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Rekombinante Wirkstoffe

Prof. Dr. Theo DingermannInstitut für Pharmazeutische Biologie

Goethe-Universität [email protected]

Dienstag, 11. Mai 2010

„Praktische“ Definitionen

GentechnikUnmittelbare neukombination von DNA am isolierten Molekül bzw. Molekülgemischen (Isolierte DNA ⇒ Rekombination ⇒ Reintegration in eine Zelle): In-vitro-Technologie




BiotechnikZellbiologische Verfahren unter Ausnutzung der vorhandenen biologischen Informations- (DNA) und Syntheseausstattung (Enzyme) der Zellen ohne Isolierung des Genoms und anschließender Manipulation am isolierten Genom: In-vivo-Technologie




BiotechnikZellbiologische Verfahren unter Ausnutzung der vorhandenen biologischen Informations- (DNA) und Syntheseausstattung (Enzyme) der Zellen ohne Isolierung des Genoms und anschließender Manipulation am isolierten Genom: In-vivo-Technologie

BiochemieIsolierung, Aufreinigung und Modifikation von Biomolekülen, wobei die Modifikation der Biomoleküle meistens mit Hilfe von Enzymen bewerkstelligt wird: In-vitro-Technologie


natürliches Ausgangsprotei

n

Herstellung rekombinanter Proteine



n


Zielgen



n


Zielgen isoliertes Zielgen

GENTECHNIK



n


Zielgen

neukombiniertes Zielgen

isoliertes Zielgen

GENTECHNIK



n


Zielgen


GVO

isoliertes Zielgen

GENTECHNIK



n


Zielgen


GVOKultivierung des GVO

isoliertes Zielgen

GENTECHNIK



n


Zielgen


GVORekombinantes Protein

BIOTECHNIK

Kultivierung des GVO

isoliertes Zielgen

GENTECHNIK



n


Zielgen



BIOTECHNIK

Isoliertes rekombinantes

Protein


isoliertes Zielgen

GENTECHNIK



n


Zielgen



BIOTECHNIK

Eventuellmodifiziertes

Protein

BIOCHEMIE

Isoliertes rekombinantes

Protein


isoliertes Zielgen

GENTECHNIK


Genetische Informations-einheit = universellverständlich in allen

biologischen Organismen

”Target"-Organismus

”Quell"-Organismus

Rekombinante Proteine


Mechanismen der Transkription/Translation


Genetische Informations-einheit = universellverständlich in allen

biologischen Organismen

Kontrolleinheiten =extrem spezifisch

”Target"-Organismus

”Quell"-Organismus

Rekombinante Proteine

Promotor 1TF 1 POL


"genetic engineering"

Ziel-organis-

mus

Quell-organis-

mus

Kontrollregionen Informationseinheit

(Expressions-)Vektor

Selektionscassette

TransgenerOrganismus

(GVO) Extraktion undReinigung

Produktion rekombinanter Protein


Proteine


einfach,nicht glykosyliert

Proteine


komplex,glykosyliert


Proteine


E. coli oder Hefe



Proteine


E. coli oder Hefe

CHO-Zellen oder BHK-ZellenPflanzenzellen oder humane/Maus-Zellen



Proteine


E. coli

Sehr sicher, aberzu unflexibel für „komplexe“ Proteine

Robust und sicher, aber schlecht ge-eignet für Proteine mit anspruchsvollen Zuckergerüsten

S. cerevisiae

Zellen, die fast alles können und extrem häufig verwendet werden

CHO-Zellen humane Zellen

Zellen, die fast alles können, die allerdings die höchsten Anfor-derungen an die Sicherheit stellen

Pflanzenzellen

Bisher nur in der Forschung einge- setzt. Keine Erfah-rungen im Bereich Arzneimittel

Die richtige Wahl der Produktionszelle


• Bacculovirus-System• Vibrio colerae Stamm213• E. coli• S. cerevisiae• Maus (SP2/0)• Maus (NS/0)• Maus (C127)• Maus-Hybridoma• CHO• BHK• Ziege• HEK 293• Humane B-Zelllinie• Humanzelle (HAT-1080)

Wirtssysteme


Die Bestimmungen dieser Monographie gelten im Zusammenhang mit den jeweiligen einzelnen Monographien des Arzneibuches über DNA-rekombinationstechnisch hergestellte Produkte. Die Anforderungen betreffen nicht notwendigerweise Produkte, die nicht Gegenstand solcher Monographien sind.

Die Monographie gilt nicht für modifizierte lebende Organismen, die für die direkte Anwendung am Menschen und am Tier vorgesehen sind, beispielsweise als Lebendimpfstoffe.

DNA-rekombinationstechnisch hergestellte ProdukteProducta ab ADN recombinante


Definition

DNA-rekombinationstechnisch hergestellte Produkte werden durch genetische Modifikation hergestellt, bei der die kodierende DNA für das benötigte Produkt gewöhnlich mit Hilfe eines Plasmids oder viralen Vektors in einen geeigneten Mikroorganismus oder eine geeignete Zellinie eingeführt wird, in denen diese DNA exprimiert und in Protein translatiert wird. Das gewünschte Produkt wird dann durch Extraktion und Reinigung gewonnen. Die vor der Aufnahme des Vektors vorliegende Zelle oder der Mikroorganismus wird als Wirtszelle bezeichnet, die im Herstellungsprozess verwendete stabile Verbindung der beiden als Wirt-Vektor-System.



