Aus der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte des

Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil der Ruhr-Universität Bochum

Direktor: Prof. Dr. med. M. Lehnhardt

Onkolytische Aktivität des Designer Host Defense Peptids [D]-K4H2L9 bei Weichteilsarkomen im immunkompetenten syngenen Mausmodell

Inaugural-Dissertation zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer

Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von Corinn Isabel Mata Mera

aus Bonn in 2012

Dekan: Prof. Dr. med. Klaus Überla Referent: Prof. Dr. med. Lars Steinsträßer Korreferent: PD Dr. rer. nat. Carsten Theiß Tag der Mündlichen Prüfung: 5. November 2013

Abstract

Mata Mera Corinn Isabel Onkolytische Aktivität des Designer Host Defense Peptids [D]-K 4H2L 9 bei Weichteilsarkomen im immunkompetenten syngenen Mausmodell

Problem: Weichteilsarkome, die 1 % der Neoplasien darstellen, haben häufig eine schlechte Prognose aufgrund einer oftmals späten Diagnose und einer hohen Rate an Resistenzen gegen Zytostatika und Strahlentherapie, sowie Rezidiven. Seit der Entdeckung der antibakteriellen und teilweise onkolytisch wirksamen Host Defense Peptide, entwickeln die Forscher synthetische Peptide, die möglichst spezifisch Krebszellen bekämpfen. Das synthetisch hergestellte Designer-Peptid [D]-K4H2L9 zeigte im Einsatz gegen Weichteilsarkomzellen vielversprechende Ergebnisse unter anderem im athymischen Xenograft-Modell. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Wirksamkeit dieses Host Defense Peptids im immunkompetenten Organismus überprüft, um Einzelheiten über seine Wirkungsweisen herauszufinden. Methode: Zunächst wurde die Einschränkung der Proliferationsaktivität von Fibrosarkomzellen, Synovialsarkomzellen und von nicht-tumorösen Fibroblasten durch [D]-K4H2L9 sowie durch das Vergleichspeptid scP-K3H3L9 mittels BrdU-Assays untersucht. Auch der Effekt einer Kombinationstherapie mit dem Zytostatikum Doxorubicin wurde in vitro geprüft. Im syngenen immunkompetenten Mausmodell wurde dann die Wirksamkeit von [D]-K4H2L9 in vivo beobachtet. Proben der Tumore aus diesem Versuch wurden anschließend mittels Immunhistochemie und RT-PCR analysiert, um einzelne Auswirkungen der Peptid-Therapie identifizieren zu können. Ergebnis: Das Peptid [D]-K4H2L9 erreichte in vitro eine Hemmung der Zellproliferationsrate bis 98 % gegen maligne und nicht-maligne Zellen. Das Vergleichspeptid scP-K3H3L9 hemmte die Zellproliferation nicht. In Kombination mit dem Zytostatikum Doxorubicin zeigte [D]-K4H2L9 einen Synergie-Effekt bei Anwendung auf die Sarkomzellen. Die in vivo-Applikation erzielte eine partielle Ansprechrate von 40 % mit Komplettremissionen in weiteren 20 %. In den peptidbehandelten Tumoren zeigten sich eine Hemmung der Angiogenese sowie eine Rekrutierung von T-Zellen und Makrophagen. MIG konnte als ein vermittelndes Zytokin identifiziert werden. Diskussion: [D]-K 4H2L9 zeigte im Rahmen dieser Dissertation weitere vorteilhafte Wirkungen eines onkolytischen Therapeutikums. So erwies es sich bei den in vitro-Versuchen abermals als spezifisch gegen maligne Zellen, wobei das für den Subtyp spezifische therapeutische Fenster bei der Dosierung beachtet werden muss. Die Hemmung der Angiogenese korrelierte mit dem Therapieerfolg. Nach einem ersten Nachweis einer Rekrutierung von Immunzellen und einer signifikanten Erhöhung der MIG-Expression im Tumorgewebe nach [D]-K4H2L9-Einfluss gilt es die chemotaktische Wirkung noch genauer zu analysieren und weitere vermittelnde Zytokine zu identifizieren. Des Weiteren ist die in vivo-Untersuchung der Kombinationstherapie mit dem Zytostatikum Doxorubicin, sowohl lokal als dann gegebenenfalls auch systemisch, von großem Interesse.

1

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG 7

1.1 Weichteilsarkome 7 1.1.1 Definition 7

1.1.2 Epidemiologie und Klassifikation 7

1.1.3 Ätiologie 9

1.1.4 Pathologie 10

1.1.5 Symptome 11

1.1.6 Diagnostik 11

1.1.7 Therapie 14

1.1.8 Prognose 15

1.2 Host Defense Peptide 16 1.2.1 Natürliche Host Defense Peptide des Immunsystems 16

1.2.2 Synthetische Host Defense Peptide in der Tumortherapie 18

1.2.3 Gezielt-konfigurierte Peptide im Einsatz gegen Neoplasien 19

2 ZIELSETZUNG 22

3 MATERIAL UND METHODEN 23

3.1 Material 23 3.1.1 Chemikalien und Reagenzien 23

3.1.2 Antikörper und Seren 24

3.1.3 Primer und Sonden 25

3.1.4 Fertige Versuchsansätze 26

3.1.5 Puffer, Lösungen 26

3.1.6 Geräte 27

3.1.7 Das synthetische Host Defense-Peptid 29

3.1.8 Das Scrambled-Peptid scP-K3H3L9 29

3.1.9 Primärzellen und Zelllinien 29

3.1.10 Tiere 30

3.2 Methoden 30 3.2.1 Lösen der Peptide 30

3.2.1.1 Lösen des Peptids [D]-K4H2L9 30

2

3.2.1.2 Lösen des Scrambled-Peptids scP-K3H3L9 31

3.2.2 Generierung und Kultivierung der Zellen 31

3.2.2.1 Gewinnung der humanen Fibroblasten 31

3.2.2.2 Zellkulturbedingungen 31

3.2.3 In vitro-Versuch: BrdU-Zellproliferationsassay 32

3.2.4 In vivo-Versuch 33

3.2.4.1 Genehmigung 33

3.2.4.2 Projektübersicht 33

3.2.4.3 Injektion der Tumorzellen 34

3.2.4.4 Therapeutische Injektionen 35

3.2.4.5 Euthanasie 35

3.2.4 Immunhistochemie 36

3.2.4.1 Allgemeines Protokoll 36

3.2.4.2 Ki67-Proliferationsaktivitätfärbung 38

3.2.4.3 CD31-Blutgefäßfärbung 38

3.2.4.4 CD3-T-Zellfärbung 38

3.2.4.5 F4/80-Makrophagenfärbung 38

3.2.4.6 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen 39

3.2.5 Genexpressionsanalyse 39

3.2.5.1 RNA-Isolation 39

3.2.5.2 cDNA-Synthese 41

3.2.5.3 Real-time-PCR 41

3.2.5.4 Gel-Elektrophorese 42

4 ERGEBNISSE 44

4.1 Wirkung des Peptids [D]-K4H2L9 in in vitro-Studien 44 4.1.1 Hemmung der Zellproliferation 44

4.1.2 Nachweis der spezifischen Wirkung durch [D]-K4H2L9 45

4.1.3 Hemmung der Zellproliferation durch Doxorubicin 46

4.1.4 Kombination von [D]-K4H2L9 mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin 47

4.2 Wirksamkeit des Peptids [D]-K4H2L9 im syngenen Tiermodell 48

4.3 Histologische Beobachtungen in den Tumoren nach [D]-K 4H2L9-Therapie 54 4.3.1 Hemmung der Proliferation in vivo 54

4.3.2 Hemmung der Angiogenese 55

4.3.3 Rekrutierung von T-Zellen 56

4.3.4 Rekrutierung von Makrophagen 56

3

4.4 Genexpressionsanalyse nach dem Einfluss von [D]-K4H2L9 57

5 DISKUSSION 61

6 ZUSAMMENFASSUNG 71

7 LITERATUR 72

DANKSAGUNG

CURRICULUM VITAE

4

Abkürzungen

Abb. Abbildung

AMP antimikrobielles Peptid

BrdU 5-Brom-2-Desoxy-Uracil

BFS-1 wt murines Fibrosarkom

cDNA komplementäre DNA (engl.: complementary DNA)

CT Computertomographie

DAB 3,3’-Diaminobenzidin

DAPI 4’,6-Diamidin-2-phenylindol

DMEM engl.: Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DNA Desoxyribonukleinsäure

EDTA Ethyldiamintetraessigsäure

FCS fötales Kälberserum (engl.: Fetal Calf Serum)

H Histidin

hBD humanes β-Defensin

HDP Host Defense Peptid

HE Hämatoxylin-Eosin(-Färbung)

HFB primäre humane Fibroblasten

HNP Humane Neutrophile Peptide

HT1080 humane Fibrosarkomzelllinie

IGFbp Insulin-ähnlicher-Wachstumsfaktor bindendes Protein (engl.: insulin-like

growth factor binding protein)

IL Interleukin

IFN-γ Interferon-gamma

IP Interferon-gamma induziertes Protein (engl.: interferon-gamma inducible

protein)

5-JÜR fünf-Jahre-Überlebensrate

K Lysin

L Leucin

LD50 mittlere letale Dosis

LDH Laktatdehydrogenase

MCP Monozyten chemotaktisches Protein (engl.: monocyte chemotactic

protein)

5

MDR Multiple Resistenzen (engl.: multidrug-resistence)

MFH Malignes Fibröses Histiozytom

MIG Monokin induziert durch Interferon-gamma (engl.: monokine induced by

gamma)

MRT Magnetresonanztomographie

MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

NaOH Natriumhydroxid (Natronlauge)

NOV Nephroblastom überexprimiertes Gen (engl.: nephroblastoma

overexpressed gene)

PBS phosphatgepufferte Salzlösung (engl.: phosphate buffered saline)

PCR Polymerase-Kettenreaktion (engl:. polymerase chain reaction)

PECAM engl.: Platelet endothelial cell adhesion molecule

Pen Penicillin

R rückwärts

R0-Resektion Tumorexzision ohne mikroskopische Tumorrückstände

RNA Ribonukleinsäure

rpm Umdrehungen pro Minute (engl.: rounds per minute)

RPMI engl.: Roswell Park Memorial Institute

RT-PCR Echtzeit-PCR (engl.: Realtime-PCR)

scP Kontrollpeptid (engl.: scrambled peptide)

Strep Streptomycin

SW872 humane Liposarkomzelllinie

SW982 humane Synovialsarkomzelllinie

Tab. Tabelle

TAM Tumor-assoziierte-Makrophagen

V vorwärts

VEGF Vakulärer-endothelialer Wachstumsfaktor (engl.: vascular endothelial

growth factor)

wt Wildtyp

6

Tabellenverzeichnis 1.1 Einteilung der Sarkome 8 1.2 TNM-Klassifikation maligner Tumore nach UICC 13 1.3 Stadiengruppierung der Weichteilsarkome 13 1.4 Die Aminosäuresequenzen einiger 15-mer kationischen Peptide 20 3.1 Übersicht über Primer und Sonden für die RT-PCR 25

Abbildungsverzeichnis 1.1 Diagnostizierte Weichteilsarkom-Subtypen im Referenzzentrum für

Gliedmaßentumore 9 1.2 Einschränkung der Zellvitalität verschiedener Sarkomzelllinien und

Referenzzellen durch das Host Defense Peptid [D]-K4H2L9 21 3.1 Arbeitsphasen bei der Untersuchung der Wirkung des Host Defense

Peptids [D]-K4H2L9 30 4.1 Bestimmung der antiproliferativen Aktivität des Peptids [D]-K4H2L9 44 4.2 Bestimmung der antiproliferativen Aktivität des Peptids scP-K3H3L9 46 4.3 Bestimmung der antiproliferativen Aktivität des Zytostatikums

Doxorubicin 47 4.4 Bestimmung des antiproliferativen Effekts bei der Kombination von

[D]-K 4H2L9 und Doxorubicin 48 4.5 Hemmung des Tumorwachstums in vivo durch die Therapie mit

[D]-K 4H2L9 49 4.6 Tumorgewicht eine Woche nach Therapieende 50 4.7 Bilder der Veränderung der Tumorgröße 51 4.8 Serielle Lungenschnitte 52 4.9 Wachstumskurven der einzelnen Tumore der Therapie- und der

Kontrollgruppe 52 4.10 Immunhistochemische Anfärbung proliferierender Zellen im

Tumorgewebe 54 4.11 Immunhistochemische Anfärbung der Gefäßanschnitte im

Tumorgewebe 55 4.12 Immunhistochemischer Nachweis von T-Zellen im Tumorgewebe 56 4.13 Immunhistochemischer Nachweis von Makrophagen im Tumorgewebe 57 4.14 Gelelektrophorese der PCR-Ansätze 58 4.15 Genexpression einiger Zytokine eine Woche nach Therapieende 59

7

1 Einleitung

1.1 Weichteilsarkome

1.1.1 Definition Der Begriff Sarkom wurde ursprünglich für „fleischige“ und große Tumoren verwendet

entsprechend der griechischen Termini „sarkos“ für Fleisch und „oma“ für Geschwulst

(Stock, 1979). Der heutige Begriff des Sarkoms ist histologisch definiert und bezeichnet

Tumore mesenchymalen Ursprungs. Weichteilsarkome umfassen Neoplasien die von

extraskelettalen mesenchymalen Geweben ausgehen, wozu unter anderem Fett-,

Muskel- oder Bindegewebe, aber auch Strukturen des Gefäß- oder Lymphsystems

gehören.

1.1.2 Epidemiologie und Klassifikation Weichteilsarkome sind seltene Tumore und machen weniger als 1 % aller Neoplasien

der Erwachsenen und 15 % der Neoplasien im Kindesalter aus. Das Durchschnittsalter

der Diagnose liegt bei 57 Jahren (Vincenzi et al., 2010).

Bei diesen Neoplasien handelt es sich, unter anderem auf Grund der vielen

verschiedenen Ursprungsgewebe, um eine sehr heterogene Gruppe von Tumoren,

welche mehr als 50 Subtypen umfasst (Vincenzi et al., 2010) (Tab. 1.1). Im Register für

Gliedmaßentumore am Institut für Pathologie des Berufsgenossenschaftlichen

Universitätsklinikums Bergmannsheil, Ruhr-Universität Bochum, waren das

Liposarkom mit 22,9 %, das Maligne Fibröse Histiozytom (MFH) mit 17,5 % und das

Leiomyosarkom mit 10,1 % die häufigsten Weichteilsarkome. Die Fibromatose und das

Myxofibrosarkom stellten jeweils 6,5 % und das Synovialsarkom 6,4 % der Diagnosen

dar (n=2056; 1990-2009) (Abb. 1.1). Diese Verteilung entspricht der allgemeinen

Literatur.

8

Tab. 1.1 Einteilung der Sarkome (Enzinger, 1995).

Bezugsgewebe Diagnose Subtypenbindegewebige FibrosarkomTumorenfirbrohistiozytäre malignes fibröses pleomorph myxoid riesenzellig xanthomatösTumoren Histiozytomlipomatöse hochdifferenziertes lipomartig sklerosieren inflammatorischTumoren Liposarkom (LS)

myxoides LSrundzelliges LSpleomorphes LSmischzelliges LS

glattmuskuläre Leiomyosarkom klassisch myxoid inflamma- granularzellig Mit Tumoren torisch Riesenzellen

epitheloides Leiomyosarkomskelettmuskuläre Rhabdomyosarkom embryonal botryoid spindelzellig alveolär pleomorphTumoren

Ektomesenchymomvaskuläre Angiosarkom klassisch epitheloidTumoren

LymphangiosarkomKaposi-Sarkom

perivaskuläre malignes Tumoren Hämangioperizytom

maligner Glomustumorsynoviale maligner tendosynovialerTumoren Riesenzelltumormesotheliale malignesTumoren Mesotheliom (lokal)

diffuses epithelial spindelzellig biphasischMesothelium

neurale Tumoren maligner peripherer klassisch Tritontumor mit drüsiger Diff-Nervenscheidentumor erenzierungmaligner GranularzelltumorKlarzellsarkommalignes melanozytäres SchwannomNeuroblastomGanglioneuroblastomperipherer neuroektodermaler Tumor

paraganglionäre malignes Tumoren Paragangliomchondromatöse/ extraskelletales hochdiff. myxoid mesen- dedifferenziertossäre Tumoren Chondrosarkom chymal

extraskelletalesOsteosarkom

mesenchymal malignesvariante Diff. Mesenchymomverschieden- alveoläres Weichteilsarkomartige epitheloides SarkomTumoren extraskelletales Ewingsarkom

Synovialsarkom biphasisch monophasischmaligner extrarenaler Rhabdoidtumordesmoplastischer kleinzelliger Tumor

unklassifizierbareTumoren

9

Liposarkom 22,9%

Malignes fibröses Histiozytom 17,5%

Leiomyosarkom 10,1%

Fibromatose 6,5%

Myxofibrosarkom 6,5%

Synovialsarkom 6,4%

Maligner peripherer Nervenscheidentumor 5,6%

Spindelzellsarkom 3,6%

Rhabdomyosarkom 3%

Dermatofibrosarcoma protuberans 2,8%

Fibrosarkom 2,6%

Myofibroblastisches Sarkom 2,3%

Hämangio-Tumoren 2,1%

Restliche Diagnosen <2%

Abb. 1.1 Diagnostizierte Weichteilsarkom-Subtypen im Referenzzentrum für Gliedmaßentumore. Das Diagramm zeigt die Weichteilsarkom-Subtypen, die in den Jahren von 1990 bis 2009 am häufigsten im Register für Gliedmaßentumore am Institut für Pathologie des Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil eingetragen wurden sind. Die Diagnosen, die in über 2 % der 2056 registrierten Fälle gestellt wurden, werden hier einzeln und namentlich aufgeführt.

1.1.3 Ätiologie

Die meisten Fälle von Weichteiltumoren scheinen bis heute ohne erkennbare Ursache

zu entstehen. Nur in wenigen Fällen sind genetische Charakteristika, Umweltfaktoren

oder Immunschwäche als Ursache zu identifizieren (Fletcher, 2002).

So wurden nach externer Bestrahlung im Rahmen einer vorangegangenen

Tumortherapie vermehrt Fälle von Weichteilsarkomen, wie dem Malignen Fibrösen

Histiozytom (MFH) zu 16 % oder den Lymphangio- und Angiosarkomen zu 15 %

beobachtet (Brady et al., 1992). Auch Herbizid-Expositionen begünstigen eine

Weichteilsarkomentstehung (Zahm and Fraumeni, 1997).

Genetische Charakteristika, die die Entstehung von Weichteilsarkomen begünstigen,

können entweder erworbene oder auch vererbte Veränderungen des Erbguts sein. So

wurde eine erhöhte Inzidenz festgestellt bei Veränderungen der Gene von

Tumorsuppressoren wie p53, welches den Zellzyklus in der G1-Phase arretiert sobald

DNA-Schäden entstehen, oder dem Rb-Gen, welches die Synthese der Enzyme für die

DNA-Replikation erst induziert, wenn die Zelle in die S-Phase des Zellzyklus übertritt,

und somit auch eine unkontrollierte DNA-Synthese verhindert (Bühling, 2000). Ein

10

Defizit dieser Tumorsuppressoren begünstigt eine Vermehrung von genetisch

veränderten Zellen. Ein Beispiel hierfür ist das Li-Fraumeni-Syndrom, bei dem die

Entstehung von Weichteilsarkomen neben anderen Neoplasien auf die vererbte

Mutation, überwiegend im p53-Gen, zurückzuführen ist.

Darüber hinaus werden einige Subtypen von Weichteilsarkomen mit bestimmten

chromosomalen Translokationen in Verbindung gebracht. So wird die Translokation

von Chromosomenabschnitten des X-Chromosomen mit dem Chromosomen 18,

bezeichnet als t(X;18), in über 95 % der Synovialsarkome vorgefunden. Zu

diagnostischen Zwecken kann das Transkript des am Translokationsort entstandenen

Fusionsgen SYT-SSX detektiert werden, das aus den Exons 1-10 des SYT-Gens des

Chromosom 18 und aus den Exons 5 und 6 des SSX-Gens des X Chromosoms besteht

(Thorson et al., 2006).

Das Kaposi-Sarkom tritt bei einer deutlichen Immunschwäche wie in etwa bei AIDS-

Patienten oder bei immunsupprimierten Patienten nach einer Transplantation und einer

hinzukommenden Infektion durch den Humanen Herpesvirus 8 auf (Fulciniti et al.,

2012). Eine Besserung des Immunstatus der betroffenen Personen hemmt die

Proliferation der entarteten Zellen.

1.1.4 Pathologie

Obwohl es sich bei den Weichteiltumoren um eine sehr heterogene Tumorentität

handelt, bestehen klinische und histologische Gemeinsamkeiten. So treten 60 % der

Sarkome in den Extremitäten auf und nur je weitere 10 % in der Rumpfwand und im

Retroperitoneum (Fletcher, 2002). Ihr Malignitätsgrad korreliert meist mit der

Tumorwachstumsrate.

