Aus der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgischen Klinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

(Direktor: Prof. Dr. Dr. F.W. Neukam)

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Prognoserelevante Bedeutung der Expression von Repp86

bei Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Philipp Häußinger aus Aachen

2

Gedruckt mit Erlaubnis der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. J Schüttler Referent: Prof. Dr. Dr. E. Nkenke Korreferent: Prof. Dr. Dr. F. W. Neukam Tag der mündlichen Prüfung: 10. Februar 2010

3

Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung…………………………………………………... 1

1.1. Zusammenfassung……………………………………………………. 1 1.2. Summary……………………………………………………………….. 3 2. Einleitung……………………………………………………………… 5 2.1. Das Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle……………………….. 5 2.2. Ki-67…………………...……………………………………………….. 6 2.3. Repp86…………………………………………………………………. 8 3. Material und Methoden……………………...…………………….... 12 3.1. Patientenauswahl…………………...……………………………….... 12 3.2. TNM-Klassifikation und histopathologisches Grading……...…….. 13 3.3. Immunhistochemie……………………………………………...…….. 14 3.3.1. Prinzip der immunhistochemischen Färbung………………………. 14 3.3.2. Primärantikörper………………………………………...…………….. 16 3.3.2.1. Ki-S2 (Repp86)……………………………………………………..…. 16 3.3.2.2. Ki-S5 (Ki-67)…………………………………………………………… 16 3.3.3. Herstellung und Vorbehandlung der Schnittpräparate……………..17 3.3.4. Austestung der Primärantikörper-Konzentration…………………… 18 3.3.5. Immunhistochemische Färbung……………………………………… 19 3.3.6. Kontrollen………………………………………………………………. 21 3.3.6.1. Negativkontrolle……………………………………………………….. 21 3.3.6.2. Positivkontrolle………………………………………………………… 21 3.4. Auswertung…………………………………………………………….. 21 3.5. Statistikteil……………………………………………………………… 22 4. Ergebnisse…………………………………………………………….. 23 4.1. Patientenbezogene Parameter……………………………………..... 23 4.2. Qualitative immunhistochemische Analysen……………………….. 23 4.2.1. Antikörper Ki-S2 (Repp86)…………………………………………… 23 4.2.2. Antikörper Ki-S5 (Ki-67)………………………………………......….. 25 4.3. Quantitative Analyse der Antigenexpression………………………. 25 4.3.1. Repp86-Expression…………………………………………………... 25 4.3.1.1. Explorative Datenanalyse der Repp86-Expression………………...25 4.3.1.2. Univariate Analyse – Repp86………………………………………… 27 4.3.2. Ki-67-Expression.……………………………………………………... 29 4.3.2.1. Explorative Datenanalyse der Ki-67-Expression…………………... 30 4.3.2.2. Univariate Analyse – Ki-67………………………………………….... 32 4.3.3. Korrelation der Proliferationsmarker nach Pearson……………….. 34 4.4. Prognose……………………………………………………………….. 35 4.4.1. Überlebensfunktion nach Kaplan-Meier…………………………….. 35 4.4.2. Univariate Analyse…………………………………………………….. 35 4.4.3. Multivarianzanalyse…………………………………………………… 37 5. Diskussion…………………………………………………………….. 41 6. Literaturverzeichnis…………………………………………………. 45 7. Anhang………………………………………………………………… 56 8. Danksagung…………………………………………………………... 57 9. Lebenslauf…………………………………………………………….. 58

1

1. Zusammenfassung

1.1. Zusammenfassung

Hintergrund und Ziele

Ziel der Untersuchung war die Erfassung der prognostischen Bedeutung der

Expression von Repp86 (Restrictedly Expressed Proliferation-associated

Protein), eines S-Phase-spezifischen Proteins, bei Plattenepithelkarzinomen

der Mundhöhle.

Methoden

In die retrospektive Untersuchung wurden 225 Patienten aus einem Kollektiv

von 731 Patienten anhand definierter Ein- und Ausschlusskriterien

eingeschlossen, bei denen die Erstdiagnose eines primären

Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle in den Jahren 1997 bis 2003 gestellt

worden war und die anschließende R0-Tumorresektion, Lymphknotenchirurgie

und Defektrekonstruktion einzeitig erfolgten. Die Expressionsindizes von

Repp86 und Ki-67 wurden immunhistochemisch ermittelt und mit klinischen

Parametern korreliert. Die Überlebensdaten wurden aus einer prospektiven

Datenbank (Tumorzentrum, Universitätsklinikum Erlangen) generiert. Die

statistische Auswertung erfolgte zunächst mittels univariater Analyse und

Erstellung der Kaplan-Meier-Überlebenskurven. Zudem wurde der Einfluss der

Expressionsindizes und der klinischen Parameter (Alter, Geschlecht, pT, pN,

histopathologische Differenzierung) auf das tumorspezifische Überleben sowie

das Gesamtüberleben in einem multivariaten Modell überprüft.

Ergebnisse und Beobachtungen

Repp86 konnte in allen untersuchten Gewebeproben nachgewiesen werden.

Die mittleren Labelingindizes (LI) betrugen 19,2% und 27,6% für Repp86 bzw.

Ki-67. Ein Zusammenhang von Repp86- bzw. Ki-67-LI und pT- bzw. pN-

Stadium sowie histopathologischem Differenzierungsgrad konnte im

2

untersuchten Kollektiv nicht nachgewiesen werden. Dagegen zeigte sich eine

signifikante Korrelation der Proliferationsmarker (rRepp86_Ki-67=0,194; p<0,01).

Aus dem Patientenkollektiv verstarben 117 Patienten (52,5%) im

Beobachtungszeitraum. Das Gesamtüberleben sowie das tumorbezogene

Überleben betrugen 67% nach zwei Jahren, 63% nach drei Jahren und 53%

nach fünf Jahren bzw. 78%, 78% und 71%.

Die univariate Analyse zeigte einen signifikanten Zusammenhang zwischen

Gesamtüberleben bzw. tumorspezifischem Überleben und pT-Stadium

(p<0,001) sowie pN-Stadium (p<0,001). In der multivariaten Analyse hatten

Tumorgröße (p<0,05) und Nodalstatus (p<0,01) einen signifikanten Einfluss auf

das Gesamtüberleben. Bzgl. des tumorspezifischen Überlebens zeigte sich ein

signifikanter Effekt allein für den Nodalstatus (p<0,01).

Praktische Schlussfolgerungen

Die vorliegende Analyse zeigt, dass die Repp86-Expression als Maß der

Fraktion proliferierender Tumorzellen keinen signifikanten Einfluss auf die

Prognose von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle hat. Im

Gegensatz zu anderen Tumorentitäten führt der Vorteil der S-Phase-Spezifität

des Repp86-Antigens gegenüber anderen Proliferationsmarkern (Ki-67) somit

nicht zu einer verbesserten Abschätzung der Prognose.

3

1.2. Summary

Purpose

The aim of the study was to assess the impact of Repp86 (Restrictedly

Expressed Proliferation-associated Protein) labeling index on prognosis in

patients undergoing curative resection of oral squamous cell carcinoma (OSCC)

and reconstruction by microvascular flaps.

Patients and Methods

A total of 731 patients with squamous cell carcinoma of the oral cavity (OSCC)

were selected from a prospective database (Clinical Cancer Registry, University

of Erlangen-Nuremberg). Following an in- and exclusion protocol, 225 patients

were included in the study. All patients underwent complete resection (R0) of

squamous cell carcinoma of the oral cavity and reconstruction by microvascular

flaps at a single center between 1997 and 2003. The closing date of the study

was March 31st, 2008. Repp86 and Ki-67 labeling indices (LI) were determined

immunohistochemically by use of monoclonal antibodies Ki-S2 and Ki-S5.

Clinical (age, sex), pathologic (pT and pN stage, grading) and survival data

were retrieved from a prospective database and analysed retrospectively.

Overall and tumor related survival were assessed using the method of Kaplan

and Meier. For multivariate analysis the Cox hazard model was chosen.

Results

Repp86 and Ki-67 were detectable in all tissues analyzed. The mean LI were

19,2% und 27,6% for Repp86 and Ki-67 resp.. The expression of Repp86- and

of Ki-67 were not related to tumor size, lymph node invasion, or

histopathological grading but were positively correlated with each other

(rRepp86_Ki-67=0,194; p<0,01).

117 patients (52,5%) died within the period of observation. Overall survival was

67% at 2 years, 63% at 3 years, and 53% at 5 years while tumor related

survival was 78%, 78%, and 71% resp..

In univariate analysis pT stage (p<0,001), and nodal status (p<0,001) were

significantly associated with both tumor related and overall survival. Multivariate

4

analysis identified pT and pN stage as independent risk factors (p<0,05 and

p<0,01 resp.) for overall survival, whereas only pN stage showed a significant

effect on tumor related survival (p<0,01).

Conclusion

Repp86 and Ki-67 LI failed to show a significant influence on prognosis

following R0 resection of oral squamous cell carcinoma.

5

2. Einleitung

2.1. Das Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle

Das Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle ist ein maligner Tumor, der seinen

Ursprung im Epithel der Mundschleimhaut nimmt. Mit 22,2

Neuerkrankungen/100.000 Einwohner haben Mundhöhlen- und

Rachenkarzinome die fünfthöchste Inzidenz und mit 8,7 Todesfällen/100.000

Einwohner die achthöchste Mortalität maligner Tumorerkrankungen bei der

männlichen Bevölkerung in Bayern. Bei Frauen sind Inzidenz und Mortalität mit

5,7 Neuerkrankungen/100.000 Einwohner bzw. 2,0 Todesfällen/100.000

Einwohner deutlich geringer, was primär als Folge einer verminderten

Kanzerogeneinwirkung angesehen wird. Hier sind Rauchen und Alkoholkonsum

als die bedeutendsten Risikofaktoren für Plattenepithelkarzinome der

Mundhöhle wie auch des oberen Aerodigestivtraktes im Allgemeinen zu nennen

[8,27,31,40,45]. Sie allein tragen einen Anteil von 75% zur Inzidenz dieser

Tumorarten bei [7]. Daneben gibt es eine Reihe erwiesener bzw. vermuteter

Risikofaktoren aus den Bereichen Beruf, Ernährung, Mikrobiologie und

medizinische Vorgeschichte [8,13,15,31,38,43,48,49,50,52]. Genetische

Faktoren spielen ebenfalls eine Rolle, wobei diese in der Literatur als

Nachrangig angesehen wird [22,47]. Schlechte Mundhygiene wird seit langem

als unabhängiger Risikofaktor diskutiert, konnte aber bis heute nicht konsistent

nachgewiesen werden [39]. Es summieren sich mit fortschreitendem Alter die

exogenen und endogenen Ursachengruppen, wodurch die ansteigende

Tumorrate in den höheren Lebensjahren eine Erklärung findet [1,28,53].

Die Prognose wird limitiert durch Lokalrezidive, Zweitmalignome im Bereich des

oberen Aerodigestivtraktes, Fernmetastasen und lokoregionäre Metastasen.

Die 5-Jahres-Überlebensrate beträgt für die Gesamtheit der am

Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle Erkrankten trotz diagnostischer und

therapeutischer Fortschritte derzeit lediglich 55% [27]. Trotz ähnlicher klinischer

und histopathologischer Charakteristika zeigen sich sehr unterschiedliche

6

Krankheitsverläufe, so dass die zur Risikostratifizierung herangezogenen

Faktoren, wie beispielsweise das pTNM Klassifikationssystem, eine genaue

Einschätzung des Krankheitsverlaufes bzw. der individuellen Prognose oftmals

nicht zulässt [34]. Dieser Umstand lässt nach Faktoren suchen, die es

ermöglichen, das Risiko eines Wiederauftretens in Form eines Regional- oder

Lokalrezidives sowie die Überlebenswahrscheinlichkeit im individuellen Fall

genauer bestimmbar zu machen. In diesem Zusammenhang haben Proteine

wie Ki-67 Antigen, Topoisomerase IIα oder Repp86, deren Expression auf die

DNS-Synthesephase bzw. die Teilungsphase des Zellzyklus beschränkt ist, bei

verschiedenen Tumorerkrankungen Bedeutung erlangt.

2.2. Ki-67

Ki-67 wurde erstmals im Jahre 1983 durch J. Gerdes beschrieben [25]. Das

Protein besteht aus zwei Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 345

bzw. 395 kDa [23]. Beide Isoformen enthalten sog. Ki-67-Repeats mit jeweils 16

repetitiven Elementen, die von einem einzigen, 6845 Basenpaaren

umfassenden Exon kodiert werden [62]. Der Genlocus von Ki-67 umfasst

annähernd 30.000 Basenpaare [21]. Ki-67 gilt als Bestandteil der nukleären

Matrix und wird ausschließlich in proliferierenden Zellen, der sog.

