Krypten, neutrophile

Exozytose

OXBERRY et al. 1998 B. pilosicoli Mensch (Mann, 43 Jahre alt, Freiwilliger)

AB, Kot Übelkeit, Magenbeschwer-den, Aufgeblähtheit

nicht untersucht

JAMSHIDIAN et al. 2004*2

B. pilosicoli Mäuse (3 Wo alt) KGW, Kot, APV, flüchtige Fettsäuren im Caecuminhalt

keine Gruppe 1: flüchtigen Fettsäuren -, KGW + Gruppe 2: Gewicht vom Caecum u. Inhalt +, Acetatproduktion +, Propionat- u. Isovaleratprod. -, ein Tier mit B.sp. kolonisiert Gruppe 3: alle Tiere mit B.sp kolonisiert

RÅSBÄCK et al. 2007 „B. suanatina“ Schwein 5 Wo AB, KGW, Kot KGW-, D nicht untersucht

BURROUGH et al. 2012

Stark hämolysierende (B. hyodysenteriae,

B. intermedia, B. sp. SASK30446)

Schwein 4 Wo AB, KGW, Kot, APV Db, KGW- Typhlocolitis, fibrinöse Exsudate, Hämorrhagien und Mukus + in Caecum und Kolon

BURROUGH et al. 2012

Schwach hämolysierende (B. innocens,

B. murdochii)

Schwein 4 Wo AB, KGW, Kot, APV D vereinzelt Typhlocolitis, fibrinöse Exsudate, ggr mehr Mukus in Caecum und Kolon

RUBIN et al. 2013 B. hampsonii Schwein 5 Wo AB, KGW, Kot, APV D Mukohämorrhagische Kolitis, mesenteriale Lymphknoten geschwollen, fibrinöse Typhlokolitis, Hämorrhagien in Lamina propria, neutrophile Infiltrationen

COSTA et al. 2014 B. hampsonii Schwein 5 Wo AB, KGW, Kot, APV Dsb mukosale Ödeme u. Läsionen, mukofibrinöse Exsudate, fokale Nekrosen, mild bis moderate Entzündungszeichen

WILBERTS et al. 2014

B. hampsonii

B. hyodysenteriae

Schwein 6 Wo AB, KGW, Kot, APV D Mukusproduktion +, neutrophile Inflammation, mukosale Ulzerationen

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AB = Allgemeinbefinden, KGW = Körpergewicht, EG = Eigewicht, EA = Eianzahl, EV = Eischalenverschmutzung, APV = Anatomisch-pathologische

Veränderungen (inklusive Histologie), - = verringert, + = erhöht, Kot: Farbe, Konsistenz, Menge, Durchfall (= D) mit ggf. Beimengungen wie

Schleim (= s) oder Blut (= b), Nachweis von Brachyspiren (= B.sp.), *Prädisposition, Wo = Wochen

*1 leicht fermentierbares Diätfutter,

*2 Diätfutter (Gruppe 1: Zinkbacitracin, Gruppe 2: 50 % Laktosezusatz, Gruppe 3: Zusatz von beidem)

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Allgemein wird B. intermedia beim Geflügel häufiger nachgewiesen als B. pilosicoli. Beide Arten

wurden wiederholt zusammen isoliert (PHILLIPS et al. 2005). B. pilosicoli zeichnet sich im Vergleich

durch eine höhere Virulenz und ein zoonotisches Potential aus (HAMPSON et al. 2006; TROTT et al.

1998). Die Art kommt beim Menschen, beim Schwein, bei Hunden und etlichen anderen Spezies

vor. Bei B. pilosicoli konnten zahlreiche Funktionen beziehungsweise Pathomechanismen erforscht

werden, durch die sich diese Art hervorhebt. So besitzt diese Art ein Galactose-binding Protein

Gen (mglB) -Homologon. Dieses Gen kodiert für ein Lipoprotein, welches zur Chemotaxis befähigt

(ZHANG et al. 2000). Über Chemotaxis kommen die Brachyspiren schnell und gezielt zu ihrem

Bestimmungsort, den GIT. Außerdem ist B. pilosicoli neben B. aalborgi in der Lage, an gesundes

Epithel anzuhaften, einzudringen und dieses dann zu zerstören (KENNEDY & STRAFUSS 1976).

Mikroskopisch ist in diesem Zusammenhang für diese Art der „false brush border“ charakteristisch.

Als Folge werden Mikrovilli und mikrofilamentäre Strukturen zerstört (MUNIAPPA et al. 1996;

PRAPASARAKUL et al. 2011).

Im Falle einer Erkrankung können bei den Vögeln Durchfall, verminderte Wachstumsraten (TROTT

et al. 1995), eine Reduktion der Legeleistung und kotverschmierte Eischalen (JAMSHIDI &

HAMPSON 2003; STEPHENS & HAMPSON 2002) beobachtet werden. Hinzu kommt, dass bei

natürlichen Infektionen mit B. pilosicoli ovarielle Dysfunktionen und Lethargie auftreten

(FEBERWEE et al. 2008; TRAMPEL et al. 1994). Bei Puten konnte eine gesteigerte Mortalität

festgestellt werden (SHIVAPRASAD & DUHAMEL 2005).

Histologisch wurden Entzündungen im gesamten Ceacumbereich, Hyperplasie der Krypten und

Becherzellen, epitheliale Erosionen und die Bildung von Vakuolen im Zytoplasma beschrieben.

Darüber hinaus konnten systemische Veränderungen mit Nierendegenerationen und Amyloidosen

in der Leber und Milz festgestellt werden (DWARS et al. 1992; GLAVITS et al. 2011).

2.4 Differenzierung der Brachyspirenarten

Eine zuverlässige Differenzierung der verschiedenen Brachyspirenarten ist für den Nachweis einer

AIS entscheidend, da nur drei von neun Arten eine pathogene Bedeutung zukommt. Es stehen

sowohl phänotypische als auch genotypische Methoden zur Verfügung. Einen Goldstandard zur

Differenzierung der Brachyspiren gibt es aber nicht.

Zu den phänotypischen Differenzierungsverfahren gehören die mikroskopische Untersuchung, die

Beurteilung des Hämolyseverhaltens, die Differenzierung aufgrund der biochemischen

Eigenschaften und die Massenspektrometrie.

Anhand der charakteristischen Spiralform kann man Brachyspiren im Nativpräparat gut erkennen

und hat einen ersten Verdacht auf Brachyspira sp. direkt bestätigt (HARRIS & GLOCK 1981). Die

typische Morphologie und Fortbewegung ist mittels Phasenkontrast- oder Dunkelfeldmikroskopie

ebenfalls schnell darzustellen (AMTSBERG & MERKT 1986; FELTRUP. 1998). Eine Speziesdiagnose

ist auf diese Weise aber nicht möglich.

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FELLSTRÖM et al. (1997), FELTRUP et al. (1999) und STANTON et al. (1997) entwickelten ein

Schema zur Einteilung der Arten aus der Kombination vom jeweiligen Hämolyseverhalten (stark

oder schwach) und dem biochemischen Profil, hauptsächlich basierend auf der Indolbildung, der

Hippuratspaltung sowie der α-Galaktosidase- und α- sowie β-Glucosidaseaktivität. Einige

Brachyspirenarten verhalten sich aber in diesen biochemischen Eigenschaften nicht einheitlich, so

dass die genaue Artbestimmung manchmal unsicher beziehungsweise unmöglich ist.

Beispielsweise beschreiben FELLSTRÖM et al. (1999) sowohl Indol-abbauende als auch Indol-nicht-

abbauende B. hyodysenteriae-Isolate bei Schweinen.

In den letzten Jahren ist eine massenspektrometrische Differenzierung der Brachyspirenarten

durch Matrix-Assistierter Laser-Desorption-Ionisierung (MALDI) mit der Flugzeitanalyse (engl. time

of flight, TOF) vermehrt zum Einsatz gekommen (CALDERARO et al. 2013; WARNEKE et al. 2014;

PROHASKA et al. 2014). Die MALDI-TOF-Analyse liefert schnelle Diagnosen und bietet die

Möglichkeit einer Speziesdiagnose (WARNEKE et al. 2014). Es ist aber zu berücksichtigen, dass alle

zurzeit kommerziell verfügbaren Datenbanken sehr unvollständig in Bezug auf

veterinärmedizinisch wichtige Brachyspirenarten sind. Es besteht aber die Möglichkeit, mit einer

Datenbankerweiterung die Genauigkeit der MALDI-TOF-Analyse entscheidend zu verbessern

(CALDERARO et al. 2013; WARNEKE et al. 2014).

Zur genotypischen Differenzierung der Brachyspiren sind unterschiedliche PCRs beschrieben

worden. Viele davon stützen sich auf den Nachweis der Gene für die 16S rRNA, die 23S rRNA und

die NADH-Oxidase (nox) (ATYEO et al. 1999; LA et al. 2003). Zur Detektion von B. pilosicoli wurde

eine PCR für das 16S rRNA-Gen entwickelt. Hingegen wurde zum Nachweis von B. intermedia vor

allem das 23S rRNA-Gen oder das nox-Gen als Zielgen der beschriebenen PCR ausgewählt

(PHILLIPS et al. 2005, 2006). Für B. hyodysenteriae wurden sowohl PCRs für das nox-Gen als auch

für das tlyA-Gen entwickelt (FELLSTRÖM et al. 2001; JANSSON et al. 2004). Neben diesen und noch

einigen anderen Monoplex-PCRs wurden auch Duplex-PCRs auf den Markt gebracht, die mit einer

Reaktion die Differenzierung mehrerer Arten, wie insbesondere B. pilosicoli und B. hyodysenteriae,

ermöglichen (LA et al. 2003). Im nächsten Schritt folgten einige Multiplex-PCRs, mit denen eine

Unterscheidung von B. hyodysenteriae, B. pilosicoli und B. intermedia vorgenommen wurde (SONG

& HAMPSON 2009). Da es für die Differenzierung der Brachyspiren keinen akzeptierten

Goldstandard gibt, ist die Zuverlässigkeit der unterschiedlichen, oben erwähnten PCRs, aber

schwierig zu beurteilen. So konnten FELLSTÖM et al. (2008) nur bei 19 von 34 getesteten B.

intermedia-Isolaten eine übereinstimmende positive Diagnose von zwei als B. intermedia

spezifisch beschriebenen PCR feststellen. Keine der beiden PCRs erkannte alle B. intermedia

Stämme.

Eine weitere genotypische Differenzierung wurde 2002 von ROHDE et al. mit der Analyse des

Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus des nox-Gens eingeführt. Ein DNS-Fragment aus

dem nox-Gen wird mittels PCR amplifiziert und anschließend mit spezifischen

Restriktionsendonukleasen verdaut. Das durch den Restriktionsverdau entstehende

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Bandenmuster lässt eine Differenzierung von B. hyodysenteriae, „B. suanatina“, B. pilosicoli, B.

intermedia, B. murdochii und B. innocens zu (ROHDE et al. 2002; ROHDE & HABIGHORST-BLOME

2012).

Des Weiteren setzen viele Wissenschaftler eine Sequenzierung eines PCR-Amplifikates (nox, 16S

rRNA, 23S rRNA, tlyA, VSH1- Region, cpn60, trep, glt, oxd, mcpB, mcpC, 5S rRNA, est, pgm, thi,

glpK, gdh, alp, adh, yqi, blaOXA) zur genaueren Differenzierung der Brachyspiren ein. Die

erhaltene Sequenz wird dann über eine Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)-Analyse

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) mit Einträgen in der NCBI-Genbank verglichen (JANSSON

et al. 2011). Aktuell gibt es in der GeneBank 9785 Einträge zu Brachyspira spp., davon unter

anderem 2692 zu 16S rRNA-, 2203 zu 23S rRNA- und 406 zu nox-Gensequenzen (Stand

12.02.2017).

Zur Differenzierung der Brachyspirenarten sind weiterhin Methoden zum Einsatz gekommen, die

im Allgemeinen bei anderen Erregern im Rahmen von epidemiologischen Untersuchungen zur

Feindifferenzierung innerhalb einer Art eingesetzt wurden. So wird in der Erstbeschreibung der

Multilokussequenztypisierungen (MLST) der Brachyspiren bereits die Möglichkeit der

Speziesidentifizierung aufgezeigt (RÅSBÄCK et al. 2007). Auf der anderen Seite können MLST und

die Pulsfeldgelelektrophoresen (PFGE) auch zur Feindifferenzierung innerhalb der Art B.

hyodysenteriae in epidemiologischen Untersuchungen eingesetzt werden (LA et al. 2009). Mit der

PFGE konnten FELLSTRÖM et al. (2008) eine hohe Diversität innerhalb der Spezies B. intermedia

aufzeigen. Weiterhin wurde die „random amplified polymorphic DNA“ (RAPD) zur

Speziesdifferenzierung eingesetzt (FELLSTRÖM et al. 2008; HIDALGO et al. 2010). In der

veterinärmedizinischen Routinediagnostik der IS finden MLST, PFGE und RAPD aber keine

Anwendung (Baums, persönliche Mitteilung. 2017).

Einzelne Tests basieren auf dem Einsatz von Brachyspiren-spezifischen-Antikörpern. So wurde der

indirekte Immunfluoreszenz-Antikörpertest eingesetzt, um ein Screening von Kotproben vom

Geflügel durchzuführen (FEBERWEE et al. 2008). Die Autoren leiteten die kulturelle Untersuchung

auf Brachyspiren nur bei positivem IFAT Ergebnis ein. Eine Artdiagnose ist mit dem IFAT nicht

möglich. Enzyme-linked immunosorbent assay´s (ELISA´s) (SONG et al. 2012) und Mikro-

Agglutinations-Verfahren (LEE & HAMPSON 1996) sind wie auch der IFAT in der Lage,

Brachyspiren nachzuweisen. Die Spezifität und Sensitivität sind aber zu gering gewesen, so dass

diese Verfahren keinen Einzug in die Routinediagnostik erhalten haben (LA & HAMPSON 2001).

Tabelle 4 (Methoden zur Differenzierung von Brachyspiren in wissenschaftlichen Untersuchungen)

zeigt exemplarisch die angewandten Methoden zur Differenzierung der Brachyspirenarten in

verschiedenen wissenschaftlichen Untersuchungen.

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Tabelle 4: Methoden zur Differenzierung von Brachyspiren in wissenschaftlichen Untersuchungen

Methoden zur Differenzierung

phänotypisch genotypisch

Art Isoliert aus Makros.a Bioch.b MALDI PCRc RAPD RFLP Seq. PFGE MLEE Publikation B. pilosicoli W + + FELLSTRÖM et al. 1995

Ms, S +a1 +b1 16SrRNA + TROTT et al. 1996

S + + 16SrRNA FELLSTRÖM et al. 1997

Ms +a2 +b2 16SrRNA + STANTON et al. 1997

Hu + + + MCLAREN et al. 1997

S 23SrRNA + LESER et al. 1997

Gf + +b6 16SrRNA + MUNIAPPA et al. 1997

W 16SrRNA + OXBERRY et al. 1998

Ms, S, Gf, Hd nox + ATYEO et al. 1999

Ms 16SrRNA, nox + MIKOSZA et al. 1999

Ms 16SrRNA MIKOSZA et al. 2001

S nox + ROHDE et al. 2002

S 16SrRNA JAMSHIDI&HAMPSON 2002

Gf + 16SrRNA, nox STEPHENS&HAMPSON 2002

Gf + 16SrRNA, nox STEPHENS&HAMPSON 2002

S 16SrRNA LA et al. 2003

S + 16SrRNA JAMSHIDI&HAMPSON 2003

S + + 16SrRNA JOHANSSON et al. 2004

Gf + +b4 16SrRNA + PHILLIPS et al. 2003

Ma 16SrRNA JAMSHIDIAN et al. 2004

Gf + +b4 + STEPHENS et al. 2005

S, Gf 16SrRNA, nox + + TOWNSEND et al. 2005

S 16SrRNA LA et al. 2006

Gf 16SrRNA PHILLIPS et al. 2006

Gf 16SrRNA + HAMPSON et al. 2006

S + + 16SrRNA RÅSBÄCK et al. 2006

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phänotypisch genotypisch Art Isoliert aus Makros.a Bioch.b MALDI PCRc RAPD RFLP Seq. PFGE MLEE Publikation B. pilosicoli S, Gf, Hd, Ma + +b5 16SrRNA + + + RÅSBÄCK et al. 2007

Gf + + 16SrRNA, nox + FEBERWEE et al. 2008

Gf 16SrRNA + BANO et al. 2008

S + nox, c 1 + BARTH et al. 2012

Gf + + nox + GLAVITS et al. 2011

Gf + +b5 16SrRNA + JANSSON et al. 2011

Hd + + 16SrRNA + PRAPASARAKUL et al. 2011

S + + 16SrRNA + CHANDER et al. 2012

Ms, S + 16SrRNA, nox + CALDERARO et al. 2013

Gf 16SrRNA MAPPLEY et al. 2013

Gf 16SrRNA MAPPLEY et al. 2013

Ms, S, Gf, Hd, Pf + NEO et al. 2013

S + nox + PATTERSON et al. 2013

Gf 16SrRNA AMIN et al. 2014

S + nox + WARNEKE et al. 2014

S + + + PROHASKA et al. 2014

Gf 16SrRNA WOODWARD et al. 2015

B. hyodysenteriae S + SUEYOSHI. 1987

S + + SUEYOSHI&ADACHI 1990

S + + FELLSTRÖM et al. 1995

S + + TROTT et al. 1995

S + + 16SrRNA PETTERSSON et al. 1996

S 16SrRNA + STANTON et al. 1996



S + + ATYEO et al. 1999

S, Gf nox + ATYEO et al. 1999

S +a2 + CALDERARO et al. 2001


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phänotypisch genotypisch

Art Isoliert aus Makros.a Bioch.b MALDI PCRc RAPD RFLP Seq. PFGE MLEE Publikation S nox LA et al. 2003

W + +b3 16SrRNA, tlyA + + JANSSON et al. 2004

S 16SrRNA, nox + + TOWNSEND et al. 2005

S + + tlyA RÅSBÄCK et al. 2006

S nox LA et al. 2006

S, Gf, Hd, Ma + + b5 16SrRNA + + + RÅSBÄCK et al. 2007

Gä + + 16SrRNA + IVANICS et al. 2007


Gf + +b5 + JANSSON et al. 2009


S + nox, c1 + BARTH et al. 2012

S + 16SrRNA, nox + CALDERARO et al. 2013

S nox + + ROHDE et al. 2012

S + + nox + CHANDER et al. 2012

S + 16SrRNA, nox + BURROUGH et al. 2012


S nox + WILBERTS et al. 2014


B. innocens S + + + TROTT et al. 1995

S + + 16SrRNA PETTERSSON et al. 1996

Gf 16SrRNA + STANTON et al. 1996





Gf + 16SrRNA, nox STEPHENS & HAMPSON 2002


S 16SrRNA, nox + + TOWNSEND et al. 2005

Gf + +b4 nox + STEPHENS et al. 2005

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phänotypisch genotypisch Art Isoliert aus Makros.a Bioch.b MALDI PCRc RAPD RFLP Seq. PFGE MLEE Publikation

B. innocens Gf + +b5 23- u. 16SrRNA, nox + JANSSON et al. 2008


Gf nox BANO et al. 2008

Gf + +b5 nox, 23SrRNA + JANSSON et al 2011





W + + 16SrRNA, nox, tlyA + MARTINÉZ-LOBO et al. 2013




B. aalborgii Ms 16SrRNA + STANTON et al. 1996

Ms nox + ATYEO et al. 1999

Ms 16SrRNA, nox + MIKOSZA et al. 1999

Ms 16SrRNA MIKOSZA et al. 2001

Ms + 16SrRNA, nox + CALDERARO et al. 2013

B. intermedia Hu + + + MCLAREN et al. 1997


Gf + + HAMPSON&MCLAREN 1999



Gf 23SrRNA HAMPSON et al. 2002

Gf 23SrRNA HAMPSON et al. 2002

Gf nox(int) PHILLIPS et al. 2004

Gf nox(int) PHILLIPS et al. 2004

Gf + +b4 nox(int) + PHILLIPS et al 2005


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B. intermedia Gf + +b4 23SrRNA + STEPHENS et al. 2005

Gf nox PHILLIPS et al. 2006

Gf 16SrRNA + HAMPSON et al. 2006

S, Gf, Hd, Ma + + b5 16SrRNA + + + RÅSBÄCK et al. 2007

Gf + +b5 23- u. 16SrRNA, nox + JANSSON et al. 2008


Gf 23SrRNA BANO et al. 2008

Gf nox(int) AMIN et al. 2009

Gf + +b5 23SrRNA, nox + JANSSON et al. 2011






Gf nox AMIN et al. 2014



B. murdochii Hu + + + MCLAREN et al. 1997


S nox + ATYEO et al. 1999




Gf + +b4 Nox + STEPHENS et al. 2005



Gf nox BANO et al. 2008



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B. murdochii S nox + + ROHDE et al. 2012







B. alvinipulli Gf nox + ATYEO et al. 1999

Gf + + 16SrRNA JOHANSSON et al. 2004

Gä + + 16SrRNA + NEMES et al. 2006

Gä + + 16SrRNA + IVANICS et al. 2007




Gf + 16SrRNA, nox + CALDERARO et al. 2013


„B. canis“ Hd + + 16SrRNA JOHANSSON et al. 2004


„B. pulli“ Gf + +b4 16SrRNA + + PHILLIPS et al. 2005

Gf + +b4 + STEPHENS et al. 2005





B suanatina S, Gf + + b5 23- u.16SrRNA, nox, tlyA RÅSBÄCK et al. 2007

S, Gf + +b5 + JANSSON et al. 2009

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B suanatina Gf + + nox + GLAVITS et al. 2011