Weichteilsarkome wachsen zentripetal, dabei bildet sich um sie herum eine reaktive

Pseudokapsel. In dieser faserreichen Struktur zwischen gesundem Gewebe und Tumor

befinden sich neben absterbenden Zellen und Immunzellen auch vitale Tumorzellen.

Daher sollten diese bei therapeutischen Eingriffen nicht eröffnet werden. Umgeben von

der Pseudokapsel wachsen die Weichteilsarkome für gewöhnlich nicht infiltrativ.

Einzelne Tumorzellen treten auch nur selten in die Lymphwege über (Gilbert et al.,

2009; Gitelis et al., 1989).

Stattdessen streuen die Primärtumore ihre Tochtergeschwülste, auch Metastasen

genannt, fast ausschließlich über die Blutgefäße (Liebig et al., 2009). Histolytische

Enzyme wie zum Beispiel Metalloproteinasen ermöglichen durch Abbauprozesse des

11

umgebenden Bindegewebes ein Loslösen von Tumorzellen aus dem Zellverband und

ein Einbrechen dieser in die Blutgefäße. In der Blutbahn kann ein Fibrin-

Thrombozyten-Belag die Tumorzellen vor onkolytischen Immunzellen schützen.

Oberflächenrezeptoren der Tumorzellen bewirken die Adhäsion an Endothelien, meist

nachdem eine Tumorzelle als Tumorembolus in der terminalen Endstrombahn der

Gefäße stecken geblieben ist. Nach der Zerstörung der Basalmembran der Gefäße

gelangen die Tumorzellen dort in das umliegende Parenchym, wo sie unter vorteilhaften

Wachstumsbedingungen zu soliden Metastasen proliferieren. Organe wie Knochen,

Leber und Lunge tragen Oberflächenrezeptoren auf ihren Parenchym- und

Endothelzellen, die eine Metastasierung begünstigen (Bühling, 2000). Die Metastasen

der Weichteilsarkome befinden sich hauptsächlich in der Lunge (Vikis et al., 2010).

Extrapulmonale Metastasen treten dabei kaum als primäre Tochtergeschwülste, sondern

hauptsächlich in einem fortgeschrittenen Tumorstadium oder bei einem Rückfall auf.

Dabei erreichen sie lediglich einen Anteil von 4,7 % (Ryzewicz et al., 2008).

1.1.5 Symptome

Die klinische Manifestation der Tumore findet sehr spät statt. Die Tumore wachsen

zunächst ohne Schmerzen zu verursachen. Meist ist eine Vorwölbung an einer

Extremität ein erstes Anzeichen eines Weichteilsarkoms, welches von den Patienten

jedoch oft fälschlich als Folge eines Bagatelltraumas eingeordnet wird (Steinau et al.,

2001). Wenn der Tumor sehr tief lokalisiert ist, können schließlich Schmerzen auf

Grund einer Nervenkompression auftreten.

1.1.6 Diagnostik

Liegt die Verdachtsdiagnose Tumor beziehungsweise Sarkom vor, so gilt es, diese

Diagnose zu sichern. Entsprechend des Leitsatzes Typing, Grading, Staging findet

zunächst die Analyse des Subtypes und des Entartungsgrades statt und dann das

Feststellen des Stadiums der Tumorerkrankung.

Um den Subtyp und den Entartungsgrad des Tumors zu erfassen, bedarf es einer

Probenentnahme. Von den vier möglichen Methoden wird die Aspirationsbiopsie am

häufigsten verwandt. Mit bildgebenden Verfahren kann bei dieser Gewebeentnahme

durch die Hohlnadel sichergestellt werden, dass die Biopsie dem gewünschten Bereich

des veränderten Gewebes entstammt. In 68-93 % der Fälle kann in den Vereinigten

Staaten mit diesem Verfahren eine Diagnose gestellt werden (Dupuy et al., 1998;

12

Mitsuyoshi et al., 2006). Ist dies nicht möglich, liegt eine Inzisionsbiopsie nahe, bei der

mit einem Skalpell eine größere Gewebeprobe entnommen werden kann. Eine

Exzisionsbiopsie wird nur bei kleinen kutanen Tumoren mit einem geringen

Malignitätsverdacht eingesetzt. Bei der Feinnadelbiopsie wird nur eine geringe Menge

Gewebe entnommen, die durch einen erfahrenen Pathologen beurteilt werden muss. Sie

wird vor allem bei der Lymphknotenanalyse und bei der Diagnose von Rezidiven

praktiziert. Bei allen Biopsiemethoden gilt es, nach den Prinzipien der

Tumoroperationen vorzugehen (Abschnitt 1.1.7), um eine Verschleppung von

Tumorzellen in das gesunde umgebende Gewebe zu verhindern.

Die räumliche Ausbreitung des Tumors kann durch eine Magnetresonanztomographie

(MRT) mit Kontrastmittel dargestellt werden. Eine Abgrenzung zwischen gesundem

mesenchymalem und entartetem Gewebe ist meist möglich. Auch benachbarte Gefäße

und Nerven sowie gegebenenfalls deren Infiltration, Nekrosen, Ödeme oder

Einblutungen werden beurteilbar.

Zur Ausbreitungsdiagnostik gehört zudem ein Röntgenbild der Lunge, da dies der

häufigste Ort einer Metastasierung bei Weichteilsarkomen ist. Zeigt das Röntgenbild

einen positiven oder unklaren Befund erfolgt zur weiteren Diagnostik eine

Computertomographie (CT) zur genaueren Darstellung der Lunge. Bei Verdacht auf

okkulte Metastasen kann eine Positronen-Emissions-Tomographie eingesetzt werden.

Je nach Subtyp ist eine genauere Untersuchung der Lymphknoten, erst durch Palpation

und Ultraschall, später auch durch perioperative Entnahme und histologische

Aufarbeitung, sinnvoll und notwendig. Die Knochenszintigraphie oder ein CT der

Knochen sind ebenso nur bei bestimmten Subtypen indiziert, wie zum Beispiel bei dem

myxoiden Liposarkom, welches vermehrt in die Knochen metastasiert (Gilbert et al.,

2009).

Die gesammelten Informationen über die Ausbreitung und den Entartungsgrad des

Tumors erlauben die Feststellung des Tumorstadiums mittels eines Staging-Systems.

Dieser folgt nach einer optimalen Therapieplanung eine angemessene Therapie. Für

gewöhnlich erfolgt die Stadieneinteilung nach dem pTNM-System, das durch das

American Joint Comittee on Cancer (AJCC) und die Union Internationale Contre le

Cancer (UICC) unterstützt wird. Dabei gibt der Buchstabe p an, ob die Diagnose

postoperativ durch einen Pathologen gesichert wurde. Die übrigen Buchstaben werden

je nach Befund mit einer kleinen Zahl oder einem kleinen Buchstaben versehen, wobei

die Bezeichnung T die Tumorgröße angibt, N den Lymphknotenbefall und M den

13

Metastasenstatus. Unter verschiedenen fakultativen zusätzlichen Kategorien findet sich

auch der Buchstabe G, der mit aufsteigenden Ziffern den Grad der Gewebeentartung

angibt. Diese einzelnen Befunde ergeben das Stadium der Tumorerkrankung, welchem

oft eine bestimmte Prognose und bestimmte Therapiemaßnahmen zugeordnet sind (Tab.

1.2 und Tab. 1.3).

Alle genannten diagnostischen Mittel werden nach Bedarf wiederholt eingesetzt, um

den Verlauf der Krankheit zu beobachten und die Therapie gegebenenfalls anzupassen.

Beispielsweise wird zur Evaluation der Wirksamkeit einer Radio- oder Chemotherapie

eine aktuelle MRT-Aufnahme benötigt.

Tab. 1.2 TNM-Klassifikation maligner Tumore nach UICC.

T PrimärtumorT1a Tumordurchmesser ≤ 5 cm

Lokalisation oberflächlich zur Fascia superficialis ohne deren InfiltrationT1b Tumordurchmesser ≤ 5 cm

Lokalisation unterhalb der Fascia superficialis und/oder deren Infiltration sowieretroperitoneale, mediastinale bzw. Beckentumoren

T2a Tumordurchmesser > 5cmLokalisation oberflächlich zur Fascia superficialis ohne deren Infiltration

T2b Tumordurchmesser > 5cmLokalisation unterhalb der Fascia superficialis und/oder deren Infiltration sowieretroperitoneale, mediastinale bzw. Beckentumoren

N Regionäre LymphknotenNX Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werdenN0 Keine regionären LymphknotenmetastasenN1 Regionäre Lymphknotenmetastasen

M FernmetastasenMX Fernmetastasen können nicht beurteilt werdenM0 Keine FernmetastasenM1 Fernmetastasen

Tab. 1.3 Stadiengruppierung der Weichteilsarkome (Spiessl, 1993). Das Stadium der Sarkomerkrankung ist von dem Entartungsgrad des Tumors (G), von dessen Größe (T), vom Lymphknotenbefall (N) und von dem Metastasenstatus (M) abhängig.

Stadium I A G1 T1a und b N0 M0G2 T1a und b N0 M0

B G1 T2a N0 M0G2 T2a N0 M0

Stadium II A G1 T2b N0 M0G2 T2b N0 M0

B G3 T1a und b N0 M0G4 T1a und b N0 M0

C G3 T2a N0 M0G4 T2a N0 M0

Stadium III G3 T2b N0 M0G4 T2b N0 M0

Stadium IV Jedes G Jedes T N1 M0Jedes G Jedes T Jedes N M1

14

1.1.7 Therapie

Der Therapieansatz bei Weichteilsarkomen ist primär chirurgisch. Dabei soll eine

Exzision des Tumors weit im Gesunden erfolgen. Es gelten die tumor-chirurgischen

Ansätze „En-bloc“-Resektion und die „no touch isolation technique“. Hierbei soll der

Tumor nicht berührt und dessen Kapsel nicht eröffnet werden, um eine Kontamination

des umliegenden Gewebes mit Tumorzellen zu vermeiden. Ein Sicherheitsabstand von

4-5 cm seitlich und 2 cm zur Tiefe sollte eingehalten werden (Steinau et al., 2001).

Postoperativ gilt es, Hämatome und Ödeme zu vermeiden, da diese wiederum die

Tumorzellverschleppung begünstigen.

Eine präoperative oder postoperative Chemotherapie wird je nach histologischem

Subtyp eingesetzt. Entschieden wird hier nach der Sensibilität des Sarkoms gegenüber

den zytotoxischen Medikamenten und nach dem Metastasierungsrisiko. Die

Chemotherapeutika können einerseits den Tumor präoperativ verkleinern und somit die

Tumorresektion erleichtern oder auch eine Sensibilisierung für eine folgende

Strahlentherapie erreichen.

Die Ansprechrate von Weichteilsarkomen auf eine Chemotherapie liegt nur bei

Aktinomycin D, Ifosfamid und Doxorubicin über 15% und wird folglich insgesamt nur

zurückhaltend nach den oben genannten Kriterien und vor allem im fortgeschrittenen

Tumorstadium eingeleitet. Doxorubicin, welches ein geläufiges Zytostatikum in der

Sarkomtherapie ist und Ansprechraten bis 26 % erreicht, interkaliert zwischen den

Basenpaaren der DNA, verhindert auf diese Weise die Transkription und Replikation

und führt zu Mutationen. Es inhibiert die Topoisomerase II, die auch für die DNA-

Replikation benötigt wird, und reguliert die Expression proapoptotischer Faktoren wie

zum Beispiel Cytochrom C und verschiedene Kaspasen hoch (Lehnhardt et al., 2005).

Ein Mechanismus der Tumorzellen der Wirkung dieses und der anderen

Chemotherapeutika zu entgehen, ist in etwa die Ausschleusung jeglicher Medikamente

aus der Zelle durch die Expression des Transportproteins des Multidrug-Resistance-

Gen 1 (MDR-1). Auch eine erworbene Unfähigkeit der Zellen, den programmierten

Zelltod (Apoptose) einzuleiten, zum Beispiel durch eine Mutation im Tumorsuppressor-

Gen p53, kann für eine Resistenz gegenüber den Therapeutika verantwortlich sein. Das

Protein p53 akkumuliert bei metabolischem Stress, äußeren negativen Reizen und

DNA-Schäden und hält über die Einbindung weiterer Faktoren den Zellzyklus bis zu

einer Behebung der Stresssituation und einer erfolgten DNA-Reparatur an. Erfolgt dies

nicht, wird die Apoptose der geschädigten Zelle eingeleitet. Einige Chemotherapeutika

15

wirken über eine Aktivierung des Tumorsuppressors und verlieren ihre Wirkung, wenn

eine Mutation im p53-Gen vorliegt (Gomez-Lazaro et al., 2004; Wattel et al., 1994).

Die Strahlentherapie hingegen hat als adjuvante oder neoadjuvante Methode einen

festen Platz in der Tumortherapie. Die Kombination mit einer Operation ist vor allem

bei Extremitätenbefall zu einer Vermeidung der Amputation die Therapiemethode erster

Wahl. Die Überlebensrate ist in diesem Fall ähnlich der einer Amputation bei

verbesserter lokaler Tumorkontrolle und verbesserter Lebensqualität. Diese wird durch

die Nebenwirkungen wie in etwa einer Ödembildung, Fibrose oder auch

Wundheilungsstörungen nicht merklich gemindert (Yang et al., 1998).

Ein Beheben des Weichteildefektes bzw. auch des Knochendefektes zum

Funktionserhalt nach Tumorresektion erfolgt im plastischen chirurgischen Bereich

bevorzugt mittels autologen Transplantationen.

1.1.8 Prognose

Die Lebenserwartung der Patienten hängt stark von dem Stadium der Tumorerkrankung,

von dem histologischen Subtyp, von der Therapie und dem Therapieendergebnis ab.

Nach gestellter Diagnose und erfolgreicher Therapie ohne mikroskopische

Tumorrückstände (R0-Resektion), werden innerhalb des ersten Jahres in 22-60 % der

Fälle Rezidive beschrieben. Diese hohen Rückfallsraten werden hauptsächlich auf das

Vorhandensein nicht erkennbarer Metastasen zum Diagnosezeitpunkt zurückgeführt

(Worth, 2005). Die beste Prognose haben Patienten, dessen Tumor sich im ersten

Dedifferenzierungsstadium befindet (G1). Hier beträgt die fünf-Jahre-Überlebensrate

(5-JÜR) 75 %. Bei Patienten mit einem G2- oder einem G3-Tumor beträgt sie hingegen

nur 56 % beziehungsweise 26 % (Kotilingam et al., 2006). Die schlechteste Prognose

haben Patienten, bei denen keine R0-Resektion mehr möglich ist und bei denen bereits

Lungenmetastasen bestehen.

Kontrolluntersuchungen, um einen Rückfall oder ein Tumorwachstum frühzeitig zu

erkennen und entsprechend zu therapieren, finden zunächst alle drei Monate statt. Bei

ausbleibendem Rückfall werden die Untersuchungsintervalle nach festgelegten

Abschnitten verlängert, so dass nach zwei Jahren ohne Tumorrezidiv jährliche

Untersuchungen ausreichen. Der lokale Befund kann durch Ultraschall oder MRT-

Aufnahmen kontrolliert und das Auftreten von Lungenmetastasen durch Röntgen- oder

CT-Aufnahmen detektiert werden.

16

1.2 Host Defense Peptide

1.2.1 Natürliche Host Defense Peptide des Immunsystems

Als natürliche Host Defense Peptide (HDP) werden körpereigene Peptide bezeichnet,

denen antimikrobielle und teilweise auch onkolytische Eigenschaften im Rahmen der

angeborenen Immunantwort nachgewiesen werden konnten.

Erst in den achtziger Jahren des zwanzigsten Jahrhunderts wurden diese Peptide, von

denen zunächst nur eine antimikrobielle Wirkung bekannt war und sie dementsprechend

antimikrobielle Peptide (AMP) genannt wurden, in einzelnen Lebewesen wie den

Säugetieren und den Amphibien entdeckt. Mittlerweile sind antimikrobielle Peptide in

fast allen Lebewesen nachgewiesen worden. Ihr Wirkspektrum ist sehr breit und

schließt gram-negative sowie gram-positive Bakterien ein; aber auch eine Wirksamkeit

in der Bekämpfung von Viren und Pilzen wurde bestätigt (Klotman and Chang, 2006;

Zasloff, 2002). Einige Jahre nach ihrer Entdeckung wurden bereits onkolytische

Wirkungen unter den AMPs beobachtet.

Es handelt sich bei den HDPs meistens um kurze kationische Peptide bestehend aus 5

bis 40 Aminosäuren. Dabei liegt die positive Ladung zwischen +2 bis +9 bei neutralem

pH-Wert und wird durch einen hohen Gehalt an positiv geladenen Aminosäuren wie

Lysin und Arginin erreicht. Allerdings wurden vereinzelt auch anionische HDPs

beobachtet (Lai et al., 2007). Des Weiteren sind auch hydrophobe Aminosäuren

charakteristisch für viele HDPs (Hoskin and Ramamoorthy, 2008). In ihrer

dreidimensionalen Struktur sind die Peptide mit einer hydrophoben und einer

hydrophilen Seite amphipathisch.

Auf Grund der positiven Ladung nähern sie sich vor allem Bakterien, deren

Zellmembran durch Cardiolipin und Phosphatidylserin und deren Zellwand bei gram-

negativen Bakterien durch Lipopolysaccharide negativ geladen ist. Krebszellen nähern

sie sich auf Grund des höheren Anteils an Phosphatidylserin, N-Acetylneuraminsäure

und Heparansulfaten in der Membran, die eine negative Ladung dieser verursachen

(Riedl et al., 2011).

Die Moleküle wirken über verschiedene zytotoxische Mechanismen. Ein Angriffspunkt

und Inhalt zahlreicher Modelle ist die Zellmembran. So wird beispielsweise

angenommen, dass sich die amphipathischen Host Defense Peptide in deren

Lipiddoppelschicht einlagern und Poren in der Membran bilden. Die daraus

resultierende erhöhte Membrandurchlässigkeit bewirkt nachfolgend den Zelltod. Ein

anderes Modell beschreibt ein flächiges Anlagern der Host Defense Peptide an die

17

Membran mit einer folgenden Detergens-ähnlichen unstrukturierten Auflösung dieser

(Bechinger and Lohner, 2006; Shai, 1999).

Einige HDPs wirken jedoch über eine Interaktion mit intrazellulären Strukturen wie

Enzymen, Organellen oder sogar der DNA nach einem Eindringen in die Zelle ohne

deren Membran zu zerstören. Magainin 1 leitet beispielsweise im Zytosol die Apoptose

der Zelle über eine Cytochrom C-Freisetzung aus Mitochondrien ein und steigert die

Aktivität von Proteasomen (Cruz-Chamorro et al., 2006; Teixeira et al., 2012). Eine

chemotaktische Wirkung auf Immunzellen wurde vielen HDPs nachgewiesen; dabei

rekrutieren die verschiedenen HDPs bestimmte Gruppen von Immunzellen. Das humane

β-Defensin 2 (hBD-2) zieht beispielsweise speziell T-Gedächtnis-Zellen und unreife

dendritische Zellen an (Zasloff, 2002).

Zu den beiden großen Gruppen der Host Defense Peptide zählen zum einen die

Kathelizidine, die aus Vorläufermolekülen entstehen und reich an α-Helices sind, und

zum anderen die Defensine, die sich durch β-Faltblattstrukuren und Dissulfidbrücken in

der Sekundärstruktur auszeichnen.

Ein gut erforschtes Kathelizidin ist das humane HDP LL-37, das in Lösung helikal

angeordnet ist und ubiquitär im Körper produziert wird. Neben direkten antibakteriellen

Eigenschaften wurde auch eine chemotaktische Wirkung auf Neutrophile, Monozyten

und T-Zellen beobachtet. Diese wird durch eine Induktion von Chemokinen und deren

Rezeptoren vermittelt (Mookherjee et al., 2009; Nijnik et al., 2012). LL-37 unterstützt

jedoch das Tumorwachstum von Brust-, Lungen- und Ovarialkarzinomen durch eine

Stimulation der Zellproliferation der Tumor- nicht aber der Stromazellen. Auch die

Stimulation der Angiogenese begünstigt ein Tumorwachstum (Coffelt et al., 2009;

Heilborn et al., 2005). Währenddessen wirkte ein zentrales Element des Peptids,

bestehend aus den Aminosäuren 6-32, zytotoxisch gegen orale

Plattenepithelkarzinomzellen (Okumura et al., 2004). Da LL-37 nicht nur negativ

geladene sondern auch zwitterionische Membranen angreift, beeinträchtigt es auch den

Stoffwechsel von gesunden eukaryotischen Zellen und wirkt hämolytisch (Johansson et

al., 1998; Oren et al., 1999).

Zu der Gruppe der Defensine zählen unter anderem die Humanen Neutrophilen Peptide

1-3 (HNP). Diese wirken zytotoxisch gegen verschiedene humane und murine

Tumorzelllinien über eine Porenformation in deren Zellmembran sowie über eine

Schädigung der DNA (Gera and Lichtenstein, 1991; Kagan et al., 1990). Darüber hinaus

verschlechtern ihre anti-angiogenetischen Eigenschaften die Wachstumsbedingungen

18

der Tumorzellen (Chavakis et al., 2004). Auch diese HDPs greifen nicht spezifisch

maligne Zellen sondern auch gesunde Zellen an (Nishimura et al., 2004).