Wachstumsfraktion, exprimiert [83]. Es liegt somit während der Phasen G1, S,

G2 und der Mitose (M) vor, nicht aber während G0 [24,65,78]. In

Zusammenhang mit diesem Expressionsverhalten ist die Dauer der

Phasenintervalle von Bedeutung. Es ist in der S- und G2-Phase sowie während

der Mitose sowohl in entartetem als auch in physiologischem Gewebe nahezu

gleich, wohingegen in der G1-Phase eine zeitliche Inkonstanz herrscht [57].

Diese Variabilität wird durch zahlreiche Faktoren beeinflusst [31,51]. Als Maß

für die Aggressivität eines Tumors wird die Höhe der Proliferationsaktivität

angesehen. Die Zellen aggressiver Tumoren durchlaufen die G1-Phase

schneller als die Zellen langsam wachsender Tumoren. Weiterhin sind die in G1

befindlichen Zellen allen anderen Zellpopulationen der einzelnen

Zellzyklusphasen zahlenmäßig überlegen [55]. Daraus resultiert eine

7

konsistente Überschätzung der Anzahl proliferierender Zellen [10,68].

Proliferationsmarker der Wachstumsfraktion zeichnen sich durch die

kontinuierliche Expression im Verlauf des Zellzyklus, sowie eine unverzügliche

Abnahme der Expression bei Wachstumsstillstand aus [80]. Diese Forderungen

werden von Ki-67 erfüllt. Unterschiedliche Auffassungen existieren hingegen für

die relative Expression in G1. Während manche Autoren einen Anstieg der Ki-

67 Expression bereits in der späten G1-Phase beschreiben, wiesen andere

Arbeitsgruppen eine Abnahme bis zum Eintritt in die S-Phase nach [9,11,37,72].

Diese Diskrepanz wird von du Manoir in einem Modell mit tridirektionalem

Signalweg gedeutet [17]. Der Signalweg der Anreicherung mündet dabei aus

dem Zellzyklus in die reversible G0-Phase. Werden diese Zellen anschließend

mittels geeigneter Wachstumsfaktoren aktiviert und in den Zyklus rückgeführt,

resultiert eine Anreicherung und der Eintritt in die S-Phase. Liegen optimale

Wachstumsbedingungen vor, verfolgen die Zellen einen konstanten Signalweg

und exprimieren kontinuierlich. Während der S-Phase ist ein Anstieg der

Expression feststellbar, der in der G2-Phase weiter zunimmt [17]. In der

Metaphase erreicht die Expression ihr Maximum [60,81]. In der nachfolgenden

Ana- und Telophase nimmt die Expression wieder ab. Die Halbwertszeit von Ki-

67 beträgt maximal eine Stunde [32]. Zu Beginn der G1-Phase ist die

Lokalisation von Ki-67 in direkter Nachbarschaft zur Satelliten-DNA zu finden

[10]. Diese räumliche Beziehung wird aber im Verlauf des Zellzyklus zugunsten

einer diffusen Verteilung im Kernplasma fast vollständig aufgegeben [62].

Weiterhin ist Ki-67 in den Umformungsprozess der Nukleoli involviert, die das

Protein ab Mitte der G1-Phase überwiegend assimilieren [47]. Während der G2-

Phase sind Lokalisationen im Nukleus oder im Nukleoplasma beschrieben

[9,17]. Die Funktion von Ki-67 ist bis zum heutigen Tag nicht vollständig geklärt.

Vermutungen über mögliche Interaktionen stützen sich häufig auf die Co-

Lokalisation zu Strukturen bekannter Funktionalität oder ähnlicher genetischer

Muster. So beinhaltet das Protein eine Struktur, die man als “forkhead

assoziiert” bezeichnet [42]. Diese Sequenz weisen auch Proteine auf, die

regulierend in den Zellzyklus eingreifen. Falini et al. wiesen Ki-67 in

physiologischem und neoplastischem Gewebe von Hunden, Ratten und

Kaninchen nach und brachten diese weitreichend evolutionäre

Antigenkonservierung mit einer Kontrollfunktion des Zellzyklus in Verbindung

8

[18]. Die Erfahrungen mit Ki-67 mit Bezug zu klinischen Daten sind

weitreichend. Rudolph und Jansen et al. beschrieben dabei den Ki-67 LI als

einen signifikanten prognostischer Faktor [33,55]. Tabelle 1 gibt einen

Literaturüberblick über bereits veröffentlichte Ki-67-Studien beim

Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle.

2.3. Repp86

Im Jahr 1997 beschrieben Heidebrecht et al. ein bisher unbekanntes Protein,

das im Westernblot durch Immunisierung weiblicher BALB/C Mäuse mit

nukleären L428-Zelllysaten generierten monoklonalen Maus-Antikörper der

Subklasse IgG1 detektiert wurde [31]. Dieses Protein wurde vorübergehend als

p100, und schließlich aufgrund seines theoretischen Molekulargewichts von 86

kDa als “restrictedly expressed proliferation-associated protein” 86kDa

(Repp86) bezeichnet. Manda et al. spezifizierte diese Bezeichnung für

untersuchtes Lungengewebe und führte als Synonym die Kurzbezeichnung DIL-

2 (differentially expressed in cancerous and noncancerous lung cells 2) ein

[41]. Das korrespondierende Gen ist auf dem Chromosom 20 lokalisiert.

Während der Mitose wird Repp86 mittels Phosphorylierung aktiviert, was für

zellzyklusassoziierte Proteine als typisch ausgewiesen wird. Repp86 ist in der

G1-Phase nicht detektierbar und liegt im Verlauf der Phasen S und G2 im

Nukleoplasma diffus verteilt vor [30]. Repp86 besitzt eine Halbwertszeit von 90

Minuten [31].

Färbungen mit dem monoklonalen Antikörper Ki-S2 zeigen, dass Repp86 in der

Prophase an den Spindelpolen kumuliert, während es in Meta- und Anaphase

den Verlauf des Spindelapparates nachzeichnet [31]. Weiterhin konnte Repp86

durch Klonierung der cDNA als menschliches Homolog des Xenopus Proteins

TPX2 charakterisiert werden [30,83]. Dieses Protein interagiert mit dem am

Minusende der Mikrotubuli und an den Spindelpolen lokalisierten Protein Xklp2,

dem eine wichtige Funktion bei der Chromosomentrennung zukommt [30].

Während der Mitose ist TPX2 für die chromatininduzierte Mikrotubulusformation

verantwortlich und kann die Geschwindigkeit der Mitose quantitativ beeinflussen

9

[29]. Eine analoge Affinität ist in Form des humanen Repp86-Hklp2 Komplexes

gegeben und lässt Vermutungen über eine gemeinsame Funktionsweise zu. In

der Mitose tritt das Antigen mit Spindelpolen und Mikrotubuli in

Wechselwirkung. Weiterhin ist Repp86 neben der Vermittlung eines

Dynein/Dynactin-Komplexes am Transport des Motorproteins Hklp2 an die

Minusenden der Mikrotubuli mitbeteiligt. Ein unterschiedlicher

Phosphorylierungsstatus könnte neben der Bindungsaffinität von Repp86 auch

seine Ubiquitierung bedingen, die in der Ana- und Telophase erfolgt. Das 747

Aminosäuren umfassende Protein Repp86 nimmt bezüglich seines

Expressionsverhaltens eine Sonderstellung ein, die es als neuartigen

Proliferationsmarker etabliert. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen

Markern hebt es sich durch Beginn der Expression am Übergang von der G1/S-

Phase ab [30,35]. Durch dieses Expressionsmuster wird ein

Proliferationsmarker beschrieben, der eine Differenzierung von schnell

proliferierenden und langsam wachsenden Tumoren zulässt. Untersuchungen

an Normalgewebe und verschiedenen Tumorentitäten zeigten, dass der LI nur

ca. 40% der Ki-67 positiven Zellfraktion ausmacht [31]. In retro- und

prospektiven Studien konnte die Expression von Repp86 als

prognoserelevanter Parameter beim Neuroblastom, Mammakarzinom,

Endometriumkarzinom und Non-Hodgkin-Lymphom etabliert werden (Tab. 2).

10

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Tab. 1: Literaturübersicht zu Veröffentlichungen von Ki-67

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2003

2007

1999

2005

2005

2008

2005

2005

Auto

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[35]

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[56]

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[21]

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[63

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[74]

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mann M

[75]

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[76]

Tab. 2: Literaturübersicht zu Veröffentlichungen von Repp86

12

3. Material und Methoden

3.1. Patientenauswahl

Im Rahmen dieser retrospektiven Studie wurden in Kooperation mit dem

Tumorzentrum der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg die

Krankengeschichten aller Patienten der Mund-, Kiefer- und

Gesichtschirurgischen Klinik, Universitätsklinikum Erlangen (Direktor Prof. Dr.

Dr. F.W. Neukam), die im Zeitraum vom 01.01.1995 bis zum 31.12.2003

aufgrund eines Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle behandelt worden

waren, rekrutiert.

Die Patientenselektion erfolgte anhand definierter Ein- und Ausschlusskriterien.

Einschlusskriterien:

primäre Plattenepithelkarzinome der Mundhöhle

operative Therapie mit R0-Resektion

kurativ intendierte Behandlung

Ausschlusskriterien:

weitere maligne Grunderkrankungen

Tumorerkrankungen im Kopf-Hals-Bereich in der Anamnese

Vorbestrahlung im Kopf-Hals-Bereich

schwerwiegenden Grunderkrankungen (ASA-Wert>3)

Aus insgesamt 731 Krankengeschichten wurden 225 Patientenfälle anhand der

genannten Ein- und Ausschlusskriterien zur weiteren Analyse herangezogen.

Die dem histopathologischen Befund zugrundeliegenden Paraffinblöcke wurden

vom Pathologischen Institut, Universitätsklinikum Erlangen (Direktor Prof. Dr.

Arndt Hartmann) zur Verfügung gestellt. Im Falle einer präoperativen

neoadjuvanten Radiatio wurde auf die archivierte Probeexzision (PE), bei

postoperativer Bestrahlung auf das Resektionsmaterial zurückgegriffen. Neben

Geburtsdatum, Geschlecht, Operationsdatum und Bestrahlungsart, fanden das

13

pTNM Staging nach der Empfehlungen der Union internationale contre le

cancer (UICC), sowie das histopathologische Grading Berücksichtigung [70].

Weiterhin wurde das Alter bei Diagnosestellung ermittelt. Es wurden insgesamt

54 (24,00%) Frauen und 170 (74,60%) Männer in die Studie aufgenommen. Bei

einem Patienten ist das Geschlecht unbekannt (0,40%).

Für die weitere Analyse wurden die patientenbezogenen Daten nach

Rücksprache mit der Ethikkommission, Universitätsklinikum Erlangen,

anonymisiert.

3.2. TNM-Klassifikation und histopathologisches Grading

Die klinische Diagnose “Plattenepithelkarzinom” erfordert die routinemäßige

Klassifikation des Tumors in Ausdehnung und Metastasierungszustand anhand

des Schemas der UICC, wobei unterschieden wird zwischen TNM als klinische

Klassifikation und pTNM als pathologische Klassifikation. Nach diesem System

ist definiert [70]:

Tumorgröße T

Tis: Carcinoma in situ

T0: Kein Hinweis auf einen Primärtumor

T1: Tumor bis zu zwei Zentimeter im Größendurchmesser

T2: Tumor zwischen zwei und vier Zentimeter im Größendurchmesser

T3: Tumor mehr als vier Zentimeter im Größendurchmesser

T4: Jeder Tumor, der Nachbarstrukturen infiltriert. Die Klassifizierung erfolgt

bei T4 unabhängig von der Tumorgröße.

Lymphknotenbefall N

NX: Der Lymphknotenstatus ist nicht zu beurteilen

N0: Kein Hinweis auf regionäre Lymphknotenmetastasen

14

N1: Lymphknotenmetastasen in einem regionärem Lymphknoten bis 3cm

Durchmesser auf der ipsilateralen Seite

N2a: Lymphknotenmetastase in einem regionären Lymphknoten zwischen 3

und 6cm im Durchmesser auf der ipsilateralen Seite

N2b: Lymphknotenmetastasen in mehreren regionären Lymphknoten bis 6cm

Durchmesser auf der ipsilateralen Seite

N2c: Lymphknoten in einem oder mehreren regionären Lymphknoten bis 6cm

Durchmesser auf der kontralateralen Seite oder bilateral

N3: Lymphknotenmetastasen in einem oder mehreren regionären

Lymphknoten über 6cm

Differenzierungsgrad G

GX: Differenzierungsgrad kann nicht bestimmt werden

G1: gut differenziert

G2: mäßig differenziert

G3: schlecht differenziert

G4: undifferenziert

3.3. Immunhistochemie

3.3.1. Prinzip der immunhistochemischen Färbung

Das zugrunde liegende Prinzip der immunhistochemischen Färbung besteht in

der Bindung eines Antikörpers an das für ihn spezifische Antigen. Diese

Bindung weist eine hohe Spezifität auf, indem die Bindungsstelle des

Antikörpers, das Paratop, nur an ein bestimmtes komplementäres Areal des

zugehörigen Antigens, das Epitop, bindet. Diese Bindungsreaktion eines

Primärantikörpers wird über mehrere Folgeschritte mittels enzymatischer

Färbereaktion sichtbar gemacht. Mit Hilfe eines vollautomatischen,

immunhistochemischen Färbegeräts der Firma DAKO (Dako Autostainer Plus;

DAKO Diagnostics, Hamburg) wurden diese Färbereaktionen durchgeführt.