B. hampsonii S + + 16SrRNA, nox + CHANDER et al. 2012



S + nox, 16SrRNA, cpn60 + COSTA et al. 2014


S nox + WILBERTS et al. 2014

S, W + nox + + MIRAJKAR et al. 2015

B. = Brachyspira, Makros. = Makroskopisch, Bioch. = Biochemisch, MALDI = Matrix-Assistierte Laser-Desorption-Ionisierung (Massenspektrometrie), RAPD = Random Amplified Polymorphic DNA Analyse, RFLP = Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-Analyse , Seq. = Sequenzierung, PFGE = Pulsfeldgelelektrophorese , MLEE = Multilokus Enzym Elektrophorese

Gä = Gänse, Gf = Geflügel, Hd = Hund, Hu = Huhn, Ma = Maus, Ms = Mensch, S = Schwein, W = Wassergeflügel

a Hämolyseverhalten (stark, schwach)

a1 Hämolyseverhalten, Zelldiameter, Zelllänge, periplasmatische Flagellen/ Zelle

a2 Hämolyseverhalten, periplasmatische Flagellen / Zelle

b Indol, Hippurat, α- Galactosidase, α- Glucosidase, β- Glucosidase (API-ZYM System)

b1 Indol, Hippurat, α- Galactosidase, α- Glucosidase, β- Glucosidase (API-ZYM System), Produktion von Butyrat, Acetat, Ethanol, CO2, H2O

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b2 Indol, Hippurat, β- Glucosidase (API-ZYM System)

b3 Indol, Hippurat, α- Galactosidase

b4 Indol

b5 Indol, Hippurat, α- Galactosidase, β- Glucosidase

b6 Hippurat

c1 clpX, bhlp16, bhlp17.6, bhlp29.7, bhmp39f, bhmp39h, hlyA, acp, tlyA, ftnA, bitC

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3. Material und Methoden

3.1 Gewinnung von Proben

In der Zeit von Oktober 2014 bis einschließlich März 2016 wurden 162 Kloakentupfer von 27

Betrieben in Thüringen, Sachsen-Anhalt, Berlin und Niedersachsen in Legehennenbetrieben

gesammelt. In dieser Arbeit sollte auch ein Zusammenhang zwischen Haltungsform und

Brachyspirenvorkommen untersucht werden. Drei in Deutschland wichtige Haltungssysteme

wurden ausgewählt: Bodenhaltung, Freilandhaltung und die ökologische Haltung. Jede der

Haltungsformen ist mit 9 Betrieben vertreten, aus denen jeweils 6 zufällig ausgewählte Tiere

beprobt wurden. Die Betriebe wurden in erster Linie nach ihrer Motivation zur Teilnahme

ausgewählt. Viele angesprochene Betriebsleiter waren nicht dazu bereit, „fremden“ Personen

Zugang zu ihren Betrieben zu gewähren. Einerseits wollten sie kein Hygienerisiko eingehen und

andererseits sahen viele keinen Grund zur Teilnahme, da das Thema Brachyspiren

beziehungsweise die AIS nicht bekannt war. Der Probenumfang pro Betrieb wurde initial mit 6

festgelegt, damit die gründliche Bearbeitung und Differenzierung jeder einzelnen Probe dieser

anspruchsvollen Bakteriengattung gewährleistet werden konnte. Zusätzlich zu den 162

Kloakentupfern wurden in Sachsen-Anhalt noch von 5 Betrieben mit Bodenhaltung 29

Caecumtupfer genommen. Bei diesen Tieren handelte es sich um Broilerelterntiere, die im

Rahmen einer regelmäßigen Wurmkontrolle untersucht wurden. Diese Möglichkeit wurde genutzt,

da bereits in der Vergangenheit öfter beschrieben wurde, dass aus caecal entnommenen Proben,

Brachyspiren leichter zu isolieren sind (HAMPSON & SWAYNE 2008). Des Weiteren wurden von

diesen Tieren auch Gewebeproben des Caecum entnommen und histologisch untersucht. Dazu

wurden die Schnitte mittels der Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE) eingefärbt und mikroskopisch

begutachtet. Die histologische Untersuchung der Gewebeproben wurde von Dr. Volker Schmidt

(Klinik für Vögel und Reptilien, Veterinärmedizinische Fakultät Leipzig) durchgeführt und die

Ergebnisse nachfolgend intensiv besprochen. In den übrigen 27 Legehennenbetrieben bestand

keine Möglichkeit, Proben direkt aus dem Caecum zu gewinnen.

In jedem Betrieb wurde ein Datenerfassungsbogen (siehe Anhang 9.1 Datenerfassungsbogen)

ausgefüllt, in dem Informationen über die Tiere und den Betrieb allgemein festgehalten wurden.

Im Vorfeld der Probensammlung wurden markante epidemiologische und prädisponierende

Fakten der AIS zusammengetragen und auf Grundlage dieser Kenntnisse dann der

Datenerfassungsbogen erstellt. Beispielsweise wurden das Alter der Hennen, Probleme in der

jeweiligen Legeperiode, Größe des Betriebes sowie gegebenenfalls eine Schadnagerproblematik

dokumentiert. Eine Übersicht dieser Informationen ist in Tabelle 5 (Datenerfassung zu

Betriebsparametern) dargestellt. Detaillierte Informationen bezüglich der zu dem Zeitpunkt

aktuellen Legeleistung der beprobten Betriebe konnten nicht erlangt werden.

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Tabelle 5: Datenerfassung zu Betriebsparametern

Betriebskennung/ Postleitzahl

Bestands-größe

Betriebs-form

Haltungs-form

Rasse

Alter Tiere in LW

Einstreu

Fütterung

Schadnager

Aktuelle Behandlung mit ABK/ APK

Sonstige Bemerkungen

N1/ 26188 225 L O LB 26 Hb A BiK keine keine

N2/ 26670 225 GA*R O LB,DS 41 St, Di K BiK keine keine

N3/ 26871 2700 L O LB 59 St, Sc A BeF keine keine

N4/ 29352 7000 GA*R,mH,P O DS 43 St, Sa K BiK keine keine

N5/ 26169 1200 GA*R,S B LB 70 M A BeF keine keine



N8/ 26871 15000 GS O SN 56 We, Sc A BeF keine keine

N9/ 26871 15000 GS O SN 56 We, Sc A BeF keine keine

N10/ 26676 70000 L B LB 77 We A BeF keine keine

N11/ 26676 70000 L B LB 77 We A BeF keine keine



N14/ 26892 24000 L F LB 28 Sc K BeF keine keine

N15/ 26892 24000 L F LB 28 Sc K BeF keine keine

N16/ 26871 3000 L F LB 74 St, Sc K BiK keine keine

N17/ 26871 3000 L F LB 74 St, Sc K BiK keine keine

T1/ 99423 61239 L B LSL 75 St, Sc A BeF keine keine

T2/ 99423 15940 L O LB 71 St, Sc A, K BeF Keine keine

T3/ 07751 1200 GF F LB 68 C A BiK keine keine

T4/ 07973 16000 L F LB 49 Hb A BeF keine keine

T5/ 37339 15000 L B LB 76 St A BeF keine keine

T6/ 37339 15000 L B LB 76 St A BeF keine keine

T7/ 06268 9200 L F LB 63 St K BeF keine keine

T8/ 06268 9200 L F LB 63 St K BeF keine Keine T9/ 06268 10200 L B LSL 63 St K BeF keine keine

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Betriebskennung/ Postleitzahl

Bestands-größe

Betriebs-form

Haltungs-form

Rasse

Alter Tiere in LW

Einstreu

Fütterung

Schadnager

Aktuelle Behandlung mit ABK/ APK

Sonstige Bemerkungen

J1/ 14822 56 H F RI 80 St, Sa K Bik keine keine

W1/ 39291 21000 L B RO 51 St A BeF keine keine



W4/ 39291 21000 L B RO 40 C A BeF keine keine

W5/ 39291 28000 L B RO 55 C A Bef keine keine

Betriebsform: L = reiner Legehennenbetrieb, GF = Geflügelhaltungsbetrieb mit verschiedenen Arten (*gibt die Arten an: Lh = Legehennen, W =

Wassergeflügel), GS = landwirtschaftlicher Betrieb mit Geflügel und Schweinen; GA = landwirtschaftlicher Betrieb mit mehreren Tierarten

(*gibt die Tierarten an: R = Rind, mH = Masthähnchen, P = Pferde, S = Schweine), H = Hobbyhaltung

Haltungsform: B = Bodenhaltung, F = Freilandhaltung, O = ökologische Haltung

Rasse: LSL = Lohmann Selected Leghorn , LB = Lohmann Brown, DS = Domaine Silver, SN = Super Nick, RO = Ross, RI = Rebhuhnartige Italiener

Legeleistung: Ø = angegebene Leistung ist normal

Einstreu: St = Stroh; Sc = Softcell, C = Cellulosegranulat, Hb = Hobelspäne, Di = Dinkelspelzen, Sa = Sand, M = Maispellets, We = Weichholzspäne,

Fütterung: A = Alleinfutter, K = kombinierte Fütterung

Schadnager: BeF = Bekämpfung durch externe Firma in regelmäßigen Intervallen, BiK = Bekämpfung wird intern mit Köderboxen durchgeführt, SP =

Schadnagerproblematik (*gibt an, welche Schadnager vorhanden sind)

Aktuelle Behandlung mit ABK = Antibiotika oder APK = Antiparasitika

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Als Transportmedium wurden Tupfer in Amiesmedium mit Kohlezusatz (Heinz Herenz Medical

Bedarf, Hamburg) verwendet. Jede Henne wurde von der vor Ort betreuenden Person gefangen

und danach zur Tupferentnahme gehalten. Der Tupfer wurde vorsichtig in das Lumen der Kloake

eingeführt und in kreisförmigen Bewegungen mehrmals über die Schleimhaut geführt, so dass

ausreichend sichtbares Probenmaterial anhaftete. Bei den Caecumabstrichen wurden die gleichen

Tupfer verwendet. Der Untersucher für die Wurmkontrollen eröffnete mit sterilem Besteck den

gesamten Darm. Dann wurde der Tupfer direkt auf der Caecumschleimhaut angesetzt und mit

Probenmaterial bestückt. Alle Tupfer wurden in einer gekühlten Styroporbox innerhalb von 6

Stunden nach der Entnahme ins Institut gebracht und dort weiterverarbeitet. Ende März 2016

konnten wir je 9 Legehennenbetriebe pro Haltungsform, durch kloakale Tupfer beprobt, sowie 5

Betriebe in Bodenhaltung mit caecalen Tupferproben und Gewebeproben vorweisen. Keiner der

Betriebe hatte in den erhobenen Daten Probleme angegeben. Jeder Betrieb war mit seiner

Leistung zufrieden. Zum Zeitpunkt der Probennahme waren die Tiere weder krank noch standen

sie unter Behandlung mit Medikamenten.

In mehreren Veröffentlichungen wurde bereits geschrieben, dass die Prävalenz von Brachyspiren

sich mit dem Alter der Tiere erhöht. Daher war der ursprüngliche Leitgedanke in dieser Arbeit,

möglichst Legehennen in hohem Alter zu beproben. Außerdem war für die Vergleichbarkeit

angestrebt, die Variation bezüglich der Altersklassen in den teilnehmenden Betrieben gering zu

halten. Wie bereits erwähnt, konnten nur wenige Freiwillige ausgemacht werden, so dass am Ende

vorrangig das Ziel verfolgt wurde, die Haltungsformen äquivalent vertreten zu haben. Daher ergab

sich einerseits in Bezug auf die Herdengrößen sowie andererseits das Alter der Tiere betreffend

eine weite Spanne. Die Betriebsgrößen reichten von 225 bis 70.000 Hennen. Im Durchschnitt

bedeutete dies eine Größe von Ø 16443 Tieren mit einer Standardabweichung (SD) von 18.921.

Die beprobten Legehennen befanden sich im Alter von 25 bis 77 Lebenswochen (LW), was im

Durchschnitt ein Alter von 54,6 Lebenswochen ergab.

Das durchschnittliche Alter, bezogen auf die einzelnen Haltungsformen, stellt sich wie folgt dar:

Bodenhaltung 58,4 Lebenswochen, Ökologische Haltung 44,6 Lebenswochen sowie in der

Freilandhaltung 58,5 Lebenswochen. Alle Teilnehmer, bis auf einen großen Hobbyhalter in der

Freilandhaltung, waren kommerzielle Geflügelhalter. Die vorherrschend gehaltene Rasse war

Lohmann braun und stellte mit 20,5/32 Betrieben (ein Betrieb hatte zur Hälfte Lohmann braun

sowie Domaine Silver eingestallt) den größten Anteil dar. Zwei Betriebe mit Lohmann Selected

Leghorn waren vertreten und weitere 1,5 Betriebe mit Domaine Silver (eine Hälfte bestand aus

Lohmann braun), 2 Betriebe mit Herden der Rasse Super Nick, 5 Herden der Rasse Ross und der

Hobbyhalter zählte auf rebhuhnartige Italiener als Eierlieferant.

Die Art der Einstreu zeigte auf der einen Seite zwar eine große Vielfalt an verwendeten

Materialien, dennoch verwendete die Mehrheit Stroh sowie Softcell oder auch eine Kombination

dieser beiden, um den Tieren einen angenehmen Lebensraum zu verschaffen. Lediglich 4 Betriebe

gaben Weichholzspäne als Einstreu an, dahinter in der Häufigkeit folgend: 3 Farmen mit

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Cellulosegranulat sowie Maispellets und weiter vereinzelt wurden Hobelspäne, Dinkelspelzen und

Sand vermerkt.

In der Fütterung wurde zwischen der Gabe von Alleinfutter oder einer kombinierten Fütterung

unterschieden. Die Informationen fielen in diesem Punkt leider dürftig aus, da kaum einer der

Teilnehmer genauere Details über die Zusammensetzung freigeben wollte. Wir konnten schließlich

vermerken, dass ein Geflügelhalter sich beider Alternativen bediente, also sowohl ein Alleinfutter

als auch eine Art der kombinierten Fütterung beanspruchte. 21 Herden wurden mit Alleinfutter

versorgt und 10 Betriebe verfolgten das Prinzip einer kombinierten Fütterung. Die Mehrheit der

Verfechter der Gabe von Alleinfutter fiel auf die Betriebe in Bodenhaltung mit n=15 Betrieben.

Lediglich 4 Biobetriebe und 2 Freilandhalter fütterten ebenfalls ein Alleinfutter. Die in Freiland

haltenden Betriebe setzten in der Mehrzahl (n=7) eine kombinierte Fütterung um. Weiterhin

verfolgten auch 2 ökologische Haltungen und 1 Betrieb in Bodenhaltung dieses Prinzip.

3.2 Kulturelle Untersuchung auf aviäre Brachyspiren

Alle Proben wurden mittels der sogenannten Grabentechnik auf Tryptikase-Soja-Agar (TSA)

kultiviert. Dieser Nährboden wurde nach DÜNSER et al. (1997) modifiziert und enthält neben 10

Prozent (%) Rinderblut eine Supplementierung von drei Antibiotikazusätzen in den finalen

Konzentrationen: Colistin 6,25 mikrogramm pro milliliter (µg/ml), Rifampicin 12,5 µg/ml und

Spectinomycin 200 µg/ml. In diesen Selektivagar, im Folgenden als AIS-TSA bezeichnet, wurden

mit einem sterilen Glasstab mäanderförmig unter leichtem Druck Mikrogräben erzeugt und dann

quer zu diesen Gräben das Probenmaterial ausgestrichen. Diese Technik ist in Abbildung 1

(Schematische Darstellung der Grabentechnik) und Abbildung 2 (Originaldarstellung der

Grabentechnik) dargestellt. Die anaerobe Bebrütung erfolgte bei 37 Grad Celsius (°C) für vorerst 7

Tage. Mit Hilfe eines Anaerobiertopfes 2,5 Liter (l) (Merck, Darmstadt) sowie einem

Anaerogenbeutel für 2,5 l (Oxoid, Wesel) wurde das entsprechende Milieu erzeugt. Jedem Topf

wurde zusätzlich ein Indikatorstreifen (Oxoid, Wesel) hinzugefügt, damit über den gesamten

Zeitraum der Bebrütung eine optische Kontrolle des anaeroben Milieus gewährleistet werden

konnte. Der Indikatorstreifen weist in Kontakt mit Sauerstoff eine rosa Färbung auf. Innerhalb

ungefähr einer Stunde entfärbt sich der Streifen unter Abwesenheit von Sauerstoff zu weiß. Nach

jeder Bearbeitung oder auch Kontrolle der Proben wurden die Anaerobiertöpfe schnellstmöglich

zurück in den Brutschrank gestellt und nach einer Stunde auf ein anaerobes Milieu, optisch also

auf einen weißen Indikatorstreifen, überprüft.

Nach sieben Tagen fand eine erste Begutachtung der Kulturen statt, bei der auf das

charakteristische, schwärmende Wachstum der Brachyspiren geachtet wurde. Im positiven Fall

wurden die Kolonien dann auf Columbia Blutagar (Oxoid, Wesel) durch einen

Verdünnungsausstrich subkultiviert und erneut für 7 Tage unter den angegebenen Bedingungen

bebrütet. Im negativen Fall wurde die erste Bebrütung auf dem AIS-TSA-Selektivnährboden um

weitere 5 Tage verlängert.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der Grabentechnik

Abbildung 2: Originaldarstellung der Grabentechnik

Abbildung 1: Schematische Darstellung der

Grabentechnik; Darstellung des Tryptikase-

Soja-Agars, mit den erzeugten Mikrogräben

in der Oberfläche (mäanderförmig

gleichmäßig auf der Oberfläche des

Mediums verteilt) sowie dem zentralen

Impfstrich des Probenmaterials.

Abbildung 2: Originaldarstellung der

Grabentechnik; gezeigt ist eine beimpfte

Agarplatte des AIS-TSA nach 7 Tagen Bebrütung

bei 37 °C

Bei erneut negativem Befund nach 5 Tagen wurden diese Proben als negativ eingestuft und

verworfen. Bei jedem Schritt wurden Gramfärbungen zur mikroskopischen Kontrolle durchgeführt.

In den weiteren Schritten wurden die brachyspirenverdächtigen Kulturen makro- und

mikroskopisch auf das Vorhandensein von Reinkulturen oder auch Mischkulturen geprüft. Im Falle

von Mischkulturen wurde die Subkultivierung auf Columbia Blutagar so lange wiederholt, bis eine

Reinkultur vorlag. Eine Reinkultur war dann erreicht, wenn nur Bakterien der Gattung Brachyspira

auf dem Columbia Blutagar vorhanden waren. Zur weiteren Bearbeitung der Brachyspirenstämme

wurde Koloniematerial der jeweiligen Reinkultur eines Isolates von dem Nährboden

abgeschwemmt. Dafür wurde 2,0 ml sterile Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) auf den

Nährboden gegeben und die Flüssigkeit vorsichtig mit einem sterilen Einmal-Drigalskispatel in L-

Form (neolab, Deutschland) verteilt. Unter leichtem Druck mit dem Spatel wurde Koloniematerial

von dem Nährboden abgelöst, so dass sich eine trübe Bakteriensuspension aus Brachyspira sp.

und PBS bildete.

3.3 Kryokonservierung der Brachyspirenisolate

Alle brachyspirentypischen Isolate und Referenzstämme wurden kryokonserviert. Dafür wurde

jede Reinkultur, wie unter 3.2 beschrieben, mit 2,0 ml Phosphat gepufferter Salzlösung von der

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Platte abgespült. Im Anschluss wurden 400 µl dieser Bakteriensuspension in 10 % Glycerinstocks

gefüllt, in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und anschließend bei -80 °C als

Bakterienstammsammlung gelagert. Die Glycerinstocks waren mit 10 % Kälberserum und brain

heart infusion (Oxoid, Wesel) supplementiert.

3.4 Verwendete Referenzstämme

Tabelle 6: In dieser Arbeit verwendete Referenzstämme der Gattung Brachyspira

Isolat Spezies Herkunfts-tier

Herkunfts-land

GenBank accession number

Referenz

AN1268/3/04 B. alvinipulli Huhn Schweden EF164989 Jansson et al. 2008

5369-1x/12 B. hampsonii Schwein Deutschland Mirajkar et al. 2015

3824-15x/14 B. hampsonii Schwein Deutschland Mirajkar et al. 2015

404/06* B. hyo-

dysenteriae

Schwein Deutschland Provided by Rohde

C336 B. innocens Schwein Schweden U14919 Fellström et al. 1995

AN26/93 B. intermedia Schwein Schweden U14916 Fellström et al. 1995

863-1x/06* B. intermedia Schwein Deutschland Provided by Rohde

C301 B. murdochii Schwein Schweden EF517545 Fellström et al. 1995

102/06* B. pilosicoli Schwein Deutschland Provided by Rohde

AN4859/03 „B. suanatina“ Schwein Schweden DQ473575 Rasbäck et al. 2007

*Diese Stämme wurden vom Institut für Mikrobiologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule

Hannover, Deutschland, isoliert und mittels nox-PCR und Restriktionsfragment-

Längenpolymorphismus differenziert (ROHDE et al. 2002, 2012, 2013).

3.5 nox- Sequenzierung

Zur Gewinnung von Brachyspiren-DNA wurde jede Reinkultur mit 1 ml PBS von der Platte gespült.

Mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen GmbH, Hilden) wurde die DNA isoliert. Die DNA-

Extraktion erfolgte nach den Angaben des Herstellers mit einer empfohlenen Vorbehandlung für

gram-negative Bakterien. Die nox-PCR wurde nach ROHDE et al. (2002; 2012; 2013) durchgeführt

(Bnoxf TAG C(CT)TGCGGTAT(CT)GC(AT)CTTTGG und Bnoxr CTTCAGACCA(CT)CCAGTAGAAGCC). Das

PCR- Programm setzt sich zusammen aus: Einer initialen Denaturatierung bei 94 °C für 3 Minuten

(Min.), 30 Zyklen mit je einer Denaturierung bei 94 °C für 30 Sekunden (Sek.), Anlagern der Primer

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(annealing) bei 59 °C für 40 Sek. sowie einer Elongation bei 72 °C für 54 Sek. Final schloss sich

noch die Elongation für 10 Min. bei 72 °C an mit abschließender Abkühlung auf 8 °C. Zehn µl der

PCR-Reaktion wurden auf ein 1-prozentiges Agarose-Gel zur elektrophoretischen Auftrennung der

DNA geladen, welche mit Roti®-GelStain (Carl Roth, Karlsruhe) markiert wurde. Die

Gelelektrophorese lief bei 80 Volt (V), 40 Milliampere (mA) für 1 Stunde (Std) 10 Min. Nach Ablauf

dieser Zeit folgte eine visuelle Kontrolle der PCR-Produkte. Im positiven Fall, also einer sichtbaren

Bande bei 939 Basenpaaren (bp) in dem Gel, wurde die restliche DNA, mindestens aber 35 µl des

Amplifikates, mit dem innuPREPDOUBLEpure Kit (Analytik Jena, Jena) aufgereinigt. Die

Arbeitsschritte folgten streng den Angaben des Herstellers für das entsprechende Protokoll.

Für die Sequenzierung nach Sanger (SANGER & COULSON 1975) wurden die aufgereinigten

Produkte nach Vorgaben des durchführenden Labors (Seqlab, Göttingen) vorbereitet. Je Amplifikat

wurden zweimal 12 µl (nach Vorgabe des durchführenden Labors: 18 nanogramme (ng) per 100

bases PCR product in 12 µl) in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß (Eppendorf, Hamburg) pipettiert. Auf das

eine wurden dann 3 µl des forward-Primers (TAG C(CT)TGCGGTAT(CT)GC(AT)CTTTGG

(Konzentration: 10 Mikromol (µM)) und auf das andere 3 µl des reverse-Primers

(CTTCAGACCA(CT)CCAGTAGAAGCC (Konzentration: 10 µM) gegeben (Primer nach ROHDE et al.

2002). Die Ergebnisse der Sequenzierung bestanden für jede Reaktion einerseits aus einer FASTA-

Datei, ein textbasiertes Format zur Darstellung und Speicherung der Nukleinsäuresequenz oder

Proteinsequenz in der Bioinformatik. Desweiteren lag für jede Reaktion eine zweite Datei mit den

Intensitätskurven der Basensequenz vor, welche durch den Einsatz mit Fluoreszenz-Farbstoffen

markierten Didesoxynukleosidtriphosphat zustande kamen (Abbildung 3: Ausschnitt einer

Intensitätskurve: Farbliche Darstellung der unterschiedlichen Basen in der jeweiligen Intensität).

Abbildung 3: Ausschnitt einer Intensitätskurve: Farbliche Darstellung der unterschiedlichen Basen in der jeweiligen Intensität; zu sehen ist der Ausschnitt von Nukletid 467 bis knapp 500 der erhaltenen Sequenz vor der Bearbeitung und Korrektur; Grün steht für Adenin, Blau für Cytosin, Rot für Thymin, Schwarz für Guanin.

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Jede einzelne Intensitätskurve wurde auf ihre Qualität visuell kontrolliert. Wichtig war, dass die

Peaks deutlich voneinander abgesetzt waren. Am 5`- und 3`-Ende der Sequenz wurde der Beginn

beziehungsweise das Ende einer hochwertigen Sequenzierung anhand dieser Intensitätskurven

bestimmt, um die unzuverlässigen Sequenzen in diesen Abschnitten in der dazugehörigen FASTA-

Datei löschen zu können. Im Verlauf der Arbeit hat sich herausgestellt, dass mit den gewählten

Primern in den meisten Isolaten Nukleotid 512 bis 926 des nox-Genes zufriedenstellend

sequenziert werden konnte (Nukleotid 1 bezieht sich auf das A in dem Startkodon des nox-Gens

von B. pilosicoli mit der Accession Nummer CP003490). Bei zweifelhaften Sequenzabschnitten in

der Zielsequenz wurde die Sequenzierung wie beschrieben wiederholt oder nach wiederholten

Problemen mit den Primern 676-695nox_rev (TTAACTCTGTCATCACCTTC) und 805-826nox_for

(GGTGCTATTGTAGTTGATACTA) sequenziert. Nach Abschluss der Sequenzierungen wurde eine

NCBI-BLAST-Analyse mit dem Abschnitt der Nukleotide von 512 bis 926

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) durchgeführt. Das Ergebnis mit dem höchsten Score

wurde als Speziesdiagnose angesehen. Eine minimale Übereinstimmung von 92 % wurde als

untere Grenze festgelegt.

3.6 MALDI-TOF-MS

Für die massenspektrometrische Untersuchung wurde das Mikroflex System (MS) (Bruker

Daltonics, Deutschland) benutzt. Dafür wurde Koloniematerial der Reinkulturen von Columbia

Blutagar, wie unter 3.2 beschrieben, abgeschwemmt. 400 µl jeder Probe wurden in ein

Reaktionsgefäß gegeben und 900 µl Ethanol hinzugefügt. Es folgte eine Zentrifugation bei 14.560 g

für 2 Min. Danach wurde der Überstand verworfen. Das verbleibende Pellet im Reaktionsgefäß

trocknete für mindestens 5 Min. bei Raumtemperatur. Im Anschluss wurden 40 µl 50%iges

Acetonitril (Bruker Daltonics, Deutschland) auf das Pellet gegeben und sorgfältig resuspendiert.

Nach Zugabe von 40 µl 70%iger Ameisensäure folgte eine erneute Zentrifugation für 2 Min. bei

14.560 g. Letztendlich konnte der Probenauftrag auf eine Mikrospotplatte 96 (main spectrum

profiles (MSP) 96 polished steel target plate) erfolgen. Nach Zentrifugation der gewonnenen

Lösung wurde 1 μl des Überstandes je Isolat 12 Mal in die dafür vorgesehenen Spots aufgetragen.

Direkt nach der Lufttrocknung des Probenmaterials, wurde jeder Spot mit 1 μl Matrix (Bruker

Daltonics, Deutschland) bedeckt. Bei der verwendeten Matrix handelt es sich um eine gesättigte

Lösung von α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (HCCA), einem Derivat der Zimtsäure. Sie wurde immer

frisch hergestellt, indem die HCCA in 47,5 % Wasser (Bioscience), 50 % Acetonitril und 2,5 %

Trifluoressigsäure gelöst wurde. Erst nach völliger Trocknung der Matrix konnte die Messung im

MALDI-TOF-MS durchgeführt werden.

Die kommerziell erhältliche Datenbank des Herstellers beinhaltet 4 Brachyspirenarten mit

insgesamt 11 Einträgen: Brachyspira innocens AN3706_90 Animal Health and Veterinary

Laboratories Agency (AHVLA, New Haw, Surrey), Brachyspira innocens C109 AHVLA, Brachyspira

intermedia AN1707_96 AHVLA, Brachyspira intermedia AN519_97 AHVLA, Brachyspira intermedia

AN621_97 AHVLA, Brachyspira intermedia AN885_94 AHVLA, Brachyspira murdochii 12563T

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Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Braunschweig,

Deutschland), Brachyspira pilosicoli AN652_02 AHVLA, Brachyspira pilosicoli C162 AHVLA,

Brachyspira pilosicoli GD82 De Gezondheidsdienst voor Dieren (GDD, Deventer; Netherlands) und

Brachyspira pilosicoli GD83 GDD.

Für eine Differenzierung aviärer Brachyspirenisolate bis zur Art war es notwendig, diese

Datenbank mit Spektren von Referenzstämmen (Tabelle 6: Verwendete Referenzstämme) und

eigenen Isolaten zu erweitern. Dazu wurde von jedem gemessenen Stamm ein Main Spectra

Profile (MSP) erstellt. Nach jeder Messung der 12 Spots eines Isolates mit dem MALDI-TOF-MS

wurden die Spektren visuell mit dem Softwareprogramm Flex analysis von Bruker kontrolliert und

eingestuft. Es wurde überprüft, ob die Spektren in einem vergleichbaren Bereich der

Maximalintensitäten liegen, ob Störpeaks auftreten oder gegebenenfalls die Peaks ein

ausgeprägtes Tailing zeigen. Als Störpeaks werden einzelne Peaks beziehungsweise Peakgruppen

interpretiert, wenn diese bei allen anderen Einzelspektren des Isolates nicht vorlagen. Wenn

deutliche Hinweise auf eine schlechte Spektrumqualität vorlagen, wurden diese Spektren gelöscht.

Für jedes MSP wurden aber mindestens 6 Einzelspektren verwendet. Die Anlage der MSPs erfolgte

mit der Software MBT Compass Explorer. Die bereits auf ihre Qualität geprüften Spektren wurden

durch die vorhandene Funktion MSP Creation in einer neu erstellten Datei gespeichert. Die

Speziesdiagnose und der darauf basierende Eintrag in die erweiterte Datenbank erfolgte aufgrund

des Ergebnisses der nox-Sequenzierung sowie auf dem Ergebnis der vorangegangenen

massenspektrometrischen Messung. Für die Spezies „B. pulli“ war kein Referenzstamm erhältlich

und auch die Bruker-Datenbank führte diesbezüglich keinen Eintrag. Die Einträge für „B. pulli“

basierten somit ausschließlich auf der nox-Sequenzierung.

3.7 Neue Multiplex-PCRs für aviäre Brachyspiren

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine neue Multiplex-PCR (MP-PCR) für die Differenzierung von

Brachyspiren entwickelt. Als Grundlage dienten biochemische Eigenschaften, die zur Orientierung

genutzt wurden. Das Tryptophanase-Gen (tnaA) kodiert das Enzym, welches für die Indol-Reaktion

verantwortlich ist. Dieses Enzym ist bei den Arten B. intermedia, „B. suanatina“ und B.

hyodysenteriae nachgewiesen worden (Phillips et al. 2010). Für den Nachweis des tnaA wurde das

Oligonukleotidprimerpaar tnaAfor (GTAAAATGTCTTAATATAGGAGGCT) und tnaArev

(GACATGCTTTATTTGTAGATGCTAA) entworfen (Gen BHWA1_01919 im Genom von B.

hyodysenteriae CP001357.1), um ein 325 Basenpaar (bp) großes Amplikon von tnaA zu erhalten.

Weiterhin sollte das Gen für die Hippurathydrolase in der MP-PCR nachgewiesen werden. Die

Hippurathydrolyse ist eine charakteristische Reaktion der Arten B. pilosicoli und B. alvinipulli

(Calderaro et al. 2001; Jansson et al. 2004; Nemes et al. 2006). Mit Hilfe des Basic Local Alignment

Search Tool (BLAST) konnte im publizierten Genom von B. pilosicoli (CP002873.1) (LIN et al. 2013)

ein Gen (36 % Identities beziehungsweise 52 % Positives), mit Ähnlichkeiten zum Gen der

Hippurathydrolase von Campylobacter jejuni (Steele et al. 2006) identifiziert werden, das analog

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der Nomenklatur für Campylobacter jejuni in dieser Arbeit als abgB-Gen bezeichnet wurde. In

Campylobacter jejuni kodiert abgB für eine p-Aminobenzoyl-glutamathydrolase. Zum Nachweis

des abgB-Gens der Brachyspiren wurde das Primerpaar abgBfor (GGTAATATGCATGCTTGCGGAC)

und abgBrev (TCCAGGCATTTTATGCTGATATTC) ausgewählt, basierend auf den abgB-Genen von B.

alvinipulli und B. pilosicoli (WP_028330113.1 für B. alvinipulli und CP002873.1 für B. pilosicoli). Das

zu erwartende abgB-Amplifikat sollte eine Größe von 744 bp besitzen.

In dieser neuen MP-PCR sollten das nox-Gen, das tnaA- und das abgB-Gen detektiert werden.

Hierzu wurden zu 48 µl Mastermix 2 µl DNA (ca. 50 ng) hinzugefügt. Der Mastermix führte zu

folgenden finalen Konzentrationen: 2 µM je Primer (abgBfor (GGTAATATGCATGCTTGCGGAC) und

abgBrev (TCCAGGCATTTTATGCTGATATTC), 1,5 mMMgCl2 (Invitrogen, Karlsruhe), 1 x PCR-Puffer

(-MgCl2) (Invitrogen, Karlsruhe), 0,2 millimol (mM) von jedem Desoxynukleosidtriphosphat

(Invitrogen, Karlsruhe) sowie 1 Unit (U) Taq Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe). Nach initialer

Denaturierung bei 94 °C für 3 Min. folgten 30 Zyklen mit je einer Denaturierung bei 94 °C für 30

Sek., Annealing bei 55 °C für 30 Sek. und Elongation bei 72 °C für 1 Min. 15 Sek. Die Amplifikate

waren nach einer finalen Elongation bei 72 °C für 5 Min. fertig. Die Visualisierung erfolgte wie

bereits oben, in Kapitel 3.5 für die nox-PCR beschrieben.

3.8 Statistische Analyse

Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit ermittelten Ergebnisse, wurden zur Überprüfung der

Aussagekraft mit statistischen Mitteln überprüft. Dabei fand Microsoft Excel 2007 Verwendung.

Für die in Tabelle 9 beschriebenen Vergleichswerte der Logscores für einzelne Brachyspirenspezies

wurde zur Beurteilung der Streuungsweite um den arithmetischen Mittelwert für die einzelnen

Betriebe die Standardabweichung ermittelt. Diese Werte wurden jeweils für die Bruker- und die

erweiterte Datenbank bestimmt.

Weiterhin wurde die Prävalenz der Brachyspiren in Abhängigkeit von Faktoren wie Haltungsform,

Größe der Betriebe und Alter der Tiere untersucht.

Da in diesem Zusammenhang verschiedene Gruppen mit teilweise unterschiedlichen

Probenumfängen vergleichend untersucht wurden, kam die ANOVA-Varianzanalyse zur Prüfung

der Aussagekraft der Ergebnisse zum Einsatz. Unterschiede mit einem Signifikanzwert (p-Wert)

kleiner als 0,05 wurden als signifikant eingestuft.

Die im Anhang befindliche Übersicht zur Normalverteilung der Isolate, vergleicht die gemittelten

Logscores von Bruker- und erweiterter Datenbank.

Hierfür wurde, wenn mehrere Isolate verfügbar waren, neben der Standardabweichung das 98 % -

Konfidenzintervall bestimmt. So wurde die Aussagekraft der gemittelten Logscores verifiziert.

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4. Ergebnisse

4.1 Optimierung der kulturellen Untersuchung von Kotproben von Legehennen auf Brachyspiren

In Vorversuchen wurden die kulturellen Bedingungen für den Nachweis der Brachyspiren aus

Kotproben von Legehennen evaluiert. Ausgegangen wurde von dem genannten

Selektivnährboden, dem Tryptikase-Soja-Agar mit 5 - 10 % Schaf- oder Rinderblut und einer

Supplementierung von verschiedenen Antibiotikazusätzen wie Spectinomycin, Rifampicin,

Spiramycin, Vancomycin, Polymyxin (JENKINSON & WINGAR 1981; DÜNSER et al. 1997) und

Bebrütungstemperaturen, wie sie in der porzinen Brachyspirendiagnostik eingesetzt werden. Die

zu dem Zeitpunkt bereits verfügbaren Referenzstämme (C301 B. murdochii, AN26/93 B.

intermedia, 102/06 B. pilosicoli, 404/06 B. hyodysenteriae) wurden zur Evaluierung der

Bebrütungstemperatur parallel bei 37 °C und 42 °C auf Columbia-Blut-Agar bebrütet. Zur

Evaluierung der Selektivnährböden wurden einige Proben von natürlich infizierten Hühnervögeln

aus der Klinik für Vögel und Reptilien auf TSA mit unterschiedlicher Supplementierung

antimikrobieller Substanzen kultiviert. Diese Proben wurden ebenfalls vergleichend bei 37 °C

sowie 42 °C bebrütet. Es zeigte sich sowohl bei den Referenzstämmen als auch bei den genannten

Proben, dass eine Bebrütungstemperatur von 37 °C gegenüber einer Temperatur von 42 °C mit

einem besseren Wachstum der Brachyspiren einherging. Weiterhin stellte sich bei diesen Proben

heraus, dass der in der Diagnostik der Dysenterie des Schweines übliche Zusatz 5 verschiedener

Antibiotika (JENKINSON & WINGAR 1981; DÜNSER et al. 1997) in den folgenden Konzentrationen

das Wachstum der Brachyspiren in der Kultur der Vogelkotproben sehr stark hemmt (bei 10 %

Rinderblut): Vancomycin 6,25 Mikrogramm pro Milliliter (µg/ ml), Colistin 6,25 µg/ ml, Rifampicin

12,5 µg/ ml, Spiramycin25 µg/ ml und Spectinomycin 200 µg/ ml. Daher wurde eine

Supplementierung mit Colistin 6,25µg/ ml, Rifampicin 12,5 µg/ ml und Spectinomycin 200 µg/ ml

sowie 10 % Rinderblut gewählt. Bei dieser Zusammensetzung des Nährbodens wurde die

Begleitflora angemessen gehemmt und gleichzeitig schwärmten die Brachyspiren weiter in die

Peripherie als bei der Verwendung von 5 Antibiotikazusätzen. Bei einer Reduktion der Antibiotika

im Selektivnährboden wurden die gewünschten Ergebnisse erzielt: Die Begleitflora wurde

ausreichend gehemmt und gleichzeitig zeigten die Brachyspiren noch zufriedenstellendes

Wachstum und Schwärmverhalten.

Die bei dem Anlegen einer Kultur angewendete Grabentechnik sollte den Zweck erfüllen, dass die

Brachyspiren aufgrund ihrer Motilität vom zentralen Impfstrich aus den Mikrogräben in die

Peripherie ausschwärmen. Diese Eigenschaft ermöglicht es dem Untersucher bei der

Subkultivierung schneller eine Reinkultur zu gewinnen. Dafür ist es zielführend, wenn die

Brachyspiren bis in die Peripherie der Mikrogräben ausschwärmen. Es zeigte sich ein besseres

Auswachsen der Brachyspiren aus der Mischkultur der Kotproben bei einer Bebrütungstemperatur

von 37 °C gegenüber einer Temperatur von 42 °C.

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Unter diesen Bedingungen konnten in 45 der 191 gesammelten Proben von Legehennen (Caecal-

oder Kloakaltupfer) Brachyspiren kulturell nachgewiesen und mittels PCR-basierter Methoden

sowie der MALDI-TOF-MS-Analyse differenziert werden. Insbesondere konnten aus 23 der 29

caecalen Tupferproben Brachyspirenisolate gewonnen werden. Von den 162 kloakalen Tupfern

waren 22 positiv in dem kulturellen Nachweisverfahren für Brachyspiren. In nachfolgender Tabelle

7 (Prävalenz von Brachyspira spp. in klinisch unauffälligen Herden in Bezug auf die verschiedenen

Haltungsformen) ist eine Übersicht dargestellt, in der die Verteilung der gewonnenen Isolate auf

die Haltungsformen gezeigt wird.

Tabelle 7: Prävalenz von Brachyspira spp. in klinisch unauffälligen Herden in Bezug auf die

verschiedenen Haltungsformen

* Es handelt sich um Broilerelterntiere, welche im Rahmen von regelmäßigen Wurmkontrollen in

den Betrieben getötet werden.

Für die Analyse im Massenspektrometer war initial eine Flüssigkultur vorgesehen. Allerdings

konnte in den Vorversuchen im Gegensatz zu publizierten Ergebnissen (CALDERARO et al. 2001;

2013) kein Wachstum im Brain Heart Infusion (BHI) -Medium beobachtet werden, so dass die

Kolonien von der Platte abgespült werden mussten (PHILLIPS et al. 2006).

Die in dieser Arbeit gewonnenen Brachyspirenisolate haben das Ausschwärmen in den

Mikrogräben in der initialen Kultur auf dem Selektivnährboden in unterschiedlicher Ausprägung

gezeigt. Die Anzahl der notwendigen Subkultivierungen bis zur Gewinnung einer Reinkultur

variierte in Abhängigkeit dieses Schwärmverhaltens von ein bis fünf Mal. Für die

massenspektrometrische Untersuchung wurden die Reinkulturen der Brachyspiren auf Columbia-

Blut-Agar kultiviert (ohne Antibiotika Supplementierung).