Unter den nicht-humanen Host Defense Peptiden wurde ebenso eine onkolytische

Potenz beobachtet. So wirken die bovinen Kathelizidine BMAP-27 und -28 zytotoxisch

gegen Leukämie-Zellen und schnell proliferierende hämatopoetische Zellen. Die in den

Insekten entdeckten Cecropine A und B lysieren einzelne maligne Zelllinien ohne

gesunde eukaryotische Zellen bei der entsprechenden Konzentration zu beeinträchtigen

und auch die aus den Amphibien isolierten Magainine greifen spezifisch Tumorzellen

an (Hoskin and Ramamoorthy, 2008).

1.2.2 Synthetische Host Defense Peptide in der Tumortherapie

Mit der Entdeckung der onkolytischen Eigenschaften der Host Defense Peptide entstand

die Hoffnung, unter diesen Molekülen ein neues effektives Therapeutikum für die

Behandlung von Tumorerkrankungen zu finden. Die Fähigkeiten, Zellmembranen zu

zerstören, Angiogenese zu hemmen und Immunzellen durch Chemotaxis zu rekrutieren,

stellen eine viel versprechende Kombination von Wirkmechanismen dar.

Allerdings zeigen viele der in der Natur entdeckten HDPs auch nachteilige

Eigenschaften, die einem Einsatz als Therapeutikum widersprechen. So greifen einige

HDPs auch gesunde Zellen an und führen beispielsweise zu einer Hämolyse. Zudem

werden die meisten HDPs schnell im Blutkreislauf abgebaut, so dass sie, wenn sie von

extern zugeführt werden, die Zielstruktur nicht erreichen oder zu kurz in einer

therapeutischen Dosis dort präsent sind.

Das Ziel vieler Forschungsgruppen besteht somit darin, Peptide zu finden, die eine

maximale Wirkung gegen Tumorzellen zeigen, jedoch ein Minimum an nachteiligen

Eigenschaften. Zur genaueren Erforschung der existierenden Host Defense Peptide

werden diese unter anderem künstlich synthetisiert. Die ursprüngliche Sequenz und

Konfiguration der Aminosäuren wird im Verlauf oft verändert mit dem Ziel einer

Optimierung der therapeutischen Eigenschaften. Die dadurch entstehenden Peptide

werden dann Designer Host Defense Peptide genannt. Da die Peptidproduktion sehr

teuer ist, ist es erstrebenswert, Peptide für die Tumortherapie zu finden, die eine hohe

Effektivität bei kurzer Aminosäuresequenz zeigen.

Die Verwendung von D-Aminosäuren in synthetischen HDPs führt zu einer

schlechteren Abbaubarkeit der Peptide durch körpereigene Peptidasen und verbessert

somit die Pharmakokinetik. Darüber hinaus erwiesen sich synthetische HDPs mit D-

19

konfigurierten Aminosäuren als selektiver in ihrer Wirkung gegen Tumorzellen im

Vergleich zu gesunden Körperzellen. Dies steht offenbar im Zusammenhang mit der

Sekundärstruktur, die die Host Defense Peptide in oder auf Membranen annehmen: Die

α-helikale Konformation der rein L-konfigurierten Peptide scheint den Peptiden mit D-

konfigurierten Aminosäuren hinsichtlich der selektiven Anlagerung an negativ geladene

Membranen unterlegen zu sein (Papo et al., 2004).

Der Bedarf an neuen Medikamenten in der Tumortherapie wird deutlich angesichts der

hohen Resistenzraten der Neoplasien gegenüber den konventionellen

Chemotherapeutika. Die Resistenzmechanismen bestehen oft in der Veränderung von

intrazellulären Prozessen der Krebszellen. Der Vorteil der Host Defense Peptide besteht

darin, dass sie oftmals bereits über die Auflösung der Zellmembran wirken, so dass hier

der einzige wirksame Resistenzmechanismus in einer stark veränderten

Membranstruktur bestehen würde. Meist wirken die HDPs jedoch über mehrere

Mechanismen, so dass der Selektionsdruck, einen besonderen Resistenzmechanismus

auszubilden, nicht gegeben ist (Peschel and Sahl, 2006).

Auf der Suche nach dem optimalen Host Defense Peptid ist der onkolytische Effekt in

in vivo-Mausmodellen mehrfach nachgewiesen worden. Die HDPs sind sowohl lokal als

auch systemisch zur Unterbindung der Metastasenentstehung wirksam (Papo et al.,

2006). Auch die Unabhängigkeit ihrer Wirkung von vorhandenen Resistenzgenen

konnte belegt werden (Held-Kuznetsov et al., 2009). Die Frage nach einer möglichen

Steigerung der Medikamentenakkumulation in Krebszellen durch HDPs, was eine

Kombinationstherapie von HDPs und Chemotherapeutika zu einer effektiven

Therapieoption machen würde, ist noch nicht geklärt.

1.2.3 Gezielt-konfigurierte Peptide im Einsatz gegen Neoplasien

Die Forschungsgruppe um Professor Yechiel Shai, Weizmann Institute of Science,

Rehovot, Israel erforscht kationische Peptide bestehend aus 15 Aminosäuren und

insbesonders ihre Wirksamkeit gegen Prostatamalignome im in vivo-Mausmodell. Die

Peptide bestehen aus den Aminosäuren Histidin (H), Leucin (L) und Lysin (K) zu

verschiedenen Anteilen. Die Lysine sind Träger der positiven Ladung des Peptids und

die Leucine verleihen den Peptiden Hydrophobizität, während die Histidine durch ihre

niedrige Säurekonstante (pKs) von 6,1 dadurch eine Spezifität vermitteln, dass sie erst

im sauren anaeroben Milieu der Tumorzellen protoniert werden und die positive Ladung

des Peptids weiter verstärkt wird (Makovitzki et al., 2009). Erste Versuche ergaben,

20

dass auch diese Peptide durch die Verwendung von D-konfigurierten Aminosäuren

resistenter gegen einen proteolytischen Abbau und aktiver bei der Zelllyse sind, weshalb

diese Eigenschaft bei der Synthese von den 15-mer Peptiden fortan beibehalten wurde

(Rosenfeld et al., 2008). Zunächst zeigte das Peptid [D]-K6L9 eine starke Hemmung des

Tumorwachstums. Seine Toxizität gegen gesunde Zellen, die sich in vitro und bei

systemischer Applikation in vivo zeigte, erforderte jedoch eine Veränderung des

Peptids. Die Peptide [D]-K3H3L9 und [D]-H6L9 erwiesen sich lediglich in vitro bei

hohen Konzentrationen als toxisch bei potenter onkolytischer Wirkung von bereits

niedrigen Konzentrationen. Zusätzlich zeigten die histidinhaltigen Peptide eine

Hemmung der Vaskularisierung in den Tumoren (Makovitzki et al., 2009).

Tab. 1.4 Die Aminosäuresequenzen einiger 15-mer kationischen Peptide (Frei nach Makovitzki et al., 2009). Aufgelistet sind einige der 15-mer Host Defense Peptide dessen Eigenschaften und Wirkungen gegen Tumorzellen genauer erforscht werden. D-Aminosäuren sind hier fettgedruckt und unterstrichen. Host Defense Peptide Sequenz

[D]-K6L9 L K L L K K L L K K L L K L L

[D]-K3H3L9 L H L L H K L L K H L L K L L

[D]-H6L9 L H L L H H L L H H L L H L L

[D]-K4H2L9 L K L L H K L L K H L L K L L

Die Forschungsgruppe „Molekulare Onkologie und Wundheilung“ von Professor

Steinsträßer, Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte des

Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil, Bochum, erforscht

seit 2005 die Wirksamkeit der Peptide [D]-K3H3L9 und [D]-K4H2L9 im Einsatz gegen

Weichteilsarkome.

Beide Host Defense Peptide konnten die Zellvitalität von Sarkomzelllinien häufig

vorkommender Subtypen, darunter Liposarkom-, Fibrosarkom- und

Synovialsarkomzellen, einschränken und im athymischen in vivo-Mausmodell das

Tumorwachstum sowie die Vaskularisierung der Tumore hemmen. Für das selektive

[D]-K 3H3L9 konnte bereits eine onkolytische Wirkung im immunkompetenten

Organismus nachgewiesen werden. Auch eine gesteigerte Migration von T-Zellen in das

Tumorgewebe nach der Peptidtherapie wurde beobachtet (Steinstraesser et al., 2011).

Das Peptid [D]-K4H2L9 erwies sich ebenso als selektiv gegenüber Sarkomzellen unter

realen Bedingungen. So betrug die mittlere letale Dosis (LD50) für Sarkomzellen im

sauren Tumormilieu (pH 6,3) 3-5 µM und für Fibroblasten bei einem physiologischen

21

pH-Wert (pH 7,3) das 3-6-fache mit 19 µM (Abb. 1.2). Die Oberflächenladung dieses

kationischen Peptids beträgt je nach dem pH-Wert seiner Umgebung zwischen +4 und

+6. Eine hämolytische Wirkung auf humanes oder murines Blut wurde ausgeschlossen.

Die schnelle LDH-Freisetzung aus den Sarkomzellen durch das Peptid spricht für eine

Lyse der Membran die den LDH-Austritt verursacht (Mersch, 2010).

Abb. 1.2 Einschränkung der Zellvitalität verschiedener Sarkomzelllinien und Referenzzellen durch das Host Defense Peptid [D]-K4H2L9. Das Diagramm stellt die Einschränkung der Zellvitalität bei saurem pH-Wert (pH = 6,3) und steigenden [D]-K4H2L9-Konzentrationen dar. Es wurden die humanen Synovialsarkomzellen SW982, die humanen Fibrosarkomzellen HT1080, die humanen Liposarkomzellen SW872 und als Referenzzellen die humanen Fibroblasten untersucht. Die humanen Fibroblasten wurden zusätzlich bei einem physiologischen pH-Wert von 7,3 untersucht. Die Zellvitalität wurde mittels MTT-Assay analysiert (Mersch, 2010).

22

2 Zielsetzung

Die Prognose der Weichteilsarkom-Erkrankung ist auf Grund des späten

Diagnosezeitpunktes, der hohen Resistenzraten gegen Chemotherapeutika und

eingeschränkter Sensibilität gegenüber Strahlentherapie oftmals ungünstig. Es bedarf

daher noch effizienterer Methoden, um einen größeren Therapieerfolg zu erreichen. Die

ersten Forschungsergebnisse des Einsatzes von Host Defense Peptiden gegen

Karzinome sind vielversprechend und zeigen unter anderem eine Reduktion des

Tumorwachstums und der Metastasenentstehung. Das Anliegen der Tumorforschung ist

es nun, die effektivsten und wirtschaftlichsten Peptide mit dem günstigsten

Nebenwirkungsprofil zu finden.

Das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit besteht darin, die onkolytischen Eigenschaften

gegen Weichteilsarkome des synthetischen Host Defense Peptids [D]-K4H2L9 zu

untersuchen.

Hierzu wird zunächst in vitro die anti-proliferative Wirkung des Peptids auch im

Vergleich mit einem Scrambled-Peptid analysiert. Zudem wird eine

Kombinationstherapie von [D]-K4H2L9 mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin

durchgeführt. Die Spezifität der Wirkung gegen entartete Zellen wird durch das

Mitführen gesunder Zellen bei den entsprechenden Versuchen geprüft.

Zur Erforschung der Wirkung von [D]-K4H2L9 im lebenden Organismus wird es zur

lokalen Therapie subkutaner Sarkome bei immunkompetenten Mäusen angewendet.

Dies ermöglicht eine nachfolgende Analyse von immunmodulatorischen Funktionen.

Hierzu wird mit den murinen Sarkomen nach Beendigung des in vivo-Versuchs

immunhistochemisch weitergearbeitet, um Rückschlüsse über Interaktionen des Peptids

mit dem Immunsystem oder über eine Beeinflussung der Vaskularisierung durch das

Peptid ziehen zu können. Mögliche Wege dieser Einflussnahme werden durch eine

Analyse der Genexpression einiger Zytokine in den Tumoren untersucht.

23

3 Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Chemikalien und Reagenzien

Agarose Roth, Karlsruhe

Augen- und Nasensalbe 5 g Bepanthen Bayer AG, Leverkusen

Alexa Flour® 488 Streptavidin Invitrogen, Heidelberg

Ammoniak Roth, Karlsruhe

Antigen Unmasking Solution Vector, Burlingame (USA)

Bacillol® Bode Chemie, Hamburg

Bromphenolblau Fisher Scientific, Schwerte

ß-Mercaptoethanol Sigma, Steinheim

100 bp Ladder Invitrogen, Heidelberg

CASYTON® Schärfe Systeme Reutlingen

DAPI Staining Solution Invitrogen, Heidelberg

Doxorubicin in 0,9 %NaCl (2 mg/ml) Apotheke, Bergmannsheil, Bochum

Dispase Invitrogen, Heidelberg

EDTA(Ethylendiamintetraessigsäure) Sigma, Steinheim

Entellan Mounting Medium Merck, Darmstadt

Eisessig Sigma, Steinheim

Essigsäure Sigma, Steinheim

Ethanol Merck, Darmstadt

FCS (Fötales Kälberserum) Perbio Science, Thermo Scientific, Bonn

Flourescent Mounting Medium Dako, Hamburg

Formafix 5 % Patho Med. Logistik GmbH, Viersen

GelStar® Nucleic Acid Gel Stain Lonza, Maine, USA

Glycerol 87 % Merck, Darmstadt

Glycerol 99,5 % Roth, Karlsruhe

Hautdesinfektionsmittel (Softasept) B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Hämatoxylin Lösung nach Mayer Apotheke, Bergmannsheil, Bochum

Immersol 518F Carl Zeiss, Oberkochen

Isofluran Abott, Wiesbaden

Kalziumchlorid Sigma, Steinheim

Kollagenase II Cell Systems, Troisdorf

24

O.C.T.-Kryomedium VWR, Darmstadt

Lachgas Air Products, Hattingen

Matrigel BD Biosciences, Heidelberg

Natriumchlorid Merck, Darmstadt

Natriumhydroxid Roth, Karlsruhe

Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) PAA Laboratories, Cölbe

Proteinase K Roth, Karlsruhe

Proteinase K solution Qiagen, Hilden

Reinstwasser (Millipore) Forschungslabor Plastische Chirurgie;

Bergmannsheil Bochum

Salzsäure 1N Roth, Karlsruhe

Sauerstoff Air Products, Hattingen

Stickstoff, flüssig Air Products, Hattingen

Tris-Base Appli Chem, Darmstadt

Triton X-100 Sigma, Steinheim

Trypsin-EDTA PAA Laboratories,Cölbe

Tween® 20 Roth, Karlsruhe

Veet® Haarentfernungs-Creme Sensitive Reckitt Benckiser Deutschland

GmbH,Mannheim

Xylenecyanol Sigma, Steinheim

Xylol (Isomere) Roth, Karlsruhe

3.1.2 Antikörper und Seren

Anti-muriner-CD31-AK in Ratte Dianova, Hamburg

Anti-Ratte-IgG in Ziege Dianova, Hamburg

Biotinyl. Anti-Kaninchen-IgG in Ziege Vector, Burlingame (USA)

Monoklonaler Anti-CD3-AK in Ratte Acris, Herford

Monoklonaler Anti-F4/80-AK in Ratte Acris, Herford

Monoklonaler Anti-Ki67-AK Acris, Herford

in Kaninchen

Normales Ziegenserum Vector, Burlingame (USA)

25

3.1.3 Primer und Sonden

Die folgenden eingesetzten Primersequenzen und Sonden für die Realtime-PCR

stammen von der Firma Roche, Mannheim. Die Auswahl erfolgte mittels des

verfügbaren Assay Design Center der Universal Probe Library auf der Website

www.roche-applied-science.com. Hergestellt wurden die Primer von der Firma TIB

MOLBIOL, Berlin.

Tab. 3.1 Übersicht über Primer und Sonden für die RT-PCR. Zugangsnummer der Primer mit deren Vorwärts- (V) und Rückwärtssequenz (R), sowie der zugehörigen Sondenummer, die bei der Genexpressionsanalyse der aufgeführten Proteine verwendet wurden. Die Länge der Amplikons ist in Basenpaaren (bp) angegeben.

Gen

(Synonym)

Zugangsnummer/

Fragmentgröße

Sonden-

nummer

Sequenz 5’-3’

IFN-γ EF423643.1

89 bp

21 V: atctggaggaactggcaaaa

R: ttcaagacttcaaagagtctgaggta

IGFbp-3 NM_008343.2

88 bp

63 V: gcagcctaagcacctacctc

R: ctttccacactcccagcatt

IL-12 Gene_1

94 bp

62 V:ccaggtgtcttagccagtcc

R: gcagtgcaggaataatgtttca

IL-16 NM_010551.3

66 bp

71 V: aaggtcacagacccttctgg

R: tggcagcagctctctggt

IP-10 (CXCL

10)

NM_021274.1

111 bp

3 V: gctgccgtcattttctgc

R: tctcactggcccgtcatc

MCP-1 (JE) NM_011333.3

76 bp

62 V: catccacgtgttggctca

R: gatcatcttgctggtgaatgagt

MIG (CXCL

9)

NM_008599.4

75 bp

1 V: cttttcctcttgggcatcat

R: gcatcgtgcattccttatca

NOV

(Igfbp 9)

NM_010930.4

94 bp

11 V: agtggacctgtggctcaga

R: tcaactcctacggtggcttc

18S rRNA NR_003278.1

68 bp

48 V:gcaattattccccatgaacg

R: gggacttaatcaacgcaagc

26

3.1.4 Fertige Versuchsansätze

ABC Kit ELITE Vectastain, Wertheim

Cell Proliferation ELISA, BrdU Roche, Mannheim

ImmPACT DAB Vector, Burlingame (USA)

LightCycler® 480 Probes Master Roche, Mannheim

RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden

RNase-free DNase Set Qiagen, Hilden

Transcriptor First Strand cDNA Roche, Mannheim

Synthesis Kit

3.1.5 Puffer, Lösungen

DMEM-Zellkulturmedium für HFB225 890 ml Dulbecco’s Modified Eagle

und SW982 Medium (DMEM ohne Kalzium und

Magnesium), PAA Laboratories Cölbe,

100 ml/l FCS, 10 ml/l Pen (100 U/µg)/Strep

(100 µg/ml)

PBS (Phosphatpuffer), pH 7,2 PAA Laboratories, Cölbe

PBST-Puffer 0,1 % Tween 20 in PBS

Probenpuffer (6-fach), 0,125 g Bromphenolblau, 0,125 g

Xylenecyanol, 17,2 ml 87 % Glycerol auf

50 ml MQ-Wasser

RPMI-Zellkulturmedium für BFS-1-wt PAA Laboratories, Cölbe

100 ml/l FCS, 10 ml/l Pen (100 U/µg)/Strep

(100 µg/ml)

50 x TAE, 242 g Tris Base, 57,1 ml Eisessig, 18,6 g

EDTA auf 1 l MQ-Wasser, pH 8

(eingestellt mit NaOH)

TE-Kalziumchloridpuffer 6,10 g Tris Base, 0,37 g EDTA, 0,56 g

Kalziumchlorid, 5 ml Triton X-100 in

1000 ml MQ-Wasser; pH 8 (eingestellt mit

10 M HCl)

27

3.1.6 Geräte

Analysenwaage BL 600 Sartorius, Göttingen

Anästhesiegerät Sulla 19 Draeger, Lübeck

Backofen Bachofer, Reutlingen

Bio-Photometer Eppendorf, Hamburg

Cell strainer 100 µM BD Biosciences, Heidelberg

Combitips plus biopur 0,5 ml, 2,5 ml, Eppendorf, Hamburg

5 ml, 10 ml

Deckgläser Diagonal, Knittel Glass, Braunschweig

Eismaschine Ziegra, Isemhagen

Einmalpipetten 5 ml, 10 ml, 25 ml Biochrom, Berlin

Einweg-Pinzette, steril Servoprax, Wesel

Electrophoresis Power Supply E881 Consort, Turnhout, Belgien

Elektrophoresekammer Subcell GT Bio-rad, Kalifornien, USA

Feinwaage RC210D Sartorius, Göttingen

Homogenisator PT3100 Polytron® Kinematica, Luzern, Schweiz

Image Station 4000MM Kodak, Stuttgart

Insulinspritzen, steril BD Biosciences, Heidelberg

Kalliper 572587 LUX, Wermelskirchen

Kamera PowerShot S2IS Canon, Japan

Kanülen G1, G17 Braun, Emmenbrücke

Kryo-Röhrchen Nalgene, Wien

Laminar Air Flow-Käfige und Racks Allentown Caging Equipment Co., New

Jersey, USA

Laserdissektionsmikroskop DM600B Leica Mikrosysteme Vetrieb GmbH,

Wetzler

LightCycler® 480II Roche, Mannheim

Microplate Luminometer Orion Berthold–Detection Systems,

Alabama, USA

Magnetrührer MR0 Heidolph, Schwabach

Megafuge 1.0R Heraeus, Tuttlingen

Mikrowelle R2V26 Sharp, Hamburg

Multipette® stream Eppendorf, Hamburg

Objektträger Menzel-Gläser, Braunschweig

28

Opti-seal optical disposable adhesive Bioplastics, Landgraaf, Niederlande

Permanentstift Lumocolor Staedler, Nürnberg

Petrischalen Sarstedt, Nürnbrecht

pH-Meter pH340/ION-Set WTW, Weilheim

Pipettenspitzen (0,5-2 µl, 0,5-10 µl, Biosphere AG, Wilhelmshaven

20-100 µl, 20-200 µl, 100-1000 µl)

Pipettierhilfe Eppendorf, Hamburg

Präparierbesteck, steril Forschungslabor Plastische

Chirurgie, Bergmannsheil Bochum

Reinstwasseranlage MiliQ-Plus Millipore, Schwalbach

50 ml Röhrchen, steril, Schraubkappe VWR International GmbH,

Darmstadt

Safe Lock Tubes 1,5 ml, PCR, clean Eppendorf, Hamburg

Skalpelle, steril Aesculap, Tuttlingen

Speed Vac Sternkopf, Lübeck

Stereo-Mikroskop Axiokop2 Plus Zeiss, Jena

Sterilbank HS12 Heraeus Holding GmbH, Hanau

Thermocycler 60 bio-med, Oberschleißheim

Untersuchungshandschuhe Nitril Top Glove, Duisburg

UV-Einmal-Küvetten Eppendorf, Hamburg

Vortex Genie 2 Scientific Industries, New York,

USA

WärmeinkubatorZellen/Medien Heraeus, Tuttlingen

6-well-Platte BD Bioscience, Heidelberg

96-well-Platten black, clear bottom Costar, NY, USA

96x0,2 ml-well-plate, Roche LC480 Bioplastics, Landgraaf, Niederlande

compatible, white

Zellkulturflasche, 150 cm2 TPP, Trasadingen, Schweiz

Zellzähler CASY®-1TT Schärfe System, Reutlingen

Zentrifuge 5415R Eppendorf, Hamburg

Zentrifugenröhrchen 10 ml, steril TPP, Trasadingen, Schweiz

29

3.1.7 Das synthetische Host Defense Peptid

Das eingesetzte Peptid [D]-K4H2L9 wurde freundlicherweise von Prof. Yechiel Shai,

Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel, als Lyophilisat zur Verfügung gestellt.