15

Prinzipiell können direkte und indirekte Färbeverfahren unterschieden werden.

Bei der direkten Methode ist der Primärantikörper bereits chemisch mit einer

Peroxidase gekoppelt. Diese wandelt ein chromogenes Substrat enzymatisch in

einen Farbstoff um und verursacht somit die spezifische Färbung des

Präparates. Bei der indirekten Methode kommt es zunächst zur Verbindung des

darzustellenden Antigens mit dem Primärantikörper, der allerdings nicht mit

einer Peroxidase gekoppelt ist. Um diesen Komplex sichtbar zu machen ist ein

weiterer Antikörper, der Sekundärantikörper nötig, der mit einer Peroxidase

konjugiert ist. Dieser konjugierte Sekundärantikörper bindet spezifisch an den

Primärantikörper, womit der Gesamtkomplex durch Chromogene wiederum

sichtbar gemacht werden kann.

Das hier verwendete Detektionssystem Advanced™ HRP (DakoCytomation

Advanced HRP Ready-to-Use; For In Vitro Diagnostic Use) verwendet ein

indirektes immunhistochemisches Färbeverfahren, welches zum Nachweis

niedriger Konzentrationen vorhandener Antigene eingesetzt wird. Dieses

System funktioniert nach der Peroxidase-Antiperoxidase-Färbemethode (PAP-

Methode; Abb. 1). Dazu werden drei Reagenzien gebraucht:

- Der Primärantikörper (im Advanced™ HRP-Kit nicht enthalten),

- Der Sekundärantikörper (Advanced™ HRP link mit sekundären

Anti-Maus- und Anti-Kaninchen-Antikörpern in Tris-HCl-Puffer)

und

- Der Tertiärantikörper oder PAP-Komplex (Advanced™ HRP

Enzyme mit Meerrettichperoxidase polymerisierte Antikörper in

Tris-HCl-Puffer).

Der Primärantikörper ist spezifisch gegen das Antigen (Repp86, Ki-67)

gerichtet. Der Sekundär- oder Brückenantikörper (link antibody) kann sich

sowohl an den Primärantikörper als auch an den PAP-Komplex binden, da

beide in derselben Tierspezies hergestellt wurden [6]. Da es biotinfrei ist wird

die unspezifische Färbung wie z.B. in lymphatischen Geweben erheblich

abgeschwächt.

16

3.3.2. Primärantikörper

3.3.2.1. Ki-S2 (Repp86)

Der monoklonale Mausantikörper Ki-S2 wurde im Institut für Pathologie der

Universität Kiel als Marker der Immunglobulin-Subklasse IgG1 entwickelt [32]

Im Westernblot wurde die Affinität von Ki-S2 zum Antigen Repp86

nachgewiesen, das vom Übergang G1/S-Phase bis zur Mitosephase exprimiert

wird. Zur Detektion dieses formalin- und paraffinresistenten Antigens können

sowohl frische als auch gefrorene Gewebeproben verwendet werden.

3.3.2.2. Ki-S5 (Ki-67)

Der monoklonale Antikörper Ki-S5 [32,36,58,59] ist ein Immunglobulin der

Subklasse IgG1, der gegen ein formalinresistentes Epitop des Ki-67-Antigens

gerichtet ist [23,24,25,61], das ausschließlich in proliferierenden Zellen

exprimiert wird. Westernblot-Analysen zeigten, dass der Antikörper Ki-S5 an ein

Kernantigen bindet, das wie bei Ki-67 aus einem 345 kDa und einem 395 kDa

Protein besteht und in den Zellzyklusphasen G1, S, G2 und M aber nicht in G0

exprimiert wird [77].

Abb. 1: Prinzip der Peroxidase-Antiperoxidase (modifiziert nach einer Produktbeschreibung der Firma DAKO Diagnostika GmbH Hamburg, Deutschland)

17

3.3.3. Herstellung und Vorbehandlung der Schnittpräparate

Von den Paraffinblöcken wurden mittels eines Schlittenmikrotoms (Leica RM

2165®, Leica Microsysteme, Nussloch GmbH, Deutschland) 2-3μm dicke

Schnitte angefertigt. Diese wurden zum Strecken in ein auf ca. 40°C beheiztes

Wasserbad (Aqua dest.) gegeben und anschließend auf beschichtete

Objektträger (Super Frost Plus, Menzel, Braunschweig, Deutschland)

aufgezogen. Über Nacht wurden die Schnitte bei 37°C im Brutschrank

getrocknet. Die nachfolgende Inkubation für 3×15 Minuten in Xylol (Merck,

Darmstadt, Deutschland) entzog dem Gewebe das Paraffin. Danach wurden die

Schnitte für eine Dauer von jeweils 2 Minuten in einer absteigenden

Alkoholreihe (100%, 100%, 96%, 96%, 90%, 70%, 70%; Isopropanol, Roth,

Karlsruhe, Deutschland) rehydriert. Abschließend wurden die Proben für 15

Minuten in einem Puffermedium (S3006, DAKO, Wash Buffer, 1:10 mit Aqua

dest. verdünnt) gespült.

Die Formalinfixierung vor der routinemäßigen Paraffineinbettung der

Tumorproben ruft eine Veränderung der Proteinstruktur im Gewebe hervor,

wodurch es auch zu einer Veränderung der antigenen Bindungsstellen, den

Epitopen kommen kann. Man spricht von einer so genannten „Antigen-

Maskierung“. Um die Immunreaktivität der Epitope wiederherzustellen, also eine

„Antigen-Demaskierung“ herbeizuführen, eignet sich besonders die auch hier

eingesetzte Methode der Hitze-induzierten-Epitop-Wiederherstellung

(Retrieval). Durch Inkubation der Schnitte zusammen mit einer weiteren

Pufferlösung (S2367, DakoCytomation, Target Retrieval Solution, pH 9) in ein

kochendes Wasserbad (Aqua dest. ca. 99°C) für 25 Minuten werden die Proben

vorbehandelt. Es folgt ein Abkühlungsintervall von 30 Minuten in Pufferlösung

bei Raumtemperatur.

18

3.3.4. Austestung der Primärantikörper-Konzentrationen

Als zu verändernde Variablen wurden die Andauzeit, das Puffermedium in

welchem die Proben während der Andauzeit liegen sowie die

Primärantikörperkonzentration [PAK] gewählt. Die Vorbehandlung der Schnitte,

die Konzentration der Sekundärantikörper, die Färbung und Gegenfärbung war

hingegen bei jeder Probefärbung identisch. Verdünnt wurden die

Primärantikörper mit einem stabilen, gebrauchsfertigen Reagenz der Firma

DAKO (S2022, Dako REAL™, Antibody Diluent), das speziell für die

Verdünnung von Primärantikörpern entwickelt wurde.

1. Probefärbung: [Ki-S2] 1:5 und 1:10

[Ki-S5] 1:10 und 1:20

Andauzeit: 30 Minuten in Citratpuffer (2,1g

Zitronensäuremonohydrat in 900ml Aqua dest.; mit

NaOH auf pH 6 einstellen und abschließend mit

Aqua dest. auf 1000ml auffüllen)

2. Probefärbung: [Ki-S2] 1:25; 1:50 und 1:100

[Ki-S5] 1:10; 1:25 und 1:50

Andauzeit: 20 Minuten in Target Retrieval Solution

(Dako; verdünnt mit Aqua dest. 1:10; pH 9)

3. Probefärbung: [Ki-S2] 1:5; 1:10 und 1:25

Andauzeit: 20 Minuten in Target Retrieval Solution

(Dako; verdünnt mit Aqua dest. 1:10; pH 9)

4. Probefärbung: [Ki-S2] 1:5; 1:10 und 1:25

[Ki-S5] 1:10 und 1:25

Andauzeit: 25 Minuten in Target Retrieval Solution

(Dako; verdünnt mit Aqua dest. 1:10; pH 9)

19

Nach den Probefärbungen wurde die Andauzeit auf 25 Minuten in Target

Retrieval Solution (Dako; verdünnt mit Aqua dest. 1:10; pH 9) sowie folgende

Primärantikörperkonzentrationen festgelegt:

Verwendete Primärantikörper

Antigen Antikörper Verdünnung

Repp86 Ki-S2 1:10 Prof. Dr. Parwaresch, Institut für Hämato-

Pathologie, Christian-Albrechts-Universität, Kiel

Ki-67 Ki-S5 1:10 Prof. Dr. Parwaresch, Institut für Hämato-

Pathologie, Christian-Albrechts-Universität, Kiel

Tab. 3: Auflistung der verwendeten Primärantikörper

3.3.5. Immunhistochemische Färbung

Vor Beginn einer Färbung wurden alle Reagenzien auf Raumtemperatur

gebracht. Da ausgetrocknete Schnitte unspezifische Färbungen aufweisen

können wurde die Luft im Automaten angefeuchtet um ein Austrocknen der

Gewebeproben zu verhindern. Außerdem wurde das richtige Tropfvolumen, das

pro Präparat und Reagenz auf den Objektträger getropft wurde, eingestellt.

Dieses Volumen ist bei kleinen Proben 100µl und 150µl bei den Restlichen.

Nach dem Andauen wurden die Präparate der Reihe nach in den Färbeautomat

(Dako Autostainer plus®, Dako Diagnostics, Hamburg, Deutschland)

eingeordnet. Alle Proben wurden mit Dako Wash Buffer (S3006, verdünnt mit

Aqua dest. 1:10) gespült. Dieser Dako Wash Buffer ist ein Tris-Puffer mit einem

pH-Wert von 7,6 (+/-0,1), der Tween 20 enthält, ein Stoff der die

Oberflächenspannung herabsetzt und molekulare, oberflächliche Verbindungen

löst. Im nächsten Schritt wurde die im Gewebe vorhandene endogene

Peroxidase geblockt, um eine Hintergrundfärbung zu vermeiden. Das geschieht

mit DEEB (S2003, Dual Endogenous Enzyme Block, DakoCytomation,

Carpinteria, California, USA). Dieser Enzymblock wurde für 10 Minuten auf die

Objektträger gegeben und anschließend wieder mit Dako Wash Buffer (S3006,

verdünnt mit Aqua dest. 1:10) abgespült. Der Primärantikörper (Repp86/Ki-67)

wurde inkubiert und für 60 Minuten auf den Präparaten belassen. Nach einer

20

weiteren Spülung der Objektträger mit Dako Wash Buffer (S3006, verdünnt mit

Aqua dest. 1:10) wurde nun der Sekundärantikörper für 30 Minuten, gefolgt von

einer Spülung mit Dako Wash Buffer (S3006, verdünnt mit Aqua dest. 1:10),

aufgetragen. Auch der Tertiärantikörper blieb für 30 Minuten auf den Proben.

Nach einer neuerlichen Spülung mit Dako Wash Buffer (S3006, verdünnt mit

Aqua dest. 1:10) wurde das chromogene Substrat (K3469, AEC + High

Sensitivity Substrate Chromogen, DakoCytomation, Carpinteria, California,

USA) auf die Proben aufgebracht und für 18 Minuten auf den Gewebeschnitten

belassen. Wieder wurde gespült und für 15 Minuten Aqua dest. auf die

Objektträger appliziert. Der Färbedurchgang wurde mit einer Spülung Dako

Wash Buffer (S3006, verdünnt mit Aqua dest. 1:10) beendet. Anschließend

wurde die Gegenfärbung mit Hämatoxylin durchgeführt [6]. Dazu wurden die

Objektträger in Küvetten überführt und für 4 Minuten in Hämatoxylin (S3301,

Automation Hematoxylin Histological Staining Reagent, DakoCytomation,

Carpinteria, California, USA) inkubiert. Um die Gegenfärbung zu stabilisieren

und die Haltbarkeit des Präparates zu verlängern wurden die angefärbten

Proben nachfolgend 5 Minuten „gebläut“, d. h. sie wurden unter fließendem

Leitungswasser abgespült um abschließend noch 5 Minuten in Aqua dest.

gelagert zu werden [12]. Nun wurden die Schnittpräparate auf das Eindecken

vorbereitet. Dazu mussten sie mit Zellstofftüchern getrocknet werden um

anschließend mit einem wasserbasiertem Klebstoff (Aquatex von Merck,

Darmstadt, Deutschland) und geeigneten Deckgläsern (Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland) eingedeckt zu werden. Das Eindeckmedium muss wasserhaltig

sein, da das Reaktionsprodukt von AEC in Alkohol und organischen

Lösungsmitteln löslich ist. Beim Eindecken muss außerdem darauf geachtet

werden, dass sich keine Luftblasen unter dem Deckglas befinden, da AEC sehr

oxidationsempfindlich ist und es so zu einem Ausbleichen des Präparats

kommen kann [6].