4.2 Befunde aus der pathohistologischen Untersuchung

In der histologischen Untersuchung der 29 Broilerelterntiere wurde eine Gewebeprobe aus dem

Apex Caecum in der Hämatoxylin-Eosin-Färbung begutachtet. Es konnten in 10 von 29 Fällen

Veränderungen wie geringgradig diffuse lymphoplasmazelluläre und heterophile Infiltrate

nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden Anschnitte von Heterakis gallinarum und auch Eier

Haltungssystem Anzahl der untersuchten Betriebe

Lokalisation der Tupferent- nahme

Anzahl Proben

Positive Betriebe

Anzahl der Isolate

Freilandhaltung 9 Kloake 54 3 3 Biohaltung 9 Kloake 54 4 7 Bodenhaltung 9

5 Kloake Caecum*

54 29

7 5

12 23

Total 32 191 19 45

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dieses Parasiten entdeckt. Ein weiterer Befund waren polymorphe, stäbchenförmige Bakterien,

welche in manchen Schnitten präsent waren. Die polymorphen, stäbchenförmigen Bakterien

wurden nicht weiter verfolgt oder differenziert. Hier liegt die Vermutung nahe, dass es sich um

Clostridium spp. handeln könnte. Als weitere Befunde konnten geringgradige Zottenatrophien

sowie -fusionen aufgenommen werden. Weiterhin traten auch Epithelverluste auf, wobei diese

letztgenannten Veränderungen auf autolytische Prozesse zurückgeführt werden. Die beprobten

Tiere waren bei der Entnahme der Proben bereits seit mindestens einer Stunde tot und besonders

im Darm setzen diese Prozesse unmittelbar nach dem Exitus ein. Es gab in den Gewebeschnitten

keinen histologischen Nachweis von spiralförmigen Bakterien, so dass eine in situ Assoziation

zwischen den beschriebenen Läsionen und Brachyspiren nicht festgestellt werden konnte. Nach

der erfolgreichen kulturellen Untersuchung und Differenzierung der caecalen Tupferproben der

Broilerelterntiere auf Brachyspiren stand fest, dass sich in mindestens 23 der 29 Proben

Brachyspiren befanden. In zwanzig Fällen lautete die Speziesdiagnose B. murdochii, in zwei Fällen

wurde „B. pulli“ nachgewiesen und einmal B. innocens. Da somit nach dem aktuellen Stand nur

apathogene Arten wie B. murdochii diagnostiziert wurden (TROTT & HAMPSON 1990), wurde den

nachgewiesenen Brachyspiren im Gegensatz zu den nachgewiesenen Parasiten keine Bedeutung

für die histologischen Veränderungen beigemessen.

4.3 Differenzierung der aviären Brachyspirenisolate durch die nox-Sequenzierung

Die aviären Brachyspirenisolate wurden durch drei unabhängige Methoden differenziert. Mittels

nox-Sequenzierung, durch massenspektrometrische Analyse mit dem MALDI-TOF-MS sowie einer

Genotypisierung. Alle 45 Isolate, die mikroskopisch das typische Bild gramnegativer spiralförmiger

Stäbchen zeigten, generierten ein nox-PCR-Amplifikat mit Primern, die zuvor nur für die

Untersuchung von porzinen Stämmen beschrieben wurden (ROHDE et al. 2002; 2012; 2013).

Dieses nox-PCR-Amplifikat wurde nachgeschaltet sequenziert. In 41 Fällen konnte eine Sequenz

vom Basenpaar 512 bis 926 sicher bestimmt werden (Nukleotid 1 bezieht sich auf das A in dem

Startkodon des nox-Gens von B. pilosicoli mit der Accession Nummer CP003490). Bei 4 Isolaten

(Isolate N5.1, N5.6, N10.2, W1.4) wurden nur kürzere Sequenzen geeigneter Qualität generiert.

Hier wurde sowohl die nox-PCR als auch der Prozess der Sequenzierung mehrfach wiederholt, bis

sich die Qualität und Länge des sequenzierten Abschnittes an die übrigen angenähert hatte. Für

das Isolat N5.1 konnte auch nach zahlreichen Wiederholungen keine verwertbare Sequenz

generiert werden, so dass diese Speziesdiagnose allein durch die massenspektrometrische Analyse

getroffen wurde.

Für die restlichen 44 Isolate wurde mittels BLAST-Analyse der NCBI-Datenbank eine

Speziesdiagnose erzielt. Mit dieser Methode wurden 20 Isolate als B. murdochii mit einer

100%igen Übereinstimmung identifiziert. In sechs Fällen lautete die Speziesdiagnose B. innocens,

wobei drei Isolate eine 100%ige Übereinstimmung mit den Datenbankeinträgen zeigten und die

übrigen drei Isolate zwischen 93 - 97 % lagen. Die Diagnose „B. pulli“ kam bei fünf Isolaten mit 99 -

100 % Wahrscheinlichkeit zum Vorschein. B. intermedia konnte dreimal als Spezies mit 99 %

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vermerkt werden und B. pilosicoli wurde ebenfalls dreimal zu 100 % identifiziert. Bei 7 Isolaten

konnte durch die BLAST-Analyse der NCBI-Datenbank keine Diagnose auf Spezieslevel gefunden

werden. Lediglich die Aussage Brachyspira sp. wurde in diesen 7 Fällen getroffen. Jeder einzelne

Referenzstamm aus dieser vorliegenden Arbeit (Tabelle 6: Verwendete Referenzstämme) wurde

nach dem gleichen Prinzip bearbeitet. In jedem Fall lag die Übereinstimmung mit der NCBI-

Datenbank bei 100 %. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch diese BLAST-Analyse in 34

von 44 Fällen bei den Feldisolaten eine 99%ige oder 100%ige Übereinstimmung ermittelt wurde.

Im Anhang ist eine tabellarische Auflistung aller Ergebnisse der BLAST-Analyse aufgeführt (siehe

Anhang Tabelle 9.2 Auflistung der Ergebnisse durch die durchgeführte BLAST-Analyse).

Tabelle 8: Identifikation der Isolate mit der nox-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS*

MALDI-TOF-MS**

nox- Sequenzierung***

B. pilosicoli

n = 3 B. intermedia

n = 2 B. innocens

n = 6 B. murdochii

n = 14 „B. pulli“# n = 0

B. sp.

n = 14

B. pilosicoli

n = 3 3 0 0 0 0 0

B. intermedia

n = 2 0 2 0 0 0 0

B. innocens

n = 4 0 0 2 0 0 2

B. murdochii

n = 19 0 0 1 13 0 5

„B. pulli“

n = 5 0 0 0 1 0 4

B. sp.

n = 6 0 0 3 0 0 3

*exklusiv der Isolate N5.1, N5.6, N10.2, W1.4, T1.3, T1.6 (es wurden nicht beide Methoden auf

diese Isolate angewendet).

**MALDI-TOF-MS-Differenzierung mit der kommerziell erhältlichen Datenbank, aktuell 11 Einträge

für Brachyspira sp. mit 4 verschiedenen Arten.

***nox-Sequenzierung der Nukleotide 512 bis 926 des Leserahmens des nox-Gens (CP003490)

ermittelt aus einem nox-Amplifikationsprodukt.

# kein Eintrag in der Datenbank des MALDI-TOF-MS.

41 der in dieser Arbeit bestimmten nox-Sequenzen wurden in der Genbank

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) unter den Nummern KY216077 - KY216109 und

KY196395 - KY196402 erfolgreich eingereicht. Tabelle 8 (Vergleichende Identifikation der Isolate

mit der nox-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS*) zeigt die Ergebnisse der BLAST-Analyse

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vergleichend mit den Ergebnissen der massenspektrometrischen Untersuchung (MALDI-TOF-MS-

Datenbank des Herstellers Bruker Daltonics).

4.4 Differenzierung der aviären Brachyspirenisolate durch MALDI-TOF-MS

Die massenspektrometrische Differenzierung von Krankheitserregern hat in den letzten Jahren die

Routinediagnostik revolutioniert und ist inzwischen die führende Technik geworden. In dieser

Arbeit sollte die MALDI-TOF-MS Technologie erstmalig zur Differenzierung aviärer Brachyspiren

eingesetzt werden. Daher wurden zunächst einige Vorversuche durchgeführt. Zu Beginn der Arbeit

wurde das Verfahren des direct smear angewendet. Hierbei wird direkt von dem Nährmedium

Koloniematerial auf die einzelnen Spots der Mikrospotplatte 96 (main spectrum profiles 96

polished steel target plate) aufgetragen. Die Messung durch das MALDI-TOF-MS erfolgt nun nach

Lufttrocknung der Matrix. Mit diesem Verfahren des direct smear-Auftrags konnten keine

Spektren erzielt werden. Aufgrund dieser Tatsache wurde dazu übergegangen, mit

abgeschwemmtem Kulturmaterial und der chemischen Extraktion zu arbeiten. Mit diesem

Verfahren wurden alle hier verwendeten Referenzstämme sowie die Feldisolate gemessen. Zwei

der Feldisolate (T1.3, T1.6) konnten allerdings nicht mit dem MALDI-TOF-MS gemessen werden, da

die Kulturen, bevor diese durch die Kryokonservierung in die Stammsammlung aufgenommen

werden konnten, abgestorben sind. Leider konnten auch bis zu dem unerwarteten Absterben

keine massenspektrometrischen Spektren dieser beiden Isolate erzeugt werden. Weiterhin wurde

im Vorfeld getestet, ob Material des Nährbodens, welches gegebenenfalls mit abgeschwemmt

wird, Auswirkungen auf die Messung oder die Spektren hat. Um das ausschließen zu können,

wurde ein unbeimpfter Nährboden mit der beschriebenen Technik abgespült. Diese Suspension

wurde ebenfalls mit der chemischen Extraktion bearbeitet und nachfolgend wie alle anderen

Isolate massenspektrometrisch analysiert (Abbildung 4: Auszug aus der Leermessung des

unbeimpften Nährmediums). Das Nährmedium erzeugte somit keine Signale oder Störpeaks, so

dass dies keine Auswirkungen auf die erzeugten und verwendeten Spektren der untersuchten

Isolate haben sollte.

Primär konnte jedes Isolat nur mit der kommerziell erhältlichen Datenbank der Firma Bruker nach

dem Mikroflex System (Bruker Daltonics, Deutschland) gemessen und differenziert werden. Der

Hersteller hat zur Interpretation der Ergebnisse eine Einteilung erstellt. Scores die zwischen 2,300 -

3,000 liegen, werden als höchstmögliche Speziesdiagnose angesehen. Diagnosen in diesen

Bereichen stellen also eine sichere Identifizierung dar. Der Bereich 2,000 - 2,299 wird als sichere

Gattungsdiagnose sowie glaubhafte Speziesdiagnose beschrieben. Absteigend folgt dann die

Range zwischen 1,700 - 1,999, welche noch eine glaubhafte Gattungsdiagnose beschreibt und

zuletzt Scores im Bereich von 0,000 - 1,699. Hier ist keine sichere Identifikation mehr gegeben. Der

Anhang 9.3 zeigt einen Auszug aus einem Befundbogen des MALDI-TOF-MS zur Beurteilung der

erhaltenen Ergebnisse.

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Abbildung 4: Auszug aus der Messung einer Spülprobe des unbeimpften Nährmediums als Kontrolle Abbildung 4: Auszug aus der Messung einer Spülprobe des unbeimpften Nährmediums als

Kontrolle. X-Achse: Die übliche m / z (Angabe der Massenzahlenachse und die entsprechende

numerische Skalierung von 2000 - 20.000); Y-Achse: Einheitslose absolute Intensitätseinheiten mal

10.000 (durch die Software so vorgegeben).

In 33 von 53 Isolaten, also in 63 % der Fälle, wurde mit der kommerziellen Bruker Datenbank eine

Speziesdiagnose mit maximalen Scores größer als 2,000 ermittelt, wobei lediglich nur ein Isolat

einen Score über 2,300 erzielte, also eine höchstmögliche Speziesdiagnose hatte. In 11 (20 %)

Fällen konnte nur eine Gattungsdiagnose, also Brachyspira, durch Scores im Bereich 1,700 - 2,000

getroffen werden und neunmal (17 %) lag der maximale Score unterhalb von 1,699, so dass hier

nach der ersten Messung keine Identifizierung festlag. Eine exakte Auflistung ist im Anhang in

Tabelle 9.4 (Übersicht zur Identifizierung mittels MALDI-TOF-MS mit der Bruker Datenbank und

der erweiterten Datenbank) dargestellt. Die teilweise geringen Scores standen jedoch nicht mit

einer schlechten Qualität der Spektren in Zusammenhang. So konnten qualitativ sehr hochwertige

Spektren gewonnen werden, wie in Abbildung 5 zu erkennen ist. Es sind exemplarisch die MALDI-

TOF-MS-Spektren von 5 verschiedenen Brachyspirenarten dargestellt.

Zur Erzielung eines höheren Anteils sicherer Diagnosen wurde eine Erweiterung der

Datenbankeinträge durch die Erstellung von Main spectra profiles mit den verwendeten

Referenzstämmen sowie sicher differenzierten Feldisolaten vorgenommen (Berücksichtigung der

Ergebnisse der nox-Sequenzierung). Jedes Isolat wurde erneut mit je 12 Spots gemessen, bis

sichergestellt werden konnte, mindestens 6 qualitativ hochwertige Spektren pro Isolat für ein MSP

verwenden zu können. In 4 Fällen, also bei 7,4 %, wurden 6 beziehungsweise 7 Single-Spektren für

das jeweilige MSP benutzt. Bei den restlichen 92,6 % wurden mindestens 8 Spektren pro MSP

verwendet, in 36 Fällen sogar alle 12 Einzelspektren, also bei 80 % der eingespeisten MSP`s.

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Abbildung 5: Beispielhafte Darstellung der MALDI-TOF-MS Spektren der angegebenen 5 verschiedenen Brachyspirenspezies

Abbildung 5: Beispielhafte Darstellung der MALDI-TOF-MS-Spektren der angegebenen 5

verschiedenen Brachyspirenspezies. Gezeigt ist der Bereich im Massenzahlbereich m / z zwischen

3800 bis 12000. Die Spektren wurden zur besseren Darstellung geglättet und es wurde eine

Basislinienkorrektur durchgeführt. Zur besseren Übersicht sind die Massenzahlen angegeben.

Durch die Erweiterung der MALDI-TOF-MS-Datenbank im Rahmen dieser Dissertation enthielt

diese für 9 Brachyspirenarten schließlich 53 Einträge (B. alvinipulli, B. hampsonii, B.

hyodysenteriae, B. innocens, B. intermedia, B. murdochii, B. pilosicoli, „B. pulli“ und „B.

suanatina“). Die Differenzierung der Feldisolate dieser Studie mit der eigenen Datenbank

resultierte jetzt bei 53 Feldisolaten in Logscores, die über 2,300 lagen. Die Ergebnisse der

massenspektrometrischen Differenzierung mit den beiden unterschiedlichen Datenbanken sowie

die Verteilung der verschiedenen Arten werden in Tabelle 9 (Vergleich der Logscores (Mittelwerte

mit Standardabweichungen, SD) zur Differenzierung der Brachyspira spp. unter Verwendung der

Original Bruker Datenbank sowie der in dieser Studie erweiterten Datenbank zur MALDI-TOF-MS-

Differenzierung) gegenübergestellt.

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Tabelle 9: Vergleich der Logscores (Mittelwerte mit Standardabweichungen) zur Differenzierung

der Brachyspira spp. unter Verwendung der Original Bruker Datenbank sowie der in dieser Studie

erweiterten Datenbank zur MALDI-TOF-MS Differenzierung

Brachyspiraspezies Anzahl der Stämme

Logscores der verschiedenen Datenbanken*

Original** SD Erweiterung

*** SD

B. alvinipulli 1 1.24 - 2.74 -

B. hampsonii 2 1.61 - 2.77 -

B. hyodysenteriae 1 1.39 - 2.80 -

B. innocens 15 1.75 0,05 2.69 0,01

B. intermedia 4 1.77 0,14 2.72 0,03

B. murdochii 21 1.90 0,03 2.66 0,02

B. pilosicoli 4 2.05 0,06 2.63 0,04

„B. pulli“ 4 1.44 0,06 2.72 0,01

„B. suanatina“ 1 1.95 - 2.72 -

*Es sind für n > 1 die durchschnittlichen erhaltenen Logscores der Differenzierung mit der

kommerziellen (Original) sowie der erweiterten Datenbank (Erweiterung) dargestellt. **11 Einträge: B. innocens AN3706_90 AHVLA, B. innocens C109 AHVLA, B.intermedia AN1707_96

AHVLA, B. intermedia AN519_97 AHVLA, B. intermedia AN621_97 AHVLA, B. intermedia AN885_94

AHVLA, B.murdochii DSM 12563, B. pilosicoli AN652_02 AHVLA, B.pilosicoli C162 AHVLA,

B.pilosicoli GD82 GDD, B. pilosicoli GD83 GDD.

***53 Einträge für unterschiedliche Brachyspira spp., einschließlich der in Tabelle 6 aufgelisteten

Referenzstämme und 43 Feldisolaten, welche in der nox-Sequenzierung differenziert wurden.

Die Messung nach der Erweiterung der Datenbank brachte für jedes Isolat aus der

Probensammlung einen Score über 2,300. Das bedeutet, dass die Messung mit der Erweiterung in

jedem einzelnen Fall zu einer sicheren Speziesdiagnose geführt hat. Die Verteilung der

Speziesdiagnosen war wie folgt: B. murdochii (n=20), B. innocens (n=14), „B. pulli“ (n=4),

B.intermedia (n=2) und B. pilosicoli (n=3) (Die Isolate T1.3 und T1.6 konnten nicht im MALDI-TOF-

MS gemessen werden). Gleichzeitig wurde die Standardabweichung mit der erweiterten

Datenbank deutlich verringert, was ebenfalls für eine wesentlich präzisere Identifikation der

Spezies spricht. Des Weiteren zeigt die niedrigere SD in den Werten der erweiterten Datenbank,

dass die höheren Logscores nicht auf einzelne Ausreißer, sondern insgesamt auf einer

verbesserten Speziesdiagnose beruhen. Dies wird ebenfalls dadurch gestützt, dass die

zugrundeliegenden Werte der Feldisolate innerhalb des 98 %-Konfidenzintervalls liegen (siehe

Anhang, Tabelle 9.5 Statistische Übersicht, Normalverteilung der Logscores, α (uG) und α (oG)).

Diese Verbesserung ist in Tabelle 10 (Vergleich der Differenzierung der Feldisolate mit nox-

Sequenzierung und MALDI-TOF-MS* mit der erweiterten Datenbank) zu sehen, in der die

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Ergebnisse der nox-Sequenzierung den Ergebnissen der MALDI-TOF-MS Differenzierung mit der

erweiterten Datenbank gegenübergestellt sind.

Tabelle 10: Vergleich der Differenzierung der Feldisolate mit nox-Sequenzierung und MALDI-TOF-

MS* mit der erweiterten Datenbank

MALDI-TOF-MS**

nox- Sequenzierung***

B. pilosicoli

n = 3 B. intermedia

n = 2 B. innocens

n = 11 B. murdochii

n = 19 “B. pulli”

n = 4 B. sp. n = 0

B. pilosicoli

n = 3 3 0 0 0 0 0

B. intermedia

n = 2 0 2 0 0 0 0

B. innocens

n = 4 0 0 4 0 0 0

B. murdochii

n = 19 0 0 1 18 0 0

„B. pulli“

n = 5 0 0 0 1 4 0

B. sp. n = 6

0 0 6 0 0 0

*Die Tabelle berücksichtigt nur Isolate, die mit beiden Methoden differenziert wurden (exklusive

N5.1, N5.6, N10.2, T1.3, T1.6 und W1.4).

**MALDI-TOF-MS-Analyse mittels der erweiterten Datenbank mit 53 Einträgen inklusive der 10

Referenzstämme. ***

nox-Sequenzierung der Nukleotide 512 bis 926 des Leserahmens des nox-Gens (CP003490)

ermittelt aus einem nox-Amplifikationsprodukt.

Weiterhin wurde mit der Software von Bruker Daltonics ein Dendrogramm mit ausgewählten

Einträgen aus der Datenbank erstellt. Die in dem Dendrogramm dargestellten Ähnlichkeiten

beruhten auf den gemessenen massenspektrometrischen Daten. Die ausgewählten MSP`s wurden

alle in diesem Vorgang normalisiert. Es fand eine Korrektur auf eine Maximalintensität und auch

auf die Ausschlaghäufigkeiten statt (peaks). Der als distance level auf der X-Achse aufgetragene

Wert gibt den Grad der Übereinstimmung an. Ein distance level unter 100 bedeutet beispielsweise,

dass hier eine sehr hohe Übereinstimmung bestand. In Abbildung 6 (MALDI-TOF-MS-

Dendrogramm basierend auf den Main Spectra Profiles von 64 Brachyspiren Stämmen) ist ein

Dendrogramm der in dieser Arbeit untersuchten Brachyspiren zu sehen. Alle B. pilosicoli Isolate

gruppierten sich zusammen in einem Cluster mit einem distance level geringer als 100. Der

distance level zu den anderen Brachyspiren war mit Werten um die 1000 wesentlich größer.

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Abbildung 6: MALDI-TOF-MS Dendrogramm basierend auf den Main Spectra Profiles von 64 Brachyspiren Stämmen

Abbildung 6: MALDI-TOF-MS-Dendrogramm basierend auf den Main Spectra Profiles von 64

Brachyspiren Stämmen. Referenzstämme der Bruker-Datenbank sind mit * markiert; in dieser

Studie verwendete Referenzstämme sind mit + markiert und die im Rahmen dieser Arbeit

gewonnenen Feldisolate tragen ein #; Isolate mit einer Diskrepanz zwischen der Diagnose der nox-

Sequenzierung und dem Ergebnis der MALDI-TOF-Analyse sind mit ± gekennzeichnet.