Die Aminosäuresequenz lautet wie folgt:

L K L L H K L L K H L L K L L -NH2

(D-Aminsäuren sind fettgedruckt und unterstrichen).

3.1.8 Das Scrambled-Peptid scP-K3H3L 9

Das verwendete Kontrollpeptid besteht aus den L-Aminosäuren Lysin, Histidin und

Leucin, welche wie folgt angeordnet sind: L K L K L L K L L H L H L H L -NH2.

Im Folgenden wird dieses Peptid als scP-K3H3L9 bezeichnet. Das Peptid wurde von

PolyPeptide Laboratories France SAS in Straßburg synthetisiert.

3.1.9 Primärzellen und Zelllinien

Gearbeitet wurde in den folgenden in vitro-Versuchen und auch im syngenen

Mausmodell mit der murinen Fibrosarkomzelllinie BFS-1 wt. Die BFS-1 wt-Zellen

stammen von einem Fibrosarkom ab, welches in einer weiblichen C57BL/6-Maus durch

das Karzinogen Methylcholanthrene induziert wurde. Die Zellen wurden

freundlicherweise von Prof. Hehlgans, Universität Regensburg, zur Verfügung gestellt.

Bei den in vitro-Versuchen wurden zusätzlich Synovialsarkomzellen SW982 als

humane Sarkomzelllinie eingesetzt. Diese wurde bereits bei Vorversuchen der

Arbeitsgruppe im athymischen Mausmodell verwendet. Die Zelllinie stammt von der

Firma CLS (Cell Line Service, Eppelheim).

Die primären humanen Fibroblasten, HFB225, repräsentierten gesunde Zellen. Diese

wurden aus einem chirurgischen Resektat eines Patienten der Klinik für Plastische

Chirurgie des Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil in

Bochum gewonnen. Die Genehmigung für die Verarbeitung von Haut (Dermis und

Epidermis) für Forschungszwecke wurde durch das Ethikkomitee des

Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil, Ruhr-Universität

Bochum erteilt und trägt das Aktenzeichen 2353/3.3. Der 47-jährige Spender des

Gewebes wurde aufgeklärt und erteilte schriftlich seine Zustimmung.

30

3.1.10 Tiere

Die männlichen C57BL/6 Mäuse für den in vivo-Versuch stammen aus den Charles

River Laboratories, Sulzfeld. Zum Zeitpunkt der Lieferung waren sie ca. 6 Wochen alt

und wogen 20 g.

3.2 Methoden

Abb. 3.1 Arbeitsphasen bei der Untersuchung der Wirkung des Host Defense Peptids [D]-K4H2L9. Nach der Kultivierung der verschiedenen Zelllinien und der in vitro-Versuche folgte die intratumorale [D]-K 4H2L9-Therapie von murinen Fibrosarkomen (BFS-1 wt) in immunkompetenten Mäusen. Bei der abschließenden Finalisierung der Versuchstiere wurden Gewebeproben asserviert. Eine Analyse der Tumore durch immunhistochemische Färbungen (IHC) und Genexpressionsanalyse mittels RT-PCR sollte Aufschluss über mögliche Einflüsse des Peptids geben.

3.2.1 Lösen der Peptide

3.2.1.1 Lösen des Peptids [D]-K4H2L9

Zunächst musste das als Lyophilisat gelieferte Peptid in Lösung gebracht werden. Dazu

wurden die vorhandenen 25 mg Peptid in 20 ml 20 % Essigsäure gelöst, welche das

Peptid aktivierte. Auf 20 Eppendorfgefäße verteilt verdampfte die Flüssigkeit in 3-

4 Stunden durch Wärme und unter Vakuumbedingungen in einer Speed Vac. Das auf

diese Weise neu erhaltene Lyophilisat wurde nun in PBS gelöst. Die dafür verwendeten

2,5 ml PBS mit den 25 mg des gelösten Peptids wurden gesammelt und aliquotiert. Die

Endkonzentration der Aliquots betrug folglich 10 mg/ml. Die Peptidlösungen wurden

bei -80 ºC aufbewahrt und erst unmittelbar vor Gebrauch aufgetaut.

31

3.2.1.2 Lösen des Scrambled-Peptids scP-K3H3L 9

Die 55 mg Scrambled-Peptid scP-K3H3L9 wurden auf Grund seiner Hydrophobizität in

0,1 % Essigsäure gelöst. Die 5 mg/ml konzentrierte Lösung wurde aliquotiert bei -80 ºC

aufbewahrt.

3.2.2 Generierung und Kultivierung der Zellen

3.2.2.1 Gewinnung der humanen Fibroblasten

Die Gewinnung der primären humanen Fibroblasten fand nach Überführung von sterilen

chirurgischen Resektaten ins Forschunglabor der Plastischen Chirurgie statt. Dort wurde

die bei einer Abdominoplastik entnommene Haut zunächst durch PBS gereinigt und von

Fett befreit. Nach Ausdünnen der Dermis mit Hilfe eines Skalpells wurde die Haut in

0,2 %iger Dispase-PBS-Lösung über Nacht bei 4 ºC inkubiert. Am nächsten Morgen

konnten Epidermis und Dermis voneinander separiert werden. Letztere wurde zunächst

durch ein Skalpell zerkleinert und folgend durch 1 % Kollagenase II zwei Stunden lang

im 37 ºC-Schüttler bei 200 rounds per minute (rpm) enzymatisch verdaut. Die so

erhaltene Zellsuspension wurde durch DMEM-Nährmedium verdünnt, mit Hilfe eines

100 µm-Filters von gröberen Gewebestücken befreit und für 10 min bei

Raumtemperatur und 1400 rpm zentrifugiert. Das so erhaltene Zellpellet wurde in

Medium resuspendiert und die gewünschte Zellzahl in Kulturflaschen ausgesät.

3.2.2.2 Zellkulturbedingungen

Die Zellen wurden stets in sterilen Behältern kultiviert und mit sterilen Substanzen

behandelt. Die BFS-1 wt-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium mit 10 % fötalem

Kälberserum (FCS) und 1 % Penicillin/Streptomycin-Zusatz (Pen/Strep) kultiviert, die

Synovialsarkomzellen und die Fibroblasten in DMEM mit ebenfalls jeweils 10 % FCS

und 1 % Pen/Strep. Einmal pro Woche wurden die Zellen in neue 150 cm2-

Kulturflaschen umgesetzt. Dafür wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mittels

Trypsin-EDTA (0,05 %/ 0,02 %) in PBS (5 ml/ 150 cm2) vom Boden der Kulturflasche

abgelöst. Diese Reaktion wurde nach 2-3 Minuten mit FCS-haltigem Medium gestoppt.

Dem Überführen der entstandenen Zellsuspension in ein 10 ml-Röhrchen folgte ein

Abzentrifugieren der Zellen bei 1400 rpm für 5 Minuten und Raumtemperatur und ein

erneutes Lösen in Nährmedium. Die Zellzahl pro Milliliter wurde durch den CASY-

Zellzähler bestimmt und die Zellen mit einer Dichte von 3000 Zellen/cm2 in die

32

Kulturflaschen ausgesät. Ein Mediumwechsel fand alle zwei Tage statt. Die

Kultivierung der Zellen erfolgte bei 37 ºC und 5 % CO2.

3.2.3 In vitro-Versuch: BrdU-Zellproliferationsassay

Zur Quantifizierung der antiproliferativen Aktivität zytotoxisch und onkolytisch

wirksamer Substanzen diente der 5-Brom-2-Desoxy-Uracil(BrdU)-Assay, der nach dem

Protokoll des Herstellers des entsprechenden Kits durchgeführt wurde.

Je 3x104 Zellen/well der BFS-1 wt und HFB-Zellen beziehungsweise 2x104 Zellen/well

der SW982-Zellen wurden in FCS-haltigem Medium in eine 96-well-Platte ausgesät.

Nach 24 Stunden fand ein Mediumwechsel statt. Zu dem nun FCS-freien Medium

wurden onkolytische Substanzen in den gewünschten Konzentrationen zugegeben. Der

Negativkontrolle wurde PBS zugesetzt und das Medium der Positivkontrollen enthielt

0,1 % Triton X-100. Zur Messung des Hintergrundsignals wurden einige Messzellen

nur mit Medium versehen. Nach weiteren 24 Stunden wurde das Thymidinanalogon

Bromdesoxyuridin hinzugegeben, welches während der Zellproliferation in die neu

synthetisierte DNA der Zellen eingebaut wurde. Diese Inkubation wurde nach 22

Stunden abgestoppt, indem die Reagenzien abgesaugt und die Zellen für eine halbe

Stunde fixiert wurden. Es folgte die 90-minütige Inkubation mit dem BrdU-Antikörper.

Nach dreimaligem Waschen und Substratzugabe konnte die Lichtemission, die der

Proliferationsaktivität entsprach, durch ein Luminometer gemessen werden. Die

Veränderung der Zellproliferation durch die anfangs zugegebenen Substanzen wurde

durch den Vergleich zur Negativkontrolle ausgewertet. Vorher wurde das gemessene

Hintergrundsignal von allen Werten abgezogen.

Mit Hilfe dieses Tests wurde die onkolytische Wirksamkeit der Peptide [D]-K4H2L9 und

scP-K3H3L9 bestimmt. Die Dosisabhängigkeit dieses Effektes wurde durch Einsetzen

folgender Konzentrationen herausgestellt: 100 µM, 87,5 µM, 75 µM, 62,5 µM, 50 µM,

25 µM, 12,5 µM, 6,25 µM, 3,125 µM, 1,5625 µM und 0 µM. Es wurde berücksichtigt,

dass das scP-K3H3L9 in 0,1 % Essigsäure gelöst ist. Dementsprechend wurde den

Negativkontrollen auch die Essigsäure zugesetzt, die sich bei der höchsten

Peptidkonzentration in den Ansätzen befand (0,04 %). Durch das basische Nährmedium

in den Ansätzen beziehungsweise in den Negativkontrollen wurde die Essigsäure

gepuffert.

Auch der onkolytische Effekt von Doxorubicin, einem Standardzytostatikum, wurde

quantifiziert. Da das Chemotherapeutikum bereits im nanomolaren Bereich wirkt,

33

wurden hier geringere Konzentrationen gewählt: 5 µM, 4,588 µM, 3,59 µM, 2,5 µM,

1,25 µM, 625 nM, 312,5 nM, 156,25 nM, 78,125 nM, 39,0625 nM und 0 nM.

Um Aussagen über die pharmakologische Interaktion der beiden Substanzen treffen zu

können, wurden die Zellen zusätzlich mit beiden Substanzen inkubiert. Hierbei wurden

Konzentrationen benutzt, die in Einzelversuchen die Zellproliferation um ca. 25 %

einschränken. Diese Konzentrationen wurden anhand der erhaltenen Dosis-Wirkungs-

Kurve ermittelt. Für die kombinierte Proliferationshemmung durch [D]-K4H2L9 und

Doxorubicin wurden folgende Werte eingesetzt: Die BFS-1 wt-Zellen wurden mit

6,1 µM [D]-K4H2L9 und 40 nM Doxorubicin inkubiert, die SW982-Zellen mit 1,6 µM

[D]-K 4H2L9 und 8 nM Doxorubicin und die HFB225-Zellen mit 7 µM [D]-K 4H2L9 und

2,2 nM Doxorubicin.

3.2.4 In vivo-Versuch

3.2.4.1 Genehmigung

Die Durchführung des Tierversuchs erfolgte gemäß des deutschen Tierschutzgesetzes

(§7 ff. TierSchG) nach Genehmigung durch die Bezirksregierung Arnsberg (AZ: 8.87-

50.10.37.09.235).

3.2.4.2 Projektübersicht

Um die Wirksamkeit des synthetischen Peptids im physiologischen Kontext, vor allem

bei vorhandenem Immunsystem zu ermitteln, wurde ein syngenes Mausmodell

angewandt. Dazu wurde 15 immunkompetenten C57BL/6–Mäusen nach einer

einwöchigen Eingewöhnungszeit subkutan BFS-1 wt-Zellen injiziert. Sobald der Tumor

eine durchschnittliche Größe von ca. 38 mm3 ± 35,02 mm3 erreicht hatte, startete die

Behandlung mit dem synthetischen Host Defense Peptid oder mit PBS in der

Kontrollgruppe. Die Substanzen wurden dreimal pro Woche über einen Zeitraum von

drei Wochen intratumoral injiziert. Nach Ablauf der Therapieperiode erfolgte eine

Beobachtungszeit von einer Woche, bevor die Tiere euthanasiert wurden. Während des

gesamten Versuchs wurde das Futtergewicht, das Tiergewicht sowie die durch einen

Messschieber bestimmte Tumorgröße und oberflächliches Nekrosenausmaß

protokolliert. Die fotografische Dokumentation von sämtlichen Eingriffen erfolgte mit

anliegendem Lineal und aufgetragener Rückennummer.

Die Messungen sowie die therapeutischen Injektionen und die Rasur erfolgten stets in

Narkose. Dazu wurden die Tiere unter eine Narkoseglocke gesetzt, die mit 5 Vol%

34

Isofluran und 3-4 l/min Sauerstoff geflutet wurde. Nach Einsetzen der Wirkung wurden

die Mäuse mit einer Gesichtsmaske, die Mund und Nase umschloss, auf den

Versuchsplatz gelegt. Über die Gesichtsmaske wurde die Narkose mit Hilfe von 1,5

Vol% Isofluran und 0,4-0,5 l/min Sauerstoff aufrechterhalten. Die Tiefe der Narkose

konnte anhand der Atemfrequenz eingeschätzt und das Isofluran in einem Rahmen von

0,6-3 Vol% entsprechend angepasst werden. Bei schmerzhaften Eingriffen wie der

Tumor- oder Peptidinjektion wurde zusätzlich 0,75-1 l/min Lachgas zugeflutet. Ein

Austrocknen der Augen während der Narkose wurde mit Augensalbe verhindert. Nach

diesem Narkoseschema erwachten die Tiere sehr schnell, sobald sie zurück in ihren

Käfig waren.

Um das Tumorwachstum besser fotografisch und metrisch verfolgen zu können, wurde

die linke Seite der Mäuse zunächst mit einem elektrischen Rasierer rasiert und dann mit

Veet-Enthaarungscreme enthaart. Letztere wirkte kurz ein und wurde dann zusammen

mit den gebrochenen Haaren durch einen Spatel entfernt. Gründlich nachgereinigt

wurde mit Wasser und Desinfektionsmittel um eine starke Hautreizung und Wunden zu

vermeiden.

Zur Berechnung des Tumorvolumens diente folgende Formel:

V = π/6 x a x b x c (Sersa et al., 2010),

wobei a der Länge, b der Breite und c der Höhe entsprach. Von Bedeutung war dabei

das Einbeziehen der Höhe des Tumors, weil sich gerade zu Beginn des Versuchs die

Tumorgröße von behandelten und nicht-behandelten Versuchstieren in der Höhe

unterschied.

Zehn Mäuse erhielten die Host Defense Peptid-Behandlung während fünf Tieren die

Trägersubstanz PBS appliziert wurde.

3.2.4.3 Injektion der Tumorzellen

Die BFS-1 wt-Zellen wurden mit Trypsin-EDTA-Lösung (5 ml/150 cm2) vom Boden

der Kulturflaschen abgelöst, nachdem die Zellen dreimal mit PBS gewaschen wurden,

um alte und zerstörte Zellen zu beseitigen. Die Ablösereaktion wurde nach 2-3 Minuten

mit FCS-haltigem Medium gestoppt. Anschließend erfolgte bei Raumtemperatur ein

Abzentrifugieren der Zellen bei 1400 rpm für 5 Minuten und ein Wiederlösen in PBS.

Nachdem die Zellzahl mit Hilfe des CASY-Zellzählers ermittelt wurde, wurde die

35

benötigte Menge an Zellen, d.h. 5 x 105 Zellen pro Maus, in ein steriles 50 ml-Gefäß

pipettiert und erneut abzentrifugiert.

Das Pellet wurde in je 50 µl PBS pro Maus gelöst. Je 50 µl der Zellsuspension wurden

zusammen mit je 50 µl Matrigel im Kühlraum in die Insulinspritzen aufgezogen, welche

bis zur Injektion auf Eis gelagert wurden. Die dazu verwandten Pipettenspitzen und

Insulinspritzen wurden vorher auf 4 ºC heruntergekühlt. Das Matrigel als gelatinöses

proteinhaltiges Sekret muriner Sarkomzellen übernahm zunächst die Funktion einer

extrazellulären Matrix. Es verfestigte sich, sobald es auf die Körpertemperatur der Tiere

aufgewärmt war und erlaubte den lokalen Verbleib der Tumorzellen.

Die Injektion erfolgte in oben beschriebener Narkose langsam sukutan in die linke

Flanke. Die Haut wurde vorher desinfiziert. Das Ausbreitungsvolumen wurde mit dem

Messschieber gemessen und der Eingriff fotografisch festgehalten.

3.2.4.4 Therapeutische Injektionen

Als Dosis der Host Defense Peptid-Behandlung wurde 5 mg/kg gewählt; entsprechend

in vivo durchgeführter Vorversuche im Forschungslabor der Plastischen Chirurgie des

Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil Bochum. Bei nun

fast 30 g schweren Mäusen betrug die Dosis folglich 150 µg. Diese Menge wurde in

einem Volumen von 50 µl injiziert. Dementsprechend wurde eine Peptidlösung für die

Versuche angesetzt, die vor den Injektionen aufgetaut, gemischt und abzentrifugiert

wurde. Das benötigte Volumen wurde in 1,5 ml-Reaktionsgefäße vorgelegt und in die

sterilen Insulinspritzen aufgezogen. Für die Kontrollgruppe wurde die äquivalente

Menge an PBS vorgelegt und ebenfalls aufgezogen. Diese Schritte erfolgten unter

sterilen Bedingungen.

Die Spritzen wurden bis zur intratumoralen Injektion auf Eis gelagert.

3.2.4.5 Euthanasie

Der Versuch schloss mit der Finalisierung der Tiere. Diese wurden dazu wie

beschrieben in Narkose versetzt und die Tumormaße, Körper- und Futtergewicht erneut

festgehalten. Nach Atemstillstand durch reines Isofluran wurde zusätzlich eine zervikale

Dislokation durchgeführt. Der Tumor wurde präpariert, entnommen, beschrieben, erneut

gemessen und gewogen. Ein Teil des Tumors wurde wie Teile der Lunge, Haut, Leber

und Milz in 5 % Formafix zur Herstellung von Paraffinschnitten konserviert. Ein

zweiter Teil wurde wie Lunge und Haut in Kryoröhrchen durch Stickstoff

36

schockgefrostet, so dass dieses Gewebe zur RNA-Isolation und der folgenden

Genexpressionsanalyse verwendet werden konnte. Der dritte Teil des Tumors wurde auf

einem Korkplättchen in Kryo–Medium eingebettet und in flüssigem Stickstoff

eingefroren, um die Option der Herstellung von Gefrierschnitten zu erhalten.