DefinitionHerstellungKlonierung und ExpressionCharakterisierung der Wirtszelle einschließlich der Herkunft, des Phänotyps und Genotyps sowie der ZellkulturmedienDokumentation der Klonierungsstrategie für das Gen und Charakterisierung des rekombinanten VektorsCharakterisierung des Wirts-Vektor-SystemsZellbanksystemHerstellung mit begrenzter PassageKontinuierliche HerstellungValidierung der ZellbänkeKontrolle der ZellenValidierung des HerstellungsprozessesExtraktion und ReinigungCharakterisierung des Bulkproduktes

Gleichförmigkeit der ProduktionAminosäure-ZusammensetzungPartielle AminosäuresequenzanalysePeptidmustercharakterisierung Bestimmung der MolekülmasseRetention des ExpressionskonstruktsGesamtproteinChemische ReinheitVon Wirtszellen stammende ProteineAus Wirtszelle oder Vektor stammende DNAHybridisierungsanalyseSequenzunabhängige TechnikenPrüfung auf Identität, Prüfung auf Reinheit und GehaltsbestimmungLagerungBeschriftung



Der legale Markt:• 120 zugelassene Wirkstoffe• 23 Indikationsgruppe



• Angiogenesehemmer• Antiasthmatika• Antianämika• Antidiabetika (Wirkstoffe zur Aufrechterhaltung der Glucose-Homöostase)• Antiinfektiva und Atemwegstherapeutika • Antipsoriatika• Antirheumatika/Antiinflammatorika• Antithrombotika/Antikoagulanzien/Fibrinolytika• Gerinnungsfaktoren• Hämolyse-Inhibitor• Hormone bei Fertilitätsstörungen• Immunmodulatoren bei Multipler Sklerose• Immunsuppressiva zur Transplatat-Abstoßungsprophylaxe• Impfstoffe• Knochenwachstumsfaktoren• Mukoviszidose-Therapeutika• Osteoporose-Therapeutika• Sepsis-Therapeutika• Substitutionstherapeutika bei lysosomalen Speicherkrankheiten• Thrombozytenwachstumsfaktor• Tumortherapeutika• Wachstumshormone• Wundheilungstherapeutikum



Auf den ersten Blick liegt es nahe:– diese Wirkstoffe entsprechen einem

natürlichen, humanen Vorbild

Rekombinante Arzneimittel

Humane, naturidentische Wirkstoffe



Der zweite Blick zeigt:– eine erhebliche Zahl dieser Wirkstoffe

entspricht nicht einem natürlichen, humanen Vorbild

Auf den ersten Blick liegt es nahe:– diese Wirkstoffe entsprechen einem

natürlichen, humanen Vorbild



Warum Modifikationen an authentischen Biomolekülen?



Einige Modifikationen sind Konzessionen an die technische Machbarkeit – durchaus u.U. mit einem signifikanten Zusatzgewinn (Kasse-1 Biotechs)




Einige Modifikationen sind in der Tat naturidentische Wirkstoffe(Kasse-2 Biotechs)





Einige Modifikationen machen die Moleküle besser als die natürlichen Vorbilder, auch weil sie den signifikanten Unterschieden eines physiologischen und eines therapeutischen Delivery‘s Rechnung tragen (Kasse-3a Biotechs)





Einige Modifikationen machen die Moleküle besser als die natürlichen Vorbilder, auch weil sie den signifikanten Unterschieden eines physiologischen und eines therapeutischen Delivery‘s Rechnung tragen (Kasse-3a Biotechs)

Einige Modifikationen sind ganz einfach „neu erfunden“(Kasse-3b Biotechs)


Authentisch vs. modifiziert:•40 „authentisch“•48 modifiziert•4 Maus-Antikörper•1 Ratte-Antikörper•6 chimerisierte Antikörper•12 humanisierte Antikörper•5 „humane“ Antikörper•1 humanisiertes Fab-Fragment•4 „Kunstprotein“



Pharmakokinetische Eigenschaften• 3 schnell wirksam• 101 normal wirksam• 16 verzögert wirksam



H H

G

I E K D KR

M

Met-Somatropin (Protropin®)

Wachstumshormon


H H

G

I E K D KR

M

Klasse-1 Biotech

Met-Somatropin (Protropin®)

Wachstumshormon


H H

G

I E K D KR

Wachstumshormon

Somatropin


H H

G

I E K D KR

Wachstumshormon

Somatropin

Klasse-2 Biotech


H H

G

I E K D KR

längere Halbwertszeitmodifiziertes Wachstumshormon

Pegyliertes Somatropin


H H

G

I E K D KR

längere Halbwertszeitmodifiziertes Wachstumshormon

Pegyliertes Somatropin

Klasse-3a Biotech


H H

G

I E K D KR

D D

NARST

KS

GH-Rezeptor-AntagonistWachstumshormon

Pegvisomant (Somavert®)


H H

G

I E K D KR

D D

NARST

KS

GH-Rezeptor-AntagonistWachstumshormon

Pegvisomant (Somavert®)

Klasse-3b Biotech


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