Ein weiteres Cluster bilden die verschiedenen B. intermedia Isolate mit einem maximalen distance

level von 400. Zwei der Referenzstämme von „B. suanatina“ und B. hyodysenteriae fallen ebenfalls

mit in dieses Cluster. Der Referenzstamm von B. alvinipulli AN1268/3/04 grenzt sich mit einem

distance level von über 500 deutlich zu allen anderen untersuchten Stämmen ab. Ein weiteres

großes Cluster mit einem maximalen distance level von ca. 180 wird von allen untersuchten B.

innocens sowie B. murdochii Isolaten gebildet, wobei sich diese beiden Arten innerhalb dieses

Clusters mischen. Weiterhin finden sich in diesem Cluster die Isolate der Spezies B. hampsonii

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sowie ein Isolat von „B. pulli“. Die restlichen drei Isolate der Spezies „B. pulli“ bilden ein separates

Cluster.

4.5 Neue Multiplex-PCRs für die Differenzierung aviärer Brachyspiren

Wegen zahlreicher pathogener und apathogener Brachyspirenarten beim Geflügel ist der

ätiologische Nachweis der aviären intestinalen Spirochätose schwierig. Hinzu kommt, dass B.

alvinipulli und „B. pulli“ sehr schlecht charakterisierte Arten sind. So sind für beide Arten keine

spezifischen PCRs beschrieben. In dieser Arbeit wurde eine neue Multiplex-PCR (MP- PCR) zur

Detektion und Differenzierung aviärer Brachyspiren entwickelt. In dieser MP-PCR wird das nox-

Gen (NADH-Oxidase kodierend), das tnaA-Gen (Tryptophanase) sowie das Gen abgB für die

Hippurat-Hydrolase nachgewiesen. In Abbildung 7 (Ergebnisse der MP-PCR zum Nachweis des

nox-, des abgB- und des tnaA-Gens für die aufgeführten Referenzstämme) sind die Ergebnisse

dieser neuen MP-PCR für die 10 Referenzstämme dargestellt.

Es zeigte sich, dass für alle Referenzstämme und für alle Feldisolate das 939 bp Amplikon des nox-

Gens detektiert wurde. Weiterhin ist bei den B. hyodysenteriae (404/06), B. intermedia (AN26/93,

863x01/06) und „B. suanatina“ (AN4859/03) Referenzstämmen eine zweite Bande bei 325 bp in

Übereinstimmung mit dem tnaA positiven Genotyp zu sehen. Die als B. intermedia identifizierten

Feldisolate (T1.6, T9.4 und T9.5) zeigten ebenfalls diese Bande bei 325 bp. Wie die

Referenzstämme sind diese somit auch tnaA positiv. Zwei der durch nox-Sequenzierung und

MALDI-TOF-MS als B. murdochii identifizierten Feldisolate (W3.3 und W3.5) wiesen in der MP-PCR

gleichfalls eine sichtbare Bande bei 325 bp auf. An dieser Stelle kam der Verdacht auf, dass es sich

in diesen beiden Fällen gegebenenfalls um Mischkulturen handeln könnte. Diese Stämme wurden

noch weiter untersucht. Die restlichen Isolate waren alle negativ für tnaA. Wie in der Abbildung 7

gezeigt, generierte die MP-PCR wie erwartet für B. pilosicoli 102/06 ein weiteres Amplikon bei 744

bp, das auf das abgB-Gen zurückgeht. Diese Bande konnte ebenfalls für alle B. pilosicoli Feldisolate

(T3.4, T5.4 und T6.4) nachgewiesen werden. Bis auf eine Ausnahme, das Isolat N6.3 als B. innocens

beschrieben, waren alle restlichen Stämme negativ für das abgB-Gen (keine Bande bei 744 bp). So

zeigte auch der einzige Referenzstamm der Spezies B. alvinipulli AN1268/3/04 keine sichtbare

Bande bei 744 bp, obwohl dies im Zusammenhang mit der Hippurat-Hydrolyse erwartet worden

war.

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Abbildung 7: Ergebnisse der MP-PCR zum Nachweis des nox-, des abgB- und des tnaA-Gens für die aufgeführten Referenzstämme

Abbildung 7: Ergebnisse der MP-PCR zum Nachweis des nox-, des abgB- und des tnaA-Gens für die

aufgeführten Referenzstämme. Mit den erwarteten Banden bei 939 bp für das nox-Gen, bei 744

bp für das abgB-Gen sowie bei 325 bp für das tnaA-Gen.

4.6 Subkultivierung und nachfolgende Differenzierung von Einzelkolonien bei Brachyspirenisolaten

mit widersprüchlichen MALDI-TOF-MS und MP-PCR Ergebnissen

Es wurde die Arbeitshypothese untersucht, dass bei den einzelnen Fällen, bei denen in der MP-

PCR unerwartete Banden generiert wurden, Mischkulturen vorlagen. Die Erwartungen bezogen

sich in diesen Fällen auf die Ergebnisse der nox-Sequenzierung und der MALDI-TOF-MS-Analyse.

Dies lag in drei besonderen Fällen vor: Zwei B. murdochii Isolate (W3.3 und W3.5) mit einem tnaA-

Amplifikat sowie ein B. innocens Isolat (N6.3) mit Nachweis des abgB-Gens. Im Rahmen einer

assoziierten Projektarbeit der Studentinnen L. Eidam und L. Dißmann wurde versucht, aus diesen

drei putativen Mischkulturen Reinkulturen herzustellen. Dafür wurden die genannten Isolate auf

Fastidious Anaerobe Agar (FAA) (LabM, Lancashire, United Kingdom) supplementiert mit 5 %

Pferdeblut neu kultiviert. Für Brachyspirenkulturen auf diesem Nährboden war

Einzelkoloniebildung beschrieben (RÅSBÄCK et al. 2006). In Übereinstimmung mit der Literatur

konnte bei den drei genannten Brachyspirenisolaten eine Tendenz zur Einzelkoloniebildung

beobachtet werden. Von jedem der drei Isolate wurden drei Einzelkolonien subkultiviert und

erneut mit der MALDI-TOF-MS und der MP-PCR analysiert. Jedes der insgesamt neun Subkulturen

war für das nox-Gen positiv. Keines der drei Isolate zeigte in diesem zweiten Durchgang eine

zusätzliche Bande, weder für das tnaA-Gen bei 325 bp noch für das abgB bei 744 bp. Die MALDI-

TOF-Analyse ergab mit Logscores über 2,000 für alle FAA-Subkulturen von W3.3 und W3.5 die

Speziesdiagnose B. murdochii und für alle FAA-Subkulturen von N6.3 die Diagnose B. innocens.

Somit konnte keine Mischkultur bewiesen werden. Das Fehlen der tnaA- und abgB-Banden nach

FAA-Subkultivierung spricht aber für das Vorhandensein einer Mischkultur in der Ausgangskultur

und gegen tnaA positive B. murdochii beziehungsweise abgB positive B. innocens Isolate.

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4.7 Prävalenz der Brachyspiren in Abhängigkeit unterschiedlicher Faktoren

In dieser Studie konnten Brachyspiren in Legehennenbetrieben mit sehr unterschiedlichen

Haltungsformen detektiert werden. Insgesamt konnten in 60 % der beprobten Betriebe

Brachyspiren kulturell nachgewiesen werden. Bei 87 % der gewonnenen Isolate handelte es sich

um die vermeintlich apathogenen Brachyspirenarten B. murdochii, B. innocens und „B. pulli“. Auf

der anderen Seite wurden in 13 % der differenzierten Isolate pathogene Arten nachgewiesen. Zwei

Arten (B. pilosicoli und B. intermedia) der drei beschriebenen Erreger der AIS bei Hühnervögeln

wurden in dieser Studie bei Legehennen gefunden. Die dritte pathogene Brachyspirenart, B.

alvinipulli, konnte in keiner der untersuchten Proben isoliert werden.

Es ist beschrieben, dass die Prävalenz von Brachyspireninfektionen in Betrieben mit

Freilandhaltung gegenüber Betrieben mit anderen Haltungsformen höher ist (Jansson et al. 2008).

In dieser Arbeit wurden Legehennen aus den drei gängigsten Haltungsformen in Deutschland,

Freilandhaltung, Ökologische Haltung und Bodenhaltung beprobt: Brachyspiren konnten bei 3 von

9 Betrieben mit Freilandhaltung isoliert werden. Einmal wurde B. pilosicoli identifiziert und in zwei

Fällen lautete die Diagnose „B. pulli“. Bei den Betrieben, die eine biologische Haltungsform

praktizierten waren 4 von 9 positiv auf Brachyspiren, alle 7 Isolate wurden als B. innocens

identifiziert. Von den 9 Bodenhaltungsbetrieben, die mit Kloakentupfern beprobt wurden,

konnten in 7 Betrieben Brachyspiren nachgewiesen werden. Zweimal wurden die Isolate als B.

pilosicoli differenziert, in drei Fällen als B. intermedia und bei 7 Isolaten lautete die Spezies B.

innocens. Im Fall der 5 Bodenhaltungsbetriebe, in denen caecale Tupferproben genommen

werden konnten, stellten sich alle Betriebe als positiv auf Brachyspirenvorkommen heraus. Die

Verteilung der differenzierten Isolate ergab, dass es sich bei 20 der insgesamt 23 Isolate um B.

murdochii handelt. Außerdem wurde 1 Isolat als B. innocens erkannt und letztendlich konnte

zweimal „B. pulli“ nachgewiesen werden.

Dabei stellen die von den kloakalen Proben 22 positiven Isolate der 162 genommenen Proben

13,5 % an der Gesamtheit dar. Diese fanden sich in 14 der 27 untersuchten Betriebe, was einem

Anteil von 52 % entspricht.

Bezogen auf die einzelnen Haltungsformen ergaben sich bei der Freilandhaltung 33,3 % (3 von 9)

befallene Betriebe mit 5,6 % (3 von 54) positiven Proben.

Für die Biohaltung ergaben sich 44,4 % (4 von 9) positive Betriebe mit 13 % (7 von 54) positiven

Proben.

Bei der Bodenhaltung waren 77,7 % (7 von 9) der Betriebe befallen, wobei 22,2 % (12 von 54)

positive Proben ermittelt werden konnten.

Mit einem P=0,17 für den Anteil befallener Betriebe und P=0,5 für den Anteil positiver Proben,

deutet sich hier kein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Haltungsform und dem Befall durch

Brachyspiren an.

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Ein weiterer Parameter, der mit der Prävalenz einer Brachyspireninfektion in Zusammenhang

stehen kann, ist das Alter (BANO et al. 2008; PHILLIPS et al. 2005). In der vorliegenden Dissertation

reichte die Altersspanne der beprobten Hennen von der 25. bis zur 80. Lebenswoche. In der

Tabelle 11 (Prävalenz von Brachyspira sp. bei klinisch unauffälligen Betrieben in Abhängigkeit vom

Alter (in Lebenswochen (LW) der Tiere) sind die Brachyspirennachweise in Bezug zum Alter

dargestellt. In dieser Arbeit wurden drei Altersgruppen unterschieden: die erste Gruppe bildeten

Tiere jünger als 39 LW, im zweiten Bereich fanden sich Herden im Alter von 40 - 69 LW und der

dritte enthielt Betriebe mit Hennen von einem Alter über 70 LW. In der jüngsten Altergruppe war

lediglich einer von 5 Betrieben (20 %) sowie 4 von 30 Proben (13,3 %) positiv auf Brachyspiren

getestet worden. Im mittleren Altersbereich konnten in 7 von 12 Betrieben (58,3 %) und 9 von 72

Proben (12,5 %) Brachyspiren nachgewiesen werden. Aus den 10 Herden mit einem Alter über 70

LW bestätigte sich in 6 Herden (60 %) und 9 von 60 Proben (15 %) eine positive Testung auf

Brachyspira. Insgesamt 92,8 % der positiv auf Brachyspiren getesteten Betriebe befindet sich in

der Altersklasse über 40 LW.

Eine statistische Analyse wurde für diese Werte nicht vorgenommen, da die Proben teilweise

voneinander abhängig sind, da immer sechs Tiere in einem Bestand beprobt wurden.

Tabelle 11: Prävalenz von Brachyspira sp. bei klinisch unauffälligen Betrieben in Abhängigkeit vom

Alter (in Lebenswochen LW) der Tiere*

Alter Anzahl der beprobten Betriebe

Anzahl gesammelter Proben

Anzahl positive Betriebe

Anzahl der Isolate

≤ 39. LW 5 (19 %) 30 (19 %) 1 (7 %) 4 (18 %)

40. – 69. LW 12 (44 %) 72 (44 %) 7 (50 %) 9 (41 %)

≥ 70. LW 10 (37 %) 60 (37 %) 6 (43 %) 9 (41 %)

Gesamt 27 (100 %) 162 (100 %) 14 (100 %) 22 (100 %)

* Es sind nur die Betriebe berücksichtigt, in denen kloakale Tupferproben genommen worden sind.

Weiterhin wurde auch das Vorkommen von aviären Brachyspiren in Abhängigkeit von der

Herdengröße betrachtet. Es wurden wiederum drei Gruppen von Betriebsgrößen gebildet, in

denen die teilgenommenen Betriebe eingeteilt worden sind. Nachfolgend ist in Tabelle 12

(Prävalenz von Brachyspira spp. in klinisch unauffälligen Herden in Abhängigkeit zur Herdengröße)

eine Übersicht zum Brachyspirennachweis in Abhängigkeit von der Herdengröße dargestellt.

Seite | 50

Im Bereich von weniger als 5000 Tieren wiesen 5 von 12 Betrieben (41,6 %), beziehungsweise 10

von 72 Proben (13,9 %) positive Testergebnisse auf. Die Gruppe von Betrieben mit 5001-20.000

Tieren, zeigte in 7 von 10 Betrieben (70 %) und 9 von 60 Proben (15 %) positive Ergebnisse. In der

Gruppe mit Betrieben von 20.001 und mehr Tieren, wurden bei 2 von 5 Betrieben (40 %) und 3

von 30 Proben (10 %) Brachyspiren nachgewiesen.

Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Betriebsgröße und Befall mit Brachyspiren

konnte nicht nachgewiesen werden (P=0,09).

Tabelle 12: Prävalenz von Brachyspira spp. in klinisch unauffälligen Herden in Abhängigkeit zur

Herdengröße

Betriebsgröße

in Tierzahlen

Anzahl Betriebe

in diesem

Bereich

Anzahl gesammelter

Proben

Anzahl positiver

Betriebe

Anzahl Isolate/ davon

pathogene Arten

≤ 5.000 12 (44 %)

72 (44 %) 5 (36 %) 10 (45 %)/ 1

5.001 - 20.000 10 (37 %)

60 (37 %) 7 (50 %) 9 (41 %)/ 4

≥ 20.000 5 (19 %) 30 (19 %) 2 (14 %) 3 (14 %)/ 1

Gesamt 27 (100 %) 162 (100 %) 14 (100 %) 22 (100 %)/ 6

* Es sind nur die Betriebe berücksichtigt, in denen kloakale Tupferproben genommen worden sind.

Die Ergebnisse zeigen, dass das evaluierte Verfahren durch die erweiterte Datenbank des MALDI-

TOF-MS, die nox-Sequenzierung sowie die neue MP-PRC zur Differenzierung der aviären

Brachyspiren sehr gut funktioniert. Von der Probennahme über die Kultivierung bis hin zur

Differenzierung wurde der Diagnoseprozess, in Anlehnung an die porzine Brachyspirendiagnostik

auf die beim Geflügel vorkommenden Brachyspiren verfeinert und angepasst.

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5. Diskussion

Obwohl Brachyspiren weltweit verbreitet sind und sowohl beim Schwein als auch beim Geflügel

wirtschaftlich wichtige intestinale Erkrankungen hervorrufen, sind viele Fragen ungeklärt und

unzählige Problematiken ungelöst. So konnte bis heute kein Goldstandard für die Differenzierung

der Brachyspiren festgelegt werden. Einzelne Arten wie „B. pulli“ sind noch nicht offiziell als Art

anerkannt. Weder für das Schwein noch für das Geflügel ist ein Impfstoff gegen eine intestinale

Spirochätose zugelassen.

Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Methoden zur Differenzierung aviärer Brachyspiren zu

evaluieren und erste Daten zur Prävalenz der Brachyspiren in deutschen Legehennenbetrieben zu

generieren.

Der Aviären Intestinalen Spirochätose (AIS) wird in der deutschen Geflügelindustrie nur wenig

Aufmerksamkeit geschenkt. Dies hängt mit dem aufwendigen kulturellen Nachweisverfahren

zusammen, das wesentlich mehr Zeit als der Nachweis von anderen aviären intestinalen Erregern

wie Escherichia coli, Salmonella enterica oder Clostridium perfringens kostet. Weiterhin gibt es bei

der AIS keine spezifischen Symptome und die Mortalität ist grundsätzlich sehr niedrig. Die AIS

kann subklinisch verlaufen oder aber Störungen des Allgemeinempfindens unterschiedlichen

Grades hervorrufen (MC LAREN et al. 1996; DAVELAAR et al. 1986; GRIFFITHS et al. 1987; TROTT et

al. 1995; SAGARTZ et al. 1992). Die Ausprägung der Symptome der AIS ist von vielen

verschiedenen Faktoren abhängig. Neben der Brachyspirenart, auf Grund der unterschiedlichen

Virulenz der einzelnen Isolate spielen die Wirtsspezies, das Alter des Wirtstieres, die Haltung, die

Hygienebedingungen, der Umgebungsstress, die Fütterung und andere Bakterien im

Gastrointestinaltrakt des Wirtes eine große Rolle (SWAYNE et al. 1993; SWAYNE. 1994). Milde

Verläufe mit Diarrhoe und Leistungseinbußen sind häufig beschrieben (DAVELAAR et al. 1986;

GRIFFITHS et al. 1987; TROTT et al. 1995). Allerdings werden diese Symptome oft überhaupt erst in

der Herde für den Landwirt sichtbar, wenn mindestens 20 % der Tiere betroffen sind (David Burch.

Intestinal spirochaetes in poultry. Proceedings of the 7th International Conference on Colonic

Spirochaetal Infections in Animals and Humans, 2016 Oct 6 - 7; Hannover, Germany; 2016). Solche

Krankheitszeichen können durch die hohe Anzahl der Tiere in einer Herde verschleiert werden.

Wenn beispielsweise nur ein paar Tiere an einem Durchfallgeschehen leiden, so wird sich dies

kaum in einer signifikanten Erhöhung des Feuchtigkeitsgehaltes im Mist des gesamten Bestandes

widerspiegeln. Genauso verhält es sich mit einer gegebenenfalls geringeren Leistung einzelner

Hennen. Diese Schwankungen können sich in den kleinsten Prozentzahlen bewegen, treten

vielleicht in einigen Betrieben auf Grund anderer Faktoren, wie Futterumstellung oder andere

Stressoren, regelmäßig auf und klingen nach einiger Zeit wieder ab. Ebenfalls können verminderte

Eigewichte, veränderte Eidotter sowie physiologisch abweichende Blutparameter (Proteinen,

Lipiden, Karotinoiden und Bilirubin) als Anzeichen einer AIS vorkommen (DWARS et al. 1992, 1993,

1990; HAMPSON & MCLAREN 1999; PHILLIPS et al. 2004). Im Falle von verminderten Eigewichten

herrscht ebenfalls die Problematik der Verschleierung durch die große Gesamtzahl der Eier. Es

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schlägt sich nicht signifikant auf die Gesamtmasse nieder, wenn ein paar leichtere Eier von einer

kleinen Gruppe der Hennen gelegt werden. Falls die Eidotter oder Blutparameter bei einigen

Tieren verändert sein sollten, so kann dieser Sachverhalt für den Herdenmanager erstmal völlig

verborgen bleiben. Sofern in dem Betrieb keine offensichtlichen Probleme vorherrschen, werden

auch keine Blutuntersuchungen oder etwaige weiterführende Diagnostik durchgeführt.

In Deutschland gibt es bisher keine epidemiologischen Studien zu aviären Brachyspiren. In

Australien konnten in 53,3 % der auffälligen Betriebe und in England in 70 % der untersuchten

Proben von Betrieben mit dokumentierter schlechter Herdenleistung pathogene Brachyspiren

isoliert werden (MCLAREN et al. 1996; BURCH et al. 2007). In der vorliegenden Arbeit wurden zum

ersten Mal Legehennenbetriebe in Deutschland systematisch auf Brachyspiren untersucht. In

dieser Arbeit wurden nur Legehennen untersucht, da beschrieben ist, dass die Prävalenz einer

Infektion mit Brachyspira spp. ab der 15. Lebenswoche erhöht ist (STEPHENS & HAMPSON 1999)

und Herden älter als 40 Wochen häufiger betroffen sind (BANO et al. 2008; PHILLIPS et al. 2005).

In dem Zeitraum von Oktober 2014 bis März 2016 wurden 162 Kloakentupfer von Legehennen aus

unterschiedlichen Haltungsformen, jeweils 9 Betriebe mit Freilandhaltung, 9 mit ökologischer

Haltungsform sowie aus 9 Herden mit Bodenhaltung, gewonnen. Diese Verteilung der beprobten

Betriebe mit den genannten Haltungsformen ist gezielt getroffen worden, damit die in

Deutschland wichtigsten Formen der Haltung in gleicher Anzahl vertreten sind. Es sollte damit der

Fragestellung dienen, welche der Haltungsform eventuell ein vermehrtes Vorkommen von

Brachyspiren aufzeigt. Denn bereits veröffentlichte Studien aus den letzten Jahren konnten

verschiedenen Haltungsformen unterschiedliche Prävalenzen zuordnen. In einer Studie aus dem

Jahr 2009 betrug die Kolonisation mit Brachyspira spp. in Freilandhaltung 91,7 %, in der

biologischen Haltung 77 % und in Käfighaltung dagegen nur 25 % (BURCH et al. 2009). Diese

Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass in der Käfighaltung die Hygienestandards einfacher

einzuhalten sind. Die Tiere haben keinen Kontakt zu kontaminierten Böden, Gewässern und

Wildtieren. Wenn in Deutschland durch Umstrukturierungen in der Legehennenhaltung die

Freilandhaltung zunimmt, initiiert beispielsweise durch die „Initiative Tierwohl“, könnte auch die

Infektion der Tiere mit Brachyspiren zunehmen, falls die Ergebnisse der Studien aus England auf

Deutschland übertragbar sind.