Die Entnahme der Organe erfolgte nach Eröffnung des Bauchraums und des Brustkorbs.

Indikationen für eine frühzeitige Euthanasie wären ein Gewichtsverlust von mehr als 20

Prozent, persistierende Schmerzen oder ein Tumordurchmesser größer als 20 mm

gewesen. Diese Umstände traten jedoch nicht ein.

Für die immunhistochemischen Untersuchungen stellte das Pathologische Institut des

Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil, Bochum,

Paraffinschnitte von 2-3 µm Dicke aus Tumor- und Lungengewebe sowie der Haut her.

Zur Übersicht wurde jeweils ein Schnitt pro Probe einer HE-Färbung unterzogen.

3.2.4 Immunhistochemie

3.2.4.1 Allgemeines Protokoll

Zur Anfärbung der gewünschten Strukturen in den Tumor-Paraffinschnitten wurde

immunhistochemisch mit zwei Methoden gearbeitet. Zum einen wurde der braune

Farbstoff 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) und zum anderen eine Floureszenzfärbung

eingesetzt. Welche Strukturen gefärbt wurden, entschied sich durch den Einsatz der

entsprechenden Antikörper, die folgend genannt werden.

Alle Paraffinschnitte wurden zunächst für eine Stunde bei 70 ºC durch Hitze fixiert.

Dann kühlten sie eine halbe Stunde bei Raumtemperatur ab. Die Deparaffinierung

erfolgte durch Inkubation in Xylen für 2 x 5 Minuten und die Hydration in einer

absteigenden Alkoholreihe, das heißt für je zwei Minuten in 100 %, 95 %, 70 %, 50 %

Ethanol und MQ-Wasser. Proteinbindestellen wurden folgend in

Antigendemaskierungslösung (Citrat-Puffer, pH 6) freigelegt, in welchem die Schnitte

erst 10 Minuten lang in der Mikrowelle erhitzt wurden (ohne zu kochen) und dann

30 Minuten bei 4 ºC abkühlten. Wie nach jedem einzelnen der nachfolgenden Schritte

erfolgte ein Waschen erst für eine und dann für vier Minuten in PBS. Bei einer DAB-

Färbung, nicht aber bei einer Fluoreszenzfärbung, erfolgte nun ein Quenchen der

endogenen Peroxidase-Aktivität in 3 % Wasserstoffperoxid-Lösung, um falsch

positiven Anfärbungen durch DAB vorzubeugen. Für die DAB- und die

Fluoreszenzfärbung wurden anschließend die unspezifischen Proteinbindestellen in den

Tumorschnitten für 30 Minuten durch Serum geblockt. Da dieses entsprechend dem

37

Wirt des Zweitantikörpers gewählt wird, wurde in den beschriebenen Versuchen

Ziegenserum (15 µl/ml PBST) verwendet. Erneut wurden die Schnitte gewaschen und

für ebenfalls 30 Minuten mit dem Erstantikörper inkubiert. Es wurde stets eine

Negativkontrolle mitgeführt, die mit PBS statt mit dem Erstantikörper während der

30 Minuten inkubiert wurde. Nach insgesamt fünf Minuten Waschen wurde für weitere

30 Minuten der Zweitantikörper spezifisch gegen den Wirt des Erstantikörpers auf das

Tumorgewebe gegeben. Es folgte ein weiterer Waschschritt.

Für die DAB-Färbung wurde wie folgt weitergearbeitet: Nach dem Protokoll des

Herstellers wurde das ABC ELITE Reagenz eine halbe Stunde vor Gebrauch angesetzt

(10 µl Reagenz A plus 1 ml PBST plus 10 µl Reagenz B) und die Schnitte dann für eine

halbe Stunde mit diesem inkubiert. In diesem Schritt wurden die Zweitantikörper mit

einer exogenen Peroxidase versehen, die das später zugegebene DAB farblich umsetzen

kann. Während des folgenden Waschschrittes wurde kurz vor Gebrauch das ImmPACT

DAB Substrat nach Herstellerempfehlung in einem mit Aluminiumfolie umwickelten

Eppendorf-Gefäß angesetzt (1 Tropfen ImmPACT DAB Chromogen-Konzentrat auf

1 ml ImmPACT Verdünnungsmittel). Dieses wurde probeweise für wenige Minuten auf

einen Schnitt gegeben. Nach kurzem Abwaschen des Substrates durch PBS wurde die

Farbintensität unter dem Lichtmikroskop geprüft und nach Ermessen weitergefärbt.

Nach Feststellen der optimalen Färbezeit wurden die restlichen Schnitte

dementsprechend gefärbt. Die maximale Färbezeit betrug 30 Minuten.

Nach fünfminütigem Waschen in PBS erfolgte eine Gegenfärbung und Nachbehandlung

zur längerfristigen Qualitätssicherung der immunhistochemischen Färbung. Dazu

wurden die Schnitte 30 Sekunden in Hämatoxylin-Lösung nach Mayer gefärbt und

wurden dann unter laufendem Leitungswasser solange gespült, bis dieses farblos blieb.

Zehnmal wurden die Tumorschnitte nun in 2 % Essigsäure (2 ml Eisessig plus 98 ml

MQ-Wasser) und danach zehnmal in Leitungswasser getaucht. Nach einer Minute in

Bläuungslösung (1,5 ml Ammoniak plus 98,5 ml 70 % Ethanol) verblieben die Schnitte

noch eine Minute in Leitungswasser.

Zum Entwässern erfolgte nun eine verkürzte aufsteigende Alkoholreihe von je 2

Minuten in 95 % und 100 % Ethanol. Der letzte Schritt bestand in fünfminütiger

Xylene-Inkubation. Beim Eindecken mit Deckgläschen wurde Entellan als Medium

verwendet.

Bei der Fluoreszenzfärbung wurde anschließend an das Waschen zum Entfernen der

Zweitantikörperlösung Streptavidin Alexa Fluor488® (10 µg/ml PBS) für eine halbe

38

Stunde auf das Tumorgewebe gegeben, welches an den biotinylierten Zweitantikörper

binden konnte. Auch die Streptavidin-Lösung wurde durch PBS entfernt und eine

Gegenfärbung der Zellkerne durch eine DAPI-Löung (300 ng/ml PBS) erfolgte. Zum

Eindecken mit Deckgläschen wurde ein Floureszenz-Eindeckmedium verwendet. Die

Schnitte wurden im Dunkeln bei 4 ºC aufbewahrt.

3.2.4.2 Ki67-Proliferationsaktivitätfärbung

Zum Anfärben der sich in der Proliferation befindenden Zellen wurde der monoklonale

Antikörper Anti-Ki67 gewählt, der in Kaninchen produziert wurde. Dieser markiert ein

Antigen, das während aller Zellzyklusphasen außer in der G0-Phase im Zellkern

exprimiert wird. So kann die Proliferationsaktivität genauer als durch eine Mitosen-

Auszählung festgestellt werden (Ueda et al., 1989). Der Antikörper wurde in einer

Verdünnung von 1:100 für die Fluoreszenzfärbung eingesetzt und in einer Verdünnung

von 1:20 für die DAB-Färbung. DAB verblieb fünf Minuten auf den Tumorschnitten.

3.2.4.3 CD31-Blutgefäßfärbung

Für die Anfärbung der Blutgefäße mittels des Antikörpers Anti-CD31 aus dem Wirt

Ratte wurde auch die DAB-Färbung angewandt. Die Färbezeit mit DAB betrug drei

Minuten. Bei CD31 handelt es sich um ein integrales Membranprotein, welches

konstitutiv auf der Oberfläche von Endothelzellen exprimiert wird und ein Bestandteil

der Zellkontakte im Endothelzellverband ist. Ein Synonym ist PECAM-1 (engl.: Platelet

endothelial cell adhesion molecule; übersetzt in etwa: Plättchen-endotheliales-

Zelladhäsionsmolekül), welches darauf hinweist, dass dieses Molekül auch von

Thrombozyten und darüber hinaus auch von Monozyten und Neutrophilen exprimiert

wird (Newman, 1997).

3.2.4.4 CD3-T-Zellfärbung

Die T-Zellen wurden immunhistochemisch über das Oberflächenprotein CD3

gekennzeichnet. Verwendet wurde hierfür der monoklonale Antikörper Anti-CD3, der

in der Ratte synthetisiert wurde. Die Färbezeit mit DAB betrug sechs Minuten.

3.2.4.5 F4/80-Makrophagenfärbung

Auch zur Anfärbung der Makrophagen wurde DAB verwendet. Einzelne Schritte bzw.

deren Reihenfolge wichen vom allgemeinen Protokoll ab:

39

Im Unterschied zu dem oben beschriebenen Protokoll wurde hier nach

Herstellerempfehlung Proteinase K-Lösung zur Demaskierung der Antigene anstelle des

High-Temperature-Antigen-Retrievals mit Citratpuffer verwendet. Um diese

herzustellen, wurde zunächst eine Proteinase K-Stammlösung aus 0,016 g Proteinase K

(30 units/mg) und jeweils 20 ml TE-Kalziumchloridpuffer und Glycerol hergestellt.

Diese Stammlösung wurde bei -20 ºC aufbewahrt. Die Arbeitslösung, mit der die

Tumorschnitte nun einzeln zur Antigendemaskierung inkubiert wurden, setzte sich aus

1 ml der Proteinase K-Stammlösung und aus 19 ml des TE-Kalziumchloridpuffers

zusammen und wurde bei 4 ºC aufbewahrt. Die Inkubation der Tumorschnitte fand für

20 Minuten bei 37 ºC statt und es folgte eine Abkühlungsphase bei Raumtemperatur von

10 Minuten. Nach einem Waschschritt und der Ziegenseruminkubation (siehe oben)

folgte die 60-minütige Inkubation mit dem monoklonalen Erstantikörper Anti-F4/80,

der in der Ratte produziert wurde. Dieser bindet an das F4/80-Glykoprotein, welches

sich auf der Oberfläche von murinen Makrophagen befindet (Schaller et al., 2002).

Hiernach erfolgte das Quenchen der Endogenen Peroxidase-Aktivität und nach der

Inkubation mit dem Zweitantikörper Anti-Ratte in Ziege erfolgte die Färbung nach dem

allgemeinen Protokoll (Abschnitt 3.2.4.1). Die 3,3’-Diaminobenzidin-Lösung verblieb

für eineinhalb Minuten auf den Tumorschnitten.

3.2.4.6 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen

Nach der immunhistochemischen Färbung der Schnitte wurde die Negativkontrolle

überprüft. Folgend wurden von je drei Personen die Antigen-positiven Strukturen in je

zehn Sichtfeldern pro geblindetem Tumorschnitt ausgezählt. Nekroseareale, die durch

die Hämatoxylin- oder DAPI-Gegenfärbung gut sichtbar waren, wurden beim

Auszählen ausgespart. Die Makrophagen wurden bei einer 1000-fachen Vergrößerung

und die anderen Strukturen bei einer 400-fachen Vergrößerung ausgezählt. Pro

Behandlungsgruppe wurden je fünf Tumore immunhistochemisch analysiert.

3.2.5 Genexpressionsanalyse

3.2.5.1 RNA-Isolation

Die RNA-Isolation erfolgte mittels des RNeasy Mini Kits und die Durchführung

orientierte sich an dem vom Hersteller beigefügten Protokoll zur RNA-Isolation aus

Tiergewebe. Nur wenige Arbeitsschritte wichen von diesem ab.

40

Es wurden etwa 30 mg Tumorgewebe in 600 µl RLT-Puffer mittels eines Polytron-

Homogenisators zerkleinert. Der Homogenisatoraufsatz wurde zwischen dem

Homogenisieren der einzelnen Proben nacheinander in 20 ml MQ-Wasser, zweimal in

20 ml 70 % Ethanol, in 20 ml Natronlauge-EDTA-Lösung (0,1 M NaOH, 1 mM EDTA)

und zweimal in 30 ml MQ-Wasser gereinigt. Anschließend wurde den Proben 290 µl

MQ-Wasser und 10 µl Proteinase K-Lösung zugegeben, um das restliche inhomogene

Gewebe für 10 Minuten bei 55 ºC enzymatisch zu verdauen. Nach dreiminütigem

Abzentrifugieren der dann noch vorhandenen Gewebereste bei 10.000 rpm wurde der

Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und um sein halbes Volumen durch

100 %-igen Ethanol erweitert. Nach vorsichtigem Mischen durch auf- und abpippetieren

wurden die Proben schrittweise auf Rneasy-Mini-Säulen pippetiert, die sich in einem

2 ml-Auffangröhrchen befanden. In diese hinein wurde die Flüssigkeit durch die

Silikagel-Membran der Rneasy-Mini-Säule in 15 Sekunden bei 8.000 rpm

abzentrifugiert. Die aufgefangene Flüssigkeit wurde verworfen. Nun wurden 350 µl

RW1-Puffer auf die Rneasy-Mini-Säulen gegeben. Auch dieser wurde nach dem

beschriebenen Abzentrifugieren in die Auffangröhrchen verworfen. Zum DNase-Verdau

zum Entfernen von Kontaminationen durch DNA wurde das RNase-freie DNase-Set

eingesetzt. So wurde auf jede Silikagel-Membran der Rneasy-Mini-Säulen ein Gemisch

aus 10 µl DNase I-Stammlösung und 70 µl RDD-Puffer gegeben. Nach einer

Inkubationszeit von 30 Minuten wurden erneut 350 µl RW1-Puffer in die Säulen

pippetiert, in die Auffangröhrchen abzentrifugiert und verworfen. Anschließend wurden

die RNeasy-Mini-Säulen in neue Auffangröhrchen umgesetzt. Es wurden nun 500 µl

RPE-Puffer in die Säulen pippetiert und durch beschriebenes Abzentrifugieren wurden

die Membranen gewaschen. Das Zentrifugat wurde abermals verworfen. Nach dem der

Waschschritt wiederholt wurde, wurde die Silikagel-Membran durch zweiminütiges

Zentrifugieren bei maximaler Geschwindigkeit getrocknet. Zum Schluss wurden die

Mini-Säulen in RNase-freie 1,5 ml-Reaktionsgefäße gestellt und die RNA in 30 µl

RNase-freiem Wasser aus der Membran gelöst. Das Wasser verblieb für zwei Minuten

in der Säule bevor es bei maximaler Geschwindigkeit über eine Minute in die

Reaktionsgefäße abzentrifugiert wurde. Die RNA-Konzentration in den Lösungen

wurde mit Hilfe einer 1:50-Verdünnung im Photometer unter Verwendung UV-Licht-

durchlässiger Küvetten und Licht einer Wellenlänge von 230 nm bestimmt.

Zum Isolieren der RNA aus den BFS-1 wt-Zellen wurde auch das RNeasy Mini Kit

verwendet. Die RNA wurde nach dem Hersteller-Protokoll zur Isolierung der RNA aus

41

Tierzellen mit Durchführung des optionalen DNase-Verdaus vollzogen. Zunächst

wurden 400.000 Zellen in 2 ml ihres Mediums in eine Kammer einer Sechs-Well-Platte

ausgesät. Am nächsten Tag wurden sie nach Absaugen des Mediums mit 350µl des

1:100 verdünnten β-Mercaptoethanols in RLT-Puffer vom Boden der Kammer abgelöst.

Die Zellmembranen wurden aufgelöst und durch fünfmaliges auf- und abpipettieren mit

einer 1 ml-Pipette wurde die Suspension homogenisiert. Überführt in ein Eppendorf-

Gefäß wurden 350 µl 70 %-iger Ethanol hinzugefügt. Die Probe wurde nun auf die

RNeasy-Mini-Säule pipettiert und die RNA-Isolation erfolgte ab diesem Schritt

entsprechend der Isolation der RNA aus Tiergewebe.

3.2.5.2 cDNA-Synthese

Die cDNA-Synthese erfolgte aus der isolierten RNA mittels Transkriptor Erststrang-

cDNA-Synthese-Kit nach Angabe des Herstellers. Verwendung fand hierbei das

Protokoll für eine Zwei-Schritt-RT-PCR. Zunächst wurden für die Matrizen-Lösungen

1 µg RNA der Probe, 1 µl Oligo(dT)18-Primer und 2 µl Random-Hexamer-Primer

zusammengefügt. Durch PCR-geeignetes Wasser wurden die Ansätze auf ein Volumen

von 13 µl erweitert. Zur Denaturierung wurden die Proben für zehn Minuten auf einen

Hitzeblock bei 65 ºC platziert und anschließend auf Eis gekühlt. Pro Probe wurden

anschließend 4 µl des Reversen Transkriptase-Reaktions-Puffers, 0,5 µl des

RNase Inhibitor-Ansatzes, 2 µl des Deoxynukleotid-Mixes und 0,5 µl des

Reversen Transkriptase-Ansatzes hinzugefügt. Durch ein kurzes Zentrifugieren nach

kurzem auf- und abpipettieren wurden alle Komponenten am Gefäßboden gesammelt.

Zur cDNA-Synthese wurden die Proben für 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen

gelassen und dann für eine halbe Stunde bei 55 ºC inkubiert. Die Reverse Transkriptase

wurde dann bei einer fünfminütigen Inkubation bei 85 ºC inaktiviert. Die synthetisierte

cDNA wurde anschließend auf Eis gekühlt und bei -20 ºC aufbewahrt.

3.2.5.3 Real-time-PCR

Zur Analyse der Genexpression in den Tumoren wurde ein LightCycler 480 II und das

Universal Probe Library-System der Firma Roche verwendet. Hierbei arbeitet man mit

sogenannten Hydrolyse-Sonden und macht sich die 5’-3’-Exonuklease-Aktivität der

Polymerase zu Nutze. Jede Sonde verfügt über einen Fluoreszenfarbstoff (FAM) und

einen dunklen Quencher (Löschsubstanz), der in räumlicher Nähe zum

Fluoreszenzfarbstoff dessen Lichtemission verhindert. Kommt es zu einer Anlagerung

42

von Primer und Sonde an die cDNA, so füllt die Polymerase den Gegenstrang mit

passenden Desoxynukleosidtriphosphaten auf und baut gleichzeitig die angelagerte

Sonde ab, so dass es zu einer räumlichen Trennung von Quencher und Fluorophor

kommt und ein Fluoreszenzsignal detektiert werden kann. Die Menge des Amplifikates

korreliert somit mit der Zunahme des Fluoreszenzsignals, welche in Echtzeit mitverfolgt

werden kann. Die Spezifität der PCR ergibt sich aus der Kombination von Sonde und

Primern.

Die Expression folgender Gene wurde quantifiziert: IFN-γ, IGFbp-3, IL-12, IL-16, IP-

10, MCP-1, MIG und NOV. Die verwendeten Primer und Sonden sind in der Tabelle

3.1 aufgeführt.

In 96-well-Platten wurden die verschiedenen Reagenzien zur Analyse der

Genexpression pro well wie folgt angesetzt: 7,4 µl Wasser, je 0,2 µl des Vorwärts-

Primer, des Rückwärts-Primer und der Sonde und 10 µl des Probes Master®. Der

Probes Master enthielt die Polymerase, die Desoxyribonukleotidtriphosphate und

Magnesiumchlorid. Es wurden pro Ansatz je 2 µl der entsprechenden cDNA

hinzugefügt. Der Negativkontrolle wurde anstelle von cDNA 2 µl Wasser zugesetzt.

Die Amplifikation der spezifischen DNA-Abschnitte geschah durch Anwendung des

folgenden PCR-Programmes: Nach einer 10-minütigen Hitzeaktivierung der Taq-

Polymerase bei 95 ºC erfolgten je 50 Zyklen bestehend aus 10 Sekunden 95 ºC, 30

Sekunden 60 ºC, eine Sekunde 72 ºC und zuletzt wurden die Proben auf 40 ºC

herabgekühlt. Die Genexpression in den einzelnen Tumoren wurde im Triplikat

gemessen, pro Behandlungsgruppe wurden fünf Tumore analysiert. Die Auswertung

erfolgte durch die LightCycler-Software unter Berücksichtigung der sogenannten

Crossing Points der einzelnen Proben und unter Anwendung der 2. Ableitung. Jede

Messung wurde auf das Haushaltsgen 18SrRNA der Probe normalisiert, um etwaige

initiale Konzentrationsunterschiede zu berichtigen. Die Expression der Zytokine IFN-γ,

IP-10 und MIG, die in den Peptid-behandelten Tumoren stärker exprimiert wurden,

wurde auch in der cDNA in vitro-kultivierter BFS-1 wt-Zellen im Triplikat gemessen,

um auszuschließen, dass die Expression der Zytokine in den Tumoren nicht allein auf

die Tumorzellen zurückzuführen ist.

3.2.5.4 Gel-Elektrophorese

Zur Darstellung der spezifischen Amplifikation der gefragten cDNA-Sequenzen durch

die Verwendung von Primer und Sonden wurde eine Gel-Elektrophorese durchgeführt.