21

3.3.6. Kontrollen

3.3.6.1. Negativkontrolle

Als Negativkontrolle wurde ein Präparat mit TBS-Pufferlösung, anstelle des

primären Antikörpers inkubiert. Es folgte das reguläre Färbeprotokoll.

3.3.6.2. Positivkontrolle

Als Positivkontrolle wurde in jeder Färbeserie ein Gewebeschnitt von humanem

Ovarialkarzinom mit bekannter Positivität mitgeführt.

3.4. Auswertung

Zunächst wurden die Schnitte unter einem Hellfeldmikroskop (Axio Imager.A1,

Zeiss, Oberkochen, Deutschland) in 25- und 50-facher Vergrößerung (10-fach

Okular und 2,5- bzw. 5-fach Objektiv) qualitativ untersucht, um die

exprimierenden Areale im Tumor zu lokalisieren und unspezifische Färbungen

bzw. positive, außerhalb des Tumorgewebes gelegene Areale zu detektieren.

Anschließend wurden bei 400-facher Vergrößerung (10-fach Okular und 40-

fach Objektiv) vier Zählfelder im Tumorgewebe jedes Präparats bestimmt und

ausgezählt. Ein Zählfeld besitzt ca. 150 (±30) Zellen. Als Kriterium für eine

positive Kernfärbung galt das Vorhandensein einer artefaktfreien Zellstruktur mit

einer eindeutigen und spezifischen Färbung des Zellkerns. Die Intensität der

Färbungen fand keine Berücksichtigung. Die Bestimmung des LI konnte durch

Summation der positiv gefärbten Zellen und der Gesamtzellzahl pro Zählfeld

sowie anschließender Quotientenbildung erfolgen. Als Grundlage diente die von

Weibel beschriebene Methode des randomisierten systematischen

Subsamplings [64,66,67,82].

22

3.5. Statistikteil

Die deskriptive Darstellung stetiger Variablen (z.B. Alter, Repp86-LI und Ki-67-

LI) erfolgte durch Ermittlung von Mittelwert und Standardabweichung sowie der

Minimum- und Maximumwerte. Für kategoriale Variablen (z.B. Geschlecht,

Tumorgröße und Nodalstatus) wurden die absoluten und prozentualen

Ereignishäufigkeiten der jeweiligen Ränge ermittelt.

Für die weiterführende statistische Analyse wurden die Variablen anhand ihres

Mittelwertes/Medians bzw. anhand klinischer Überlegungen wie folgt

dichotomisiert:

Alter <55 Jahre vs. ≥55 Jahre

Tumorgröße pT1-2 vs. pT3-4

Nodalstatus pN0 vs. pN1-3

histopathologischer Differenzierungsgrad G1-2 vs. G3

Repp86-LI [%] <25 vs. ≥25

Ki-67-LI [%] <30 vs. ≥30

Der Vergleich kategorialer Variablen erfolgte über den Chi2-Test.

In der Univarianzanalyse erfolgte anhand der Kaplan-Meier-Methode die

Bestimmung der Überlebensfunktion, welche eine Schätzung der

Wahrscheinlichkeit darstellt, den Zeitpunkt t zu überleben, wobei die Analyse

aufgrund der Studienhypothese lediglich in Bezug auf das Gesamtüberleben

vorgenommen wurde. Zum Vergleich der Überlebensfunktionen wurde der

Mantel-Haenszel-Log-rank Test herangezogen.

Der gleichzeitige Einfluss verschiedener Variablen auf das Gesamtüberleben

erfolgte mittels einer Multivarianzanalyse (Cox proportional hazards model),

nachdem die Bedingungen der Anwendbarkeit einer logistischen Regression

überprüft worden waren.

Alle statistischen Berechnungen wurden mit dem Softwarepaket SPSS

(Software Package for Socioeconomic Science; Version 15.0) vorgenommen.

Das Signifikanzniveau wurde bei 5% festgelegt (P<0,05).

23

4. Ergebnisse

4.1. Patientenbezogene Parameter

Insgesamt wurden 225 Patienten mit der histopathologischen Diagnose

Plattenepithelkarzinom in die Studie aufgenommen. Die 170 (75,6%)

männlichen und 54 (24%) weiblichen Patienten zeigten eine Altersverteilung

von 30-79 Jahren. Das Durchschnittsalter betrug 56,8 Jahre

(Standardabweichung 9,9%). Die Auswertung der pTNM-Daten ergab für T1 ein

Kollektiv von 60 Patienten (26,7%), für T2 60 (26,7%) Patienten, bezüglich T3

19 (8,4%) Patienten und für T4 77 (34,2%) Patienten. Bei 9 (4,0%) Patienten

konnte retrospektiv keine Tumorgröße ermittelt werden. Sie wurden deshalb

ausschliesslich in die Berechnungen zur Expression eingebunden. Der

Nodalstatus wurde bei 105 (46,7%) Patienten mit N0 evaluiert, 37 (16,4%)

Patienten gehörten der Kategorie N1 an, bei 68 (20,2%) Patienten ergab der

histopathologische Befund eine N2-Klassifizierung und bei einem (0,4%)

Patienten war der Nodalstatus N3. Bei 14 (6,2%) Patienten fehlten Angaben

zum Nodalbefund. 20 (8,9%) Tumoren zeigten eine G1-Differenzierung, 149

(66,2%) Tumoren wurden als mäßig differenziert (G2) aufgenommen, für G3

standen 37 (16,4%) Tumoren zur Verfügung. Bei 19 (8,4%) Patienten konnte

der Differenzierungsgrad retrospektiv nicht ermittelt werden (Tab. 4).

4.2. Qualitative immunhistochemische Analysen

4.2.1. Antikörper Ki-S2 (Repp86)

Nach Durchführung des Färbeprocederes ergab sich bei allen Gewebeproben

ein bichromes Erscheinungsbild. Neben der bläulich erscheinenden

Gegenfärbung in Mukosa und Submukosa imponierte die rosa bis tiefrote

Kernfärbung als Ausdruck der Expression im Zellkern. Auftretende

Mitosefiguren fielen durch eine kräftige Färbung auf. Eventuelle

24

präparatabhängig auftretende unspezifische Hintergrundfärbungen (blassrosa)

waren dezent und hatten keine Auswirkungen auf die Auszählung.

Patientenbezogene Parameter

Parameter Kategorie Fallzahl (n) Anteil (%)

Gesamtfallzahl 225 100

Geschlecht

weiblich 54 24,0

männlich 170 75,6

keine Angabe 1 0,4

Alter: Durchschnitt 56,8 Jahre (30-79 J.) Standardabweichung: 9,9%

--- --- ---

Tumor im Größendurchmesser (T)

T1 60 26,7

T2 60 26,7

T3 19 8,4

T4 77 34,2

keine Angabe 9 4,0

Nodalbefund (N)

N0 105 46,7

N1 37 16,4

N2 68 20,2

N3 1 0,4

keine Angabe 14 6,2

Histopathologisches Grading (G)

G1 20 8,9

G2 149 66,2

G3 37 16,4

keine Angabe 19 8,4

Tab. 4: Auflistung der patientenbezogenen Parameter

Spezifische Bindungen innerhalb des Bindegewebes oder Zytoplasmas wurden

nicht beobachtet. Positive Zellen traten häufiger in kleinen Zellverbänden auf,

als in einer diffusen Verteilung.

Die Negativkontrollen wiesen keine spezifische Anfärbbarkeit auf. Die

mitgeführten Positivkontrollen (Ovarialkarzinome) zeigten eine spezifische und

charakteristische Kernfärbung.

25

4.2.2. Antikörper Ki-S5 (Ki-67)

Vor dem blau gefärbten Hintergrund der Gegenfärbung manifestierten sich im

Tumorepithel tiefrote Zellkerne als Ausdruck der Kernexpression. Spezifische

Bindungen innerhalb des Bindegewebes oder des Zytoplasmas wurden nicht

beobachtet. Die mitgeführten Negativkontrollen zeigten keinen Hinweis

spezifischer Farbreaktionen. Das Gewebe der Ovarialkarzinome reagierte

positiv.

4.3. Quantitative Analyse der Antigenexpression

4.3.1. Repp86-Expression

Die Expression der 225 ausgewerteten Tumorgewebe variierte von 0,0-82,0%

bei einem Mittelwert von 21,5%. Die Standardabweichung betrug dabei 13,7%

(Tab. 5).

Ergebnisse der Repp86-Expression, Plattenepithelkarzinom %

Anzahl n Mittelwert Minimum LI Maximum LI

225 21,5 0,0 82,0 13,7

Tab. 5: Ergebnisse der Repp86-Expression beim Plattenepithelkarzinom (%)

In Abbildung 2 ist die prozentuale Gesamtpositivität in 5%-Intervallen dargestellt

und die jeweilige Zahl der Fälle pro Intervall zugeordnet. Die markierten

Positivitäten bewegten sich zwischen 0% und 60%. Eine gleichmäßige

Verteilung ist zwischen 5% und 30% zu erkennen.

4.3.1.1. Explorative Datenanalyse der Repp86-Expression

Expressionsdaten für pT1 lagen für 45 Fälle vor. Dabei lag die minimale

Expression bei 1,0%, das Maximum bei 65,0%. Es wurde eine mittlere

Expression von 20,7% (±15,3%) berechnet. Für pT2 ergab sich eine mittlere

Expression von 21,7% (±11,3%) bei Extremwerten von 1,0-49,0% und

26

insgesamt 56 Fällen. Die Fallzahl für pT3 betrug 17 Fälle. Evaluiert wurde eine

mittlere Expression von 25,9% (±12,8%) bei einem Minimum bzw. Maximum

von 2,0% bzw. 45,0%. Für pT4 lag ein Patientenpool von 65 Fällen vor. Die

Expression betrug 1,0% im Minimum und 56,0% im Maximum. So errechnete

sich ein Mittelwert von 20,4% (±13,0%).

Abb. 2: Anzahl der durch den Antikörper Repp86 markierten Fälle in Abhängigkeit von der Proliferationsrate

Bezüglich des Lymphknotenbefundes konnten für pN0 90 Fälle, für pN1 32

Fälle und für pN2 60 Fälle evaluiert werden. Für pN0 konnte eine mittlere

Expression von 20,8% (±13,7%) bei Extremwerten von 1,0-65,0% errechnet

werden. Für pN1 lag die minimale Expression bei 1,0%, das Maximum bei

41,0%. So errechnete sich ein Mittelwert von 20,8% (±11,1%). Bezüglich pN2

wurde ein Mittelwert von 22,0% (±12,9%) mit Extremwerten von 1,0-56,0%

berechnet. Der Nodalstatus pN3 konnte nur einem Patienten zugeordnet

werden. Bei G1 mit einer Fallzahl von 16 Fällen wurde bei einer minimalen

Expression von 1,0% und einem Maximum von 40,0% ein Mittelwert von 19,3%

(±10,6%) errechnet. Eine mäßiggradige Differenzierung war mit 137 Fällen

erfasst worden und lieferte eine mittlere Expression von 20,9% (±13,3%). Die

27

Expressionen lagen zwischen Werten von 1,0-65,0%. Für G3 wurden 30 Fälle

bei einer mittleren Expression von 24,5% evaluiert (±13,2%). Die Extremwerte

betrugen 5,0% bzw. 53,0%. Eine Auflistung der ermittelten Repp86-LI in

Zuordnung zu den klinischen Parametern sind Tabelle 6 zu entnehmen.

Repp86-LI %

n Mittel Min. Max.