In dieser Arbeit konnte allerdings die höchste Prävalenz einer Besiedlung mit Brachyspiren in der

Bodenhaltung festgestellt werden. In knapp 78 % der Bodenhaltungsbetriebe, beziehungsweise in

7 von 9 Betrieben, von denen kloakale Tupfer genommen wurden, konnten Brachyspiren isoliert

werden. Im Fall der 5 Bodenhaltungsbetriebe, in denen caecale Tupfer genommen wurden,

konnten aus jedem Betrieb Brachyspiren isoliert werden. Dieser Sachverhalt ist

höchstwahrscheinlich auf die abweichende Form der Probennahme in diesen 5 Herden

zurückzuführen. In der Literatur ist bereits erwähnt, dass caecal oder auch intestinal gewonnenes

Probenmaterial ein erhöhtes Detektionslevel, im Vergleich zu Kotproben oder auch

Kloakentupfern, aufweist (HAMPSON & SWAYNE 2008). Das erhöhte Vorkommen von

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Brachyspiren in den Betrieben mit Bodenhaltung im Gegensatz zu den Betrieben mit ökologischer

Haltung, mit 44 % positiven Betrieben, und Betrieben mit Freilandhaltung, mit 33 % positiver

Isolation, könnte allerdings auch mit den Herdengrößen zusammenhängen. Untersuchte Betriebe

mit Bodenhaltung hatten tendenziell auch die größten Herden. Im Durchschnitt betrug hier die

Größe der Herden 26.789 Tiere. Demgegenüber war die ökologische Haltung mit einem

Durchschnitt von 6.832 Legehennen pro Betrieb und die Freilandhaltung mit durchschnittlich

9.962 Tieren mit wesentlich kleineren Betrieben vertreten. Es ist nicht auszuschließen, dass die

Prävalenz in größeren Herden höher sein könnte als in kleineren Herden. In dieser Arbeit waren

die Herden mit einer Größe bis 5.000 Legehennen zu 42 % positiv auf das Vorkommen von

Brachyspiren, wobei lediglich ein Isolat von insgesamt zehn einer pathogenen Art angehört. Bei

den Herdengrößen 5.001 - 20.000, als auch bei den Herden mit mehr als 20.000 Tieren konnten in

58 % der Betriebe Brachyspiren nachgewiesen werden. In dem mittleren Bereich (5.001 – 20.000)

waren fast die Hälfte der Isolate (4/9 Isolaten) einer der pathogenen Arten der Brachyspiren

zuzuordnen. Im Bereich größer als 20.000 Tiere pro Herde wurde eins von 26 Isolaten als eine

pathogene Art identifiziert. Das Management bezüglich Hygienestandards und etwa auch der

Einzeltierkontrollen ist bei 70.000 Legehennen oftmals wesentlich schwieriger zu gestalten als

beispielsweise bei 225 Tieren in einer Herde.

Des Weiteren herrschten innerhalb der verschiedenen Haltungsformen in der Qualität der

Betriebe bezüglich der Haltungsbedingungen Unterschiede. Diese Abweichungen machen es

schwierig jeden Betrieb, etwa in ökologischer Haltung, mit dem nächsten gleichzusetzen. Durch

die Bilder im Anhang 9.6 (Bild 1 und 2 der Haltung von Legehennen mit einem mobilen Hühnerstall

in ökologischer Haltung) wird deutlich, dass beispielsweise die Qualität des Bodens bezüglich der

Grasnarbe oder auch des Feuchtigkeitsgehaltes in dem gezeigten Betrieb sehr gut ist.

Der Landwirt ist speziell in diesem Fall in der Lage, seine Tiere laufend auf neue Böden

umzusiedeln. Durch die Mobilität wird verhindert, dass die Grasnarbe völlig zerstört wird und die

Hennen in hohen Belegungsdichten auf stark mit Kot kontaminiertem, offenem Boden stehen, wie

dies bei dem Vortrag von Prof. Burch auf der Spirochäten Tagung in Hannover für englische

Freilandbetriebe gezeigt wurde, die Bestandsprobleme mit der AIS hatten (David Burch. Intestinal

spirochaetes in poultry. Proceedings of the 7th International Conference on Colonic Spirochaetal

Infections in Animals and Humans, 2016 Oct 6 - 7; Hannover, Germany; 2016). Die Wasserhygiene

ist in solchen Herden gegebenenfalls auch auf einem höheren Standard. Dies ist besonders für die

Art B. pilosicoli von Bedeutung. Diese Art wurde bereits aus verschiedenen Gewässern isoliert, was

maßgeblich für die Freilandhaltung eine Bedeutung hat (OXBERRY et al. 1998). Genauso spielt „B.

suanatina“ bei Wildvögeln eine große Rolle (RÅSBÄCK et al. 2007) und könnte ohne Weiteres in

kommerziell gehaltene Herden eingetragen werden.

Solche Unterschiede in der Haltung haben großen Einfluss auf die Tiere, insbesondere auf den

Stress, dem die Hühner ausgesetzt sind und der vor allem durch hohe Besatzdichten erhöht wird.

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Da es sich bei der AIS um eine Faktorenerkrankung handelt, wirken solche Umstände natürlich

begünstigend auf einen Ausbruch.

Die Betrachtung des Einflusses vom Alter der Legehennen und einer damit einhergehenden

erhöhten Prävalenz zum Brachyspirenvorkommen stimmt mit vorangegangenen

Forschungsergebnissen überein. Wie bereits BANO et al. (2008) oder auch PHILLIPS et al. (2005)

beschrieben, ist der positive Nachweis von Brachyspira sp. mit einem Alter ab 40 Lebenswochen

deutlich erhöht. Allerdings muss hier erwähnt werden, dass die Verteilung der Haltungssysteme in

der getroffenen Alterseinteilung nicht gleichmäßig ist. Beispielsweise sind die

Bodenhaltungsbetriebe in der Altersklasse jünger als 39 LW nur mit zwei Betrieben vertreten. In

der mittleren (40 - 69 LW) und der oberen Altersklasse (älter als 70 LW) sind die Betriebe mit

Bodenhaltung je mit n=6 vertreten. Dieser Sachverhalt ist nicht unwichtig. Diese Tatsache, also

mehr Bodenhaltungsbetriebe in der mittleren und oberen Altersklasse, begünstigt die

nachgewiesen erhöhte Prävalenz in den hier beprobten Herden mit steigendem Alter. Um die

Frage nach einer erhöhten Prävalenz in Bezug auf verschiedene Haltungssysteme beantworten zu

können, hätten alle untersuchten Betriebe in der gleichen Altersklasse sein müssen. Das war in der

vorliegenden Arbeit nicht umsetzbar, da die Abhängigkeit auf freiwillige Teilnahme bestand und

die Auswahl sehr gering bis gar nicht gegeben war.

B. pilosicoli wird von Schadnagern aufgenommen und übertragen (PHILLIPS et al. 2003). Ebenso ist

eine Eintragung von Brachyspiren durch Wildvögel, beispielsweise durch abgesetzten Kot oder

Verschmutzung der Tränken, bekannt. Daher sollten im Rahmen der Probennahme möglichst viele

Informationen zu jedem Betrieb erhoben werden und es wurde in jedem Betrieb ein

Dokumentationsbogen ausgefüllt. Dieser sollte Aufschluss über Probleme oder Auffälligkeiten in

dem jeweiligen Betrieb geben. Keiner der beprobten Betriebe hatte etwas in der Art zu melden. Es

gab weder Auffälligkeiten bezüglich Legeleistung oder zunehmender Feuchtigkeit des Kotes, noch

wurde eine Schadnagerproblematik erwähnt. Dennoch konnten bei 60 % der Farmen Brachyspira

spp. kulturell nachgewiesen werden. In 87 % der Fälle wurden allerdings nur vermeintlich

apathogene Arten, wie B. murdochii, B. innocens und „B. pulli“ isoliert. Auf der anderen Seite

gelang bei 13 % der gesammelten Proben, von vermeintlich klinisch unauffälligen Herden, der

kulturelle Nachweis einer pathogenen Brachyspirenart. Es ist schwer einzuschätzen, ob bei einer

genauen Betrachtung der Leistungsdaten und einer regelmäßigen klinischen Untersuchung der

Tiere nicht doch Leistungseinbußen beziehungsweise klinische Veränderungen in Verbindung mit

einer AIS dokumentiert worden wären. Leider war dies im Rahmen der durchgeführten

Bestandsbesuche nicht möglich. Auf der anderen Seite gibt es bereits beschriebene Fälle, in denen

pathogene Brachyspiren nachweislich präsent waren, die Wirtstiere aber keine klinischen

Symptome zeigten (BANO et al. 2008).

Es erscheint nicht unwahrscheinlich, dass die an den Untersuchungen teilgenommenen Betriebe

gegebenenfalls doch Probleme mit AIS hatten. Die AIS könnte vergleichsweise mild verlaufen sein

(BANO et al. 2008), so dass die Betriebsleiter und Tierärzte sie nicht bemerkten. Die Faeces und

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damit die Einstreu könnten nur eine geringe Zunahme der Feuchtigkeit gezeigt haben, wie dies

zum Beispiel bei STEPHENS & HAMPSON (1999) mit einer Korrelation von 14 % feuchterer Einstreu

und dem Vorkommen von Brachyspira spp. beschrieben wurde. Des Weiteren könnte auch die

Legeleistung bei AIS eventuell nur 1 - 2 % unter dem Optimum gelegen haben. Auf der Spirochäten

Tagung in Hannover wurde von Prof. Burch dargestellt, dass Anomalien in einer Herde bezüglich

der Eiproduktion erst sichtbar werden, wenn ≥20 % der Hennen an der AIS erkrankt sind (David

Burch. Intestinal spirochaetes in poultry. Proceedings of the 7th International Conference on

Colonic Spirochaetal Infections in Animals and Humans, 2016 Oct 6 - 7; Hannover, Germany;

2016). In manchen Fällen wurde unter Umständen auch schon seit längerer Zeit die erreichte

Leistung als normal angesehen, so dass sich die Frage nach Problemen gar nicht erst gestellt hat.

Immerhin hatte noch keiner der besuchten Betriebe von AIS beziehungsweise Brachyspiren in

Verbindung mit Geflügel gehört. Die AIS besitzt Merkmale, die leicht dazu führen, dass die

Bedeutung der Erkrankung unterschätzt wird. Die Verluste sind nicht immer direkt sichtbar, wie

beispielsweise bei der Schweinedysenterie (SEEGER et al. 1984; HARRIS & LYSONS 1992). Die Klinik

ist unspezifisch und die Liste der differentialdiagnostisch abzugrenzenden Möglichkeiten ist groß.

Ein Durchfallgeschehen kann als Folge einer fehlerhaften Fütterung, einer Salmonellose oder

Colibacillose sowie Kokzidieninfektionen und Histomonadenbefall auftreten. Außerdem müssen

die Brachyspiren von anderen spiraligen Erregern, wie etwa Campylobacter oder Helicobacter,

abgegrenzt werden (HAMPSON & SWAYNE 2008). Wenn aber die Legeleistung einbricht, ein

hellbraun, wässriger Durchfall erscheint, der an „Starbucks Coffee“ erinnert und vielleicht auch

noch eine erhöhte Mortalität hinzukommt, dann sollte die AIS von jedem Kliniker in Betracht

gezogen werden (David Burch. Intestinal spirochaetes in poultry. Proceedings of the 7th

International Conference on Colonic Spirochaetal Infections in Animals and Humans, 2016 Oct 6 -

7; Hannover, Germany; 2016).

Selbst wenn die Herden zu dem Zeitpunkt vermeintlich keine Probleme oder Verluste durch

Symptome einer AIS verzeichneten, könnte sich diese Situation schnell ändern. Die AIS ist eine

multifaktorielle Faktorenerkrankung, die akut durch eine Verschiebung oder Änderung eines

Parameters ausbrechen kann. Es konnte gezeigt werden, dass der Weizengehalt im Futter einen

signifikanten Einfluss auf die Kolonisation mit Brachyspiren hat. Die Autoren fütterten den Hennen

eine Weizendiät mit hohen Anteilen an Nicht-Stärke-Polysacchariden und wiesen die erhöhte

Kolonisation mit B. intermedia nach (PHILLIPS et al. 2004). Des Weiteren stellte eine andere Studie

heraus, dass der Zusatz von Enzymen, welche Nicht-Stärke-Polysaccharide hydrolysieren können,

die Kolonisation mit B. intermedia verringern kann (HAMPSON et al. 2002). Im Rahmen dieser

vorliegenden Studie konnten zur Fütterung der Legehennen in den beprobten Betrieben keine

genaueren Informationen über die Zusammensetzung des Futters sowie über die Weizengehalte

ermittelt werden. In Folgeuntersuchungen wäre es aber wichtig, die Futterzusammensetzung zu

dokumentieren.

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Überdies gab es Studien, in denen die Verwendung des Polypeptidantibiotikums Zinkbacitracin,

ein Futterzusatzstoff der zur Wachstumsförderung eingesetzt wurde, und dessen Auswirkungen

auf die intestinale Kolonisation mit Brachyspiren untersucht wurde. Diese Studie legte eine

verminderte Kolonisation durch B. intermedia unter Zinkbacitracin-Aufnahme offen. Allerdings

erhöhte sich auf der anderen Seite die Besiedelung der Hennen mit B. pilosicoli (HAMPSON et al.

2002; JAMSHIDI & HAMPSON 2002).

Diese gegensätzlichen Wirkungen auf die beiden Brachyspirenarten legen die Vermutung nahe,

dass B. intermedia und B. pilosicoli in unterschiedlicher Art und Weise von der vorhandenen

Mikrobiota profitieren. Für das Schwein ist es beispielsweise bewiesen, dass die Coinfektion von

Clostridium perfringens und Brachyspira hyodysenteriae einen synergistischen Effekt hat. Die

Clostridien erleichtern B. hyodysenteriae die Kolonisation und verstärken sowohl

Entzündungsreaktionen als auch Läsionen (HARRIS et al. 1978; JOENS et al. 1981; WHIPP et al.

1979).

Beim Geflügel spielen netB positive Clostridium perfringens Typ A Stämme als Erreger der Enteritis

necroticans eine wichtige Rolle (KEYBURN et al. 2006; KEYBURN et al. 2008). Es handelt sich dabei

um eine infektiöse Faktorenerkrankung des Dünndarmes. Wie bei der AIS ist für die Enteritis

necroticans ein hoher Weizengehalt ein begünstigender Faktor (COOPER & SONGER 2009).

Allerdings tritt die Enteritis necroticans typischerweise bei Mastgeflügel und nicht bei Legehennen

auf. Es ist nicht auszuschließen, dass in einem Betrieb erst im Zuge einer entstehenden

Coinfektionen sowie Fütterungsfehlern oder Fütterungsänderungen die AIS ausbricht oder die

Problematik einer AIS größer werden kann.

Zur multifaktoriellen Natur der AIS kommt weiterhin noch eine unstetige Inkubationszeit bis zum

Auftreten von Krankheitszeichen. SWAYNE et al. (1995) stellten in einer experimentellen Infektion

erste Symptome bei Eintagsküken nach frühestens 5 Tagen fest. Bei Versuchen von HAMPSON et

al. (2002) zeigten sich erst nach einigen Wochen klinische Erscheinungen bei den infizierten

Hennen. Diese Beobachtung korrelierte mit der ebenso lange dauernden steigenden Besiedelung

mit B. intermedia.

Die Pathogenese der AIS ist offensichtlich sehr komplex. Sie besteht aus dem Zusammenspiel der

Fütterung der Tiere, der damit einhergehenden Mikrobiota im Magen-Darm-Trakt der Vögel, den

Umgebungsbedingungen der Hennen sowie letztendlich auch der vorkommenden Brachyspirenart

(SWAYNE et al. 1992; SWAYNE. 1994). Einige Wissenschaftler sehen in dieser multifaktoriellen

Abhängigkeit der zahlreichen Faktoren einen Erklärungsansatz für die Heterogenität der klinischen

und pathologischen Symptome (HAMPSON & SWAYNE 2008).

Es ist noch nicht abschließend geklärt, ob die nicht als AIS-Erreger eingestuften Brachyspirenarten

B. innocens, B. murdochii und „B. pulli“ vielleicht doch ein pathogenes Potential besitzen. In

experimentellen Infektionen konnten mit B. innocens aber keine Krankheitszeichen erzeugt

werden (STEPHENS & HAMPSON 2002; TROTT & HAMPSON 1998). Vielleicht fehlte es aber in

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diesen Studien an zusätzlichen Wegbereitern, anderen Faktoren, welche dann zur Folge haben,

dass sich die Kolonisation mit B.innocens zu einer Infektion entwickelt. So ist vorstellbar, dass

durch eine primäre Virusinfektion die Brachyspiren in tiefere Gewebeschichten vordringen

können. In einem Tagungsbericht wird von einem Zusammenhang zwischen der Kolonisation mit

B. innocens und einer verminderten Legeleistung bei Hennen in Freilandhaltung berichtet (BURCH

et al. 2009). Dies könnte auch auf die zwei weiteren als apathogen eingestuften Arten B. murdochii

und „B. pulli“ zutreffen. Für „B. pulli“ wurden 2011 in einem Infektionsversuch mit Eintagsküken

erheblich verminderte Zunahmen des Körpergewichtes sowie variable Infiltrationen des Caecums

mit Entzündungszellen pathohistologisch registriert (PRAPASARAKUL et al. 2011). Da die in dieser

Arbeit untersuchten „B. pulli“ Stämme ursprünglich vom Hund isoliert wurden, ist zurzeit unklar,

ob diese mit Isolaten vom Geflügel vergleichbar sind. Allgemein wird trotz dieser Ergebnisse „B.

pulli“ nicht als AIS-Erreger aufgeführt. Andere Veröffentlichungen schildern, dass Betriebe mit

vermeintlicher AIS-Problematik untersucht wurden und hier unter anderem B. murdochii

nachgewiesen werden konnte (STEPHENS & HAMPSON 1999; STEPHENS et al. 2005; TROTT &

HAMPSON 1990). Sollten die drei genannten Arten doch Erreger der AIS sein, wäre die

Nachweisrate von AIS-Erregern in dieser Arbeit wesentlich höher, gegebenenfalls wären dann

sogar 60 % der Betriebe positiv.

In der Brachyspirendiagnostik ist es sehr schwer bis unmöglich Mischinfektionen/-kolonisationen

unterschiedlicher Brachyspirenarten nachzuweisen. Durch die fehlende Einzelkoloniebildung auf

dem Selektivnährboden mit Mikrogräben kommt es grundsätzlich nicht zur Trennung mehrerer

Brachyspirenspezies, wie beim fraktionierten Ausstrich der bei anderen Erregern durchgeführt

wird. Es ist nicht unwahrscheinlich, dass beispielsweise B. pilosicoli durch ein starkes Wachstum

von B. innocens oder B. murdochii in vielen Fällen nicht nachgewiesen werden konnte. Für diese

Problematik kann die neue Multiplex-PCR (MP-PCR) angewendet werden. In dieser MP-PCR wird

unter anderem das abgB-Gen nachgewiesen, welches nach den Ergebnissen dieser Arbeit

spezifisch für die Spezies B. pilosicoli ist. Wenn eine Mischkultur von der Agar-Platte

abgeschwemmt und die Misch-DNA aufgereinigt wurde, sollte die MP-PCR sehr geringe Mengen B.

pilosicoli DNA in der Misch-DNA detektieren, das heißt durch das abgB-Gen von B. pilosicoli wird

bei 744 bp eine Bande erkennbar.

Eine Artdiagnose ist bei den Brachyspiren nicht nur aus wissenschaftlichem Interesse, sondern

auch für die ätiologische Aufklärung einer AIS unerlässlich, da die verschiedenen Arten eine

unterschiedliche Virulenz besitzen. Derzeit gibt es aber noch keinen Goldstandard für die

Isolierung und Differenzierung von Brachyspiren. Die Verfahren und Techniken sollten im Rahmen

dieser Dissertation evaluiert und optimiert werden.

Entsprechend ihrer Eigenschaften als Anaerobier müssen für die Proben Transportmedien gewählt

werden, die ein Überleben der putativen Brachyspirenisolate bis zum entsprechenden

Diagnostiklabor gewährleisten. Wichtig ist ebenfalls, die Zeitspanne des Transportes möglichst

gering zu halten. Porzine Brachyspiren, insbesondere B. hyodysenteriae und B. pilosicoli, überleben

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bis zu 120 Tage im Schweinekot und in kontaminierten Böden (BOYE et al. 2001). Dagegen bleiben

die aviären Brachyspiren, wie für B. intermedia und B. pilosicoli gezeigt, nur bis zu maximal 3 Tage

in Geflügelkot am Leben und in den Ställen wurde kaum ein Überleben beobachtet (PHILLIPS et al.

2003). Hierfür wird der niedrigere pH-Wert der Faeces sowie die allgemein trockenere Konsistenz

beim Vogel verantwortlich gemacht (PHILLIPS et al. 2003).