43

Dazu wurde zunächst ein Gel vorbereitet: 0,5 g Agarose wurden in 1 ml 50-fachem

TAE-Puffer und 49 ml MQ-Wasser in der Mikrowelle erhitzt, bis sich die Agarose

vollständig gelöst hatte. Dann wurde 5 µl Gelstar®, ein Farbstoff, der zwischen die

Basenpaare der DNA interkaliert und mittels UV-Licht angeregt und lokalisierbar wird,

zugefügt. Das Gesamtvolumen des Ansatzes wurde mit MQ-Wasser wieder auf 50 ml

aufgefüllt. Das Gel wurde in eine Kammer mit einem Gelkamm für 15 Geltaschen

gegossen und polymerisierte in 30 Minuten. Es wurde nun in die Gel-

Elektrophoresekammer gelegt und vollständig mit TAE-Puffer bedeckt. Je 4 µl des 6-

fachen Probenpuffers wurden zu den 20 µl der PCR-Ansätze nach Ablauf der

Polymerase-Kettenreaktion pipettiert. Hiervon wurden dann 3 µl in eine Geltasche

überführt. Von einem Basenpaar-Marker (0,1 µg/µl) wurden 5 µl in eine Geltasche

überführt. Nach Anlegen einer elektrischen Spannung (100 V (konstant), 200 mA,

40 W, 45 Minuten) wanderten die negativ geladenen DNA-Moleküle in Richtung der

positiv geladenen Anode und wurden so nach Größe aufgetrennt. Auf diese Weise

wurde die Entstehung verschiedener Amplikons in den PCR-Ansätzen analysiert. Es

wurden jeweils eine Probe und deren Negativkontrolle pro Primer-Sonden-Kombination

untersucht. Die Banden im Gel wurden mit einem Kodak Imager 4000MM

aufgenommen und sichtbar gemacht.

44

4 Ergebnisse

4.1 Wirkung des Peptids [D]-K4H2L9 in in vitro-Studien

4.1.1 Hemmung der Zellproliferation

Die Zellproliferation der verschiedenen Tumorzellen nach Inkubation mit verschiedenen

Konzentrationen des Host Defense Peptids [D]-K4H2L9 wurde anhand eines BrdU-

Assays gemessen. Es wurden die eingebauten Thymidin-Analoga quantifiziert, die nach

Zugabe des HDPs entsprechend der Zellproliferationsaktivität in das genetische

Material der Zellen eingebaut wurden. Die verwendeten Konzentrationen des Peptids

lagen zwischen 0-100 µM. Wie in den folgenden Versuchen wurde die humane

Synovialsarkomzelllinie SW982, die murine Fibrosarkomzelllinie BFS-1 und die

humanen Fibroblasten HFB als Kontrollzellen eingesetzt.

Abb. 4.1 Bestimmung der antiproliferativen Aktivität des Peptids [D]-K4H2L9. Die Zellproliferationsrate wurde durch die Quantifizierung derThymidin-Analoga gemessen, die während der Replikation in die DNA der Zellen eingebaut wurden. Die als Kontrollzellen dienenden Fibroblasten werden im Gegensatz zu den entarteten Zelllinien in rot dargestellt.

Bei geringen Konzentrationen unter 10 µM wurde teilweise ein Anstieg der

Zellproliferation beobachtet, die dann bei weiter ansteigenden Konzentrationen abfiel

(Abb. 4.1). Die SW982-Zellen zeigten mit steigender [D]-K 4H2L9-Konzentration einen

langsamen, aber stetigen Abfall der Zellproliferation. Es wurde eine maximale

Hemmung der Zellproliferation von 89,52 % erreicht. Signifikant wurde die Hemmung

ab einer Konzentration von 25 µM [D]-K4H2L9 (p<0,05).

45

Die BFS-1-Zellen reagierten währenddessen zunächst mit einem Anstieg der

Zellproliferation, die dann aber exponentiell abnahm. Ab einer Konzentration von

12,5 µM wurde die Proliferation der BFS-1-Zellen um 95 % gehemmt.

Im Vergleich dazu wurde die Proliferation der HFB-Zellen weniger konstant gehemmt.

Nach einem kurzen Anstieg der Replikationsrate um 109,8 % fiel diese zunächst auf

5 % der anfänglichen Zellproliferation bei einer Peptidkonzentration von 12,5 µM ab

und befand sich bei weiter steigender Konzentration bei 33,09 %. Im Vergleich zu den

anderen Zelllinien ist bei den HFB-Zellen das Konzentrationsintervall des

Wirkoptimums sehr klein.

Der Zellproliferationsanstieg war bei den BFS-1-Zellen und den HFB-Zellen ab einer

Konzentration von 3,125 µM signifikant (p<0,05) und der folgende Proliferationsabfall

ab einer Konzentration von 12,5 µM (p<0,01).

4.1.2 Nachweis der spezifischen Wirkung durch [D]-K4H2L 9

Um nachzuweisen, dass das Peptid [D]-K4H2L9 eine spezifische onkolytische Wirkung

hat, die auf seine spezifische Struktur und auf die D-konfigurierten Aminosäuren

zurückzuführen ist, wurde ein Scrambled Peptid eingesetzt. Hierbei handelt es sich auch

um ein 15-mer Peptid bestehend aus den drei gleichen Aminosäuren wie [D]-K4H2L9

allerdings mit einer anderen Sequenz und ohne D-konfigurierte Aminosäuren (Abschnitt

3.1.8).

Das Scrambled Peptid scP-K3H3L9 wurde in genau den gleichen Konzentrationen zu

den drei Zelltypen gegeben wie vorher [D]-K4H2L9 und eine antiproliferative Wirkung

mit einem BrdU-Assay untersucht. Es zeigte sich keine Hemmung der Zellproliferation,

sondern eher eine Stimulation dieser. Bei geringen Konzentrationen zeigte sich die

stärkste Stimulation der Zellproliferation. Sie stieg bei den BFS-1- und den HFB-Zellen

um mehr als 100 % bei einer Peptidkonzentration von 6,25 µM. Weiterhin ließ sich für

diese Zellen keine Relation zwischen Peptidkonzentration und Zellproliferationsrate

erkennen, da diese scheinbar unabhängig von der Konzentration variierte. Bei den mit

scP-K3H3L9 inkubierten BSF-1-Zellen wurde einmalig eine niedrigere

Zellproliferationsrate als in der Kontrolle beobachtet. Sie lag bei einer

Peptidkonzentration von 62,5 µM bei 85,9 % der Ausgangsproliferationsrate. Die

SW982-Zellen erreichten eine maximale Steigerung der Zellproliferation auf 160,1 %

bei einer Peptidkonzentration von 3,125 µM, danach fiel die Zellproliferationsrate ab

46

und erreichte bei 100 µM eine geminderte Zellproliferationsrate von 87 % der

Ausgangsproliferationsrate (Abb. 4.2).

Die Steigerung der Zellproliferationsrate erreichte bei den HFB-Zellen und den SW982-

Zellen im Konzentrationsintervall von 3,125-6,25µM ein signifikantes Niveau (p<0,05).

Bei den BFS-1-Zellen wurde eine signifikante Erhöhung der Zellproliferationsrate erst

bei höheren scP-K3H3L9-Konzentrationen von 62,5-100 µM erreicht (p<0,05).

Abb. 4.2 Bestimmung der antiproliferativen Aktivität des Peptids scP-K3H3L9. Der BrdU-Zellproliferationsassay wurde mit dem Vergleichspeptid durchgeführt, welches keine Aminosäuren der D-Konfiguration enthält. Die als Kontrollzellen dienenden Fibroblasten werden im Gegensatz zu den entarteten Zelllinien in rot dargestellt.

4.1.3 Hemmung der Zellproliferation durch Doxorubicin

Das Chemotherapeutikum Doxorubicin ist eines der wirksamsten Chemotherapeutika

im Einsatz gegen die Weichteilsarkome. Aber selbst dessen Wirksamkeit ist stark

begrenzt mit einer Ansprechrate von etwa 20-26 % (Lehnhardt et al., 2005).

Für die SW982-, BFS-1- und HFB-Zellen wurde eine Dosis-Wirkungskurve für

Doxorubicin ermittelt. Auf Grund der starken zytotoxischen Wirkung wurde diese für

die Konzentrationen von 0-5 µM erstellt. Die Zellproliferationsraten von den SW982-

und den BFS-1-Zellen zeigten bei steigender Wirkstoffkonzentration einen rapiden

exponentiellen Abfall. Die Proliferation der SW982-Zellen wurde ab einer

Konzentration von 0,625 µM um 99,59 % eingeschränkt. Die BFS-1-Zellen zeigten ab

einer Konzentration von 2,5 µM Doxorubicin keine Proliferation mehr. Die

47

Einschränkung der Proliferation der humanen Fibroblasten (HFB) schwankte ab einer

Doxorubicin-Konzentration von 0,15625 µM um -89,05 % (Abb. 4.3).

Die Hemmung der Zellproliferation wurde spätestens ab einer

Doxorubicinkonzentration von 156,25 nM hoch signifikant (p<0,01).

Abb. 4.3 Bestimmung der antiproliferativen Aktivität des Zytostatikums Doxorubicin. Die Menge der in die DNA eingebauten Thymidin-Analoga entspricht der Proliferationsaktivität der Zelllinien. Sie wurde nach einer Inkubation mit verschiedenen Doxorubicin-Konzentrationen gemessen. Die als Kontrollzellen dienenden Fibroblasten werden im Gegensatz zu den entarteten Zelllinien in rot dargestellt.

4.1.4 Kombination von [D]-K4H2L 9 mit dem Chemotherapeutikum

Doxorubicin

Eine effektive Kombinationstherapie von [D]-K4H2L9 mit einem Chemotherapeutikum

würde mit einer einhergehenden Dosisreduktion beider Substanzen zum einen die

Therapiekosten durch verringerten HDP-Bedarf senken und zum anderen das Ausmaß

der Nebenwirkungen beider Wirkstoffe reduzieren. In diesem Versuch wurden [D]-

K4H2L9- und Doxorubicin-Konzentrationen eingesetzt, die die Zellproliferation einzeln

angewandt um ca. 25 % einschränken.

Bei den BSF-1-Zellen reduzierten 6,1 µM [D]-K4H2L9 die Zellproliferation um 25,77 %

und 40 nM Doxorubicin die Zellproliferation um 16,77 %. Die Kombination der

Substanzen in diesen Konzentrationen zeigte eine Hemmung der Zellproliferationsrate

um 92,93 %. Die Proliferation der SW982-Zellen wurde durch 1,6 µM [D]-K4H2L9 um

48

17,89 % gehemmt und durch 8 nM Doxorubicin um 28,84 %. Die

Kombinationstherapie bewirkte eine Hemmung um 59,62 %. Eine

Kombinationstherapie der gesunden humanen Fibroblasten bewirkte durch eine

Inkubation der HFB-Zellen mit 7 µM [D]-K4H2L9, welches einzeln angewandt eine

Hemmung der Proliferation um 15,76 % erreichte, und zusätzlich mit 2,2 nM

Doxorubicin, welches einzeln angewandt eine Hemmung von 31,45 % erreichte, eine

Hemmung der Proliferation von insgesamt 38,62 % (Abb. 4.4).

Abb. 4.4 Bestimmung des antiproliferativen Effekts bei der Kombination von [D]-K 4H2L9 und Doxorubicin. [D]-K 4H2L9 und Doxorubicin wurden gemeinsam zu den Versuchzellen hinzugegeben, in Konzentrationen, die einzeln etwa eine 25 %ige Hemmung der Zellproliferationsrate bewirken. Die Ermittlung der Proliferationsrate erfolgte durch die Quantifizierung der eingebauten Thymidin-Analoga in der DNA.

4.2 Wirksamkeit des Peptids [D]-K4H2L 9 im syngenen Tiermodell

Um die Wirkung des Peptids in vivo zu untersuchen wurde ein immunkompetentes

Modell gewählt, da in diesem Fall auch Interaktionen des Peptids mit dem

Immunsystem beurteilt werden können. Die subkutanen BFS-1-Tumoren wurden ab

einem Volumen von 38 mm3 ± 35,02 mm3 dreimal pro Woche über drei Wochen

intratumoral mit 5 mg/kg [D]-K4H2L9 (n=10) oder mit dem entsprechenden Volumen

PBS (n=5) behandelt. Nach einer weiteren Beobachtungswoche wurden die Tumore

entnommen. Die mit [D]-K4H2L9 behandelten Tumore zeigten ein langsameres

49

Wachstum gegenüber den Tumoren der Kontrollgruppe. Der Unterschied zwischen den

durchschnittlichen Tumorgrößen der beiden Gruppen wurde bereits ab dem dritten

Behandlungstag signifikant (p<0,05) und erreichte vom vierten bis zum letzten

Behandlungstag eine hohe Signifikanz (p<0,01). Am fünften Behandlungstag zeigten

sich abweichend davon noch einmal signifikant (p<0,05) unterschiedliche

Tumorgrößen. Die nicht therapierten Tumore waren am letzten Behandlungstag mit

einem durchschnittlichen Volumen von 422 mm3 mehr als doppelt so groß wie die

behandelten Tumore mit 204 mm3. Nach dem Absetzen der Therapie wuchsen

allerdings auch die mit [D]-K4H2L9 behandelten Tumore wieder schneller, so dass ihr

Volumen von 623 mm3 zu Versuchsende zwei Dritteln des durchschnittlichen

Volumens der nicht behandelten Tumore entsprach, welches 974 mm3 betrug (Abb.

4.5).

Auch das Gewicht der schließlich entnommenen Tumore unterschied sich mit 0,60 g der

Behandlungsgruppe zu 1,16 g der Kontrollgruppe signifikant (p<0,05) (Abb. 4.6).

Abb. 4.5 Hemmung des Tumorwachstums in vivo durch die Therapie mit [D]-K 4H2L9. Ab einem durchschnittlichen Tumorvolumen von 38,11 mm3 ± 35,02 mm3 wurde den C57BL/6-Mäusen 9 Dosen à 150 µg [D]-K4H2L9 in 50 µl PBS intratumoral verabreicht (n=10) bzw. der Kontrollgruppe (n=5) nur das entsprechende Volumen PBS. An die neunte und letzte Injektion(→) schloss sich eine Beobachtungswoche an. Signifikante (*, p<0,05) beziehungsweise hoch signifikante Unterschiede der Tumorgröße (**, p<0,01) sind im Graphen gekennzeichnet.

50

Abb. 4.6 Tumorgewicht eine Woche nach Therapieende. Nach Abschluss der Therapie wurde das Tumorwachstum noch eine Woche in vivo beobachtet. Anschließend wurde der Tumor entnommen und gewogen. Die Tumore der Kontrollgruppe (n=5) erwiesen sich als signifikant (*, p<0,05) schwerer als die behandelten Tumore (n=10).

Während der etwa fünfwöchigen Versuchszeit wurden bei den Tieren weder Schmerzen

noch Kachexie oder andere auffällige Unverträglichkeiten des Peptids beobachtet.

Makroskopisch auffällig war ein größeres Nekrosenausmaß in den mit dem Host

Defense Peptid behandelten Tumoren, das heißt es wurden in 90 % der Fälle

nekrotische Ulzera beobachtet, die teilweise bis tief in den Tumor reichten. In der

Kontrollgruppe wurden hingegen nur in 20 % kleine Erosionen am Tumor sichtbar

(Abb. 4.7). Die Tumore, denen nur PBS verabreicht wurde, zeigten bei der Entnahme

makroskopisch ein gut entwickeltes Gefäßsystem, während dies nur bei 30 % der mit

Peptid behandelten Tumore zutraf.

Makroskopisch erreichte die [D]-K4H2L9-Therapie in 30 % eine Komplettremission. In

diesen Fällen war nur noch fibrotisches Narbengewebe bei der Tumorexzision

erkennbar. In weiteren 10 % war bei der Probenentnahme makroskopisch von nur noch

sehr wenig Tumorgewebe auszugehen. Histologisch konnte nach Anfertigen serieller

Schnitte eine Komplettremission bei 20 % der behandelten Mäuse bestätigt werden. Bei

der Organentnahme und bei anschließender histologischer Untersuchung von Lunge und

Leber konnten keine soliden Metastasen festgestellt werden (Abb. 4.8). Die BFS-1-

Tumore zeichneten sich durch einen sehr lockeren Zellverband aus. Eindrücklich war

auch die gute Abgrenzbarkeit der Tumore zu dem umgebenden Bindegewebe durch die

für die Sarkome typische Pseudokapsel.

51

Abb. 4.7 Bilder der Veränderung der Tumorgröße. Ab der subkutanen Injektion muriner Fibrosarkomzellen (BFS-1 wt) in die linke Flanke der C57BL/6-Mäuse fand eine fotografische Dokumentation des Wachstumsverlaufs der Tumore statt. Gezeigt werden Bilder, die bei Beginn und bei Abschluss der Therapie mit dem HDP [D]-K4H2L9 beziehungsweise mit der Trägersubstanz PBS (Kontrollgruppe) aufgenommen wurden sowie histologische Querschnitte der entnommenen Tumore in der HE-Färbung. Die Vergleichbarkeit der Größenverhältnisse der Querschnitte wird durch die gleichlangen schwarzen Balken gewährt. Die histologische Analyse der Schnitte des Tumor 15 zeigten kein solides Tumorgewebe, sondern nur Kutis, Subkutis und Haarfollikel. Die zugehörigen Wachstumskurven der dargestellten Tumore sind in Abb. 4.9 entsprechend gekennzeichnet.

52

Abb. 4.8 Serielle Lungenschnitte. In den seriellen Lungenschnitten ließen sich keine soliden Metastasen beobachten. Der Maßstab entspricht 100 µm.

Abb. 4.9 Wachstumskurven der einzelnen Tumore der Therapie- und der Kontrollgruppe. Logarithmische Auftragung des Wachstums der einzelnen Tumore zur besseren Einsicht der Volumenunterschiede zu Beginn des Versuchs. Die Verabreichung des HDPs beziehungsweise der Trägersubstanz erfolgte von Tag 0 bis zu Tag 19. Die Darstellung des Wachstums erfolgt hier zur besseren Übersicht nur bei Volumina im Bereich von 10-1000 mm3. Die Wachstumskurven der Tumore, deren Bilder in der Abb. 4.7 gezeigt werden, sind hier mit einem gleichfarbigem Pfeil und der Rückennummer der Tiere gekennzeichnet.

53

Bei Betrachtung der einzelnen Wachstumskurven fällt nach Abbau des Matrigels und

dem damit verbundenen Abfall des Tumorvolumens zu Beginn auf, dass sich Perioden

mit schnellem Wachstum mit Perioden mit langsamen Wachstum abwechseln. Bei den

Tumoren der Peptidbehandlung verringerte sich das Volumen intermittierend oder

gegen Ende des Versuches auch teilweise stetig. Die einzelnen Kurven zeigen, dass

weder das Startvolumen noch die Wachstumsgeschwindigkeit vor der Therapie mit dem

Therapieerfolg korrelieren (Abb. 4.9).

54

4.3 Histologische Beobachtungen in den Tumoren nach [D]-K 4H2L 9-

Therapie

4.3.1 Hemmung der Proliferation in vivo

Mit der Ki67-Anfärbung wurden alle Zellen in den Tumorschnitten markiert, die sich

nicht im G0-Stadium befanden, um die Proliferationsrate in den Tumoren festzustellen.

In den [D]-K4H2L9-Tumoren befanden sich durchschnittlich 70,18 Ki67-positive Zellen

pro Sichtfeld in der 400-fachen Vergrößerung und in der Kontrollgruppe 83,09 (Abb.

4.10). So ist eine Woche nach Therapieende ein antiproliferativer Effekt des Peptids

festzustellen, der allerdings nicht signifikant ist (p≈0,42).

Abb. 4.10 Immunhistochemische Anfärbung proliferierender Zellen im Tumorgewebe. Mit Hilfe eines Anti-Ki67-Antikörpers wurden alle sich proliferierenden Zellen markiert. Ihre Zellkerne sind in den repräsentativen Bildern braun angefärbt. Die Quantifizierung fand in 400-facher Vergrößerung statt. Der Maßstab in den histologischen Bildern entspricht 50 µm.

55

4.3.2 Hemmung der Angiogenese

Mit der CD31 Anfärbung wurden die Endothelzellen in den Tumorschnitten

gekennzeichnet. Schließlich wurden die Gefäßanschnitte pro Sichtfeld in 400-facher

Vergrößerung gezählt. Die nicht behandelten Tumore wiesen dabei konstant höhere

Werte und damit hoch signifikant (p<0,01) mehr Gefäßanschnitte (23,44) auf als die

behandelten Tumore (18,48) (Abb. 4.11). Diese sich hier manifestierende

antiangiogenetische Wirkung von [D]-K4H2L9 entspricht der makroskopischen

Beobachtung, die bei der Tumorentnahme stattfand.

Abb. 4.11 Immunhistochemische Anfärbung der Gefäßanschnitte im Tumorgewebe. Die Gefäßanschnitte wurden durch einen Anti-CD31-Antikörper, der an die Endothelzellen bindet, markiert. Sie sind hier braun dargestellt. Der Unterschied in der Gefäßanzahl zwischen den beiden Gruppen erreichte ein hoch signifikantes (**, p<0,01) Niveau. Der Maßstab in den histologischen Bildern entspricht 50 µm.