Plattenepithelkarzinome, gesamt 225 21,5 0 82 13,7

Geschlecht m 170 21,8 1 65 13,1

w 54 19,7 1 47 12,9

Tumorgröße (T)

T1 45 20,7 1 65 15,3

T2 56 21,7 1 49 11,3

T3 17 25,9 2 45 12,8

T4 65 20,4 1 56 13,0

Nodalstatus (N)

N0 90 20,8 1 65 13,7

N1 32 20,8 1 41 11,1

N2 60 22,0 1 56 12,9

N3 1

Grading (G)

G1 16 19,3 1 40 10,6

G2 137 20,9 1 65 13,3

G3 30 24,5 5 53 13,2

Tab. 6: Auflistung der ermittelten Repp86-Labelingindizes (%)

4.3.1.2. Univariate Analyse – Repp86

Der statistische Zusammenhang zwischen den kategorischen Variablen

(Tumorgröße, Nodalstatus, Grading, Geschlecht) und den stetigen Variablen

der Expression erfolgte mittels des nicht-parametrischen Mann-Whitney-U-Test.

Die statistische Signifikanz wurde ab einem Wert von p<0,05 festgesetzt.

Für Repp86 konnte in Bezug auf die klinischen Parameter Tumorgröße

(p=0,282), Nodalstatus (p=0,187) und Grading (p=0,074) keine Signifikanz

nachgewiesen werden. Beim Geschlecht hingegen war das Ergebnis mit einem

p-Wert von 0,049 signifikant.

28

Abb. 3: Boxplot für Repp86-LI in % und Tumorgröße (pT1-pT4)

Abb. 4: Boxplot für Repp86-LI in % und Nodalstatus (pN0-pN3)

29

Abb. 5: Boxplot für Repp86-LI in % und histopathologisches Grading (G1-G3)

4.3.2. Ki-67-Expression

Errechnet wurde die mittlere Expression mit 30,3% (±17,7%) bei 0,0% bzw.

78,0% als Extremwerte (Tab. 7).

Ergebnisse der Ki-67-Expression, Plattenepithelkarzinom %

Anzahl n Mittelwert Minimum LI Maximum LI

221 30,3 0,0 78,0 17,7

Tab. 7: Ergebnisse der Ki-67-Expression beim Plattenepithelkarzinom (%)

In den gefärbten Präparaten (siehe Abb. 6) wurden Proliferationsraten zwischen

0% und 80% ermittelt. Die Verteilung zeigte einen deutlichen Gipfel zwischen

15% und 35%. Zwischen 35% und 40% nimmt die Häufigkeit langsam ab.

Proliferationsraten über 80% wurden nicht beobachtet.

30

Abb. 6: Anzahl der durch den Antikörper Ki-67 markierten Fälle in Abhängigkeit von der Proliferationsrate

4.3.2.1. Explorative Datenanalyse der Ki-67-Expression

Für pT1 ergab sich ein Kollektiv von 45 Patientenfällen. Die mittlere Expression

lag bei 31,7% (±21,4%) bei Extremwerten von 0,0% und 78%. Die 56 Fälle für

pT2 ergaben eine mittlere Expression von 28,4% (±15,5%). Das Minimum bzw.

Maximum lag bei 2,0% bzw. 66,0%. Die Extremwerte von 0,0-73,0% wurden bei

einer mittleren Expression von 40,2% (±21,8%) für pT3 errechnet (17 Fälle). Für

pT4 wurden 65 Fälle gezählt, die bei einer Standardabweichung von 16,7%

eine mittlere Expression von 27,7% ergaben (Werte von 0,0-67,0%). Für pN0

ergab sich ein Kollektiv von 90 Patienten. Bei einem Minimum von 0,0% und

einem Maximum von 78,0% errechnete sich eine mittlere Expression von 30,0%

(±21,0%). Für pN1 errechnete sich eine mittlere Expression von 27,2%

(Minimum: 3,0%, Maximum: 67,0%) bei einer Standardabweichung von 16,5%.

Für pN1 lagen 32 Fälle vor. Für pN2 ergaben sich 60 Fälle bei einem Mittelwert

von 31,7% (Minimum: 2,0%, Maximum: 59,0%). Die Standardabweichung

betrug 15,3%. pN3 betraf nur einen Patienten, sodass kein Mittelwert und

31

Standardabweichung berechnet werden konnte. Die 16 Fälle bei G1 ergaben

eine mittlere Expression von 30,0% (±20,1%) bei einem Minimalwert von 2,0%

und einem Maximum von 64,0%. Für G2 konnten 137 Fälle evaluiert werden,

deren mittlere Expression bei 29,0% (±18,4%) lag (Minimum: 0,0%, Maximum:

78,0%). Für G3 berechnete sich ein Pool von 30 Fällen. Dabei lag die mittlere

Expression bei 35,2% (±17,3%). Die Werte streuten in einem Intervall von 3,0-

71,0%. Die Auflistung der Ki-67-LI ist der Tabelle 8 zu entnehmen.

Ki-67-LI %

n Mittel Min. Max.

Plattenepithelkarzinome, gesamt 221 30,3 0 78 17,7

Geschlecht m 170 31,9 0 78 18,7

w 54 23,5 0 63 15,9

Tumorgröße (T)

T1 45 31,7 0 78 21,4

T2 56 28,4 2 66 15,5

T3 17 40,2 0 73 21,8

T4 65 27,7 0 67 16,7

Nodalstatus (N)

N0 90 30,0 0 78 21,0

N1 32 27,2 3 67 16,5

N2 60 31,7 2 59 15,3

N3 1

Grading (G)

G1 16 30,0 2 64 20,1

G2 137 29,0 0 78 18,4

G3 30 35,2 3 71 17,3

Tab. 8: Auflistung der Ki-67-Labelingindizes (%)

32

4.3.2.2. Univariate Analyse – Ki-67

Der statistische Zusammenhang zwischen den kategorischen Variablen

(Tumorgröße, Nodalstatus, Grading, Geschlecht) und den stetigen Variablen

der Expression erfolgte mittels des nicht-parametrischen Mann-Whitney-U-Test.

Die statistische Signifikanz wurde ab einem Wert von p<0,05 festgesetzt.

Zwischen Ki-67 und den kategorischen Variablen Tumorgröße (p=0,517),

Nodalstatus (p=0,933) und Grading (p=0,123) zeigte sich kein signifikanter

Zusammenhang. Allerdings war auch hier das Geschlecht mit einem p-Wert von

0,020 signifikant.

Abb. 7: Boxplot für Ki-67-LI in % und Tumorgröße (T1-T4)

33

Abb. 8: Boxplot für Ki-67-LI in % und Nodalstatus (N0-N3)

Abb. 9: Boxplot für Ki-67-LI in % und histopathologisches Grading (G1-G3)

34

4.3.3. Korrelation der Proliferationsmarker nach Pearson

Repp86 Ki-67 Alter

Repp86

Korrelation 1,000 0,194 -0,020

Signifikanz 0,004 0,774

n 225 221 210

Ki-67

Korrelation 0,194 1.000 0,000

Signifikanz 0,004 0,990

n 221 221 206

Tab. 9: Korrelationsanalyse der Proliferationsmarker und dem Alter bei Diagnosestellung

Die Beziehung zwischen beiden Proliferationsmarkern und dem Patientenalter

wurde durch Bestimmung der jeweiligen Korrelationskoeffizienten nach Pearson

ermittelt (Tab. 9).

Für Repp86 und Ki-67 wurde ein Korrelationskoeffizient von 0,194 ermittelt.

Damit zeigte sich eine statistisch hoch signifikante Korrelation der

Proliferationsmarker mit einem p-Wert von 0,004.

Das Patientenalter und Repp86 zeigten eine gering negative Korrelation

(-0,020), die statistisch nicht signifikant war (p=0,774).

Zwischen Patientenalter und Ki-67 war kein linearer Zusammenhang

nachweisbar (Korrelationskoeffizient 0,000). Auch war statistisch keine

Signifikanz zu ermitteln (p=0,990).

35

4.4. Prognose

4.4.1. Überlebensfunktion nach Kaplan-Meier

Die mediane Nachbeobachtungszeit betrug 3,1 Jahre (Min. 0 Jahre, Max. 10,2

Jahre). Zum Zeitpunkt des letzten Kontaktes waren 117 (52,5%) von 223

Patienten verstorben. Die Todesursache war tumorbedingt in 64 Fällen (28,7%)

und ohne Bezug zur Tumorerkrankung in 53 Fällen (23,8%) (Tab. 10). Die

Überlebensfunktionen des Patientenkollektivs sind für das Gesamtüberleben

sowie das tumorspezifische Überleben in Abb. 10 und 11 dargestellt.

Beobachtungszeitraum in Monaten 0 24 60

Gesamtüberleben Lebend 223 (100,0%) 148 (66,4%) 122 (50,8%)

Tod (alle Ursachen) 0 75 101

Tumorbezogenes Überleben

Lebend oder Tod aus and. Urs.achen 223 (100%) 179 (78,4%) 168 (70,6%)

Tod tumorbedingt 0 44 55

Tab. 10: Gesamtüberleben des Patientenkollektivs (Fallzahl, Überlebenswahrscheinlichkeit nach Kaplan-Meier)

4.4.2. Univariate Analyse

In der univariaten Analyse für das tumorspezifische Überleben sowie das

Gesamtüberleben nach Kaplan-Meier wurden Alter (<55 Jahre vs. ≥55 Jahre),

Geschlecht, Tumorgröße (pT-Stadium, pT1-2 vs. pT3-4), Nodalstatus (pN-

Stadium, pN0 vs. pN1-3), histopathologischer Differenzierungsgrad (G1-2 vs.

G3), Repp86-LI (<20% vs. ≥20%) sowie der Ki-67-LI (<30% vs. ≥30%)

betrachtet. Hier zeigte sich für die Parameter Tumorgröße und Nodalstatus ein

signifikanter Zusammenhang zu Gesamtüberleben und tumorspezifischem

Überleben (jew. p<0,001) (Tab. 11). Ein signifikanter Einfluss auf die Prognose

konnte dagegen für die Expressionsindizes von Repp86 noch Ki-67 nicht

nachgewiesen werden.

36

Abb. 10: Überlebensfunktion nach Kaplan-Meier (krankheitsspezifisches Überleben)

Abb. 11: Überlebensfunktion nach Kaplan-Meier (Gesamtüberleben)

37

4.4.3. Multivarianzanalyse

Für die Multivarianzanalyse wurde das Cox proportional hazards Modell

herangezogen. Eingeschlossen wurden die Faktoren, die in der univariaten

Schätzung der Überlebenswahrscheinlichkeit statistische Signifikanz erlangt

hatten oder in früheren Studien als prognostisch relevante Faktoren identifiziert

worden waren. Dies waren Alter (<55 Jahre vs. ≥55 Jahre), Geschlecht,

Tumorgröße (pT-Stadium, pT1-2 vs. pT3-4), Nodalstatus (pN-Stadium, pN0 vs.

pN1-3), histopathologischer Differenzierungsgrad (G1-2 vs. G3), Repp86-LI

(<20% vs. ≥ 20%) sowie der Ki-67-LI (<30% vs. ≥30%) (Tab. 12).

Für das tumorbezogene Überleben erlangte allein der Nodalstatus (pN 3 vs.

pN1-2) eine unabhängige prognostische Relevanz (p=0,010) (Tab. 13). Die

Betrachtung bzgl. des Gesamtüberlebens identifizierte Tumorgröße und

Nodalstatus als unabhängige Risikofaktoren (p=0,016 bzw. p=0,014) (Tab. 14).

Weder Repp86- noch Ki-67-LI vermochten einen unabhängigen Einfluss auf die

Prognose zu zeigen.