Für eine erfolgreiche kulturelle Anzucht eignen sich sehr frischer Kot oder ein Schleimhautabstrich

aus den Caeca der Wirtstiere (HAMPSON & SWAYNE 2008). Als geeignete Anzuchtmedien sind in

der Literatur bluthaltige, feste Nährböden sowie Flüssigmedien mit Blut oder Serumzusätzen

beschrieben. Insbesondere der Tryptikase-Soja-Agar mit 5 - 10 % Schaf- oder Rinderblut und einer

Supplementierung von verschiedenen Antibiotikazusätzen wird als Selektivnährboden für

Brachyspiren eingesetzt. Zur Hemmung einer Begleitflora eignen sich Spectinomycin, Rifampin,

Spiramycin, Vancomycin und Polymyxin (JENKINSON & WINGAR 1981; DÜNSER et al. 1997). Diese

Angaben beziehen sich allerdings auf den Nachweis von Brachyspiren im Schweinekot. In dieser

vorliegenden Studie hat sich die Nutzung des TSA mit den Zusätzen Colistin, Rifampicin und

Spectinomycin sowie 10 % Rinderblut bewährt. Das Wachstum der Brachyspiren war auf diesem

Nährmedium wesentlich stärker, als es beispielsweise bei der Nutzung aller 5 genannten

antimikrobiellen Substanzen war. Eine mögliche Erklärung hierfür wäre die unterschiedliche

Toleranz aviärer und porziner Brachyspiren gegenüber den zur Unterdrückung der Begleitflora in

dem Nährboden eingesetzten Antibiotika. Denkbar wäre ebenfalls, dass die aviären Brachyspiren,

durch die oben genannten Eigenschaften des Geflügelkotes, bereits in der Kloake in ihrer Vitalität

geschwächt sind und deshalb in ihrer kulturellen Anzucht sensibler reagieren. In jedem Fall ist

nach den Erfahrungen dieser Arbeit bei der kulturellen Untersuchung von Geflügelkotproben der

Einsatz der drei genannten Antibiotika im Selektivnährboden zur Unterdrückung der Begleitflora

ausreichend.

Des Weiteren stellte sich eine Bebrütungstemperatur von 37 °C als vorteilhafter im Vergleich zu

42 °C heraus. Diese Beobachtung war unerwartet, da eine Anpassung der aviären Brachyspiren an

die Körperkerntemperatur ihrer Wirtsspezies naheliegend war. Bei Vögeln liegt die physiologische

innere Körpertemperatur mit 41-42 °C wesentlich höher als beim Säugetier. Auf der anderen Seite

haben NEO et al. (2013) durch eine MLST-Analyse von verschiedenen B. pilosicoli-Isolaten

nachgewiesen, dass zumindest diese Art über eine enorme genomische Plastizität verfügt. Es

konnten zum Beispiel enge Cluster von verwandten Isolaten, sowohl aus verschiedenen

Wirtstieren als auch aus unterschiedlichen geographischen Gebieten, aufgezeigt werden. Dieses

Vermögen ermöglicht es B. pilosicoli, sich an seine verschiedenen Wirte zu adaptieren.

Nach der Optimierung des kulturellen Nachweisverfahrens sollte im nächsten Schritt eine

Methode zur Differenzierung, speziell für die beim Geflügel vorkommenden Arten, evaluiert

werden. Es wurde zunächst eine makroskopische Beurteilung durchgeführt, um gegebenenfalls

das charakteristische, schwärmende Wachstum mit unterschiedlich ausgeprägter Hämolyse zu

erfassen. Im Anschluss erfolgte eine mikroskopische Untersuchung eines gramgefärbten

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Kulturausstriches, um gegebenenfalls gramnegativ, spiralig-gewundene Bakterien zu bestätigen.

Im positiven Fall wurden Kulturen subkultiviert. In dieser Arbeit wurde keine direkte

molekularbiologische Untersuchung der Kotproben auf Brachyspiren durchgeführt, da das

Vorkommen von PCR-Inhibitoren in Kotproben problematisch ist und eine Stammsammlung

aufgebaut werden sollte, die für weiterführende Untersuchungen genutzt werden kann. Mit den

gewonnenen Isolaten konnte schließlich eine vergleichende massenspektrometrische und

molekularbiologische Differenzierung durchgeführt werden. PHILLIPS et al. (2006) führten

hingegen einen direkten PCR-Nachweis von Brachyspiren in Kotproben durch. Die so gewonnenen

Ergebnisse stehen erheblich schneller zur Verfügung, aber die Gefahr einer falschen Diagnose,

beispielsweise auf Grund einer Mischinfektion, besteht (JANSSON et al. 2008).

Da fast alle Differenzierungsmethoden für porzine Brachyspirenarten entwickelt wurden und beim

Geflügel weitere Arten vorkommen, müssen die Methoden für das Geflügel kritisch hinterfragt

werden. Die biochemische Differenzierung als alleinige Methode eignet sich nur bedingt. Aktuell

gibt es bereits einige Berichte über einzelne Arten, die sich nicht einheitlich verhalten. FELLSTRÖM

et al. (1999) beschreiben für B. hyodysenteriae sowohl Indol-abbauende als auch Indol-nicht-

abbauende Isolate. Des Weiteren sind biochemische Identifikationen für B. alvinipulli und „B. pulli“

schwierig, da sich auch diese schlecht charakterisierten Arten biochemisch heterogen verhalten

(JANSSON et al. 2008), so dass die biochemische Differenzierung aviärer Brachyspiren häufig nicht

zu einer sicheren Artdiagnose führt. Und auch andere Untersucher haben in der Vergangenheit

bereits auf die biochemische Differenzierung von Brachyspiren verzichtet (ROHDE et al. 2002;

Townsend et al. 2005) und sich auf neue Methoden konzentriert.

Der für die Differenzierung porziner Brachyspirenisolate, in der Routinediagnostik des Instituts für

Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, eingesetzte Restriktionsfragment-

Längenpolymorphismus des nox-Gens (ROHDE et al. 2002, 2012, 2013) ermöglicht eine

Differenzierung der Arten: B. hyodysenteriae, „B. suanatina“, B. pilosicoli, B. intermedia,

B.murdochii und B. innocens. Aber insbesondere für B. alvinipulli ermöglicht diese Methodik keine

sichere Diagnose. Nach TOWNSEND et al. (2005) zeigt sich bei dieser Art unter Verwendung der

angegebenen Verdauungsenzyme das gleiche Bandenmuster wie bei B. pilosicoli. Ebenso verhält

es sich für viele entwickelte Polymerasekettenreaktionsverfahren (PCR`s). Bis heute ist keine PCR

beschrieben, die eine Diagnose von B. alvinipulli oder „B. pulli“ ermöglicht. Allerdings wurde im

Rahmen dieser Arbeit bereits eine Erarbeitung für eine neue MP-PCR zur Differenzierung der

aviären Brachyspiren initiiert. Zwei (B. intermedia und B. pilosicoli) der drei wichtigen Erreger der

AIS können durch dieses Verfahren differenziert werden (B. intermedia aber nur als

Verdachtsdiagnose). Die hier beschriebene MP-PCR muss noch weiterentwickelt und modifiziert

werden, damit vor Allem auch die dritte Art B. alvinipulli molekularbiologisch nachgewiesen

werden kann.

Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit an der Veterinärmedizinischen Fakultät der

Universität Leipzig die massenspektrometrische Differenzierung aviärer Brachyspiren mit MALDI-

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TOF-MS etabliert. Dafür war es notwendig, die Datenbank des Herstellers zu erweitern. Hierfür

wurden zunächst Referenzstämme und schließlich auch neue Isolate vom Geflügel, in dieser Arbeit

gewonnen, die mittels nox-Sequenzierung eindeutig differenziert wurden, eingesetzt. Trotz dieses

vorsichtigen Vorgehens, bei der Erweiterung der Datenbank, durch die Kombination mit der

Sequenzierung des nox-Genes, ist es zielführend, die Differenzierung der aviären Brachyspiren

erneut zu evaluieren, da beide Differenzierungsmethoden (MALDI-TOF-MS und nox-

Sequenzierung) nicht völlig unabhängig voneinander eingesetzt werden konnten. Eine weitere

Evaluierung könnte auch mit Stämmen erfolgen, die durch eine Genomsequenzierung eindeutig

einer Art zugeordnet werden können. Zurzeit liegen aber keine Hinweise vor, dass die

massenspektrometrische Differenzierung nicht zuverlässig wäre. Dies trifft insbesondere für die

beiden wichtigsten Erreger der AIS zu. So steht die MALDI-TOF-MS-Differenzierung von B. pilosicoli

und B. intermedia mit dem unabhängigem Nachweis des abgB- beziehungsweise des tnaA-Gens in

der MP-PCR bei allen Isolaten im Einklang. Für B. alvinipulli lag nur ein Referenzstamm vor, so dass

die Ergebnisse zu dieser Art noch weiter ausgebaut werden müssen. Im MALDI-TOF-MS-

Dendrogramm kam es zu einer Verschachtelung der B. innocens- und B. murdochii-Isolate. Diese

beiden Arten sind grundsätzlich schwierig zu differenzieren. Dieses Phänomen ist aber keinesfalls

neu und somit nicht zwangsläufig als Unzuverlässigkeit dieser Methode zu werten. FEBERWEE et

al. (2008) beschreibt dieselbe Verschachtelung dieser beiden Arten in seinen Untersuchungen. Es

zeigt sich bei dem Forscherteam dasselbe Bild, bezüglich der dort untersuchten B. innocens- und B.

murdochii-Isolate, in einem phylogenetischen Baum, der mittels einer partiellen Sequenz der 16S

rDNA erstellt wurde. Da beide Arten zurzeit als apathogen eingestuft werden, hat dies aber für die

AIS-Diagnose keine Bedeutung (SWAYNE et al. 1995; STANTON et al. 1998). Des Weiteren bilden in

dem phylogenetischen Baum, basierend auf der 16S rDNA, die Stämme B. intermedia, B.

hyodysenteriae und „B. suanatina“ ein sehr enges Cluster. Und weiterhin, wie es das MALDI-TOF-

MS-Dendrogramm aus der vorliegenden Arbeit bereits gezeigt hat, grenzt sich B.pilosicoli in der

Abbildung von FEBERWEE et al. (2008) in einem eigenen Bereich zu den übrigen Spezies der

Brachyspiren sehr deutlich ab. Die zahlreichen Übereinstimmungen dieser beiden Arbeiten

bezüglich der Cluster-Formation, unterstreichen die diagnostischen Fähigkeiten des MALDI-TOF-

MS nochmals. Die Isolate der Art „B. pulli“ bilden, bis auf eine Ausnahme, ebenfalls ein eigenes

Cluster. Da für diese Art aber weder ein Referenzstamm vorlag, noch viele Einträge in der NCBI-

Datenbank vorhanden sind, sind diese Ergebnisse als vorläufig einzustufen.

MALDI-TOF-MS-Dendrogramme sind vergleichender Natur und sollten allgemein nicht mit PCR-

basierten Dendrogrammen verglichen werden. Wichtig zu wissen ist, dass der diagnostische

Algorithmus nicht mit dem Algorithmus zur Berechnung der distance level in einem Dendrogramm

übereinstimmt (Bruker Daltonics, Persönliche Mitteilung). Durch den automatisierten Vorgang der

Compass-Software spielt es keine Rolle, ob ein MSP aus 6 Single-Spektren oder aus 9 Single-

Spektren besteht. Des Weiteren ist es nicht von Belang, wenn gegebenenfalls MSP´s für ein

Dendrogramm aus unterschiedlich vielen Single-Spektra erstellt werden. Über die Qualität eines

Datenbankeintrages entscheidet nicht vorwiegend die Anzahl der verwendeten Spektren.

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Vielmehr wird die Qualität wesentlich durch die Probenpräparation sowie die Auswahl qualitativ

hochwertiger Spektren für ein MSP bestimmt. Wenn beispielsweise 25 Spektren ausgewählt

werden, die alle unterschiedliches Peaktailing, wechselndes Basislinienrauschen, Störpeaks

und/oder sinkende Intensitäten durch Mehrfachnutzung besitzen, erzeugt man einen schlechteren

MSP-Eintrag, als wenn beispielsweise nur 5 Spektren verwendet werden, bei denen der Anwender

hohe Aufwendungen in die Probenpräparation investiert hat und eine Auswahl qualitativ

hochwertiger Spektren vorgenommen wurde. Aus diesem Grund wurde bei der Erstellung der

MSP`s mit dem MALDI-TOF-MS von den Herstellerempfehlungen abgewichen. Der Hersteller

Bruker empfiehlt das „8 x 3 Verfahren“. Damit ist gemeint, je 8 Spots einer Probe dreimal zu

messen, um dann 24 Single-Spektra (als Minimum werden 20 Single-Spektra angegeben) für die

Erstellung eines MSP`s zu erhalten. Die repräsentativen Peaks sollten dabei eine Abweichung

geringer als 500 parts per million (ppm) haben. Diese Empfehlung berücksichtigt, dass man bei

sehr vielen Spezies soviel Proteinmaterial auf einem Spot hat, dass dies für eine Dreifachmessung

ausreicht, das heißt die Intensität der Spektren aller Messungen hoch ist.

Bei einer Gattung wie Brachyspira, die im kulturellen Wachstum größere Schwankungen zeigt und

bei der Kultivierung grundsätzlich wenig Biomasse produziert, ist das Verfahren der „8 x 3

Messung“, nach den Erfahrungen in dieser Arbeit, nicht immer ohne Probleme anzuwenden. In

dieser Arbeit wurde bezüglich der Datenbankerweiterung das primäre Ziel verfolgt, möglichst

unabhängige Messungen (Spektren) zu erzeugen. Es war damit zu rechnen, dass bei diesen

teilweise sehr nahe verwandten Spezies nur sehr kleine Unterschiede in den ribosomalen

Proteinspektren auftreten. Folglich könnten Peaks mit niedriger Intensität eine größere

differential-diagnostische Bedeutung erhalten. Das zweite und dritte Spektrum vom gleichen Spot

besitzt immer eine niedrigere Gesamtintensität, als das erste Spektrum und damit grundsätzlich

ein niedrigeres differential-diagnostisches Potential. Die Aussagekraft von drei voneinander

unabhängigen Messungen ist demnach wesentlich größer und insbesondere bei den Brachyspiren

zielführend.

Die Prävalenz und Epidemiologie der AIS in Deutschland sollte weiter untersucht werden, da die

Situation in der Bundesrepublik Deutschland, im Vergleich zu Ländern wie England, sehr unklar ist.

Dies ist besonders erstaunlich, da im Jahr 2015 allein 40,2 Millionen Legehennen in Deutschland

registriert waren (Destatis. Erhebungen zum Geflügel. 2016 (zitiert vom 01.05.2016)

https://www.destatis.de/DE/ZahlenFakten/Wirtschaftsbereiche/LandForstwirtschaftFischerei/Tier

eundtierischeErzeugung/MethodischesGefluegel.html).

Mit dieser Arbeit ist es gelungen, den Grundstein für weiterführende Untersuchungen der aviären

Brachyspiren in Deutschland zu legen. Durch die Etablierung eines geeigneten Selektivnährbodens,

dem Tryptikase-Soja-Agar mit den drei genannten Antibiotikazusätzen, wurde eine sehr wichtige

Grundvoraussetzung für eine erfolgreiche kulturelle Anzucht aus Geflügelkot geschaffen. Des

Weiteren ist die erweiterte Datenbank des MALDI-TOF-MS eine gute Basis, um die

massenspektrometrische Differenzierung aviärer Brachyspirenisolate durchzuführen. Es ist aber

wichtig, noch weitere Stämme, insbesondere bestätigte Referenzstämme der Spezies B. alvinipulli

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sowie „B. pulli“ in der Datenbank zu berücksichtigen, da bisher nur wenige Einträge vorhanden

sind.

Die neu entwickelte Multiplex-PCR aus dieser Studie eignet sich, nach den Ergebnissen dieser

Arbeit, zur Differenzierung der pathogenen Arten B. pilosicoli und B. intermedia. In Zukunft ist es

unbedingt notwendig diese PCR weiterzuentwickeln, um insbesondere auch B. alvinipulli

molekularbiologisch detektieren zu können. Damit könnten zukünftig die drei wichtigsten Erreger

der AIS in einer PCR differenziert werden. Wünschenswert wäre ebenfalls eine weitere Methode,

welche die Arten B. murdochii und B. innocens sicher differenzieren kann.

Zukünftig sollte eine mögliche Assoziation eines Nachweises pathogener Brachyspiren und

klinischer Erscheinungen in Deutschland noch gezielter untersucht werden. Es wäre dafür wichtig,

die Klinik in den Beständen genauer zu erfassen. Insbesondere die Leistungsdaten und eine

Bestimmung des Feuchtigkeitsgrades der Kotproben sind von größerer Bedeutung, um auch

mildere Verläufe der AIS zu erkennen. Ätiologisch spielt die Zusammensetzung des Futters und das

Vorkommen weiterer Erreger vermutlich eine größere Rolle. Daher sollten diese Parameter

verstärkt beleuchtet werden. Die Bedeutung der AIS in Deutschland ist zurzeit völlig unklar. In

dieser Arbeit wurde die Differenzierungsmöglichkeit evaluiert und optimiert, so dass die

Voraussetzungen für weiterführende Untersuchungen wesentlich verbessert wurden.

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6. Zusammenfassung

Monika Harms

Differenzierung aviärer Brachyspiren mit PCR-basierten Methoden und MALDI-TOF-MS


Eingereicht im Oktober 2017

66 Seiten, 7 Abbildungen, 12 Tabellen, 188 Literaturangaben, 7 Anhänge

Schlüsselwörter: Brachyspira, AIS, nox, tnaA, abgB, MALDI-TOF-MS

Einleitung

Die aviäre intestinale Spirochätose (AIS) ist eine infektiöse Faktorenerkrankung, die vor allem bei

Legehennen auftritt. Zurzeit werden Brachyspira (B.) pilosicoli, B. intermedia und B. alvinipulli als

wichtige Erreger der AIS eingestuft. Die AIS geht mit Diarrhoe, Gewichtsverlust und reduzierter

Legeleistung sowie schlechter Qualität der Eier einher. Da beim Geflügel auch apathogene und

sehr schlecht charakterisierte Brachyspirenarten vorkommen, ist die Differenzierung aviärer

Brachyspiren für die Diagnostik der AIS wichtig und ohne allgemein akzeptierten Goldstandard

schwierig.

Ziele der Untersuchungen

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Optimierung der kulturellen Differenzierung aviärer

Brachyspiren. Es erfolgte eine vergleichende Evaluierung einer genotypischen Differenzierung

mittels Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (PCR)-basierter Methoden, wie der NADH-Oxidase

(nox)-Sequenzierung und einer neuen Multiplex-PCR (MP-PCR) sowie einer phänotypischen

Differenzierung mittels Matrix-Assistierter Laser-Desorption-Ionisierung (MALDI) mit der

Flugzeitanalyse (engl. time of flight, TOF). Des Weiteren sollten erste Daten zum Vorkommen der

verschiedenen Brachyspirenarten bei Legehennen in unterschiedlichen Haltungssystemen in

Deutschland gesammelt werden.

Material und Methoden

Es wurden in klinisch unauffälligen Legehennenbetrieben (n=27) mit unterschiedlichen

Haltungsformen (Bodenhaltung, Freilandhaltung und Biohaltung) Kloakentupfer (n=6/ Betrieb)

gesammelt. Des Weiteren konnten 29 caecale Tupfer aus 5 Bodenhaltungsbetrieben gewonnen

werden. Die Proben wurden auf einem Selektivnährboden kultiviert, der in dieser Arbeit für den

Nachweis von Brachyspiren im Geflügelkot entwickelt wurde. Von allen verdächtigen Kolonien

erfolgte nach DNA-Isolierung, eine nox-PCR mit folgender Sequenzierung des Amplifikates. Die

nox-Sequenzen wurden mittels Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)-Analyse zur

Differenzierung der Arten eingesetzt. Für die Analyse mittels MALDI-TOF-MS war es notwendig,

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die kommerzielle Datenbank zu erweitern. Dazu wurden von den verfügbaren Referenzstämmen

sowie von Feldisolaten Main Spectra Profiles (MSP`s) erstellt. In dieser Arbeit konnte eine neue

MP-PCR etabliert werden, mit der das nox-Gen (CP003490), das Tryptophanase-Gen (tnaA) (Gen

BHWA1_01919 im Genom von B. hyodysenteriae CP001357.1) und das Gen für die

Hippurathydrolyse (abgB) nachgewiesen werden kann.

Ergebnisse

In Vorversuchen mit Einzelproben von Hühnern erfolgte eine Modifikation der für porzine

Brachyspiren angewandten Kultivierungsbedingungen. Insbesondere durch die Einführung eines

neuen Nährbodens mit 6,25 µg/ml Colistin, 12,5 µg/ml Rifampicin und 200 µg/ml Spectinomycin

als einzige selektive Zusätze, konnte die Isolation erleichtert werden. Durch dieses

Kultivierungsverfahren konnten 45 Brachyspirenisolate aus 191 Proben gewonnen werden. Alle 45

Feldisolate waren in der nox-PCR positiv. Mit anschließender Sequenzierung und Abgleich der

Sequenzabschnitte mittels BLAST-Analyse des nox-Amplifikates, erfolgte für 44 Isolate eine

Speziesbestimmung. Erstmals wurden aviäre Brachyspirenarten mittels massenspektrometrischer

Analyse differenziert. Mit der kommerziell erhältlichen MALDI-TOF-MS-Datenbank, konnte in 33

Fällen eine Speziesdiagnose und in 11 Fällen eine Gattungsdiagnose gestellt werden. Neunmal

konnte keine Identifizierung erlangt werden. Durch die Erweiterung der Datenbank konnte für alle

Isolate (n=53, 43 Feldisolate (2 nicht mit dem MALDI gemessen), 10 Referenzstämme) eine

gesicherte Speziesdiagnose erzielt und bei allen Isolaten pathogener Arten konnte eine 100%ige

Übereinstimmung mit dem Ergebnis der nox-Sequenzierung erreicht werden. In der neuen MP-

PCR zeigte sich, dass für alle Referenzstämme sowie für alle Feldisolate das 939 Basenpaar (bp)

Amplikon des nox-Gens detektiert wurde. Des Weiteren zeigte sich für alle Stämme von B.

hyodysenteriae, B. intermedia und „B. suanatina“ eine zweite Bande bei 325 bp in

Übereinstimmung mit dem tnaA positiven Genotyp. Ein weiteres Amplikon bei 744 bp, welches auf

das abgB-Gen zurückgeht, wurde bei allen B. pilosicoli-Stämmen generiert. Insgesamt konnten in

60 % der untersuchten Betriebe Brachyspiren nachgewiesen werden. In 87 % der Fälle handelte es

sich um apathogene Arten. Die pathogenen Arten B. pilosicoli und B. intermedia konnten in 5

Betrieben nachgewiesen werden. B. alvinipulli wurde nicht isoliert.