56

4.3.3 Rekrutierung von T-Zellen

Die T-Zellen wurden über das Oberflächenmolekül CD3 angefärbt. Erfasst wurden so

unter anderem CD8-positive zytotoxische T-Zellen und CD4-positive T-Helferzellen.

Die Auswertung der Anzahl der CD3-positiven Zellen pro Sichtfeld in der 400-fachen

Vergrößerung ergab durchschnittlich 74,45 T-Zellen pro Sichtfeld in den

Tumorschnitten der behandelten Tumore und nur 37,75 T-Zellen pro Sichtfeld in der

Kontrollgruppe. Dieser Unterschied ist hoch signifikant (p<0,0000001) (Abb. 4.12).

Abb. 4.12 Immunhistochemischer Nachweis von T-Zellen im Tumorgewebe. Die über das Oberflächenmolekül CD3 markierten T-Zellen werden hier in braun dargestellt. Der Unterschied der T-Zellzahl zwischen den beiden Versuchsgruppen erreichte ein hoch signifikantes (**, p<0,001) Niveau. Der Maßstab in den 400-fach vergrößerten histologischen Bildern entspricht 50 µm und der Maßstab in den 1000-fach vergrößerten Ausschnitten 20 µm.

4.3.4 Rekrutierung von Makrophagen

Die F4/80-Färbung markiert die murinen Makrophagen über das gleichnamige

Glykoprotein. Die Auszählung der Makrophagenzahl erfolgte hier in einer 1000-fachen

Vergrößerung. Die verstärkte Migration der murinen Makrophagen in das

Tumorgewebe nach der Therapie mit [D]-K4H2L9 erfolgte hoch signifikant (p<0,001).

57

So waren in den behandelten Tumoren durchschnittlich 77,48 Makrophagen pro

Sichtfeld zählbar und in den Tumoren der Kontrollgruppe nur 52,96 (Abb. 4.13).

Abb. 4.13 Immunhistochemischer Nachweis von Makrophagen im Tumorgewebe. Die Makrophagenzahl in den Tumorschnitten wurde mit Hilfe des Anti-F4/80-Antikörpers bestimmt. Der Unterschied in der Makrophagenzahl erreicht ein statistisch hoch signifikantes (**, p<0,001) Niveau. Die Auszählung der in braun dargestellten Makrophagen fand in der 1000-fachen Vergrößerung statt. Der Maßstab in den histologischen Bildern entspricht 20 µm.

4.4 Genexpressionsanalyse nach dem Einfluss von [D]-K 4H2L 9

Die BrdU-Assays, der in vivo-Versuch und die immunhistochemische Analyse des

Tumorgewebes legten eine antiproliferative und eine antiangiogenetische Wirkung des

Host Defense Peptids [D]-K4H2L9 offen. Auch eine verstärkte Migration von

Immunzellen durch den Einfluss des HDPs wurde festgestellt. Anschließend wurde die

Genexpression von acht Zytokinen analysiert, um herauszufinden, ob diese an der

Vermittlung der beobachteten Wirkungen beteiligt sind. Mittels RT-PCR konnte die

relative Menge der Transkriptionsprodukte der jeweiligen Zytokine quantifiziert

werden.

58

Eine anschließende Gelelektrophorese wies nach, dass nur die DNA der gewünschten

Zytokine amplifiziert und quantifiziert wurde und nicht andere unspezifische

Genprodukte. So entstand pro Versuchsansatz nur eine spezifische Bande. Die Bande,

die bei manchen Negativkontrollen zu sehen ist, wird von Primerdimeren dargestellt.

Lediglich bei der Positivkontrolle des IFN-γ-Ansatzes sind noch zwei weitere Banden

angedeutet. Diese sind auf Grund ihres schwachen Signals und der geringeren

Ausprägung jedoch vernachlässigbar und auch die Messdaten der PCR bestätigen die

Amplifikation von nur einem Genprodukt. Die Spezifität der gemessenen Genprodukte

wurde zudem über die Verwendung von Sonden gesichert (Abb. 4.14).

Abb. 4.14 Gelelektrophorese der PCR-Ansätze. Pro Zytokin wurden je 3 µl eines PCR-Ansatzes und rechts davon 3 µl der zugehörigen Negativkontrolle auf ein Gel aufgetragen und eine Gelelektrophorese zur Analyse der entstehenden Amplifikate durchgeführt. Ein Basenpaar-Marker (m) zeigt, dass die entstandenen Amplifikate aus circa 100 Basenpaaren bestehen so wie das am weitesten gewanderte und kürzeste Marker-Fragment.

Der Faktor NOV (Nephroblastom überexprimiertes Gen) wirkt unter anderem

antiproliferativ. Antiangiogenetisch wirken die Zytokine IGFbp-3 (Insulin-ähnlicher-

Wachstumsfaktor bindendes Protein 3), IFN-γ (Interferon-gamma), IP-10 (Interferon-

gamma induziertes Protein 10) und MIG (Monokin induziert durch Interferon-gamma).

Chemotaxis und beziehungsweise oder eine Aktivierung der Immunzellen vermitteln

die Zytokine IFN-γ, IL-12 (Interleukin 12), IL-16 (Interleukin 16), IP-10, MCP-1

(Monozyten chemotaktisches Protein 1) und abermals MIG.

In den BFS-1-Tumoren zeigte die Behandlungsgruppe 75 % der NOV-Expression der

Kontrollgruppe. Das untersuchte Host Defense Peptid [D]-K 4H2L9 beeinflusste die

Expression nicht in signifikantem Ausmaß (p≈0,51). Die Expression des Zytokins

IGFbp-3 erfolgte in den behandelten Tumoren etwas geringer (ca. 0,8-fach) als in den

nicht behandelten Tumoren (p≈0,38). IP-10 wurde in den mit dem Host Defense Peptid

behandelten Tumoren 2,12-fach höher exprimiert im Vergleich zu den Tumoren der

Kontrollgruppe, ohne dass dieses Ergebnis eine statistische Signifikanz erreichte

59

(p≈0,13). Die IFN-γ Expression in den behandelten Tumoren war fast doppelt so hoch

(ca. 1,7-fach) wie die Expression in den Tumoren der Kontrollgruppe. Mit einem p-

Wert von 0,064 erreichen diese Expressionsunterschiede nur fast ein signifikantes

Niveau. Die Genexpression von IL-12 in der Therapie- und der Kontrollgruppe

unterschieden sich nicht deutlich. Es wurden nur geringfügig erhöhte Werte in der

Therapiegruppe gemessen (1,34-fach; p≈0,37). Das Chemokin IL-16 wird nur 1,47-fach

in den Tumoren der Therapiegruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe exprimiert

(p>0,2). Auch auf die Expression von MCP-1 scheint [D]-K 4H2L9 keinen Einfluss

auszuüben mit einem Expressionsunterschied von 10 % (p≈0,76).

Die MIG-Expression in den behandelten Tumoren ist 2,42-mal so hoch wie in den nicht

behandelten Tumoren. Dieser Expressionsunterschied erreicht eine hohe Signifikanz

(p<0,01) (Abb. 4.15).

Abb. 4.15 Genexpression einiger Zytokine eine Woche nach Therapieende. Die Genexpression einiger Zytokine wurde mittels Realtime-PCR quantifiziert. Die Expressionsniveaus der Behandlungsgruppe wurde in Relation zu den Expressionsniveaus der Kontrollgruppe dargestellt. Singulär wurde eine hoch signifikante (**, p<0,01) stärkere Expression nach HDP-Therapie auffällig. (IFN-γ Interferon-gamma, IGFbp-3 Insulin-ähnlicher-Wachstumsfaktor 3, IL Interleukin, IP-10 Interferon-gamma induziertes Protein 10, MCP-1 Monozyten chemotaktisches Protein 1, MIG Monokin induziert durch Interferon-gamma, NOV Nephroblastom überexprimiertes Gen).

Die punktuelle Genexpressionsanalyse von Zytokinen ergab, dass die Zytokine NOV,

IGFbp-3, IL-12, IL-16 und MCP-1 eine Woche nach Therapieende nicht signifikant

unterschiedlich in den beiden Gruppen exprimiert wurde. Die Zytokine IP-10 und INF-γ

werden deutlich stärker in der Therapiegruppe exprimiert, wenn dieser Unterschied

auch kein signifikantes Niveau erreicht. Nur das Chemokin MIG zeigt eine

hochsignifikante stärkere Expression nach Peptidgabe.

60

Die Genexpressionsanalyse der Zytokine MIG, IFN-γ und IP-10 in kultivierten BFS-1-

Zellen zeigte eine Basalexpression dieser Zytokine durch die Tumorzellen. Bezogen auf

die Expression im Tumorgewebe betrug die Expression von MIG in den kultivierten

BFS-1-Zellen 0,01 %, von IFN-γ 2,60 % und von IP-10 257 %.

61

5 Diskussion

Die Tumortherapie nimmt in der Medizin eine zentrale Rolle ein, die mit der steigenden

Lebenserwartung der Bevölkerung auf Grund einer entsprechend steigenden

Lebenszeitprävalenz von Tumorerkrankungen weiter an Bedeutung zunehmen wird. So

wird auch die Inzidenz der Weichteilsarkome zunehmen, die insgesamt 1 % der

gesamten Tumorerkrankungen darstellen (Nielsen et al., 2002). Das Bedürfnis nach

effektiven therapeutischen Maßnahmen wird folglich weiter wachsen. Die Rezidivrate

von 22-60 % nach erfolgreicher Therapie und eine fünf-Jahre-Überlebensrate von 75 %

bei Patienten mit Tumoren im ersten Dedifferenzierungsstadium, erfordern eine schnelle

Entwicklung potenter Behandlungsmethoden (Kotilingam et al., 2006; Worth, 2005).

Die Tumorexstirpation, die Strahlentherapie mit teilweise unzureichendem Erfolg und

die Chemotherapie mit geringen Ansprechraten, erreichen insgesamt keine

zufriedenstellenden Ergebnisse.

Die Ansätze hochfrequente fokussierte Ultraschallstrahlen gegen Sarkome einzusetzen

oder die Kombination von elektrischen Reizen mit Chemotherapeutika zur verbesserten

Medikamentenaufnahme werden nur für oberflächlich liegende Tumore eine

Behandlungsalternative werden können (Chida et al., 2009; Sersa et al., 2010).

Mit der Entdeckung der onkolytischen Host Defense Peptide und der Möglichkeit deren

Eigenschaften über die Herstellung synthetischer Varianten zu verbessern, bieten sich

aussichtsreiche neue Therapeutika dar, die über eine systemische Applikation auch

tiefgelegene Weichteilsarkome beziehungsweise okkulte Metastasen erreichen können.

Eine Schwierigkeit bei der Anwendung der bisher erforschten onkolytischen HDPs

besteht in den engen therapeutischen Fenstern, die zwischen den verschiedenen

Tumorentitäten variieren.

Das 15-mer kationische Peptid [D]-K4H2L9 erzielte bereits im Einsatz gegen

Prostatakarzinome und in Vorversuchen zum Einsatz des Peptids gegen

Weichteilsarkome vielversprechende Ergebnisse (Mersch, 2010). So erreicht das HDP

eine Verminderung der Angiogenese sowie eine Verminderung des Tumorwachstums

im athymischen Tierversuch. Das dort verwendete humane Synovialsarkom zeigte in

50 % eine Teilremission und in 20 % eine Vollremission. Eine hämolytische Wirkung

auf humanes oder murines Blut konnte nicht beobachtet werden. Im Hinblick auf einen

klinischen Einsatz des Peptids galt es nun den Wirkmechanismus genauer zu

untersuchen, das hieß zunächst dessen Wirksamkeit im immunkompetenten Organismus

62

zu erforschen. Auf diese Weise konnte eine Wirkung des Peptids bei regelrecht

funktionierendem Immunsystem beurteilt und einzelne Interaktionen mit diesem

beobachtet werden. Für den durchgeführten in vivo-Versuch wurden immunkompetente

C57Bl/6-Mäuse und das syngene murine Fibrosarkom BFS-1 wt gewählt. Darüber

hinaus fanden die ersten Versuche einer Kombinationstherapie von [D]-K4H2L9 mit dem

klassischen Chemotherapeutikum Doxorubicin, auf der Suche nach einer effizienten und

verträglichen onkolytischen Therapie der Weichteilsarkome, statt.

Zunächst zeigte die Analyse der antiproliferativen Wirkung von [D]-K4H2L9 eine

deutliche Einschränkung der Replikationsrate und damit eine Einschränkung der

Vermehrung der Sarkomzellen (Abb. 4.1). Hier verdeutlichte sich die Heterogenität der

Weichteilsarkome, die zwischen den Subtypen besteht. So zeigten sich die BFS-1-

Zellen sehr sensibel gegenüber dem Host Defense Peptid und wiesen schon ab einer

Konzentration von 12,5 µM nur noch eine Proliferationsrate von 4,2 % auf, während

eine ähnliche Hemmung der Proliferation der SW982-Zellen erst bei einer

Konzentration von 62,5 µM erreicht wurde. Diese uneinheitliche Wirkung wird auf

Unterschiede zwischen den Sarkomsubtypen zurückgeführt. Die Unterschiede bestehen

beispielsweise in der Zellmembranzusammensetzung, die auch die Ladung der

Membran und damit die elektrostatischen Anziehungskräfte zu den HDPs beeinflussen,

oder in abweichenden Genexpressionsprofilen, wie in etwa einer Überexpression von

dem anti-apoptotischen Faktor bcl-xL, die eine höhere Dosis eines HDPs für die selbe

hemmende Wirkung erforderlich machen (Mader et al., 2005).

[D]-K 4H2L9 zeigte sich weniger effizient gegen die nicht malignen HFB-Zellen,

allerdings wird auch die Zellproliferation dieser Zellen bei einer Konzentration von

12,5 µM einmalig über mehr als 80 % gehemmt. Der anfängliche Anstieg der

Replikationsrate von Fibroblasten und murinen Fibrosarkomzellen, der bei niedrigen

Peptidkonzentrationen beobachtet wurde, ist am ehesten als Folge eines

Stressmetabolismus bei Zugabe des zytotoxischen Peptids zu verstehen. Ein Metabolit,

der dieses Phänomen mitverantworten könnte, ist das Wasserstoffperoxid. Dieses

radikale Sauerstoffspezies wird vermehrt in Krebszellen synthetisiert, von Makrophagen

in Stresssituationen freigesetzt und auch von onkolytischen Medikamenten zur

Vermittlung von Zytotoxizität genutzt. Während es in niedrigen Konzentrationen die

Zellproliferation stimuliert, induziert es in höheren Konzentrationen die Apoptose

(Lopez-Lazaro, 2007; Schumacker, 2006). So können geringe Konzentrationen des

HDPs [D]-K4H2L9 über ihre onkolytische Wirkung einen geringen metabolischen Stress

63

mit geringer Wasserstoffperoxidfreisetzung verursachen, welche dann zu einem

Proliferationsanstieg der Versuchszellen führt, während sich hohe HDP-

Konzentrationen und starker metabolischer Stress mit hohen

Wasserstoffperoxidkonzentrationen zytotoxisch auf die Versuchszellen auswirken.

Die spezifische Zytotoxizität von [D]-K4H2L9 wurde durch den Vergleich mit dem

ähnlichen Peptid scP-K3H3L9 nachgewiesen. Letzteres rief eine Stimulation der

Proliferation der Zellen hervor, statt diese zu mindern (Abb. 4.2). So scheint es die

primäre Aminosäuresequenz von [D]-K4H2L9 zu sein, die auch die Basis für die

Sekundärstruktur darstellt, sowie die Selektivität-erhöhenden D-konfigurierten

Aminosäuren, die den zytotoxischen Effekt vermitteln. Eine in vivo-Anwendung des

scP-K3H3L9 steht noch aus.

Bei dem Einsatz des klassischen Chemotherapeutikums Doxorubicin zeigten sich die

SW982-Zellen am sensitivsten. Bei den BFS-1-Zellen wurde erst bei der doppelten

Konzentration keine Proliferation mehr festgestellt. Die gesunden HFB-Zellen erwiesen

sich als etwas resistenter gegen diese zytotoxische Substanz (Abb. 4.3).

Das HDP [D]-K4H2L9 zeigte sich bei einem physiologischen pH-Wert von 7,3, bei dem

der Einfachheit halber alle beschriebenen Versuche durchgeführt wurden, in einem

Konzentrationsbereich von 37,5-87,5 µM deutlich zytotoxischer gegenüber den

malignen Zellen als gegenüber den Kontrollzellen. So wurde die Zellproliferation der

malignen Zellen bei gleicher [D]-K4H2L9-Konzentration um mindestens 12-20 %

stärker eingeschränkt als die der Kontrollzellen. Das Doxorubicin wirkte in dem

Konzentrationsbereich von 2,5-5 nM auch zytotoxischer auf die malignen Zellen als auf

die Kontrollzellen. So wurde die Zellproliferation der malignen Zellen hier um

mindestens 8-15 % stärker supprimiert als die der Fibroblasten. Die Peptidbehandlung

erwies sich in den Versuchen folglich als die spezifischere Therapieoption gegen die

Sarkomzellen. Diese Spezifität, die sich in bestimmten Konzentrationsintervallen zeigt,

weist auf zu beachtende therapeutische Fenster des HDPs [D]-K4H2L9 hin. In

Vorversuchen wurde bereits gezeigt, dass das Peptid im sauren Tumormilieu (pH 6,3)

noch einmal deutlich spezifischer gegenüber entarteten Zellen als gegenüber gesunden

Zellen wirkt (Abb. 1.2). Daher ist auch davon auszugehen, dass die in vitro

durchgeführten Versuche zur Einschränkung der Zellproliferationsrate (Abschnitt 4.1.1)

unter realen Bedingungen, das heißt einer Haltung der Sarkomzellen im sauren Milieu,

eine noch spezifischere Wirkung des HDPs zeigen würden.

64

Das typisch saure Milieu von Malignomen entsteht, wenn die Blutversorgung für die

schnell proliferierenden Tumorzellen insuffizient wird und bei niedrigen

Sauerstoffkonzentrationen und hohem Glukosemetabolismus vermehrt saure Metabolite

wie Laktat anfallen. Während die Tumorzellen die Funktion ihrer Plasmaenzyme durch

alkalisierende Regulationsmechanismen schützen, wird die Extrazellularmatrix

geschädigt und ein invasives Wachstum der Tumoren begünstigt. Ein Angreifen von

Immunzellen oder von basischen Chemotherapeutika ist in dem sauren Milieu erschwert

(Chiche et al., 2009). Die Wirkung von [D]-K4H2L9 hingegen wird in dem sauren Milieu

der Tumore durch eine Protonierung der Histidine in dessen elektrostatischen

Anziehungskräften zu den Krebszellen verstärkt (Makovitzki et al., 2009). Das HDP

wirkt daher bei niedrigem pH-Wert noch spezifischer onkolytisch als bereits bei

physiologischem pH-Wert. Je spezifischer sich die onkolytische Wirkung von [D]-

K4H2L9 auf die Sarkomzellen richtet, desto weniger Nebenwirkungen sind bei einer

Therapie zu erwarten. Für eine gute Verträglichkeit des Peptids spricht auch die

Tatsache, dass bei der stärksten Proliferationshemmung der Krebszellen durch [D]-

K4H2L9 die Fibroblastenproliferation nur um 71 % gehemmt wird, jedoch bei der

Doxorubicin-Therapie in dem Fall sogar um 92 %.

Auf der Suche nach einer potenten verträglichen Therapie der Weichteilsarkome wird

auch über eine Kombination der Host Defense Peptide mit den klassischen

Chemotherapeutika nachgedacht. Dabei sollen die Peptide die Durchlässigkeit der

Zellmembranen für die Chemotherapeutika verbessern und durch eine Erhöhung der

Akkumulation des Chemotherapeutikums in der Zelle eine Dosisreduktion und somit

auch eine Reduktion der Nebenwirkungen ermöglichen (Held-Kuznetsov et al., 2009).

Die Ergebnisse der diesbezüglich durchgeführten Experimente sind Erfolg versprechend

(Abb. 4.4) Die Hemmung der Zellproliferation der BFS-1-Zellen über 90 %, die mit

entweder 2,5 µM Doxorubicin oder mit 12,5 µM [D]-K4H2L9 erreicht wird, wird mit der

Kombination von 40 nM Doxorubicin und 6,25 µM [D]-K4H2L9 erzielt. Ein Synergie-

Effekt wurde auch bei dem Einsatz der Kombinationstherapie gegen die SW982-Zellen

beobachtet. Dieser war jedoch weniger stark. Bei den HFB-Zellen blieb der Effekt einer

Kombinationstherapie unterhalb dem eines Addition-Effekts. Die maximale Hemmung,

die durch die Kombination der Therapeutika erreicht wurde betrug 38,6 %.