38

Kovariable n OSP, 2J. (SE) OSP, 3 J. (SE) OSP, 5 J. (SE) p-Wert

(Log-rank Test)

Alter 0.21

< 55 Jahre 111 69 (4) 67 (5) 57 (5)

≥ 55 Jahre 112 65 (5) 60 (5) 49 (5)

Geschlecht 0.86

männlich 168 67 (4) 63 (4) 52 (4)

weiblich 54 67 (6) 65 (7) 54 (7)

pT 0.001

< 3 118 77 (4) 73 (4) 62 (5)

≥ 3 96 55 (5) 52 (5) 41 (5)

pN 0.001

0 104 81 (4) 78 (4) 64 (5)

≥ 1 105 53 (5) 49 (5) 40 (5)

Grading 0.07

< 3 168 68 (4) 65 (4) 54 (4)

3 37 55 (8) 51 (8) 40 (9)

Repp86-LI 0.32

< 20% 107 64 (5) 61 (5) 50 (5)

≥ 20% 116 70 (4) 66 (4) 55 (5)

Ki-67-LI 0.59

< 30% 114 66 (5) 64 (5) 52 (5)

≥ 30% 105 68 (5) 63 (5) 53 (5)

Gesamt

223 67 (3) 63 (3) 53 (4)

Tab. 11: Univarianzanalyse für das Gesamtüberleben (OSP, Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit*100 zu den Zeitpunkten 2/ 3/ 5 Jahre nach Tumorresektion; SE, Standardfehler; LI, Labeling Index)

39

Kovariable n OSP, 2J. (SE) OSP, 3 J. (SE) OSP, 5 J. (SE) p-Wert

(Log-rank Test)

Alter 0.96

< 55 Jahre 111 79 (4) 79 (4) 70 (5)

≥ 55 Jahre 112 78 (4) 76 (4) 71 (5)

Geschlecht 0.86

männlich 168 79 (3) 78 (3) 70 (3)

weiblich 54 77 (6) 77 (7) 72 (7)

pT 0.003

< 3 118 87 (3) 86 (3) 78 (4)

≥ 3 96 68 (5) 68 (5) 62 (5)

pN 0.001

0 104 91 (3) 91 (4) 82 (4)

≥ 1 105 66 (5) 65 (5) 60 (5)

Grading 0.29

< 3 168 80 (3) 79 (4) 73 (4)

3 37 74 (8) 69 (8) 69 (9)

Repp86-LI 0.58

< 20% 107 78 (4) 77 (5) 68 (5)

≥ 20% 116 79 (4) 76 (4) 70 (5)

Ki-67-LI 0.58

< 30% 114 78 (4) 77 (4) 67 (5)

≥ 30% 105 78 (4) 76 (4) 73 (5)

Gesamt

223 78 (3) 78 (3) 71 (3)

Tab. 12: Univarianzanalyse für das tumorbezogene Überleben (OSP, Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit*100 zu den Zeitpunkten 2/ 3/ 5 Jahre nach Tumorresektion; SE, Standardfehler; LI, Labeling Index)

40

Kovariablen Beta SE(beta) p-wert RR LCL(RR) UCL(RR)

Alter -0,35 0,215 0,10 0,70 0,46 1.07

Geschlecht männl. vs. weibl.

0,04 0,26 0,88 1,04 0,63 1,73

pT pT<3 vs. pT≥3

-0,52 0,21 0,02 0,60 0,39 0,91

pN

pN=0 vs. pN≥1 -0,55 0.22 0.01 0,58 0,38 0,90

Grading G≤2 vs. G>2

-0,26 0,27 0,33 0,77 0,46 1,30

Repp86-LI LI≤20% vs. LI>20%

0,35 0.23 0,12 1,423 0,91 2,23

Ki-67-LI LI≤30% vs. LI >30%

0,10 0,22 0,67 1,10 0,71 1,70

Tab. 13: Multivarianzanalyse für das Gesamtüberleben (Beta: Regressionskoeffizient; SE(beta): Standardfehler von Beta; RR: risk ratio; LCL(RR), lower 95% confidence limit; UCL(RR), upper 95% confidence limit).

Kovariablen Beta SE(beta) p-wert RR LCL(RR) UCL(RR)

Alter 0,05 0,29 0,87 1,05 0,60 1.83

Geschlecht männl. vs. weibl.

-0,25 0,36 0,49 0,78 0,39 1,58

pT pT<3 vs. pT≥3

0,46 0,29 0,11 1,58 0,90 2,79

pN pN=0 vs. pN≥1

0,80 0,31 0,01 2,21 1,21 4,06

Grading G≤2 vs. G>2

0,47 0,34 0,17 1,60 0,82 3,12

Repp86-LI LI≤20% vs. LI>20%

-0,21 0.30 0,48 0,81 0,45 1,45

Ki-67-LI LI≤30% vs. LI >30%

-0,27 0,31 0,40 0,77 0,42 1,42

Tab. 14: Multivarianzanalyse für das tumorspezifische Überleben (Beta: Regressionskoeffizient; SE(beta): Standardfehler von Beta; RR: risk ratio; LCL(RR), lower 95% confidence limit; UCL(RR), upper 95% confidence limit).

41

5. Diskussion

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Repp86-Expression

keinen signifikanten Einfluss auf die Prognose von Patienten mit

Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle hat. Im Gegensatz zu etablierten

Prognosefaktoren, wie Tumorausbreitung oder Nodalstatus konnte die

Erfassung der Fraktion proliferierender Tumorzellen somit nicht zu einer

Abschätzung der Prognose bei am Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle

erkrankten Patienten beitragen.

Dabei ist das nukleäre Ki-67 Antigen mit Expression in den Zellzyklusphasen

G1, S, G2 und M ein etablierter immunhistochemischer Marker, der in der

histopathologischen Routine bei verschiedenen Tumorentitäten zur Erfassung

der Proliferation sowie als prognostischer Marker eingesetzt wird. Beim

Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle wird die prognostische Wertigkeit der Ki-

67-Expression dagegen unterschiedlich beurteilt (vgl. Tab. 1). In der

vorliegenden Arbeit ergab sich eine mittlere Gesamtexpression von 30,3%

(±17,7%) bei Extremwerten von minimal ca. 5% und maximal 78%. Der

Expressionsindex entspricht dabei den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen.

So betrug der immunhistochemisch ermittelte mittlere LI in einer Kohorte von 60

am Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle erkrankten Patienten 29,7% an der

invasiven Front und 25,6% im Tumorinneren. Die Unterscheidung von

Tumorzentrum und invasiver Front erfolgte dagegen in der vorliegenden Arbeit

nicht. Auch die fehlende prognostische Relevanz der Ki-67-Expression wird

durch die Literatur gestützt. So konnte beispielsweise in Kollektiven mit 329 [5]

und 60 [16] Patienten kein Einfluss der Ki-67-Expression auf Gesamt- bzw.

tumorbezogenes Überleben festgestellt werden. Im Gegensatz dazu finden sich

gleichfalls Arbeiten, die einen signifikanten Zusammenhang von Ki-67-

Expression und Überleben in den jeweiligen Kollektiven nachwiesen [19,69,84].

Hintergrund der vorliegenden Arbeit war die Überlegung, ob die uneinheitliche

Datenlage zum Zusammenhang von Ki-67 und der Prognose von am

Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle erkrankten Patienten auf die

zyklusabhängige Verteilung der Ki-67-Expression zurückzuführen ist. Die

Expression des Ki-67-Antigens erfolgt in den Zellzyklusphasen G1, S, G2 und

42

M. Während die Zyklusphasen S, G2 und M einen konstanten Ablauf

aufweisen, unterliegt die G1-Phase einer hohen zeitlichen Variabilität im

Zeitraum von Stunden bis hin zu Monaten [2,3]. Auch kann die Zelle in G1

verharren, apoptotisch werden oder differenzieren, während die Zellteilung erst

ab dem Übergang der G1- zur S-Phase, dem sog. Restriktionspunkt,

unwiderruflich eingeleitet wird. Da die Zellfraktion in G1 den Zellpopulationen

der anderen Phasen zahlenmäßig überlegen ist, stellt sich die Frage, ob die

proliferative Aktivität durch Erfassung eines in den Phasen G1 bis M

exprimierten Proliferationsmarkers überschätzt wird bzw. ob der Ausschluss der

G1-Zellpopulation einen Vorteil bei der Abschätzung einer Prognose im

Vergleich zur Erfassung der gesamten Wachstumsfraktion darstellt.

Zur Beantwortung dieser Fragestellung bietet sich der Prolifertionsmarker

Repp86 (monoklonaler Antikörper Ki-S2) an, der vom Restriktionspunkt bis zum

Ende der Zytokinese exprimiert wird. Die Anwendbarkeit des im Western Blot

etablierten monoklonalen Antikörpers Ki-S2 in der Immunhistochemie ist in zwei

Studien belegt [32,57]. Dabei war die Darstellbarkeit des Epitops sowohl bei

gefrorenen wie auch bei formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Geweben

nach adäquater Aufbereitung identisch. In dieser Studie wurde mit bis zu zehn

Jahren archiviertem, paraffineingebetteten Tumormaterial gearbeitet und bei

allen Gewebeproben eine auswertbare Färbung erzielt. Die Modifikation von

Andauzeit und Inkubationsdauer beeinflußte ausschließlich die Intensität der

Färbung, nicht jedoch die Anzahl gefärbter Zellkerne. Das ausschließliche

nukleare Auftreten in sowohl kleinen Zellverbänden, als auch diffuser Verteilung

wird in der Literatur bestätigt [35]. In normalem Gewebe zeigt Repp86 das

gleiche Verteilungsmuster wie Ki-67 und Topoisomerase II. Die von Repp86

vermittelte Immunreaktion war in einer Querschnittsuntersuchung an 331

Proben normaler Schleimhaut verschiedenster Lokalisationen strikt auf

prolifierierende Bereiche, z.B. die basalen Kompartimente des Epithels

beschränkt [57]. Diese dienen der Epithelregeneration und unterliegen damit

einem höheren Zellumsatz als die peripheren Anteile des Epithels. In einer

Kohorte von 371 an Brustkrebs erkrankten Frauen ohne

Lymphknotenbeteiligung betrug die mittlere Gesamtexpression 9% bei

Einzelexpressionen zwischen 0-29% [56]. Eine ähnliche Expression zeigte sich

in einer Kohorte von 161 Kindern mit Neuroblastom [35]. Der mittlere Repp86-LI

43

betrug hier 10,2% bei Minimal- bzw. Maximalwerten von 0-48%

(Standardabweichung 9,9%).

In der vorliegenden Untersuchung wurde ein mittlerer Repp86-LI von 21,5%

ermittelt (Extremwerte: 0,0-82,0%). Damit ist die mittlere Gesamtpositivität für

Repp86 in der vorliegenden Arbeit im Vergleich zu den angeführten, an

anderen Tumorentitäten erhobenen Daten annährend doppelt so hoch.

Andererseits bestätigt das in der vorliegenden Studie dokumentierte

Expressionsprofil die Ergebnisse einer zurückliegenden Untersuchung, die die

Repp86-Expression am Plattenepithelkarzinom erstmalig erfasste [21]. Der

Vergleich mit Markierungsindizes etablierter Proliferationsmarker wie Ki-67 oder

Topoisomerase IIα zeigt, dass die Repp86-Expression jeweils konstant geringer

ist [31]. So ergab der Vergleich der Expressionen von Repp86 sowie von Ki-67-

Antigen und Topoisomerase IIα beim Ovarialkarzinom und Neuroblastom, dass

der mittlere LI für Ki-67 bzw. Topoisomerase IIα um 40-60% höher war, als für

Repp86 [20]. Diese Beobachtung erklärt sich aus den phasenspezifischen

Expressionsprofilen der untersuchten Antigene (S- bis M-Phase vs. G1- bis M-

Phase) und wird durch die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung

bestätigt. Gleichfalls abgeleitet werden kann die signifikante Korrelation der

Proliferationsmarker untereinander, die in anderen Arbeiten dokumentiert ist

und ebenfalls durch die vorliegende Analyse gestützt wird.

Im Gegensatz zu den vorgelegten Ergebnissen konnte an allen bislang

untersuchten Tumorentitäten eine prognostische Relevanz der Repp86-

Expression unter Beweis gestellt werden. So wurden die Expressionen von

Repp86, Ki-67 und p27 in einer Kohorte von 356 Frauen mit nodal-negativen

Brusttumoren mit Nachbeobachtungszeiten von durchschnittlich 95 Monaten

untersucht und mit Überlebensdaten korreliert [56, 71]. Bei einem Repp86-LI

kleiner 10% unterschied sich die Lebenserwartung nicht von Frauen gleichen

Alters ohne Brustkrebs. Bei einem LI größer als 10% stieg die Mortalität

dagegen auf das bis zu 20-fache an [56]. In der Multivarianzanalyse verblieb

Repp86-LI als statistisch signifikanter Indikator des Gesamtüberlebens, des

krankheitsspezifischen Überlebens bzw. des krankheitsfreien Überlebens

(p<0,0001) als einziger unabhängiger Prognosefaktor. In einer prospektiven

Untersuchung an 161 Kindern mit Neuroblastomen wurde Repp86 ebenfalls als

wichtiger Prognoseindikator identifiziert. So zeigte ein Repp86-LI von mehr als

44

10% ein verkürztes krankheitsfreies Intervall und eine steigende

Tumormortalität auf. In der Multivarianzanalyse wurde der Repp86-LI als

wichtigster Faktor bzgl. des krankheitsspezifischen Überlebens ermittelt [35].