Schlussfolgerungen

Der neue Selektivnährboden ist für die kulturelle Untersuchung von Geflügelkotproben auf

Brachyspiren zielführend. Mit dem MALDI-TOF-MS kann nach der Erstellung von neuen

Masterspektren eine Differenzierung der aviären Brachyspiren erfolgen. Grundsätzlich sprechen

die Ergebnisse für eine gute Übereinstimmung der nox-Sequenzierung und der MALDI-TOF-MS-

Analyse. Die neue MP-PCR eignet sich speziell zur Detektion von B. pilosicoli sowie zur

unterstützenden Differenzierung von B. intermedia. Die unterschiedlichen Brachyspirenarten,

einschließlich der AIS-Erreger B. pilosicoli und B. intermedia, kommen in unterschiedlichen

Legehennen-Haltungsformen in Deutschland vor.

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7. Summary

Monika Harms

Differentiation of avian Brachyspira by PCR-based methods and MALDI-TOF-MS in Germany

Institute for Bacteriology and Mycology

Submitted in October 2017

66 pages, 7 figures, 12 tables, 188 references, 7 appendices

Keywords: Brachyspira, AIS, nox, tnaA, abgB, MALDI-TOF-MS

Introduction

Avian intestinal spirochaetosis (AIS) is a multifactorial disease affecting mainly layer flocks.

Currently Brachyspira (B.) pilosicoli, B. intermedia and B. alvinipulli are considered to be the main

causative agents of AIS. Clinical signs of AIS include diarrhea, weight loss, reduced egg production

and fecal staining of eggs. As apathogenic as well as poorly described Brachyspira species also

colonize poultry, differentiation of avian Brachypira is very important for the diagnosis of AIS but

also difficult due to a missing gold standard.

Aims of the study

One aim of this study was to optimize cultivation conditions of avian Brachyspira species.

Genotypic differentiation with polymerase chain reaction (PCR)-based methods, like NADPH

oxidase (nox)-sequencing or a new multiplex-PCR (MP-PCR), and phenotypic differentiation with

matrix-assisted laser-desorption-ionization with time of flight (MALDI-TOF) were comparatively

evaluated. Additionally, the first data on prevalences of the different Brachyspira in flocks of layer

hens in dependence of the housing systems in Germany were recorded.

Materials and Methods

In clinically unobtrusive flocks (n=27) with different housing systems (floor housing, free range and

organic housing) of poultry cloacal swabs (n=6/ flock) were obtained. Additionally, 29 caecal swabs

in 5 flocks with floor housing were collected. The samples were cultivated on a selective medium,

specifically designed in this study for detection of Brachyspira in faeces of poultry. From suspicious

colonies, DNA was isolated and a nox-PCR with subsequent sequencing of the amplicon was

conducted. The partial sequences of the nox-genes were differentiated by basic alignment search

tool (BLAST)-Analysis. For measurement with MALDI-TOF-MS the commercial database had to be

extended. For this Main Spectra Profiles (MSP`s) were generated, using reference and field strains.

In this study, a new MP-PCR, detecting the nox-gene (CP003490), the tryptophanase-gene (tnaA)

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(gene BHWA1_01919 in the genom von B. hyodysenteriae CP001357.1) and the gene encoding for

the hippurate hydrolysis (abgB), was established.

Results

Firstly, media for porcine cultivation of Brachyspira were modified for the use in the diagnosis of

AIS. The new culture medium included supplementation with 6.25 µg/ml colistin, 12.5µg/ml

rifampicin and 200 µg/ml spectinomycin as selective components only. Using this method, 45

Brachyspira isolates were obtained from 191 samples from poultry. Each isolate was positive in

the nox-PCR. By subsequent sequencing and blasting of the nucleotide sequences against the

NCBI-database, 44 Isolates were differentiated. For the first time, avian Brachyspira isolates were

differentiated by mass spectrometry. Using the original Bruker database, a species and genus only

diagnosis was achieved in 33 and 11 cases, respectively. In 9 cases, a genus was not identified.

Measurement with the extended database resulted in a reliable species diagnosis for each isolate

(n=53; 43 field isolates (2 isolates not measured with MALDI), 10 reference strains). For the

isolates of a pathogenic species nox-sequencing and MALDI-TOF-MS showed 100 % accordance.

The MP-PCR generated for all reference strains and field isolates the 939 bp amplicon of the nox-

gene. Furthermore, the strains of B. hyodysenteriae, B. intermedia and „B. suanatina“ displayed,

as expected, a second band with approximately 325 bp in accordance with a tnaA positive

genotype. In addition to the nox-gene all B. pilosicoli strains were positive for the abgB

amplification product, running at 744 bp. In summary 60 % of the flocks were positive for

Brachyspira. In most positive cases (87 %) only Brachyspira species regarded as apathogenic were

detected. Pathogenic species, namely B. pilosicoli and B. intermedia, were detected in 5 flocks. B.

alvinipulli was not isolated.

Conclusions

The new selective medium is suitable for cultivation of Brachyspira from avian faeces. Reliable

identification of Brachyspira spp. of avian origins is possible with MALDI-TOF-MS after extension of

the database. The results of this study indicate a high accordance of nox-sequencing and MALDI-

TOF-MS-analysis for differentiation of Brachyspira. The new MP-PCR is an appropriate diagnostic

approach to investigate samples of poultry for Brachyspira, specifically for detection of B. pilosicoli

and supportive differentiation of B. intermedia. Various Brachyspira species, including the

causative agents of AIS B. pilosicoli and B. intermedia, might be found in the different poultry

housing systems in Germany.

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8. Literaturverzeichnis

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Seite | 84

9. Anhang

9.1 Datenerfassungsbogen

Betrieb:

Datum:

In

Tierart

Bestandsgröße

Betriebsform

( ) reiner Legehennenbetrieb

( )eigene Aufzucht, Legeperiode im gleichen Stall/ Betrieb

( ) eigene Aufzucht, Legeperiode räumlich getrennt

( ) Zuchtbetrieb

( ) Broiler- und Legehennenhaltung

( ) Geflügelhaltungsbetrieb (mind. 2 Arten:________________________________________)

( ) Landwirtschaftlicher Betrieb mit Geflügel und Schweinen

( ) Landwirtschaftlicher Betrieb mit mehreren Tierarten: (_____________________________________________)

( ) Rassegeflügel: Rasse (_________________________)

( ) Hobbyhaltung: Rasse (_________________________)

( ) sonstiges:___________________________________

Haltungsform Gruppengröße

( )Kleingruppenhaltung je

( ) Bodenhaltung je

( ) Freilandhaltung je

( ) Biohaltung je

Seite | 85

Einstreu

( ) Stroh: ( )Kurz <8cm ( ) Langstroh

( ) Weichholzspäne

( ) Sand

( ) Strohpellets

( ) Dinkelspelzen

( ) sonstiges: ___________________________________

( ) Einstreutiefe:_________________________________

Vorgehen mit der Einstreu während der Haltungsperiode

( ) wird teilweise ausgetauscht

( ) es wird nachgestreut

Fütterung

( ) Alleinfutter

( ) kombinierte Fütterung (z.B. Körner + Pellets)

( ) sonstiges: ___________________________________

Schadnagerbekämpfung

Art der Maßnahme:________________________________

Wie häufig durchgeführt:____________________________

Tiere:

Herkunft

Eingestallt am

Alter

Rasse

Leistung

Probleme in der Legeperiode

Beh. mit Antibiotika

Beh. mit Antiparasitika

Sonstiges:

Seite | 86

9.2 Auflistung der Ergebnisse durch die durchgeführte BLAST-Analyse

Isolat Identifiziert als, in % N1.1 B. sp 96 N1.3 B. sp 96 N1.4 B. sp 96 N1.6 B. sp 96 N2.5 B. innocens 93 N5.1 - N5.6 B. innocens 94 N6.3 B. innocens 100 N6.4 B. innocens 100 N8.3 B. sp 96 N10.2 B. innocens 97 T1.3 B. sp 96 T1.6 B. intermedia 99 T2.4 B. sp 96 T3.4 B. pilosicoli 100 T5.4 B. pilosicoli 100 T6.2 B. innocens 100 T6.4 B. pilosicoli 100 T7.5 B. pulli 100 T8.5 B. pulli 100 T9.4 B. intermedia 99 T9.5 B. intermedia 99 Referenzstämme B. alvinipulli 3382/2/03 B. alvinipulli 100 B. hampsonii3624 B. hampsonii 100 B. hampsonii5369 B. murdochii 100 B. hyodysenteriae404/06 B. hyodysenteriae 100 B. innocensC336 B. innocens 100 B. intermedia 863-1x/06 B. intermedia 100 B. intermediaAN26/93 B. intermedia 100 B. murdochiiC301 B. murdochii 100 B. pilosicoli102/06 B. pilosicoli 100 „B. suanatina“AN4859/03 „B. suanatina“ 100 Broilerelterntiere W1.1 B. murdochii 100 W1.2 B. murdochii 100 W1.3 B. murdochii 100 W1.4 B. murdochii 100 W1.5 B. pulli 99 W2.2 B. murdochii 100 W2.3 B. murdochii 100 W2.4 B. murdochii 100 W2.6 B. murdochii 100

Seite | 87

Isolat Identifiziert als in % W3.1 B. murdochii 100 W3.2 B. murdochii 100 W3.3 B. murdochii 100 W3.5 B. murdochii 100 W3.6 B. murdochii 100 W4.1 B. murdochii 100 W4.2 B. pulli 99 W4.3 B. pulli 99 W4.5 B. murdochii 100 W4.6 B. murdochii 100 W5.2 B. murdochii 100 W5.3 B. murdochii 100 W5.5 B. murdochii 100 W5.6 B. murdochii 100

9.3 Auszug aus einem Befundbogen des MALDI-TOF-MS zur Beurteilung der erhaltenen Ergebnisse

Seite | 88

9.4 Übersicht zur Identifizierung mittels MALDI-TOF-MS mit der Bruker Datenbank und der erweiterten Datenbank

Isolat Bruker DB erweiterte Datenbank

Identifikation Ø Score (max. Score) Identifikation Ø Score N1.1 B. sp. 1,72 (1,86) B. innocens 2,68 N1.3 B. sp. 1,63 (1,85) B. innocens 2,73 N1.4 B. innocens 1,89 (2,02) B. innocens 2,63 N1.6 B. innocens 1,91 (2,06) B. innocens 2,74 N2.5 B. sp. 1,76 (1,93) B. innocens 2,69 N5.1 B. sp. 1,56 (1,72) B. innocens 2,77 N5.6 B. innocens 1,98 (2,16) B. innocens 2,58 N6.3 B. sp. 1,86 (1,95) B. innocens 2,75 N6.4 B. innocens 2,04 (2,22) B. innocens 2,69 N8.3 B. sp. 1,46 (1,65) B. innocens 2,66 N10.2 B. innocens 1,95 (2,07) B. innocens 2,72 T1.3 - - - - T1.6 - - - - T2.4 B. innocens 2,07 (2,16) B. innocens 2,71 T3.4 B. pilosicoli 2,05 (2,28) B. pilosicoli 2,62 T5.4 B. pilosicoli 1,95 (2,12) B. pilosicoli 2,54 T6.2 B. innocens 2,02 (2,14) B. innocens 2,65 T6.4 B. pilosicoli 2,22 (2,37) B. pilosicoli 2,64 T7.5 B. sp. 1,43 (1,68) B. pulli 2,77 T8.5 B. sp. 1,61 (1,77) B. pulli 2,70 T9.4 B. intermedia 2,09 (2,18) B. intermedia 2,76 T9.5 B. intermedia 1,95 (2,11) B. intermedia 2,66 Referenzstämme B. alvinipulli 3382/2/03 B. sp. 1,24 (1,29) B. alvinipulli 2,74 B. hampsonii3624 B. murdochii 1,88 (2,05) B. hampsonii 2,65 B. hampsonii5369 B.sp. 1,34 (1,55) B. hampsonii 2,68 B. hyodysenteriae404/06 B. sp 1,39 (1,55) B.

hyodysenteria

e

2,80

B. innocensC336 B. innocens 2,13 (2,25) B. innocens 2,67 B. intermedia 863-1x/06 B. sp. 1,50 (1,59) B. intermedia 2,69 B. intermediaAN26/93 B. sp 1,57 (1,68) B. intermedia 2,77 B. murdochiiC301 B. murdochii 2,00 (2,13) B. murdochii 2,60 B. pilosicoli102/06 B. pilosicoli 1,99 (2,12) B. pilosicoli 2,73 „B. suanatina“AN4859/03 B. intermedia 1,95 (2,11) „B. suanatina“ 2,72 Broilerelterntiere W1.1 B. murdochii 1,87 (2,00) B. murdochii 2,71 W1.2 B. murdochii 1,89 (2,08) B. murdochii 2,70 W1.3 B. murdochii 1,99 (2,07) B. murdochii 2,70 W1.4 B. murdochii 1,93 (2,02) B. murdochii 2,68 W1.5 B. murdochii 2,02 (2,13) B. murdochii 2,67 W2.2 B. murdochii 1,93 (2,09) B. murdochii 2,73 W2.3 B. murdochii 1,82 (2,00) B. murdochii 2,66 W2.4 B. murdochii 2,02 (2,18) B. murdochii 2,65 W2.6 B. innocens 1,93 (2,05) B. innocens 2,74 W3.1 B. murdochii 1,94 (2,06) B. murdochii 2,72

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Isolat

Bruker DB erweiterte Datenbank

Identifikation Ø Score (max. Score) Identifikation Ø Score W3.2 B. murdochii 1,94 (2,04) B. murdochii 2,71 W3.3 B. sp 1,61 (1,82) B. murdochii 2,49 W3.5 B. sp 1,52 (1,78) B. murdochii 2,50 W3.6 B. murdochii 2,01 (2,11) B. murdochii 2,76 W4.1 B. sp 1,88 (1,98) B. murdochii 2,55 W4.2 B. sp 1,33 (1,46) B. pulli 2,74 W4.3 B. sp 1,38 (1,59) B. pulli 2,73 W4.5 B. murdochii 2,02 (2,20) B. murdochii 2,69 W4.6 B. murdochii 2,02 (2,14) B. murdochii 2,68 W5.2 B. murdochii 1,87 (2,01) B. murdochii 2,69 W5.3 B. sp 1,73 (1,81) B. murdochii 2,61 W5.5 B. murdochii 2,08 (2,17) B. murdochii 2,72 W5.6 B. sp 1,88 (1,96) B. murdochii 2,75

Seite | 90

9.5 Statistische Übersicht, Normalverteilung der Logscores, alpha* (α) untere Grenze (uG) und α

obere Grenze (oG) bei den auf Brachyspiren positiven Betrieben

Bruker Datenbank Erweiterte Datenbank

Betrieb

Logscores der Isolate

Logscore Ø

SD α (uG)

α (oG)

Logscores der

Isolate

Logscore Ø

SD α (uG)

α (oG)

N1 1,72 1,63 1,89 1,91

1,78 0,06 1,54 2,04 2,68 2,73 2,63 2,74

2,69 0,02 2,60 2,79

N2 1,76 2,69 N5 1,56

1,98 1,77 0,21 0,99 2,55 2,77

2,58 2,67 0,1 2,32 3,03

N6 1,86 2,04

1,95 0,09 1,62 2,28 2,75 2,69

2,72 0,03 2,61 2,83

N8 2,66 1,46 N10 1,95 2,72 T2 2,07 2,71 T3 2,05 2,62 T5 1,95 2,54 T6 2,02

2,22 2,12 0,1 1,75 2,49 2,65

2,64 2,64 0,00 2,63 2,66

T7 1,43 2,77 T8 1,61 2,70 T9 2,09

1,95 2,02 0,07 1,76 2,28 2,76

2,66 2,71 0,05 2,52 2,90

W1 1,87 1,89 1,99 1,93 2,02

1,94 0,03 1,83 2,05 2,71 2,70 2,70 2,68 2,67

2,69 0,01 2,66 2,72

W2 1,93 1,82 2,02 1,93

1,92 0,04 1,77 2,08 2,73 2,66 2,65 2,74

2,69 0,02 2,61 2,78

W3 1,94 1,94 1,61 1,52 2,01

1,80 0,1 1,43 2,17 2,72 2,71 2,49 2,50 2,76

2,64 0,06 2,42 2,85

W4 1,88 1,33 1,38 2,02 2,02

1,73 0,15 1,15 2,30 2,55 2,74 2,73 2,69 2,68

2,68 0,03 2,55 2,80

W5 1,87 1,73 2,08 1,88

1,89 0,07 1,62 2,16 2,69 2,61 2,72 2,75

2,69 0,03 2,58 2,80

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9.6 Bilder der Haltung von Legehennen mit einem mobilen Hühnerstall in ökologischer Haltung

*Alpha 98 % igeWahrscheinlichkeit

unter Grenze 0,0001

obere Grenze 0,9999

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9.7 Danksagung

An erster Stelle gilt mein Dank meinem Doktorvater Herrn Prof. Christoph G. Baums für die

Überlassung des spannenden Themas und seine wissenschaftliche und methodische

Unterstützung während der gesamten Bearbeitungsphase meiner Dissertation.

Weiterhin danke ich Dipl. Ing. Jutta Hauptmann für die Einarbeitung in die kulturelle Anzucht

sowie in die bakteriologische Diagnostik und die stetige methodische Unterstützung während der

gesamten Arbeit.

Auch danke ich Frau Margitta Heider und Frau Dipl. Chem. Kerstin Klimke für gute Ratschläge und

Hilfestellung bei kulturell- diagnostischen und molekularbiologischen Aufgaben.

Herrn Tilo Heydel danke ich für die Unterstützung und Einarbeitung in das MALDI-TOF sowie die

zahlreichen und unermüdlichen fachlichen Gespräche, Ratschläge und Anmerkungen, die mich auf

dem Weg zur fertigen Arbeit immer wieder neue Aspekte und Ansätze entdecken ließen. Seine

methodische Unterstützung war immer zielführend.

Ausserdem gilt mein Dank Dr. Rene Bergmann für die Betreuung bei den molekularbiologischen

Arbeiten und des Primerdesign der neuen Multiplex- PCR.

Viktoria Rungelrath hat mich in die Durchführung vieler Prozesse eingearbeitet, insbesondere in

die Sequenzierung hat sie mich gut eingewiesen.

Theresa Bartosch danke ich für Ihre unglaubliche Motivationsfähigkeit und gute Laune, die sie

verbreitet hat.

Besonders in der Anfangsphase stand Dr. Stefan Linke mir mit seinem fundierten Wissen zur Seite

und hat mit mir bei Problemen immer gute Lösungsansätze gefunden. Dafür bedanke ich mich bei

Ihm.

Außerdem gilt mein Dank allen anderen Mitarbeitern der Diagnostik, die diese Arbeit möglich

machten und mich bei der Bearbeitung stets durch zielführende Diskussionen und anhaltende

Hilfestellung begleitet und unterstützt haben.

Allen Beteiligten meiner Studien bin ich sehr dankbar für die gute und zahlreiche Unterstützung

sowie die konstruktive und angenehme Zusammenarbeit. Dazu gehören insbesondere Frau Dr.

Judith Rohde (Institut für Mikrobiologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover) für ihren

kritischen Diskurs und die Überlassung von Brachyspirenstämmen (B. hyodysenteriae 404/06, B.

intermedia 863-1x/06, B. pilosicoli 102/06)

Desweiteren danke ich Dr. Volker Schmidt (Klinik für Vögel und Reptilien, Veterinärmedizinische

Fakultät, Universität Leipzig) für die histologische Untersuchung der Gewebeschnitte und die

stetige Unterstützung während der Erstellung dieser Arbeit.

Seite | 93

Dr. Christine Ahlers (Geflügelgesundheitsdienst, Thüringer Tierseuchenkasse) habe ich die

Vermittlung von Betrieben für die Probengewinnung zu verdanken.

PhD Viveca Båverud (National Veterinary Institute, Uppsala, Sweden) danke ich für das Überlassen

der folgenden Referenzstämme: B. suanatina AN4859/03; B. intermedia AN26/3, B. innocens

C336, B. murdochii C301 and the B. alvinipulli strain AN1268/3/04.

Besonders möchte ich an dieser Stelle auch allen danken, die an mich geglaubt und mich immer

unterstützt haben.

Hier besonders mein Vater, der mir half wo er nur konnte und meine gute Freundin Annika Reiter,

die mir schon im Studium immer zur Seite stand und immer die richtigen Worte zur Motivation

und Problemlösung gefunden hat.

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