Der deutliche Synergie-Effekt der Kombinationstherapie bei den malignen Zelllinien

und die geringe Hemmung der Zellproliferation der gutartigen Zellen sind Wirkungen,

die den Ansprüchen einer klinisch einsetzbaren Behandlungsmethode entsprechen.

65

Diese Ergebnisse befürworten eine weitere Erforschung des Mechanismus der

Wirkverstärkung der beiden Substanzen und eine Untersuchung der

Kombinationstherapie in vivo, erst lokal und dann im Metastasenmodell auch

systemisch.

Der in vivo-Versuch dieser Arbeit belegt mit dem deutlich verringertem

Tumorwachstum der behandelten Mäuse die Wirksamkeit des Peptids [D]-K4H2L9 im

immunkompetenten Organismus (Abb 4.5 ff.). Die Ulzera der behandelten Tumore

weisen dabei auf eine Verursachung von nekrotischen Prozessen hin. Nekrotische

Prozesse korrelieren bei den meisten Weichteilsarkomsubtypen mit einer schlechten

Prognose (Engellau et al., 2005; Gustafson, 1994). Werden die Nekrosen jedoch nach

einer Therapie beobachtet, können sie als Zeichen der Wirksamkeit der Therapie auch

mit einer guten Prognose korrelieren (Picci et al., 1997). Letzterem entsprechend traten

die Nekrosen in den beschriebenen Versuchen nach der Peptid-Therapie auf und gingen

mit einer Volumenreduktion des Tumors einher. Allerdings wurde im Rahmen der

nekrotischen Prozesse auch gesunde Haut zerstört. Bei einer Schädigung der

bestehenden Blutgefäße erhöht sich die Gefahr, dass Tumorzellen in den Blutkreislauf

eintreten. Spätfolgen hiervon, wie in etwa solide Metastasen, konnten nach

abgelaufenem Versuch jedoch nicht festgestellt werden. Zu prüfen bleibt, ob die

Zerstörung der Haut durch das Peptid verursacht wurde oder durch andere

Stoffwechselprodukte, die bei den nekrotischen Prozessen freigesetzt wurden. Die

Nekrose könnte das HDP mit der Oberflächenladung von +4 bis +6 durch eine direkte

Lyse der negativ geladenen Membranen der entarteten Zellen herbeigeführt haben. Die

Hemmung der Angiogenese durch das Peptid, die selbst makroskopisch beobachtet

wurde, verstärkte währenddessen den anaeroben Stoffwechsel und damit wiederum die

nekrotischen Prozesse.

Die Tumore, deren Volumen nach den neun Dosen [D]-K4H2L9 à 150 µg größer als

90 mm3 waren, nahmen nach dem Absetzen der Therapie ein exponentielles Wachstum

durch eine rasche Proliferation der verbliebenen Tumorzellen auf. Die kleineren

Tumore zeigten kein weiteres Wachstum, sondern eher eine Volumenreduktion nach

beendeter Therapie, die am ehesten auf eine Resorption des nekrotischen Gewebes

zurückzuführen ist. Der zeitige Wiederanstieg des Tumorvolumens der größeren

Tumore nach Therapieende entspricht den Beobachtungen, die nach einem

abgeschlossenen Zyklus der Chemotherapie beobachtet werden (Katz et al., 2000).

66

Es bleibt zu klären, warum die Therapie bei einigen Tumoren nicht angeschlagen hat,

das heißt welchem Wirkmechanismus des Peptids die Tumorzellen durch welche

Umstände entgehen konnten. Bei Tumoren, die sich zum Zeitpunkt des Therapiestartes

bereits in der exponentiellen Wachstumsphase befanden, wäre wahrscheinlich eine

höhere Dosis des zytotoxischen HDPs indiziert gewesen, um die sich schnell

vermehrenden Tumorzellen in die Apoptose zu leiten oder deren Nekrose

herbeizuführen. Es ist zum aktuellen Zeitpunkt noch schwer vorstellbar, wie

Tumorzellen über Mutationen den multimodalen Wirkungsmechanismen der HDPs

entgehen können. Insgesamt sind die Ergebnisse der [D]-K 4H2L9-Therapie im ersten

immunkompetenten Tiermodell vielversprechend mit einer partiellen Ansprechrate von

40 % und einer Komplettremission in 20 % der Fälle. Im Vergleich dazu erreicht das

bereits langjährig eingesetzte Doxorubicin, eines der wirksamsten Chemotherapeutika

in der Sarkomtherapie, Ansprechraten von bis zu 26 % (Lehnhardt et al., 2005).

Mit der immunhistochemischen Analyse der Tumorschnitte ließ sich eine Woche nach

Therapieende zwar noch ein antiproliferativer Effekt nachweisen, aber die Ergebnisse

erreichten kein signifikantes Niveau mehr (Abb. 4.10). Dies entspricht der

Wachstumskurve des in vivo-Versuchs, die einen Anstieg der Proliferationsrate von

einigen Tumoren nach Absetzen der Therapie suggeriert. Es wäre sinnvoll, bei einer

Wiederholung des Versuchs bereits während der laufenden Therapie oder bei

Therapieende Tumore zu entnehmen und histologische Schnitte von ihnen anfertigen zu

lassen, um die Proliferationsaktivität der Tumorzellen nach unmittelbarem [D]-K4H2L9-

Einfluss zu untersuchen.

Die mikroskopische Bestätigung der antiangiogenetischen Wirkung (Abb. 4.11) ist

bedeutsam, da den Sarkomen eine besondere Abhängigkeit von einer guten

Vaskularisierung zugesprochen wird (Saenz et al., 1998) und mehrere Studien zeigen

konnten, dass eine Hemmung der Angiogenese mit einem vermindertem

Tumorwachstum einhergeht. Dies stimmt mit der Beobachtung überein, dass bei den

Tumoren der [D]-K4H2L9-Therapie die Sichtung von makroskopisch gut ausgebildeten

Gefäßen und eine verminderte Hemmung des Tumorwachstums koinzidieren. Es ist

davon auszugehen, dass in diesen Tumoren die membranolytische und die

antiangiogenetische Wirkung des HDPs unzureichend waren, in etwa durch eine zu

geringe Dosierung bei bereits sehr aktiven Tumorzellen. Eine fehlende Hemmung der

Angiogenese erlaubte in diesen Fällen eine gute Versorgung und damit wiederum eine

ungehinderte Proliferation der Tumorzellen.

67

Deutlich war auch die vermehrte Migration von Immunzellen in das Tumorgewebe nach

der Therapie mit [D]-K4H2L9, die hier für T-Zellen und Makrophagen

immunhistochemisch nachgewiesen wurde (Abb 4.12 und Abb. 4.13). So waren eine

Woche nach Behandlungsende zum Zeitpunkt der Tumorentnahme diese deutlich

zahlreicher in den behandelten Tumoren vorhanden, wo sie im Rahmen der

unspezifischen Immunantwort die Tumorzellen phagozytierten oder aber eine

spezifische zelluläre sowie humorale zytotoxische Immunantwort vermittelten. Eine

weitere Analyse der eingewanderten Immunzellen in die Tumorareale sollte nun

dahingehend geführt werden, ob das 15-mer HDP auch die Migration von Immunzellen

fördert, die ein Milieu schaffen, in dem die Tumorzellen sich verbessert vermehren

können oder ob sie ausschließlich eine zytotoxische Immunantwort zu der Bekämpfung

der Tumorzellen begünstigen. So zeichnen sich die M1-Phänotyp-Makrophagen durch

ihre inflammatorische Immunantwort mit der Generierung von radikalen

Sauerstoffspezies aus und zeigen eine antibakterielle und onkolytische Wirkung. Die

M2-Phänotyp-Makrophagen hingegen wirken über die Expression von bestimmten

Zytokinen anti-inflammatorisch und immunsuppressiv, fördern die Angiogenese und

durch die Hochregulation von Metalloproteinasen das invasive Tumorwachstum.

Tumor-assoziierte-Makrophagen (TAM) sind oftmals vom M2-Phänotyp (Biswas et al.,

2008; Halin et al., 2009). Die chemotaktische Wirkung des HDP [D]-K4H2L9 könnte

durch Migrationsassays genauer erfasst werden.

Auf der Suche nach den Transmittern der beobachteten Effekte wurde auch die

Genexpression der Zytokine IFN-γ, IGFbp-3, IL-12, IL-16, IP-10, MCP-1, MIG und

NOV eine Woche nach dem Abschluss der HDP-Therapie analysiert (Abb. 4.15). Da

die Expression der Zytokine NOV, IGFbp-3 und MCP-1 nicht mit der Gabe des HDPs

[D]-K 4H2L9 korrelierte, wird nicht von einer Vermittlung der onkolytischen Wirkungen

des HDPs durch diese Zytokine ausgegangen Die Rolle des untersuchten Zytokins

Nephroblastom überexprimiertes Gen (NOV) in Tumoren ist laut Literatur sehr

heterogen. So korreliert eine erhöhte NOV-Konzentration in Osteosarkomen mit einer

schlechten Prognose (Perbal et al., 2008). In Gliomen hingegen geht eine erhöhte NOV-

Expression mit einem reduzierten Tumorwachstum einher. Diese wachstumshemmende

Wirkung wurde in vitro und in vivo mehrfach bestätigt (Bleau et al., 2007; Sin et al.,

2008). Das Zytokin IGFbp-3 hemmt die Expression von angiogenetischen Faktoren wie

dem vaskulären-endothelialen Wachstumsfakor (VEGF) und Interleukin 8 und wirkt

sich ungünstig auf das Tumorwachstum aus (Han et al., 2011). Das Chemokin MCP-1

68

ist ein starker Chemoattraktor für Monozyten und Makrophagen an Entzündungsherden

oder in Neoplasien. Die onkolytische Wirkung schließt beispielsweise eine gesteigerte

Stickstoffmonoxidproduktion in den aktivierten Makrophagen ein (Biswas et al., 2001).

Das Interferon-gamma induzierte Protein 10 (IP-10) wird unter anderem von

Makrophagen, Endothelzellen und Fibroblasten produziert. Seine Produktion wird

hauptsächlich durch IFN-γ stimuliert. Neben der antiangiogenetischen Wirkung, hemmt

es auch das Tumorwachstum und zieht Monozyten, Makrophagen und T-Zellen an

(Angiolillo, 1995; Gasperini et al., 1999; Luster and Leder, 1993). Die Erhöhung der IP-

10-Expression auf das 2,12-fache nach [D]-K4H2L9-Therapie erreicht zwar keine

Signifikanz, könnte aber darauf hindeuten, dass das Zytokin während der Behandlung

die Vaskularisierung der behandelten Tumore negativ beeinflusst hat. IP-10 wäre in

diesem Fall auch mit für die erhöhte Zahl von Monozyten, Makrophagen und T-Zellen

und das geringere Wachstum der behandelten Tumore verantwortlich. Auch die leichte

Erhöhung der Expression der Chemokine IFN-γ, IL-12 und IL-16 können auf eine noch

stärkere Erhöhung während der [D]-K4H2L9-Therapie hinweisen. Interferon-γ wird

durch Natürliche Killerzellen und T-Zellen sezerniert und fördert wiederum die

Differenzierung von T-Zellen. Über ein positives Feedback unterstützt es die eigene

Produktion. Das Zytokin verstärkt direkt die Immunogenität von Tumoren und

ermöglicht so eine bessere Bekämpfung von entarteten Zellen durch das Immunsystem

(Schoenborn and Wilson, 2007). Über eine Stimulation der IP-10-Produktion, kann es

auch einen hemmenden Einfluss auf die Angiogenese nehmen. Das Interleukin 12, das

nur leicht vermehrt in der Therapiegruppe nachgewiesen werden konnte, wird von

Makrophagen und B-Zellen produziert und stimuliert eine zellvermittelte Immunantwort

durch eine Förderung der Th1-T-Zell-Differenzierung. Es bewirkt eine Erhöhung der

Zellproliferation und der Zytotoxizität der Natürlichen Killer-T-Zellen und T-Zellen.

Über die Th1-T-Zell-Differenzierung fördert es die IFN-γ-Produktion und kann somit

die Verstärkung der Immunogenität von Tumoren einleiten und wiederum auch eine IP-

10-Produktion begünstigen (Bellone and Trinchieri, 1994; D'Andrea et al., 1993; Hsieh

et al., 1993; Mosmann and Sad, 1996). Das Interleukin 16 besitzt eine starke

chemoattraktive Wirkung auf CD4-positive T-Zellen, Monozyten, Eosinophile und

Dendritische Zellen. In Kombination mit anderen Zytokinen unterstützt IL-16 auch die

Zellproliferation der Immunzellen und die T-Zell-Differenzierung zu Th1-T-Zellen

ebenso wie das IL-12 (Cruikshank et al., 2000).

69

Das von den Makrophagen nach IFN-γ-Stimulation produzierte Chemokin MIG zieht

vor allem Makrophagen und T-Zellen an. Es erwies sich als potentes Zytokin zur

Unterbindung der Neovaskularisation und damit nachfolgend des Tumorwachstums und

der Metastasenstreuung (Addison et al., 2000). Zusammen mit IP-10 vermittelt es einige

onkolytische Prozesse, die von IL-12 über IFN-γ eingeleitet werden (Kanegane et al.,

1998). Eine Beteiligung des Zytokin MIG an der antiangiogenetischen Wirkung des

HDPs und dessen Förderung der Migration von Immunzellen in das Tumorgewebe, ist

wahrscheinlich auf Grund der hoch signifikant erhöhten Expression (p<0,01) nach [D]-

K4H2L9-Einfluss.

Die Expressionsniveaus der letztgenannten Zytokine präsentieren sich wie folgt

kohärent: Die 1,7-fach höhere IFN-γ-Expression in den behandelten Tumoren, die sich

nahe der statistischen Signifikanzgrenze befindet (p=0,064), bedingt die 2,42-fache

Erhöhung der MIG-Expression und die 2,12-fache Erhöhung der IP-10-Expression in

den behandelten Tumoren, da diese Zytokine von IFN-γ induziert werden. Die davor

geschalteten Zytokine IL-12 und IL-16, die die Differenzierung von Th1-T-Zellen

bewirken und teilweise auch Natürliche Killer T-Zellen stimulieren, die wiederum IFN-

γ produzieren, zeigten sich ebenso leicht erhöht. Eine höhere Fallzahl und eine

Untersuchung der Tumore während beziehungsweise direkt bei Abschluss der [D]-

K4H2L9-Therapie sind hier angezeigt, um genauer zu prüfen, ob das HDP das

Tumorwachstum auch über die Induktion von IL-12 und IL-16 über IFN-γ und IP-10

bekämpft. Eine Untersuchung in bestimmten Abständen während der Therapie würde

darüber Aufschluss geben, ob verschiedene Zytokine zu verschiedenen Zeitpunkten

hochreguliert werden. Auch ein zeitlicher Verlauf der Infiltration durch Immunzellen ist

von Interesse. Um die Wirkungsweise des HDPs und sein Eingreifen in die

Immunantwort noch besser zu verstehen, müssen zudem Genexpressionsanalysen

weiterer Zytokine durchgeführt werden.

Die Analyse der Genexpression der in vitro-kultivierten Fibrosarkomzellen bestätigte,

dass das in den Tumoren gemessene MIG, fast ausschließlich durch die Immunzellen

produziert worden ist, da die Fibrosarkomzellen dieses Zytokin in Relation gesehen nur

kaum nachweislich synthetisieren. Auch die Interferon-gamma Produktion fand

hauptsächlich durch die Immunzellen statt und in den Tumorzellen nur zu einem sehr

geringen Anteil. Die IP-10-Produktion der BFS-1-Zellen zeigte sich hingegen höher als

die durchschnittliche IP-10-Produktion des Tumorgewebes, allerdings war die

Standardabweichung des Durchschnittes relativ hoch (Abb. 4.15). Die hohe IP-10-

70

Produktion der Fibrosarkomzellen ist am ehesten auf die Tatsache zurückzuführen, dass

gesunde Fibroblasten eine der IP-10-produzierenden Zellarten sind, und die

Fibrosarkomzellen Eigenschaften der Ursprungszellen beibehalten, sofern sie nicht

vollständig dedifferenziert sind. Bemerkenswert ist, dass die Tumorzellen auch

Zytokine, die ihre Wachstumsbedingungen negativ beeinflussen, sezernieren. Welche

Zytokine sie im Einzelnen exprimieren, unter welchen Bedingungen und mit welchen

Auswirkungen, muss zeitnah erforscht werden, um die therapeutischen Strategien

dementsprechend anzupassen.

Eine noch genauere Untersuchung der Wirkweise des Peptids und dessen Einfluss auf

das Immunsystem, werden weitere Schritte sein auf dem Weg dieses oder ein anderes

Peptid eines Tages in der Behandlung von Weichteilsarkompatienten erfolgreich

einsetzen zu können.

71

6 Zusammenfassung

Aufgrund der demographisch bedingten steigenden Inzidenz der Weichteilsarkome ist

die Forschung bemüht, die aktuellen Behandlungsergebnisse durch spezifischere und

nebenwirkungsärmere Therapeutika mit höheren Ansprechraten weiter zu verbessern.

Das synthetische Host Defense Peptid [D]-K4H2L9 zeigte in dieser Arbeit vorteilhafte

Wirkungsweisen als Therapeutikum gegen Weichteilsarkome.

Neben einer bekannten Hemmung der Zellvitalität und einer spezifischen Wirkung

gegen maligne Zellen, vor allem im sauren Tumormilieu, hemmt es auch die

Zellproliferation in vitro und in vivo. Dabei konnte diese Wirkung des kationischen 15-

mer Peptids [D]-K4H2L9 auf dessen Sequenz und den Anteil an D-Aminosäuren

zurückgeführt werden. Eine erste therapeutische Kombination mit dem

Chemotherapeutikum Doxorubicin zeigte einen Synergie-Effekt im Einsatz gegen

Weichteilsarkomzelllinien und stellt somit eine aussichtsreiche neue Therapieoption

dar. In vivo hemmte [D]-K4H2L9 deutlich das Tumorwachstum im immunkompetenten

Mausmodell und erzielte in 40 % eine Teil- und in weiteren 20 % eine Vollremission.

Die Migration der Immunzellen in das Tumorgewebe und die Hemmung der

Angiogenese korrelierten mit dem Behandlungserfolg. Als ein möglicher Vermittler

einer chemotaktischen Wirkung und einer Hemmung der Neovaskularisation konnte bis

jetzt nur das Chemokin MIG identifiziert werden, auf dessen Genexpression [D]-

K4H2L9 Einfluss nahm.

72

7 Literatur

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Danksagung

Für das Gelingen meiner Doktorarbeit möchte ich mich bei allen herzlich bedanken, die

direkt oder indirekt dazu beigetragen haben.

Beim Erstellen dieser Dissertation erlernte ich Wissenschaftliches Arbeiten und Denken

und wurde mit der Vielfalt der aktuellen Forschungsmethoden konfrontiert. Diese neuen

Erfahrungen und die wertvollen menschlichen Kontakte, die sich durch die Doktorarbeit

ergaben, sind für mich eine große Bereicherung.

Herrn Professor Dr. med. Lars Steinsträßer danke ich für die Möglichkeit, in seiner

Arbeitsgruppe „Molekulare Onkologie und Wundheilung“ experimentell zu forschen

und über ein aktuelles und spannendes Thema zu promovieren sowie für die berufliche

Förderung und Beratung während der gesamten Zeit.

Dr. phil. nat. Frank Jacobsen danke ich für die stete Bereitschaft, das Projekt durch

Beratung zu unterstützen, und für das Korrekturlesen dieser Arbeit.

Für ihre grenzenlose Hilfsbereitschaft und ihre Freundschaft danke ich den Mitgliedern

der Arbeitsgruppe mit Mustafa Becerikli, Dr. med. Bassem Mikhail, Simon Pfaffe,

Matthias Schulte und Raphael Tsoukas. Mein besonderer Dank gilt Dr. rer. nat. Jennifer

Hauk und Andrea Rittig für das umfangreiche Einarbeiten, die exzellente Betreuung und

auch für das Korrekturlesen dieser Arbeit.

Dem Evangelischen Studienwerk e.V. Villigst danke ich für die finanzielle

Ermöglichung des Forschungssemesters.

Bei meiner Familie und meinen Freunden bedanke ich mich für ihre Unterstützung und

für ihren Glauben in mich.

DANKE

Curriculum vitae

Name Corinn Isabel MATA MERA

Geburtsdatum und -ort 10.12.1987 in Bonn

*

Schulausbildung 1994-1998 Erich-Kästner-Grundschule Bonn 1998-2006 Friedrich-Ebert-Gymnasium Bonn

Schulabschluss Abitur 2006 International Baccalaureate 2006

*

Studium Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum seit 2006

Physikum 2008

Studium an der Partneruniversität Université de Strasbourg, Frankreich (09/2008-06/2009)

Forschungssemester in der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte in der Arbeitsgruppe „Molekulare Onkologie und Wundheilung“ am Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikum Bergmannsheil in Bochum im Rahmen der eigenen Promotion (09/2010-03/2011)

Beginn des Praktischen Jahres des Medizinstudiums 02/2012

Voraussichtlicher Zeitpunkt des Juni 2013 (2. Staatsexamen) Studienabschlusses