Auch in Untersuchungen an Lymphomen, Ovarialkarzinomen und

Endometriumkarzinomen etablierte sich die Repp86-Expression als

überlebensrelevanter Prognosefaktor [20]. Diese Daten zeigen, dass der

Erfassung der Repp86-Expression bei den jeweiligen Tumorentitäten eine

zentrale Rolle bei der Identifikation von Risikopatienten zukommt. Beim

Vergleich zu den Ergebnissen der vorliegenden Untersuchung ist jedoch

hervorzuheben, dass bei allen untersuchten Tumorentitäten auch die

Expression anderer Proliferationsmarker (Ki-67, Topoisomerase IIα) einen

signifikanten Prognoseindikator darstellten, wohingegen die Datenlage beim

Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle als uneinheitlich zu bewerten ist. Bzgl.

des Kollektivs entsprach die Altersverteilung der Patienten mit einem mittleren

Alter von 56,8 Jahren bei Diagnosestellung bisherigen Erhebungen, die in

neueren Untersuchungen einen Altersgipfel von 50-60 Jahren, in älteren

Untersuchungen einen Altersgipfel von 60-70 Jahren aufzeigen [4,42]. Ebenso

spiegelte das Patientenkollektiv die höhere Inzidenz für Männer sowie die

bevorzugte Lokalisationen der Plattenepithelkarzinome an Mundboden und

Zunge wieder [4,42]. Durch ein Selektionsprotokoll wurde der Einschluss auf

Patienten mit Karzinomen des Mundbodens bzw. der Zunge beschränkt und

eine größtmögliche Homogenität im zu untersuchenden Kollektiv erzielt. Die

resultierende Fallzahl war dabei vergleichbar mit der Anzahl der in den

Vergleichsuntersuchungen zur Repp86-Expression eingeschlossenen Patienten

[35,56,76] und den vorliegenden Untersuchungen zur Expression von Ki-67

beim Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle z.T. deutlich überlegen [21]. Die

retrospektive Datenerhebung muss dagegen als nachteilig gewertet werden und

schränkt die Aussagekraft der vorgelegten Ergebnisse ein. Es sollte folglich die

Fragestellung der prognostischen Wertigkeit der Repp86-Expression in einem

prospektiven Ansatz erneut untersucht und zusätzliche in der vorliegenden

Untersuchung nicht vollständig erhebbare klinische Parameter, wie Ansprechen

auf Strahlentherapie, Rezidivhäufigkeit etc. in die Auswertung einfließen.

45

6. Literaturverzeichnis

1 Anisimov VN. The relationship between aging and carcinogenesis: a critical

appraisal. Crit Rev Oncol Hematol 2003; 45: 277-304.

2 Baserga R. Oncogenes and the strategy of growth factors. Cell 1994; 79: 927-

930.

3 Baserga R. The cell cycle: myths and reality. Cancer Research 1990; 50:

6769-6771.

4 Becker J, Hausamen JE, Neukam FW, Reichart PA, Schliephake H,

Schmelzeisen R. Curriculum Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie.1. Auflage,

Berlin, Chicago, London, Kopenhagen, Paris, Barcelona, Mailand, Istanbul, Sao

Paulo Tokio, Neu- Delhi, Moskau, Prag und Warschau. Quintessenz- Verlag;

2003.

5 Bettendorf O, Herrmann G. Prognostic relevance of Ki-67 antigen expression

in 329 cases of oral squamous cell carcinoma. ORL J Otorhinolaryngol Relat

Spec. 2002; 64: 200-205.

6 Bourne JA. Handbuch I der Immunperoxidase Färbemethoden. 1.Auflage;

Immunchemistry Laboratory; Carpenteria/USA; DAKO Corporation; 1983; 11-

12, 23.

7 Boyle P, Macfarlane GJ, Blot WJ, Chiesa F, Lefebvre JL, Azul AM, de Vries

N, Scully C. European School of Oncology Advisory report to the European

Commission for the Europe Against Cancer Programme: oral carcinogenesis in

Europe. Eur J Cancer B Oral Oncol 1995; 31B: 75-85.

8 Boyle P, Macfarlane GJ, Maisonneuve P, Zheng T, Scully C, Tedesco B.

Epidemiology of mouth cancer in 1989: a review. J R Soc Med 1990; 83: 724-

730.

46

9 Braun N, Papadopoulos T, Müller-Hermelink HK. Cell cycle dependent

distribution of the proliferation-associated Ki-67 antigen in human embryonic

lung cells. Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol 1998; 56: 25-33.

10 Brugal G. Interpretation of proliferation markers. Virchows Arch 1995; 427:

337-339.

11 Bruno S, Darzynkiewicz Z. Cell cycle dependent expression and stability of

the nuclear protein detected by Ki-67 antibody in HL-60 cells. Cell Prolif 1992;

25: 31-40.

12 Burck HC. Histologische Technik. 6. Auflage, Stuttgart, New York. Georg

Thieme Verlag; 1988.

13 Casterline CL, Casterline PF, Jaques DA. Squamous cell carcinoma of the

buccal mucosa associated with chronic oral polyvinyl chloride exposure: report

of a case. Cancer 1977; 39: 1686-1688.

14 De Vicente JC, Olay S, Lequerica-Fernandez P, Sánchez-Mayoral J,

Junquera LM, Fresno MF. Expression of Bcl-2 but not Bax has a prognostic

significance in tongue carcinoma. J Oral Pathol Med. 2006; 35: 140-145.

15 Dickenson AJ, Currie WJ, Avery BS. Screening for syphilis in patients with

carcinoma of the tongue. Br J Oral Maxillofac Surg 1995; 33: 319-320.

16 Dissanayake U, Johnson NW, Warnakulasuriya KA. Comparison of cell

proliferation in the centre and advancing fronts of oral squamous cell

carcinomas using Ki-67 index. Cell Prolif 2003; 36: 225-264.

17 Du Manoir S, Guillaud P, Camus E, Seigneurin D, Brugal G. Ki-67 labeling in

postmitotic cells defines different Ki-67 pathways within the 2c compartiment.

Cytometry 1991; 12: 455-463.

47

18 Falini B, Flenghi L, Fagioli M, Stein H, Schwarting R, Riccardi C, Manocchio

I, Pileri S, Pelicci PG, Lanfrancone L. Evolutionary conservation in various

mamallian species of the human proliferation-associated epitope recognized by

the Ki-67 monoclonal antibody. J Histochem Cytochem 1989; 37: 1471-1478.

19 Faratzis G, Tsiambas E, Rapidis AD, Machaira A, Xiromeritis K, Patsouris E.

VEGF and Ki-67 expression in squamous cell carcinoma of the tongue: An

immunohistochemical and computerized image analysis study. Oral Oncol.

2009; 45: 584-588.

20 Fenner M. Expression der Topoisomerase I und Proliferationsaktivität beim

Ovarialkarzinom und Neuroblastom des Menschen. Eine Immunhistochemische

Analyse. Med Diss 2002.

21 Fenner M, Wehrhan F, Jehle M, Amann K, Radespiel-Tröger M,

Grabenbauer G, Zenk J, Nkenke E, Schinhammer M, Schultze-Mosgau S.

Restricted-expressed proliferation-associated protein (Repp86) expression in

squamous cell carcinoma of the oral cavity. Strahlenther Onkol. 2005; 181: 755-

761.

22 Foulkes WD, Brunet JS, Sieh W, Black MJ, Shenouda G, Narod SA. Familial

risks of squamous cell carcinoma of the head and neck: retrospective case-

control study. BMJ 1996; 313: 716-721.

23 Gerdes J, Li L, Schlueter C, Duchrow M, Wohlenberg C, Gerlach C, Stahmer

I, Kloth S, Brandt E, Flad HD. Immunobiochemical and molecular biologic

characterization of the cell prolifeation-associated nuclear antigen that is

defined by monoclonal antibody Ki-67. Am J Pathol 1991; 138: 867-873.

24 Gerdes J, Lemke H, Baisch H, Wacker H-H, Schwab U, Stein H. Cell cycle

analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the

monoclonal antibody Ki-67. J Immunol 1984; 133: 1710-1715.

48

25 Gerdes J, Schwab U, Lemke H, Stein H. Production of a mouse monoclonal

antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell

proliferation. Int J Cancer 1983; 31: 13-20.

26 Gonzalez-Moles MA, Caballero R, Rodriguez-Archilla A, Ruiz-Avila I, Bravo

I. Prognosis value of the expression of Ki-67 for squamous cell carcinoma of the

oral cavity. Acta Stomatol Belg 1996; 93: 159-165.

27 Graham S, Dayal H, Rohrer T, Swanson M, Sultz H, Shedd D, Fischman S.

Dentition, diet, tobacco, and alcohol in the epidemiology of oral cancer. J Natl

Cancer Inst 1977; 59: 1611-1618.

28 Grimm G, Schwenzer N. Geschwülste im Mund- und Kieferbereich. In: Zahn-

Mund- Kieferheilkunde. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York 1990; 257-

260.

29 Gruß OJ, Carazo-Salas RE, Schatz CA, Guarguaglini G, Kast J, Wilm M, Le

Bot N, Vernos I, Karsenti E, Mattaj IW. Ran induces spindle assembly by

reversing the inhibitory effect of importin alpha on TPX2 activity. Cell 2001; 104:

83-93.

30 Heidebrecht HJ, Adam-Klages S, Szczepanowski M, Pollmann M, Buck F,

Endl E, Kruse ML, Rudolph P, Parwaresch R. Repp86: A human protein

associated in the progression of mitosis. Mol Canc Res 2003; 1: 271-279.

31 Heidebrecht HJ, Buck F, Steinmann J, Sprenger R, Wacker HH, Parwaresch

R. P100: A novel proliferation-associated nuclear protein specially restricted to

cell cycle phases S, G2, and M. Blood 1997; 90: 226-233.

32 Heidebrecht HJ, Buck F, Haas K, Wacker HH, Parwaresch R. Monoclonal

antibodies Ki-S3 and Ki-S5 yield new data on the `Ki-67´ proteins. Cell Prolif

1996; 29: 413-425.

49

33 Ihara T, Yamamoto T, Sugamata M, Okumura H, Ueno Y. The process of

ultrastructual changes from nuclei to apoptotic body. Virchows Arch 1998; 433:

443-447.

34 Koscielny S. Untersuchungen zur Bedeutung der Inaktivierung des

Tumorsuppressorgens p16, Reaktivierung der Telomerase und Mutation von

p53 in der Karzinogenese von Kopf-Hals-Karzinomen. Laryngo-Rhino-Otologie

2002; 81: 197-198.

35 Krams M, Heidebrecht HJ, Hero B, Berthold F, Harms D, Parwaresch R,

Rudolph P. Repp86 expression and outcome in patients with neuroblastoma. J

Clin Oncol 2003; 21: 1810-1818.

36 Kreipe H, Wacker HH, Heidebrecht HJ, Haas K, Hauberg M, Tiemann M,

Parwaresch R. Determination of the growth fraction in non-Hodgkin´s

lymphomas by monoclonal antibody Ki–S5 directed against a formalin-resistant

epitope of the Ki–67 antigen. Am J Pathol 1993; 142: 1689-1694.

37 Lopez F, Belloc F, Lacombe F, Dumain P, Reiffers J, Bernard P, Boisseau

MR. Modalities of synthesis of Ki-67 antigen during the stimulation of

lymphocytes. Cytometry 1991; 12: 42-49.

38 Maier H, Tisch M, Kyrberg H, Conradt C, Weidauer H. Occupational

hazardous substance exposure and nutrition. Risk factors for mouth,

pharyngeal and laryngeal carcinomas? HNO 2002; 50: 743-752.

39 Maier H, Zoller J, Herrmann A, Kreiss M, Heller WD. Dental status and oral

hygiene in patients with head and neck cancer. Otolaryngol Head Neck Surg

1993; 108: 655-661.

40 Maier H, Dietz A, Gewelke U, Heller WD, Weidauer H. Tobacco and alcohol

and the risk of head and neck cancer. Clin Investig 1992; 70: 320-327.

50

41 Matsumoto M, Komiyama K, Okane M, Shimoyama Y, Iwakami K, Namaki S,

Tanaka H, Moro I, Sato H. Predicting tumor metastasis in patients with oral

cancer by means of the proliferation marker Ki-67. J Oral Sci 1999; 41: 53-56.

42 Metelmann HR. Tumoren im Kopf-Halsbereich. In: Horch HH, Hrsg. Mund-

Kiefer-Gesichtschirurgie II. Praxis der Zahnheilkunde 10/II, 3. Auflage.

München: Urban & Schwarzenberg 1998; 249-328.

43 Mineta H, Ogino T, Amano HM, Ohkawa Y, Araki K, Takebayashi S, Miura

K. Human papilloma virus (HPV) type 16 and 18 detected in head and neck

squamous cell carcinoma. Anticancer Res 1998; 18: 4765-4768.

44 Mohsenifar J, Almassi-Aghdam M, Mohammad-Taheri Z, Zare K, Jafari B,

Atri M, Mortazavi SH, Azadeh P, Bagherzadeh M, Azargashb E, Rahimi F.

Prognostic values of proliferative markers ki-67 and repp86 in breast cancer.

Arch Iran Med 2007; 10: 27-31.

45 Muir C, Weiland L. Upper aerodigestive tract cancers. Cancer 1995; 75: 147-

153.

46 Myoung H, Kim MJ, Lee JH, Ok YJ, Paeng JY, Yun PY. Correlation of

proliferative markers (Ki-67 and PCNA) with survival and lymph node

metastasis in oral squamous cell carcinoma: a clinical and histopathological

analysis of 113 patients. Int J Oral Maxillofac Surg 2006; 35: 1005-1010.

47 Nagai MA. Genetic alterations in head and neck squamous cell carcinomas.

Braz J Med Biol Res 1999; 32: 897-904.

48 Negri E, Franceschi S, Bosetti C, Levi F, Conti E, Parpinel M, La Vecchia C.

Selected micronutrients and oral and pharyngeal cancer. Int J Cancer 2000; 86:

122-127.

49 O'Grady JF, Reade PC. Candida albicans as a promoter of oral mucosal

neoplasia. Carcinogenesis 1992; 13: 783-786.

51

50 Osterlind A. Cancer and UV-radiation. Pharmacol.Toxicol. 72 Suppl 1993; 1:

67-68.

51 Parwaresch R, Rudolph P. The cell cycle – theory and application to cancer.

Onkologie 1996; 19: 464-472.

52 Pollan M, Lopez-Abente G. Wood-related occupations and laryngeal cancer.

Cancer Detect Prev 1995; 19: 250-257.

53 Riede UN, Westler OD, Müller HJ. Tumorpathologie. In: Allgemeine und

spezielle Pathologie. Riede UN, Wehner H. Georg Thieme Verlag, Stuttgart,

New York 1995; 327-335.

54 Roland NJ, Caslin AW, Bowie GL, Jones AS. Has the cellular proliferation

marker Ki-67 any clinical relevance in squamous cell carcinoma of the head and

neck? Clin Otolaryngol Allied Sci 1994; 19: 13-18.

55 Rudolph P, Alm P, Heidebrecht HJ, Bolte H, Ratjen V, Baldetorp B, Fernö M,

Olsson H, Parwaresch R. Immunologic proliferation marker Ki-S2 as prognostic

indicator for lymph node-negative breast cancer. J Natl Cancer Inst 1999; 91:

271-278.

56 Rudolph P, Olsson H, Bonatz G, Ratjen V, Bolte H, Baldetorp P, Fernö M,

Parwaresch R, Alm P. Correlation between p53, c-erB-2, and topoisomerase IIα

expression, DNA ploidy, hormonal receptor status and proliferation in 356 none-

negative breast carcinomas: prognostic implications. J Pathol 1999; 187: 207-

216.

57 Rudolph P, Knüchel R, Endl E, Heidebrecht HJ, Hofstädter F, Parwaresch R.

The immunohistochemical marker Ki-S2: cell cycle kinetics and tissue

distribution of a novel proliferation-specific antigen. Mod Pathol 1998; 11: 450-

456.

52

58 Rudolph P, Lappe T, Hero B, Berthold F, Parwaresch R, Harms D, Schmidt

D. Prognostic significance of the proliferative activity in neuroblastoma. Am J

Pathol 1997; 150: 133-145.

59 Rudolph P, Lappe T, Schubert C, Schmidt D, Parwaresch R, Christophers E.

Diagnostic assessment of two novel proliferation-specific antigens in benign and

malignant melanocytic lesions. Am J Pathol 1995; 147: 1615-1625.

60 Sasaki K, Murakami T, Kawasaki M, Takahashi M. The cell cycle associated

change of the Ki-67 reactive nuclear antigen expression. J Cell Physiol 1987;

133: 579-584.

61 Schlüter C, Duchrow M, Wohlenberg C, Becker MH, Key G, Flad HD,

Gerdes J. The cell proliferation-associated antigen of antibody Ki–67: a very

large, ubiquitious nuclear protein with numerous repeated elements

representing a new kind of cell cycle-maintaining proteins. J Cell Biol 1993; 12:

513-522.

62 Scholzen T, Gerdes J. The Ki-67 protein. From the known and the unknown.

J Cell Phys 2000; 182: 311-322.

63 Schrader C, Janssen D, Meusers P, Brittinger G, Siebmann JU, Parwaresch

R, Tiemann M. Repp86: a new prognostic marker in mantle cell lymphoma. Eur

J Haematol 2005; 75: 498-504.

64 Schultze- Mosgau S, Lehner B, Rodel F, Wehrhan F, Amann K, Kopp J,

Thorwarth M, Nkenke E, Grabenbauer G. Expression of bone morphogenic

protein 2/4, transforming growth factor beta 1, and bone matrix protein

expression in healing area between vascular tibia grafts and irradiated bone –

experimental model of osteonecrosis. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2005; 61:

1189-1196.

65 Schultze- Mosgau S, Blease MA, Grabenbauer G, Wehrhan F, Kopp J,

Amann K, Rodemann HP, Rodel F. Smad-3 and Smad-7 expression following

53

anti-transforming growth factor beta 1 (TGFbeta1)- treatment in irradiated rat

tissue. Radiother Oncol 2004; 70: 249-259.

66 Schultze- Mosgau S, Wehrhan F, Rodel F, Amann K, Radespiel- Troger M,

Kopp J, Grabenbauer G. Anti-TGFbeta1 antibody for modulation of expression

of endogenous transforming growth factor beta 1 to prevent fibrosis after plastic

surgery in rats. Br J Oral Maxillofac Surg 2004; 42: 112-114.

67 Schultze- Mosgau S, Wehrhan F, Rodel F, Amann K, Radespiel- Troger M,

Grabenbauer GG. Improved free vascular graft survival in an irradiated surgical

site following topical application of rVEGF. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2003;

57: 803-812.

68 Scott JR, Hall PA, Haldane JS, Van Noorden S, Price Y, Lane DP, Wright

NA. A comparison of immunohistochemical markers of cell proliferation with

experimentally determined growth fraction. J Pathol 1991; 165: 173-178.

69 Sittel C, Ruiz S, Volling P, Kvasnicka HM, Jungehülsing M, Eckel HE.

Prognostic significance of Ki-67 (MIB1), PCNA and p53 in cancer of the

oropharynx and oral cavity. Oral Oncol 1999; 35: 583-589.

70 Sobin LH, Wittekind CH. TNM Atlas. Hoboken, New Jersey: Wiley & sons;

2005

71 Sommer T, Olofsson J. Significance of p53, PCNA and Ki-67 in the

prognosis of squamous cell carcinoma of the oral cavity. Laryngorhinootologie

1997; 76: 189-196.

72 Starborg M, Gell K, Brundell E, Höög C. The murine Ki-67 cell proliferation

antigen accumulates in the nucleolar and heterochromatic regions of interphase

cells and at the periphery of the mitotic chromosomes in a process essential for

cell cycle progression. J Cell Sci 1996; 109: 143-153.

54

73 Stoll C, Baretton G, Ahrens C, Löhrs U. Prognostic significance of apoptosis

and associated factors in oral squamous cell carcinoma. Virchows Arch 2000;

436: 102-108.

74 Taheri ZM, Mehrafza M, Mohammadi F, Khoddami M, Bahadori M, Masjedi

MR. The diagnostic value of Ki-67 and repp86 in distinguishing between benign

and malignant mesothelial proliferations. Arch Pathol Lab Med 2008; 132: 694-

697.

75 Tiemann M, Riener MO, Claviez A, Meyer U, Dörffel W, Reiter A,

Parwaresch R. Proliferation rate and outcome in children with T-cell rich B-cell

lymphoma: a clinicopathologic study from the NHL-BFM-study group. Leuk

Lymphoma 2005; 46: 1295-1300.

76 Tiemann M, Claviez A, Lüders H, Zimmermann M, Schellong G, Dörffel W,

Parwaresch R. Proliferation characteristics in pediatric Hodgkin's lymphoma

point to a cell cycle arrest in the G(1) phase. Mod Pathol 2005; 18: 1440-1447.

77 Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from

polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.

Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76: 4350-4354.

78 Tralongo V, Rodolico V, Luciani A, Marra G, Daniele E. Prognostic factors in

oral squamous cell carcinoma. A review of the literature. Anticancer Res 1999;

19: 3503-3510.

79 Tumuluri V, Thomas GA, Fraser IS. The relationship of proliferating cell

density at the invasive tumour front with prognostic and risk factors in human

oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med 2004; 33: 204-208.

80 Van Dierendonck JH, Keijzer R, Van de Velde CJ, Cornelisse CJ. Nuclear

distribution of the Ki-67 antigen during the cell cycle: comparison with growth

fraction in human breast cancer cells. Cancer Res 1989; 49: 2999-3006.

55

81 Verheijen R, Kuijpers HJ, van Driel R, Beck JL, van Dierendonck JH,

Brakenhoff GJ, Ramaekers FC. Ki-67 detects a nuclear matrix-associated

proliferation-related antigen. II. Localization in mitotic cells and association with

chromosomes. J Cell Sci 1989; 1992: 531-540.

82 Weibel ER. Measuring through the microscope: development and evolution

of stereological methods. J Microsc 1989; 155: 393-403.

83 Wittmann T, Wilm M, Karsenti E, Vernos I. TPX2, A novel xenopus map

involved in spindle pole organization. J Cell Biol 2000; 149: 1405-1418.

84 Xie X, De Angelis P, Clausen OP, Boysen M. Prognostic significance of

proliferative and apoptotic markers in oral tongue squamous cell carcinomas.

Oral Oncol 1999; 35: 502-509.

85 Yao L, Itoh S, Furuta I. Thymidine phosphorylase expression in oral

squamous cell carcinoma. Oral Oncol 2002; 38: 584-590.

56

7. Anhang

Abb. 12 Abb. 13

Abb. 12: Plattenepithelkarzinom, Negativkontrolle, 400x Abb. 13: Plattenepithelkarzinom, Färbung mit Ki-S5 (Ki-67), 400x

Abb.14 Abb. 15

Abb. 14: Plattenepithelkarzinom, Negativkontrolle, 400x Abb. 15: Plattenepithelkarzinom, Färbung mit Ki-S2 (Repp86), 400x

57

8. Danksagung

Mein Dank richtet sich an Herrn Professor Dr. Dr. F. W. Neukam, Direktor der

Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgischen Klinik der Friedrich-Alexander-

Universität Erlangen-Nürnberg für die Nutzung modernster Geräte und

Arbeitsmittel im klinikinternen S1-Genlabor.

Herrn Professor Dr. Dr. E. Nkenke, leitender Oberarzt der Mund-, Kiefer- und

Gesichtschirurgischen Klinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-

Nürnberg danke ich für die Vergabe des Themas.

In besonderem Maße möchte ich Herrn Dr. Dr. M. Fenner meinen Dank

aussprechen, der mit großem Engagement dieses Projekt betreut hat. Er war

mir jederzeit ein wertvoller Ansprechpartner.

Frau Dr. rer. nat. Jutta Ries danke ich für die gewissenhafte Einführung in das

Forschungslabor S1 der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgischen Klinik der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg.

Bei Frau Heidi Haider möchte ich mich für die gewissenhafte Einarbeitung in die

Methoden der Immunhistochemie bedanken. Durch ihre langjährige Erfahrung

auf dem Gebiet der Immunhistochemie von Weichgeweben konnte sie mir

wertvolle praktische Hilfestellung leisten.

Herrn Professor Dr. Dr. R. Parwaresch danke ich für die Bereitstellung der

Antikörper Ki-S2 und Ki-S5.

Ganz besonders danke ich meinen Eltern. Ohne ihre Unterstützung wäre diese

Arbeit nicht möglich gewesen.

58

9. Lebenslauf

Name: Philipp Häußinger

Geburtsort: Aachen

Geburtsdatum: 09.01.1981

Eltern: Dr. ing. Dr. med. Georg Häußinger, Arbeitsmediziner, Bayreuth

Maria Häußinger, Lehrerin, Bayreuth

Geschwister: Christoph Häußinger

Florian Häußinger

Schulbildung

1987 – 1991 Grundschule, Bayreuth – St. Johannis

1991 – 1992 Hauptschule, Bayreuth – St. Johannis

1992 – 2001 Wirtschaftswissenschaftliches und Naturwissenschaftliches

Gymnasium Bayreuth

2001 Abitur

Zivildienst

2001-2002 Jugendcafé Babylon, Bayreuth

Studium

2002 – 2007 Studium der Zahnmedizin an der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

2004 Naturwissenschaftliche Vorprüfung

2005 Zahnärztliche Vorprüfung

2007 Staatsexamen

28.12.2007 Approbation und Berufsbezeichnung Zahnarzt

2005 – 2007 Durchführung des experimentellen Teils der Dissertation

2008 Vorbereitungsassistent im Kammerbereich ZBV – Oberfranken